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SOG1 NAC结构域的DNA结合和二聚化与其进行液-液相分离的能力在功能上相关联

发布时间：

2026-04-19 16:19

SOG1 NAC结构域的DNA结合和二聚化与其进行液-液相分离的能力在功能上相关联

金·米尼翁，拉尼·范德·埃肯，玛戈特·加勒，马农·德穆尔德，乔里斯·范·林特，利文·德·维尔德，亨利·德·格雷弗尔，雷米·洛里斯

布鲁塞尔结构生物学，布鲁塞尔自由大学，普勒因laan 2，B - 1050布鲁塞尔，比利时

佛兰德斯生物技术研究所 - 布鲁塞尔自由大学结构生物学中心，佛兰德斯生物技术研究所，普勒因laan 2，B - 1050布鲁塞尔，比利时

根特大学植物生物技术与生物信息学系，技术园71，9052兹温纳尔德，比利时

佛兰德斯生物技术研究所植物系统生物学中心，佛兰德斯生物技术研究所，技术园71，9052兹温纳尔德，比利时

当前地址:巴塞尔大学，生物中心，斯皮塔斯特拉斯41号，4056巴塞尔，瑞士

当前地址:神经科学系，佛兰德斯生物技术研究所 - 鲁汶大学神经生物学实验室，ON5赫雷斯街49号，邮箱602，3000鲁汶，比利时

*通信应寄往此处。邮箱:remy.loris@vub.be

前两位作者应视为共同第一作者。

摘要

液-液相分离是真核生物转录调控中的一个关键现象，导致所谓无膜细胞器的形成。虽然转录因子参与了几种类型的无膜细胞器，但尚不清楚特异性DNA结合、与DNA/RNA的多价相互作用以及凝聚是如何相互联系的。在这里，我们表明，γ反应抑制因子1(SOG1)(SOG1 )的NAC结构域，一种在植物DNA损伤反应中起核心作用的转录因子，在RNA或双链DNA存在的情况下能够在体外进行液-液相分离。这种行为以及SOG1 以序列特异性方式结合DNA的能力取决于其形成同源二聚体的潜力以及其DNA结合位点中一组正电荷的存在。含有SOG1 特异性识别的序列基序的短双链DNA片段抑制RNA介导的相分离，表明DNA和RNA存在重叠的结合位点。这可能反映了DNA和RNA结合之间的复杂相互作用，这种相互作用可能控制转录位点凝聚物的形成。

图形摘要

收到:2025年5月9日。修订:2025年12月18日。接受:2025年12月22日

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引言

许多细胞功能，如RNA代谢与加工、核糖体生物合成、基因调控以及应激反应，都涉及无膜细胞器(MLOs)的形成[1 - 5]。后者是特定大分子成分的生物分子凝聚物，通过液 - 液相分离(LLPS)过程形成。MLOs的组成通常是动态的，其成分与周围环境快速交换。它们由生物分子之间有利的多价相互作用克服了与MLOs形成相关的熵成本。

MLOs与转录调控有关，在此过程中，许多大分子，包括转录因子和RNA种类，聚集在特定的基因组位置(综述见[7])。一般来说，真核转录因子通过其折叠的DNA结合结构域识别并结合启动子或增强子序列中5 - 碱基对(bp)的特定DNA基序[8]。转录机制的其他成分，如共激活因子、调节辅因子和RNA聚合酶II，通过与真核转录因子(eFTs)内在无序的反式激活结构域的多价蛋白质 - 蛋白质相互作用被招募[9, 10]。Henninger等人提出转录凝聚物的形成受RNA介导的反馈机制控制[11]。转录起始期间产生的低浓度RNA促进凝聚，而延伸期间信使RNA(mRNA)的大量产生导致凝聚物溶解[8, 10, 11]。对转录因子LLPS的研究大多集中在其内在无序结构域。后者通常含有产生多价性的低复杂性区域，并且比折叠结构域更容易发生翻译后修饰。这两个特性已被证明是LLPS的关键(综述见[12, 13])。也观察到折叠结构域，特别是易发生LLPS的蛋白质的RNA和DNA结合结构域，会影响MLOs的形成[14 - 16]。然而，LLPS与折叠核酸结合结构域特异性或非特异性结合DNA或RNA的能力之间的联系尚不清楚。

