维甲酸与抗坏血酸协同作用通过激活TET2抑制髓系白血病
发布时间：
2026-04-19 11:22
维甲酸与抗坏血酸协同作用通过激活TET2抑制髓系白血病
蒂芙尼·E·利桑， 约翰·P·布拉布森， 尹星·亚普， 丹妮拉·A·巴比里， 阿比盖尔·S·克利马斯， 乔伊·平佐内， 艾米丽·L·阿赫恩， 明赫·Q·林， 彼得·D·里昂， 安娜·斯维斯基， 尼古拉斯·B·沃尔夫， 中田裕一郎， 海伦娜·戈麦斯·多斯桑托斯， 拉明·谢赫哈塔尔， 路易斯·莫雷， 帕纳约蒂斯·I·夫兰蒂斯， 玛丽亚·E·菲格罗亚， 纳姆拉塔·钱德霍克， 费利佩·贝克罗多夫， 阿里斯泰迪斯·G·特洛尼斯， 以及路易莎·奇米诺
美国迈阿密大学米勒医学院生物化学与分子生物学系，迈阿密，佛罗里达州33136
美国迈阿密大学米勒医学院西尔维斯特综合癌症中心，迈阿密，佛罗里达州33136
美国迈阿密大学米勒医学院人类遗传学系，迈阿密，佛罗里达州33136
美国迈阿密大学米勒医学院医学系血液学教研室，迈阿密，佛罗里达州33136
这些作者贡献相同
主要联系人
*通讯作者:luisa.cimmino@med.miami.edu
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2025.116379
摘要
通过基因或药理学方法，如补充抗坏血酸，增强十 - 十一易位2(TET2)活性，可减缓髓系恶性肿瘤进展。然而，由于药代动力学限制以及需要染色质重塑以实现有效的细胞重编程，单独使用抗坏血酸可能不足以在恶性细胞中完全激活TET2。在此，我们发现一种通过全反式维甲酸(ATRA)增强TET2活性的新机制，ATRA在髓系白血病细胞中诱导维甲酸受体α(RARA)介导的TET2转录，并与抗坏血酸协同作用，促进关键髓系分化位点的DNA羟甲基化和染色质重塑。使用Tet 1/2/3缺陷小鼠和原发性人类急性髓系白血病(AML)模型，我们表明ATRA加抗坏血酸更有效地诱导分化，并以TET2依赖的方式抑制白血病干细胞自我更新，且使AML细胞在体内对靶向治疗敏感，从而提高生存率。这些发现支持联合使用ATRA和抗坏血酸作为增强TET2活性以治疗髓系恶性肿瘤的策略。
引言
十 - 十一易位蛋白(TET1 - 3)是依赖铁和 - 酮戊二酸的酶，可将5 - 甲基化胞嘧啶(5mC)氧化生成5 - 羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5 - 甲酰基胞嘧啶(5fC)和5 - 羧基胞嘧啶(5caC)，这些碱基修饰在DNA去甲基化和转录激活中起关键作用。 所有三种哺乳动物TET蛋白都是已知的淋巴或髓系细胞谱系的肿瘤抑制因子。 TET2在髓系肿瘤患者中最常发生突变， 并且已证明TET2突变或TET3表达降低会使急性髓系白血病(AML)患者的预后更差。 使用双敲除(DKO)小鼠的基因建模还表明，在Tet2缺乏的情况下Tet3功能丧失会迅速加速AML的发展， 这表明联合TET活性的最低阈值对于预防造血干细胞恶性转化和髓系白血病进展很重要。因此，增强TET功能代表了一种潜在的治疗策略，可逆转由TET2缺陷引起的表观遗传异常，这些异常驱动并维持髓系恶性肿瘤。
我们和其他人之前已经表明，使用酶辅因子维生素C(抗坏血酸和L - 抗坏血酸[L - AA])增加TET活性可以增强DNA去甲基化，以恢复TET2缺陷的造血干细胞和祖细胞(HSPCs)的正常自我更新和分化能力，并减缓白血病的发展和进展。 已证明抗坏血酸治疗可增加患者白细胞中的TET活性和5hmC水平， 并且正在进行临床试验以确定口服或胃肠外给予抗坏血酸治疗淋巴和髓系恶性肿瘤的效果。
全反式维甲酸(ATRA)形式的维生素A可以上调小鼠胚胎干细胞(ESCs)中Tet2和Tet3的mRNA表达，并且当它与抗坏血酸联合使用时，这会导致比单独任何一种治疗产生更多的5hmC形成。 我们假设这两种辅因子之间的协同作用可以增加TET细胞的总活性，从而在治疗髓系恶性肿瘤中产生治疗益处。几十年来，ATRA已成功用于治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)患者，通过恢复由PML - RARA致癌融合蛋白表达引起的缺陷RAR活性。 ATRA治疗促进APL细胞分化， 并调节正常HSPCs的休眠以防止其应激诱导的激活，同时调节自我更新和分化能力。 非APL AML细胞作为单一药物对ATRA的分化潜力 notoriously refractory；然而，与靶向染色质调节剂的疗法(如LSD1抑制剂)联合使用时，ATRA可以促进分化，并在治疗其他髓系恶性肿瘤患者中表现出更好的治疗效果。
(下一页图例)
在本研究中，我们确定了全反式维甲酸(ATRA)通过激活维甲酸受体α(RARA)对急性髓系白血病(AML)细胞中TET2表达的直接调控作用。我们发现，将ATRA与抗坏血酸联合处理可增加AML细胞上髓系分化表面标志物的表达，并促进增强子、CpG岛(CGIs)以及髓系分化转录因子(包括RAR蛋白)结合基序处的染色质可及性和DNA羟甲基化增强。我们通过染色质免疫沉淀 - 定量聚合酶链反应(ChIP - qPCR)证实，RARA在人AML细胞中直接与TET2基因位点结合，并且CRISPR介导的RARA敲除可抑制TET2转录上调以及响应ATRA和抗坏血酸处理时5 - 羟甲基胞嘧啶(5hmC)的形成。使用Tet Tet Tet 以及Tet 且Tet1和Tet3敲低的小鼠模型，我们还表明ATRA和/或抗坏血酸对AML细胞的杀伤功效主要依赖于Tet2。使用原代小鼠和患者样本，我们观察到与单独使用任何一种处理相比，ATRA和抗坏血酸联合处理还能更有效地阻断白血病干细胞的自我更新和髓系分化。鉴于先前的研究表明增加TET氧化碱基(5 - 氟胞嘧啶/5 - 羧基胞嘧啶)通过促进对活性DNA去甲基化的碱基切除修复机制的依赖性使AML细胞对聚(ADP - 核糖)聚合酶(PARP)抑制敏感， 我们表明体内ATRA联合处理与较低剂量的抗坏血酸作为奥拉帕尼的佐剂联合使用时效果更显著，从而在体内显著提高疗效。这些发现突出了使用视黄酸联合抗坏血酸靶向恢复TET2功能以预防和治疗血液系统恶性肿瘤的潜力。
结果
维甲酸通过RARA直接上调AML细胞中TET2的转录
先前的研究表明全反式维甲酸(ATRA)处理后小鼠胚胎干细胞(mESCs)中Tet2和Tet3 mRNA表达增加。 此前尚未报道ATRA是否也调节造血细胞中的TET转录。使用DepMap对白血病细胞系中的RNA表达进行分析，结果显示髓系(CD14、CD86和整合素αM / CD11b)、RARA和TET2基因表达之间存在显著正相关(图1A和补充图S1A)，并且在BeatAML2数据集中TET2和TET3表达均与RARA表达呈正相关(图1B)。 对来自接受ATRA治疗的急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞系 和 患者骨髓细胞的RNA表达数据进行分析，也显示TET2表达上调(图1C)，但TET1或TET3未上调(补充图S1B和S1C)。接下来，我们用ATRA处理一组10种人AML细胞系，发现测试的细胞系中有一半TET2和/或TET3上调(增加>1.5倍)，而TET1水平保持不变(图1D和补充图S1D)。在基线时TET2和RARA水平较低的细胞系中观察到TET2对ATRA的上调最为明显(图1E和1F)，包括MV4 - 11和U - 937细胞(图1G)。
维生素A的前体形式视黄醇需要经过两步氧化反应才能转化为视黄酸 ，并且与合成的、生物利用度更高的形式(如他米巴罗汀(RARA激动剂)和全反式维甲酸(泛RAR激动剂))相比，在U-937 AML细胞中未发现其能诱导TET2和TET3表达(图1H)。全反式维甲酸(ATRA)与RARA特异性拮抗剂(BMS614)联合处理可抑制U-937细胞中TET2和TET3的上调(图1I)，使用RARA特异性抗体进行的ChIP-qPCR证实，在mESCs中通过泛RAR ChIP鉴定的TET2基因第1内含子中的视黄酸反应元件(RARE)处，全反式维甲酸(ATRA)处理后存在直接结合。 TET2基因座处的富集与RARB和CEBPE中其他已知的RARE相似 (图1J)。CRISPR介导的RARA基因敲除也显著阻断了AML细胞中全反式维甲酸(ATRA)诱导的TET2和TET3上调，证实RARA是AML细胞中负责TET2和TET3基因上调的主要视黄酸受体(图1K和1L)。
视黄酸与抗坏血酸联合处理可增强与终末髓系分化相关的5hmC形成和染色质重塑
为了评估全反式维甲酸(ATRA)诱导的TET上调是否会影响AML细胞中的DNA羟甲基化，我们通过酶促羟甲基化碱基分辨率测序(EhMC-seq)在两种细胞系中测量了其丰度和基因组分布
图1. 视黄酸通过RARA直接上调AML细胞中TET2基因的表达
(A) 具有显著 皮尔逊R值的基因的相关矩阵。红色突出显示的基因代表具有正相关的感兴趣基因。点的颜色和大小分别按R值和绝对R值进行缩放。
(B) 使用公开可用的BeatAML数据集绘制的AML患者样本中RARA表达与TET1 - 3表达的相关图。
(C) 来自四个不同已发表的APL细胞系数据集的全反式维甲酸(ATRA)刺激后TET2表达的变化。
(D - G) 用1 μM全反式维甲酸(ATRA)处理3天后，测量人AML细胞系中TET和ARA mRNA水平。(D) 全反式维甲酸(ATRA)刺激后TET 1 - 3 mRNA水平的倍数变化。(E和F) 各AML细胞系中TET(E)和RAR(F)基因的基础表达。平均值 标准误， 。(G) 在72小时内对用全反式维甲酸(ATRA)处理的选定AML细胞系中TET1 - 3 mRNA水平进行采样。平均值 标准误， 。
(H和I) U - 937细胞中，视黄醇、他米巴罗汀和全反式维甲酸(ATRA)等RAR激动剂处理 全反式维甲酸(ATRA)3天(H)或RARA拮抗剂处理 全反式维甲酸(ATRA)3天(I)后TET1 - 3 mRNA的倍数变化。平均值 标准误，学生配对 检验， 。
(J) (顶部)TET2基因座内的RAARE基序。(底部)MV4 - 11和U - 937细胞在全反式维甲酸(ATRA)处理3天后，对经典视黄酸反应元件(RARE)区域进行的抗RARA ChIP - qPCR。TET2基因第11外显子处没有RAARE基序(非RARE)的区域用作阴性对照。平均值 标准误，学生 检验， 。