γ反应抑制因子1(SOG1)属于一个大型的植物特有的NAC[无顶端分生组织(NAM)、拟南芥转录激活因子(ATAF)、杯状子叶(CUC)]转录因子家族，其在生长发育或对非生物和生物胁迫的响应中发挥作用[17, 18]。其中，SOG1在模式植物拟南芥中激活超过300个参与DNA修复、细胞周期停滞或凋亡的基因，以响应DNA损伤[19, 20]。该蛋白质由一个155个氨基酸(AAs)的保守折叠DNA结合结构域(称为NAC结构域)组成，后面跟着一个高度可变的C末端结构域，该结构域是内在无序的[21, 22]。SOG1包含一个额外的57个AA延伸，其功能未知，大多数其他NAC转录因子中没有[19, 23]。SOG1的转录激活功能由DNA损伤传感激酶共济失调 - 毛细血管扩张突变(ATM)和共济失调与RAD3相关(ATR)对五个丝氨酸 - 谷氨酰胺(SQ)位点的磷酸化以及一个单一的酪蛋白激酶2依赖性位点的磷酸化控制[24 - 27]。

在本研究中，我们研究了拟南芥SOG1折叠的NAC结构域的体外DNA结合(从现在起将其称为SOG1 )。接下来，我们将其特异性双链DNA(dsDNA)结合与其形成功能性同源二聚体的潜力以及其经历DNA和RNA驱动的LLPS的能力联系起来。总之，我们研究了SOG1NAC二聚化、特异性和非特异性DNA/RNA结合以及相分离行为潜力之间的假定相关性。我们得出结论，SOG1的NAC结构域在RNA和dsDNA存在下会发生LLPS，并认为这种潜力需要完整的DNA结合位点和二聚体的形成。

材料与方法

蛋白质和核酸

本文中使用的SOG1氨基酸序列对应于UniProt登录号Q6NQK2。SOG1 NAC结构域范围为L58至Q212。使用Al-phaFold3 [28]预测了与pBRCA1 31 bp寡核苷酸复合的SOG1 的结构。

本文各种实验中使用的DNA序列概述可在表1中找到。这些序列的单链DNA(ssDNA)寡核苷酸(及其反向互补序列)以及使用的称为聚腺苷酸钾盐(poly-A，CAS编号:27416-86-0)的mRNA替代物购自Sigma-Aldrich。拟南芥mRNA由植物系统生物学中心(比利时根特大学植物系统生物学中心，VIB，Technologiepark 71，9052 Zwijnaarde)惠赠。

SOG1 构建体及其突变体的克隆

在SOG1 的基因序列前加上组氨酸标签，由金斯瑞公司通过限制性连接(NcoI和BamHI)合成并克隆到pET-11d载体中。对该克隆进行位点特异性诱变以获得三个SOG1 突变体克隆:SOG1 、SOG1 和SOG1 。与野生型(WT)SOG1 相比，SOG1 突变体蛋白缺少前六个氨基酸(ΔL58-K63)。SOG1 NAC-RKRR突变体包含以下四个突变:R79A、K80A、R81A和R82A。SOG1 NAC-DNA链突变体包含以下五个突变:R93S、H95S、T97A、R99S和T100S。为了获得这三个突变体克隆，设计了特定的突变引物组(补充表S1)。将突变的反向引物与含有XbaI限制性位点的正向引物(“XbaI FW”)结合使用，以扩增pET-11d载体同源区域上游突变处的克隆序列。将突变的正向引物与具有突变BamHI限制性位点至Acc651的反向引物(“BamHI(至Acc651突变)RV”)结合使用，以扩增pET11d载体同源区域下游突变处的SOG1 克隆序列。通过使用引物XbaI FW和BamHI(至Acc651突变)RV的重叠PCR，获得了带有标签的突变体的完整编码序列。随后，通过Gibson组装将构建体克隆到pET-11d载体的XbaI和BamH1位点。用限制性内切酶Acc651选择阳性菌落，并通过Sanger测序确认正确插入。