(K和L) MV4 - 11和U - 937细胞中，与非靶向向导(NTG)对照相比，CRISPR敲低RARA(单导向[sg]RARA)后，全反式维甲酸(ATRA)刺激下的基础RARA表达(K)和TET1 - 3表达的倍数变化(L)。平均值 标准误， 。
双向方差分析。* ，** ，** ，以及 *** 。(MV4 - 11和U - 937)单独使用全反式维甲酸(ATRA)以及与抗坏血酸(L - AA)联合处理 。通过主成分分析(PCA)进行的无监督聚类显示出不同的处理聚类，组间最大分离是由抗坏血酸驱动的(图S2A)。然而，在ATRA和抗坏血酸联合处理时观察到差异5 - 羟甲基胞嘧啶(DhmC)的最高频率(图2A和S2B)，并且在5 - 羟甲基化富集的CpG位点(图2B)和ATRA反应性增强子(图2C)处丰度更高。联合处理时在CGI上5 - 羟甲基化增加也存在强烈偏向(图2D)，DhmC主要靶向内含子和基因间区域，以及在CGI、岸区和陆架区，其模式类似于单独抗坏血酸处理(图S2C和S2D)。DhmC的基序分析显示，在ATRA和抗坏血酸联合处理时，髓系分化关键调节因子的靶位点有独特富集，包括RAR蛋白、SPIB和IRF4，而CEBPB/D、SPI1(PU.1)、RUNX2和FOS/JUN结合基序受抗坏血酸调节(图2E；表S1)。ATRA和抗坏血酸联合处理还在更多与多个生物学过程相关的独特基因上使5 - 羟甲基化显著增加(图2F)，这些生物学过程包括生长因子信号传导、GTP酶、中性粒细胞脱颗粒和RUNX1转录调节(图2G和S2F；表S2)。此外，当通过ELISA(图S2E)和EhMC - seq(图2H - 2J和S2G)在RARA、KLF4和CTCF基序等位点进行检测时，AML细胞中的RARA基因敲除导致基础5 - 羟甲基化丰度丧失以及对L - AA或ATRA处理的 增加受阻(图2K；表S3)。这些数据表明，ATRA与抗坏血酸联合可显著提高AML细胞中5 - 羟甲基化丰度，并产生依赖于RARA的独特5 - 羟甲基化图谱。
图2. 维甲酸与抗坏血酸联合处理增强AML细胞基因组中CpG岛、增强子和髓系成熟因子靶位点的5 - 羟甲基化
(A) 包含高(左)和低(右)差异5 - 羟甲基胞嘧啶(DhmC； 羟甲基化差异)位点的50 bp基因组区间的欧拉图，比较用 L - AA、 ATRA或L - AA + ATRA处理72小时的MV4 - 11和U - 937细胞与溶剂对照(Veh)。
(B) 0% - 100% 5 - 羟甲基化的单个胞嘧啶的Veh标准化频率箱线图。
(C) 非增强子区域、基础增强子和ATRA诱导增强子中胞嘧啶的5 - 羟甲基化百分比箱线图。p值如所示。
(D) 比较各处理与Veh的CpG岛内差异5 - 羟甲基胞嘧啶频率的饼图，以及L - AA + ATRA处理中独特改变的DhmC(L + A - unique)。
(图例见下页)
全反式维甲酸(ATRA)是一种已知的转录重编程主调节因子，它通过对基因表达的影响，改变急性髓系白血病(AML)细胞中的染色质可及性。 我们对MV4-11和U-937细胞进行了转座酶可及染色质测序(ATAC-seq)，并通过主成分分析(PCA)观察到，ATRA是可及性变化的主要驱动因素(图S3A)，这些变化与抗坏血酸联合处理时观察到的变化基本重叠(图3A)。在ATRA和抗坏血酸的每种单一或联合处理中，均可观察到可及性的更大损失；然而，联合处理独特靶向的区域总体上显示出更多的增加(图3B和3C)。根据EhMC-seq，大多数差异峰被注释到内含子和基因间区域，并富含ATRA调节的增强子(图S3B和S3C)。基序分析显示，ETS因子(如SPI1(PU.1)、SPIB、ELF和ETV)的结合位点可及性增加，而在FOS和JUN(AP-1)转录因子结合基序处观察到可及性降低(图3D；表S4)。
与其对染色质可及性的影响类似，RNA测序的PCA显示，图谱的分离主要由ATRA驱动(图S3D)，ATRA调节了AML细胞中抗坏血酸联合处理时观察到的大多数转录变化(图3E)。我们证实，ATRA诱导维甲酸受体α(RARA)基因靶点维甲酸受体β(RARB)、CCAAT增强子结合蛋白β/ε(CEBPB/E)以及TET2和TET2及视黄酸调节的基因途径的表达(图S3E - S3G；表S5)，这些途径与抗坏血酸联合时，还导致参与半胱天冬酶介导的细胞骨架蛋白裂解、蛋白酶体降解、抗原交叉呈递增加、中性粒细胞脱颗粒和先天免疫细胞功能的独特和重叠基因上调，表明向髓系细胞成熟转变(图3F)。联合处理时显著下调的基因与支链氨基酸分解代谢、mRNA降解和有丝分裂相关(图S3H和S3I；表S6)。通过比较具有高DNA羟甲基化胞嘧啶(hyper-DhmCs)的基因、染色质可及性增加的ATAC-seq峰和上调表达，我们鉴定出303个靶点(包括RUNX1、KDM2B和IL10RA；图S4A - S4C)，它们参与中性粒细胞脱颗粒、先天免疫细胞功能、白细胞迁移、粘着斑以及补体和血小板激活，表明是髓系细胞成熟和效应功能的重叠靶点。下调的基因仅与可及性降低相关，而与5hmC损失无关(图3G和3H；表S7)。这些基因组研究表明，ATRA和抗坏血酸通过增加由DNA羟甲基化调节的髓系成熟驱动转录因子结合位点的染色质可及性，协同促进髓系细胞分化。
维甲酸与抗坏血酸协同增强髓系白血病细胞分化和死亡
鉴于ATRA和抗坏血酸联合处理能够增强AML细胞中的5hmC形成和转录重编程，我们接下来测试了它们对AML细胞活力和分化的影响。在 处理后，活力测定表明，抗坏血酸可将ATRA的 降低多达10倍，并且联合处理在AML细胞系MV4-11和U-937中具有协同作用(布利斯评分>10)，其中TET2显著上调，并且5hmC水平对ATRA响应增加幅度最大(图4A - 4C和S5A - S5D)。瑞氏-吉姆萨染色观察到的多形核增加和核质比降低表明联合处理正在增强AML细胞分化(图4D)。在用ATRA和L-抗坏血酸(L-AA)进行 处理后，我们通过流式细胞术(LEGENDscreen)对354种表面标志物进行了筛选(图4E)，并鉴定出已知对
(E) 显著(错误发现率[FDR]<0.01)、正向富集(富集倍数[FE]>1)的JASPAR转录因子基序的热图。
(F和G) 注释到高(左)和低(右)差异5hmC的基因的欧拉图(F)以及注释到高DNA羟甲基化胞嘧啶的基因中选择的顶级、显著、正向富集的Reacton途径的点图(G)。
(H) 用250 μM L-AA + 1 μM ATRA (L+A) 或载体对照处理72小时的非靶向向导 (NTG) 和单向导RARA (sgRARA) CRISPR敲除U-937细胞中全球平均5hmC%的箱线图。
(I) NTG L+A、sgRARA载体、或sgRARA L+A与NTG载体相比，或sgRARA L+A与sgRARA载体相比的高到低DhmC比率的柱状图。
(J) NTG和sgRARA L+A处理的细胞与载体差异比较中的高DhmC的欧拉图。
(K) NTG L+A与载体相比以及sgRARA L+A处理的细胞与载体相比保留和丢失的JASPAR转录因子基序的正富集热图。髓系谱系定向(CD38和CD11b)， 趋化因子信号传导(血栓调节蛋白/CD141、ROR1和CD191/CCR1)， 以及由视黄酸信号传导调节的红细胞生成(Siglec-1/CD169) (图4F、4G、S5E和S5F)。RARA的CRISPR敲除减弱了联合处理后这些表面标志物的上调(图4H)。这些分化效应独立于活性氧(ROS)形成而发生(图S5G)，已知ROS仅在非常高的抗坏血酸浓度下诱导 也消除了ATRA和抗坏血酸抑制AML细胞活力的能力(图4I - 4K和S5H)，并使细胞对联合处理诱导的G0/G1期阻滞产生抗性(图4L和S5I)。因此，ATRA和抗坏血酸以RARA依赖的方式增强促进AML细胞分化和生长抑制的TET活性。
图3. 视黄酸与抗坏血酸联合处理增加髓系转录因子靶位点的染色质可及性并激活与DNA羟甲基化增加相关的TET2介导的基因调控
(A和B) 用250 μM L-AA、1 μM ATRA或L-AA + ATRA处理72小时的MV4-11和U-937细胞与载体对照相比，或与L-AA + ATRA(L+A)独特差异峰相比，显著增加(左)或减少(右)的染色质可及性峰(A)和差异ATAC-seq峰(diff-Peak)频率(B)的欧拉图。
(C) 与载体相比，L-AA + ATRA中可及性显著增加的峰处每种处理的平均读数密度直方图。
(D) 差异可及峰处显著的、正富集的JASPAR转录因子基序的热图。
(图例见下一页)
视黄酸和抗坏血酸对白血病干细胞自我更新的抑制是TET2依赖性的
为了测试全反式维甲酸(ATRA)处理对原代白血病细胞中TET活性和功能的影响，我们用AML-ETO9a(AE9a)转导来自Tet2 、Tet2 、Tet2 和Tet2 Tet183敲低的小鼠模型的造血干细胞(HSPCs)。在正常和白血病HSPCs中，ATRA处理均诱导Tet2和Tet3上调约2倍(图5A)。在液体培养生存力测定中，以正常血清血浆水平典型的低剂量抗坏血酸 共同处理足以显著降低ATRA的 ，并以Tet2依赖性方式显示协同作用(布利斯评分>10)，这表明Tet3上调不介导ATRA的白血病细胞杀伤功效(图5B、5C和S6A)。响应ATRA和抗坏血酸处理，5mC氧化为5hmC和5fC也依赖于Tet2表达，因为Tet2 足以消除这些氧化碱基的产生(图5D和S6B)。在集落形成测定中观察到对ATRA和抗坏血酸联合处理的类似Tet2依赖性敏感性，Tet 和Tet 细胞的集落数量和再接种能力受到的阻滞最大(图5E、S6C和S6D)。在Tet2 和Tet2 小鼠白血病HSPCs中，ATRA与抗坏血酸联合上调了表面标志物，如在人AML细胞系联合处理中所见，包括CD38、CD169、CD191、CD11b和Gr1，在Tet2+/+细胞中最为显著(图5F)。由Tet 、Tet 和Tet HSPCs产生的原代小鼠MLL-AF9+白血病细胞在联合处理后也显示出Tet2依赖性的生存力丧失、分化和集落形成抑制(图S7A - S7G)，表明ATRA + L - AA在AML驱动突变的多种情况下均有效。