SOG1 NAC结构域及其突变体的表达和纯化

用携带SOG1NAC或其突变体基因序列且N端带有组氨酸标签的pET - 11d载体转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，接种于含氨苄青霉素的1升LB培养基中，并在下培养，直至达到为0.6 - 0.8。通过添加0.5 mM异丙基 -D-1-硫代半乳糖苷诱导蛋白质表达，培养物在温度下孵育，WT SOG 和SOG1 突变体孵育，SOG1 -RKRR和SOG1 突变体孵育。次日早晨通过离心收集细胞，但SOG1NAC - DNA链突变体除外，其孵育时间足以实现最佳表达。将2升细菌培养物的沉淀重悬于裂解缓冲液 (pH 7.5的Tris、500 mM NaCl、10%甘油、2 mM咪唑、 -巯基乙醇)中，并补充蛋白酶抑制剂片剂[无乙二胺四乙酸(EDTA)的Complete ULTRA片剂，罗氏公司]。重悬的沉淀立即用于纯化，或速冻并储存在直至使用。

表1. 本文中使用的DNA寡核苷酸序列

名称	序列
*pBRCA1 99碱基寡核苷酸	GGTATATAGATAGATAGATGACGAAGCGTGTCCTTCAAAGAGGGCTTCC- CTTGAAAGCTTTACAGACTAAATAAAAAGCGCCAAATTTTCATCTACTTCA
*pBRCA1 49碱基寡核苷酸	GCGTGTCCTTCAAAGAGGCTTCCCTTGAAAGCTTTACAGACTAAATAAA
*pBRCA1 31碱基寡核苷酸	TCAAAGAGGCTTCCCTTGAAAGCTTTACAGA
*pBRCA1 27碱基寡核苷酸	AAAGAGGCTTCCCTTGAAAGCTTTACA
*pBRCA1 23碱基寡核苷酸	AGAGGCTTCCCTTGAAAGCTTTA
*pBRCA1 17碱基寡核苷酸	GGCTTCCCTTGAAAGCT
*pBRCA1突变体	TCTGTAAAGACGTCAAGGGCGACCTCTTTGA
31个碱基对的寡核苷酸
*随机生成的非靶向49 碱基寡核苷酸	TAGTGCGCTAATCTGAGTCGAAATAAAATCACCAGTACCCAAAACCAGGG
*随机生成的非靶向31 碱基寡核苷酸	GTCGGCGATGGTGGTAACTAATTATGTTCCT
*设计的寡核苷酸1	TCTGTAAAGCTTTCAAGGGAAGCCTCTTTGACGTAACAGAAACCCCG-
*设计的寡核苷酸1	GAGTAAGCTCCCGTGGGTCTGTAAAGCTTTCAAGGGAAGCCTCTTTGA
*设计的寡核苷酸2	TCTGTAAAGCTTTCAAGGGAAGCCTCTTTGACGTAACAGAAACCCCG-
*设计的寡核苷酸2	GAGTAAGCTCCCGTGGGGTCGGCGATGGTGGTAACTAATTATGTTCCT
*pRAD51 31碱基寡核苷酸	TAATCGAGACTTGTTGAAGAAGCCTTTGCCC
*pRAD51突变体	TAATCGAGATCCGTTGAAGGGACCTTTGCCC
31个碱基对的寡核苷酸
*pSMR5 97碱基寡核苷酸	TACCTAGCAACTTCCAGAACAAGCTACGGTCACTTCCAAAACTAGTGT
	AATAAAGAAGCAATCTAATTAAGAACCTTATTAGGAAAGTGCGAGAGAG
*pSMR5位点1(反向互补)	TGACCGTAGCTTGTTCTGGAAGTTGCTAGGT
*pSMR5位点2(反向互补)	TTAGATTGCTTCTTTATTACACTAGTTTTGG
*pSMR5位点3	ATTAAGAACCTTATTAGGAAAGTGCGAGAGA
*pXRI1 31碱基寡核苷酸	ATAAAAAGCTTCTCTTGCAATTCTCTCTTCC
*pTKa1 31碱基寡核苷酸	TGACAAATCTTCTCCAGCAATTTTCTTCCTT
pBRCA1 310碱基正向引物	AGTAATGGGTTCAAATCTTGC
pBRCA1 310碱基反向引物	TTCTCTTCCCATCCTCTCC
pUBQ10 293碱基正向引物	CTTTCTCTCAATTCTCTCTACC
pUBQ10 293碱基反向引物	CACAAACTAGAAACTAACACC

将该序列的单链DNA寡核苷酸与其反向互补序列退火，以获得名称中提到的特定长度(碱基对，bp)的双链DNA寡核苷酸。

CTT(N7)AAG “小田基序” 的六个CTT-AAG核苷酸或这些核苷酸的变体以粗体显示。突变的核苷酸用斜体书写。两个 “设计寡核苷酸” 中重复出现的31 bp寡核苷酸加下划线。pSMR5 97 bp寡核苷酸中的三个23 bp潜在结合位点也加下划线。RC = 反向互补序列，以便更清楚地表示结合基序。