在来自AML患者的原代人CD34+细胞中，与健康供体(HD)对照CD34+细胞相比，观察到TET2表达的总体基础水平较低，而那些水平最低的细胞在响应ATRA处理时显示出更强上调和分化潜力的趋势，如在反应最灵敏的人AML细胞系中所见(图5G、5H和S7H - S7K)。此外，与抗坏血酸共同处理导致AML CD34+细胞中CD38、CD11b和CD191表达显著上调，而测试的其他标志物，如CD141和ROR1，在正常CD34+细胞中也上调(图5I和5J)。这些数据表明，单独或与抗坏血酸联合时，介导对ATRA处理的反应需要TET2表达，并且联合处理可以特异性靶向白血病干细胞进行分化。
用视黄酸和抗坏血酸增强TET活性可抑制体内白血病进展
先前在小鼠模型中的研究表明，Tet2和Tet3均作为髓系谱系的肿瘤抑制因子， 并且TET2突变 或TET2和TET3任一表达降低均与AML患者中更具侵袭性的疾病相关。 与这些发现一致，我们表明，尽管单独完全缺失Tet2后AE9a 白血病进展迅速加速，但额外缺失Tet3可进一步缩短疾病潜伏期，而缺失Tet1的影响较小(图6A - 6C)。使用这些AE9a 白血病模型，我们测试了联合使用ATRA和抗坏血酸治疗是否能在体内减缓白血病进展，以及它们的疗效是否取决于Tet表达水平(图6D和S8A)。ATRA和抗坏血酸联合治疗导致移植了 白血病细胞的小鼠的存活率适度但显著提高，循环白血病细胞减少(图6E和6F)。然而，单独缺失Tet2或与Tet1/ 白血病联合时，治疗效果的显著性降低(图S8B)。这些数据证实，主要是Tet2而且Tet3的活性调节白血病进展的潜伏期以及ATRA和抗坏血酸在体内的治疗效果。
多项研究探索了ATRA或抗坏血酸与其他药物联合用于治疗非APL AML，有报道称反应有所改善。 我们测试了将ATRA和抗坏血酸作为辅助药物与BCL2抑制剂(维奈克拉)、HDAC抑制剂(伏立诺他)、DNMT抑制剂(阿扎胞苷)和PARP抑制剂(奥拉帕利)联合使用，观察到所有联合治疗均使AML细胞活力降低，其中与奥拉帕利联合具有协同作用(图6G和S8C)。ATRA和抗坏血酸联合治疗赋予的对PARP抑制的强烈敏感性与先前的报道一致，在先前报道中，TET驱动的5fC形成增加以及通过胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)和PARP1的协同作用通过活性DNA去甲基化将其去除使AML细胞对奥拉帕利敏感(图6H)。
(E和F) 与溶剂对照相比，用250 µM L - AA、1 µM ATRA或L - AA + ATRA处理72小时的U - 937和MV4 - 11细胞中显著上调(左)和下调(右)的差异表达基因的欧拉图(E)以及上调基因的选定顶级正富集Reactome基因集的点图(F)。
(G) 与溶剂对照相比，响应L - AA + ATRA处理的具有高DhmC、染色质可及性增加和表达上调(左)或低DhmC、染色质可及性降低和表达下调(右)的注释基因的欧拉图。
(H) 对303个具有高DhmC、染色质可及性增加和表达上调的基因进行Enrichr分析得到的选定顶级富集通路的点图。
图4. 视黄酸和抗坏血酸协同增强髓系白血病细胞分化和死亡
(A) 1 µM ATRA处理3天后KASUMI - 1、MOLM - 13、MV4 - 11和U - 937中TET1 - 3 mRNA的变化倍数(FC)。平均值±SEM，n = 3 -
(B和C) 跨AML细胞系的ATRA IC (B)和与L - AA的布利斯协同评分(C)的热图。平均值±SEM， 。
(D) 用溶剂、250 µM L - AA、1 µM ATRA或联合处理3天的MV4 - 11和U - 937细胞的瑞氏 - 吉姆萨染色。3次实验的代表性结果。
(图例见下一页)
在处于细胞周期的细胞中，与有丝分裂后细胞相反， 无论是通过TDG敲低还是增加TET激活来提高5fC水平， 都可能具有毒性，导致复制叉停滞和基因组不稳定。 多个研究小组已通过合成寡核苷酸诱饵和PARP1的染色质免疫沉淀(ChIP)鉴定出PARP1是5fC的识别蛋白。 因此，有人提出，在处于细胞周期的细胞中，5fC的增加直接或通过对基因组不稳定的次级效应募集PARP蛋白，是增强TET活性与PARP抑制剂(PARPi)联合治疗具有合成致死性的机制。这突出了TET在快速分裂的AML细胞对PARPi敏感性中的依赖性作用，这一作用可成为治疗靶点。与它们对5hmC水平的影响类似，全反式维甲酸(ATRA)和抗坏血酸在与奥拉帕尼联合三联治疗后，也显著增加了5fC的形成，并伴随着 H2AX水平的显著升高(图6I和S8D)。此外，我们使用原代小鼠白血病细胞表明，ATRA和抗坏血酸与奥拉帕尼联合的辅助治疗效果取决于Tet2的表达(图S8E)。与奥拉帕尼联合使用时，ATRA和抗坏血酸对正常造血干细胞(Tet )的集落形成影响最小，但显著减少了白血病细胞的集落数量(图6J)。这些数据表明，ATRA和抗坏血酸联合治疗可显著增强奥拉帕尼阻断AML细胞生长和白血病干细胞自我更新的活性，而不影响健康造血干细胞的功能。
为了在体内测试ATRA和抗坏血酸联合作为辅助疗法治疗AML的效果，我们用ATRA(0.625 mg/kg)和抗坏血酸 以之前使用剂量(图6D - 6F)的八分之一，与奥拉帕尼(25 mg/kg)联合治疗 Tet 白血病小鼠(图6K - 6M)。在这些较低剂量下添加ATRA和抗坏血酸与奥拉帕尼联合治疗导致存活率显著提高(图6L)，这与外周白血病负担减轻相关(图6M)。这些数据突出了添加ATRA和抗坏血酸作为TET激活疗法治疗AML的治疗益处。
讨论
我们已经确定了TET2的一种新作用，它是急性髓系白血病(AML)细胞中全反式维甲酸(ATRA)/维甲酸受体α(RARα)驱动的转录重编程的直接介导因子。ATRA/RARα信号传导转录激活TET2的能力，与抗坏血酸提供的催化增强作用相结合，为联合使用这些药物促进AML细胞终末分化提供了有力的机制依据。尽管之前已经证明维甲酸信号传导可逆转AML中的DNA高甲基化表型， 但其在促进5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)形成中的作用尚未见报道。除了TET2，我们发现ATRA在AML细胞中也显著诱导TET3表达，尽管这种作用可能是间接的，因为在TET3基因座未发现RAR结合或维甲酸反应元件(RARE)。 在正常造血干细胞(HSPC)和AML细胞中，TET2和TET3共同占TET总表达的90%以上 ；然而，已知在调节髓系启动的HSPC的自我更新和分化中，起主导作用的是TET2而非TET3。 这与我们的数据一致，即抑制异常白血病干细胞的自我更新以及ATRA诱导的髓系分化主要依赖于TET2。然而，TET3缺失可加速白血病发生，并通过增加更成熟髓系细胞中甲基化胞嘧啶的基因组不稳定性和诱变，在体内产生更具侵袭性的Tet2缺陷型AML。 与倾向于单核细胞的Tet2缺陷型白血病相比，Tet2/Tet3双敲除(DKO)和Tet1-3三敲除白血病也表现出更成熟的嗜中性粒细胞髓系细胞表型 ，这表明Tet3的肿瘤抑制作用可能是防止髓系分化后期的基因组不稳定，而这在我们使用白血病HSPC的体外研究中并未观察到。因此，联合使用维甲酸和抗坏血酸治疗可能协同增强TET2和TET3的活性，有助于促进它们在HSPC以及可能更成熟的髓系细胞中的肿瘤抑制作用，从而预防白血病进展。
除了维甲酸信号传导直接转录上调TET2外，类视黄醇受体已被证明可与TET蛋白形成复合物以激活基因表达。与TET1和TET3不同，TET2缺乏CXXC DNA结合结构域，通过蛋白质-蛋白质相互作用被招募到染色质上。 对肝癌和成纤维细胞系的研究表明，类视黄醇受体RAR和RXR与TDG(活性DNA去甲基化的关键介导因子)、组蛋白乙酰转移酶CBP以及TET1或TET2发生物理相互作用，以促进维甲酸反应基因位点的转录激活。 抗坏血酸介导的TET催化活性增强可进一步增强这些转录和表观遗传重塑复合物，使染色质对类视黄醇信号更具通透性，这一观点值得进一步研究。事实上，在我们的研究中，当ATRA与抗坏血酸联合使用时，我们观察到AML细胞中5hmC形成、染色质可及性和转录重编程的增加最为显著。值得注意的是，在由RAR蛋白和关键髓系谱系特异性转录因子(包括SPI1(PU.1)和CEBP)调控的基因座处，染色质可及性和5hmC水平显著增加。这些因子对髓系发育和分化至关重要，并且可以通过转录(CEBP) 或通过染色质结合(PU.1)招募或调节TET2。 PU.1相关髓系增强子处的DNA高甲基化是一种常见的表观遗传现象
(E - G) 用L-抗坏血酸(L-AA)和ATRA对MV4-11和U-937细胞进行3天处理后，对354种细胞表面标志物的筛选。(E)细胞追踪染色和流式细胞术分析的实验步骤。(F)相对于溶剂对照，(左)MV4-11和(右)U-937所有细胞表面标志物的对数 倍变化(FC)。(G)两种细胞系中均具有 的表面标志物的热图。
(H)维甲酸受体α(RARA)基因敲除(sgRARA)与非靶向对照(NTG)的MV4-11和U-937细胞中，选定细胞表面标志物的相对平均荧光强度(MFI)。平均值±标准误， ， 。
(I-L)全反式维甲酸(ATRA)的半数抑制浓度(IC50)热图(I)以及L-抗坏血酸(L-AA)与ATRA联合处理72小时的 Bliss协同得分(J)，以及NTG和sgRARA急性髓系白血病(AML)细胞系培养14天后的活力(K)和细胞周期分析(L)。平均值±标准误， ， 。
双向方差分析。 ，以及 。白血病发生的特征，并且CEBP或PU.1活性的增加可将造血细胞重编程为髓系命运。 我们的研究结果表明，维甲酸诱导的RARα激活与TET2建立了正反馈回路，促进表观遗传重塑并增强AML细胞的分化。
图5. 维甲酸和抗坏血酸对白血病干细胞自我更新的抑制作用依赖于TET2