解冻后，在加入和脱氧核糖核酸酶后，将沉淀在室温下旋转孵育20分钟。此后，使用VCX-70 Vibra Cell(Sonics)超声处理细胞，设置开/5秒关的循环，振幅为。接下来，样品在下以的转速离心。将上清液通过过滤，并加载到预先用裂解缓冲液平衡的 HisTrap™ HP柱(Cytiva)上。加载样品后，用裂解缓冲液洗涤柱子。当稳定后，应用6个柱体积(CV)的2%、6个CV的50%和6个CV的100%洗脱缓冲液(50 mM Tris，pH 7.5，500 mM NaCl，10%甘油，1 M咪唑，2 mM β-巯基乙醇)的梯度洗脱结合的蛋白质。将含有目标蛋白(POI)的洗脱级分加载到用凝胶过滤缓冲液(20 mM NaPi，pH 7.5，150 mM NaCl，1 mM三(2-羧乙基)膦(TCEP))平衡的Superdex 75 16/90柱(GE Healthcare)上。收集POI的峰级分，快速冷冻，并储存在。

圆二色性

通过透析将蛋白质样品缓冲液交换至 7.5)。使用1毫米石英比色皿(Hellma)在Biologic MOS-500旋光仪上对POI样品进行圆二色性(CD)光谱分析，POI浓度为。在以及波长范围从190至，步长为的条件下收集光谱。从原始CD数据(均以mdeg为单位的 )中减去缓冲液光谱，并使用以下公式将所得CD光谱归一化为中以摩尔椭圆度表示: ，其中MW为以为单位的分子量，为浓度，为比色皿光程长度，为氨基酸数量。

分析型尺寸排阻色谱法

在使用和三(2-羧乙基)膦(TCEP)平衡的Superdex 75 Increase 10/300柱(通用电气医疗集团)上进行分析尺寸排阻色谱(SEC)。对于每个感兴趣的蛋白质(POI)，以的浓度将的蛋白质上样到柱中。在单独的一次运行中，在与所研究蛋白质样品相同的条件下上样的Bio-Rad凝胶过滤标准品。根据标准品中蛋白质的洗脱体积，确定溶液中蛋白质的表观分子量(MW)。表观分子量与保留因子具有以下线性关系[29]:

后者由以下公式确定: ，其中为洗脱体积，为空隙体积，为柱总体积。对于每个SEC设置，通过绘制标准品中蛋白质(牛甲状腺球蛋白、牛球蛋白、鸡卵清蛋白、马肌红蛋白和维生素B12 )的MW值的对数作为其值的函数，并通过这些数据点拟合线性回归曲线(使用最小二乘法)来定义确切的线性关系。最后，使用回归曲线方程，根据蛋白质的洗脱体积确定溶液中蛋白质的表观分子量。

动态光散射

使用DynaPro NanoStar(怀亚特)设备进行动态光散射(DLS)测量，并使用DYNAMICS 7.10.1.21软件分析数据。通过向经旋转过滤的SOG1NAC中添加聚腺苷酸以诱导液-液相分离(LLPS)来跟踪液滴的生长。设置了具有以下反应条件的反应一式三份: 蛋白质和聚腺苷酸在磷酸盐缓冲液中，，以及三(2-羧乙基)膦(TCEP)。在室温下，每隔对测量的五次采集。

电泳迁移率变动分析:常规和标记

在电泳迁移率变动分析(EMSA)实验中使用的未标记双链DNA片段，是通过在将两条用于的互补单链DNA寡核苷酸杂交，随后让样品缓慢冷却至室温(持续时间 )获得的。在将不同浓度的POI和杂交双链DNA在磷酸钠(pH 7.5)、150 mM氯化钠和1 mM三(2-羧乙基)膦中混合。结合反应在于总体积中进行。此后，向每个样品中加入上样染料( - 聚蔗糖，0.1%二甲苯青和0.1%溴酚蓝)。样品在使用 TBE( Tris碱，硼酸，2.5 mM乙二胺四乙酸)制备的13%非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，该凝胶在预电泳30分钟。电泳在进行，直到迁移最快的染料到达凝胶长度的三分之二处。凝胶用溴化乙锭染色或用GelRed 进行DNA可视化。