(A)野生型(无癌基因)或AE9a+小鼠造血干细胞(HSPCs)用1 μM ATRA处理3天后，TET1-3 mRNA表达的倍数变化。平均值±标准误， ， 。(B-D)用不同浓度的L-AA(62.5 μM - 1 mM)处理原代小鼠 Tet缺陷型HSPCs 3天的液体培养试验，处理时添加或不添加ATRA。(B)单独给予ATRA或与生理浓度的L-AA(62.5 μM)联合使用时ATRA的IC 。平均值±标准误， 。(C和D)Bliss协同得分(C)以及通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的全局 (左)和 (右)与 含量的比值(D)。平均值 。
(E)AE9a Tet缺陷型HSPCs经7天处理后的相对集落数。通过将在半固体培养基中生长的集落重新接种进行4次每周传代来确定自我更新能力。平均值±标准误， ， 。
(图例见下一页)
TET2还可以通过与转录共抑制因子如组蛋白去乙酰化酶1/2(HDAC1/2)和核受体辅阻遏蛋白1/2(NCOR1/2)结合而被招募到染色质上，以抑制炎症基因转录，如在髓系细胞中TET2介导的白细胞介素(IL)-6抑制调控中所示。 有趣的是，在用ATRA和抗坏血酸联合处理后，我们观察到AP-1转录因子FOS和JUN的可及性降低，它们通常在炎症细胞因子信号响应中被激活，并维持异常的AML自我更新和干细胞生长。 FOS和JUN的结合基序在ATRA和抗坏血酸联合处理后也显示出5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)的富集，这表明这些区域可能是TET2/共抑制因子复合物的直接靶点，驱动染色质可及性丧失和凝聚，这在造血细胞的谱系定向和分化过程中是已知会发生的。
全反式维甲酸(ATRA)与抗坏血酸联合使用，除了对急性髓系白血病(AML)细胞上的髓系成熟标志物(如CD11b)有影响外，还对CD38的表达有增强作用，这与先前描述的维生素A和视黄酸在髓系细胞分化中的作用一致，已知CD11b、CD141和CD38等标志物可通过ATRA/RARA信号通路直接或间接上调。 虽然早期研究报告称ATRA可促进人类造血祖细胞特定亚群的分化， 但其他研究表明，在正常造血的背景下，ATRA对更原始的造血干细胞(HSPC)亚群的增殖和分化具有抑制作用，赋予了更休眠的造血干细胞典型的长期重建活性。 ATRA在造血过程中的这些矛盾作用归因于其激活所有三种维甲酸受体(RAR)亚型的能力:RARα刺激分化，但RARβ和RARγ也被激活，其中RARβ在应激介导的激活过程中特异性地维持长期造血干细胞的静止状态 并且是RARα已知的下游靶点。维生素A缺乏也与造血功能受损和造血干细胞静止状态丧失有关 这与抗坏血酸缺乏的影响类似，抗坏血酸缺乏会抑制造血干细胞中的Tet2活性。 鉴于单倍体不足的TET2突变是血液系统癌症的驱动因素，并赋予造血干细胞竞争优势，如在具有不确定潜能的克隆造血(CHIP)个体中所见， 未来的研究应探索联合使用ATRA和抗坏血酸治疗以抑制癌前TET2突变造血细胞的可能性。
我们已经证明，在治疗 中有效的全反式维甲酸(ATRA) 的临床相关血浆浓度会显著增加AML细胞中TET2的表达。其他出版物描述了抗坏血酸与ATRA和/或三氧化二砷联合使用时，如何在体外 杀死AML原始细胞，并且APL患者能够安全耐受，从而提高治疗效果并延长长期生存率。 然而，这些研究并未调查ATRA单独或与抗坏血酸联合使用时的疗效机制是否依赖于TET2，也未调查这些效应是否与增强的TET酶活性相关。其他研究还探索了将ATRA 或抗坏血酸作为单一药物佐剂与其他AML疗法联合使用 ，但从未将两者作为联合治疗或在增强TET功能的背景下进行研究。在患有AML等血癌的患者中，抗坏血酸的血浆水平通常不足， 并且在小鼠模型中，维生素C缺乏与Tet2活性降低相关，这会导致白血病进展加速。 如果恢复和增强TET2活性可以阻断异常的造血干细胞自我更新并减缓白血病进展， 那么单独将ATRA与抗坏血酸联合使用，除了增强现有AML疗法的治疗效果外，还可能代表一种安全有效的治疗策略，用于预防TET2单倍体不足克隆性造血的癌前患者发生转化。
研究的局限性
尽管我们的基因模型表明，敲除RARA或TET2会消除AML细胞或白血病造血干细胞对ATRA和抗坏血酸的反应，但我们没有测试RARA和TET2是否如其他研究中所建议的那样进行直接的蛋白质 - 蛋白质相互作用。此外，我们的分析仅限于5 - 羟甲基胞嘧啶(5hmC)分析；我们没有进行全基因组范围的5 - 氟胞嘧啶(5fC)或5 - 羧基胞嘧啶(5caC)图谱分析，这可能会进一步深入了解ATRA和抗坏血酸联合治疗在白血病和非白血病或非造血背景下诱导的活性DNA去甲基化动力学。最后，对联合使用ATRA和抗坏血酸治疗的耐药机制未进行探讨，这仍然是未来研究的一个重要领域，特别是考虑到存在对ATRA治疗无反应的APL和AML患者亚群。
资源可用性
主要联系人
资源和试剂请求应发送至Luisa Cimmino (luisa. cimmino@med.miami.edu)。
材料可用性
本研究产生了新的RARA-KO AML细胞系。在合理请求并完成材料转移协议(MTA)后，可从主要联系人处获得这些细胞系。
数据和代码可用性
- 5hmc-seq、RNA-seq和ATAC-seq的FASTQ文件、带有hmC信息的CpG报告文件、ATAC-seq的BigWig和窄峰文件以及RNA-seq的原始和FPKM标准化计数文件已存入GEO(GEO: GSE241585)。
(F) 在液体培养中处理3天的AE9a + Tet缺陷型HSPCs中选定小鼠细胞表面标志物的相对MFI。平均值 标准误， 。
(G-J) 原发性患者白血病细胞(AML)或来自健康供体(HDs)的野生型CD34*细胞在液体培养中用L-AA和/或ATRA刺激7天。(G和H) 用ATRA(1 μM)处理时TET mRNA表达的基础水平(G)和变化倍数(H)。平均值 标准误，学生 检验， 。(I和J) HD CD34*和原发性患者AML细胞中CD38 MFI的代表性直方图(I)和选定细胞表面标志物的相对MFI(J)。平均值 标准误， 。双向方差分析。 ，以及 。
图6. 用视黄酸和抗坏血酸增强TET活性可抑制体内白血病进展
(A) 原发性转导的AE9a 具有各种Tet缺陷的小鼠HSPCs中TET1-3的基础mRNA表达。平均值 标准误， 。
(B和C)移植原发性AE9a* Tet缺陷型小鼠造血干细胞的小鼠在4周以及12 - 13周时外周血中的Kaplan - Meier生存曲线(B)和AE9a*细胞(C)。均值 标准误。
(D和E)二次 Tet 移植小鼠的示意图(D)以及用全反式维甲酸(ATRA)和/或抗坏血酸(ASC)处理后的Kaplan - Meier生存曲线(E)。(F)治疗开始时(0周)和治疗2周后外周血中的 细胞。均值 标准误， 。
(G)低剂量L - AA + ATRA与维奈托克、阿扎胞苷、伏立诺他和奥拉帕尼(Olap)在MV4 - 11和U - 937细胞中的Bliss协同评分。均值 标准误， 。
(H)增强TET活性与PARP抑制剂奥拉帕尼协同调节AML细胞合成致死性的潜在机制。
(I)L - AA和ATRA处理72小时后MV4 - 11和U - 937细胞中基因组5fC/5mC含量的比值。均值 标准误， 。
(图例见下页)
- 本文未报告原始代码。
- 如需重新分析本文报告的数据所需的任何其他信息，可向主要联系人索取。
致谢
我们感谢迈阿密大学西尔维斯特综合癌症中心和米勒医学院的核心设施，包括流式细胞术(FCSR；RRID:SCR02251)、生物样本库(BSSR；RRID:SCR022889)、肿瘤基因组学(OGSR；RRID:SCR022502)和癌症建模(CMSR；RRID:SCR022891)共享资源，这些资源由美国国立卫生研究院(NIH)的国立癌症研究所(NCI)资助，资助编号为P30CA240139。本研究部分得到了国立综合医学科学研究所授予L.M.的R01GM141349和R01GM146409、国立癌症研究所授予L.C.的R01CA282453以及“对抗癌症的弃儿们”对L.C.的资助。
作者贡献
T.E.L.设计、进行并分析了体外和体内实验，并参与了论文撰写。J.P.B.进行了生物信息学分析。Y.S.Y.协助进行体外实验、基因组文库制备和测序分析。A.S.K.、J.P.和E.L.A.进行了活力和分化测定。D.A.B.在M.E.F.的监督下协助进行集落形成测定，M.Q.L.、P.D.L.、A.S.以及N.B.W.在N.C.、Y.N.、H.G.D.S.、P.I.V.、R.S.、L.M.、F.B.和A.G.T.的指导下协助进行体外实验和小鼠治疗。L.C.监督实验的设计、分析和解释、项目管理以及论文撰写。
利益声明
作者声明无利益冲突。
明星方法
本文的在线版本提供了详细方法，包括以下内容:
- 关键资源表
- 实验模型与受试者详情
- 小鼠研究
- 细胞系
- 原代细胞培养
- 方法详情
- 逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和染色质免疫沉淀定量聚合酶链反应(ChIP-qPCR)
- 流式细胞术
- 组织学
- (氧化-)甲基胞嘧啶定量
- 公开可用测序数据的分析
- 高通量测序
- 酶促简化代表性5-羟甲基胞嘧啶测序
- 转座酶可及染色质分析(ATAC)测序
- RNA测序
- 交叉NGS分析
- 定量与统计分析
- 试剂与资源
补充信息
补充信息可在网上获取:https://doi.org/10.1016/j.celrep.2025.116379。
收到日期:2025年6月2日
修订日期:2025年8月26日
接受日期:2025年9月15日
发表日期:2025年10月1日
参考文献
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(K和L)三级 移植小鼠的示意图(K)以及用赋形剂、低剂量ASC + ATRA(0.25 g/kg和0.625 mg/kg)、高剂量ASC + ATRA(2 g/kg和5 mg/kg)、奥拉帕尼(25 mg/kg)或其组合(低剂量ASC + ATRA +奥拉帕尼和高剂量ASC + ATRA +奥拉帕尼)处理后的卡普兰 - 迈耶生存曲线(L)(M)治疗0周和2周时外周血中循环的AE9a 细胞。均值 标准误， 。学生 检验
，以及**** 。
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