对于使用的放射性EMSA，使用了一个单端标记且长度为的99bp DNA片段。该片段的单链DNA寡核苷酸首先通过T4多核苷酸激酶(Fermentas)用 - ATP(PerkinElmer)进行标记。接下来，使用先前描述的方法将标记的单链DNA寡核苷酸与互补寡核苷酸杂交以获得双链DNA。随后，如[30]中所述，从凝胶(6%聚丙烯酰胺凝胶电泳)中纯化杂交的、标记的双链DNA片段。在磷酸钠(pH 7.5)、1 M三(2-羧乙基)膦和50、150、300或500 mM氯化钠中混合不同浓度的SOG1NAC和每分钟15000计数的标记DNA。结合反应在于总体积中进行25分钟。加入上样染料(25%聚蔗糖，0.1%二甲苯青和0.1%溴酚蓝)后，样品在使用 TBE( Tris碱，硼酸，2.5 mM乙二胺四乙酸)制备的10%聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，该凝胶在预电泳。电泳在进行，直到迁移最快的染料到达凝胶底部。使用X射线敏感胶片进行可视化。

等温滴定量热法

在MicroCal PEAQ - ITC系统(马尔文仪器公司)上于并在以及三(2 - 羧乙基)膦(TCEP)存在的情况下进行等温滴定量热法(ITC)测量。将DNA样品(以与未标记的电泳迁移率变动分析实验相同的方式获得)以6至的浓度范围加载到样品池中。蛋白质样品以155至的浓度范围加载到注射器中。对于测量，使用10微卡/秒的参考功率和750转/分钟的搅拌速度。每次测量包括20次的注射，注射间隔为，在第一次0.4 的测试注射之前进行。在每次运行开始之前，包括的初始延迟。为了进行数据积分并确定所得结合等温线的最佳拟合结合模型，使用了MicroCal Peaq - ITC分析软件(版本1.41，马尔文帕纳科分析公司)。在所有情况下，使用“一组位点”模型来拟合结合等温线，假设存在单个结合事件DNA(双链体)+ SOG1(二聚体) DNA(双链体)- SOG1(二聚体)。描述此模型的方程在马尔文Microcal PEAQ - ITC用户手册(https://www.malvernpanalytical.com/en/learn/ knowledge - center/user - manuals/man0573en)中提供。化学计量和热力学参数作为三次重复测量的平均值得出，误差确定为与各自平均值的平均偏差。

浊度测定

在具有透明底部的非结合384孔黑色微孔板(格瑞纳生物 - 1公司，μClear®)中，对总体积为的混合蛋白质和聚A样品在390和处进行三次重复吸光度测量。尽管通常使用600纳米来监测液 - 液相分离(LLPS)，但选择了390纳米的较短波长以提高检测较小凝聚物的灵敏度。在室温下，在磷酸盐缓冲液、68 mM氯化钠和0.45 mM TCEP中，使用SynergyTM Mx酶标仪进行测量。在开始测量前至少，通过添加聚A诱导相分离。

显微镜观察

使用连接到Leica DFC7000 GT相机的徕卡DMi8显微镜观察液滴形成。在具有透明底部的非结合384孔黑色微孔板(格瑞纳生物 - 1公司，μClear®)中制备体积为 ( 磷酸盐，pH 7.5，，0.5 mM TCEP或9.1 mM磷酸盐，pH 7.5，68 mM氯化钠，0.45 mM TCEP)的反应，其中含有荧光标记的蛋白质和/或核酸以及过量的未标记分子。在用油浸物镜观察之前，将板在冰上孵育。SOG1 蛋白及其突变体根据制造商的方案用DyLight 488(赛默飞世尔科技 )标记。聚A使用pCp - Cy5(耶拿生物科学公司)和T4 RNA连接酶(赛默飞世尔科技 )用Cy5标记。Cy5标记的DNA寡核苷酸购自Integrated DNA Technologies公司。使用异硫氰酸荧光素滤光片检测绿色荧光。使用罗丹明滤光片检测红色荧光。所有实验均重复进行两次。

图1. SOG1 在体外与DNA(2 μM)特异性结合。(A)位于pBRCA1上的结合基序以及SOG1 与pBRCA1 DNA的49 bp双链DNA片段(该基序位于其中央)和随机生成的非靶标双链DNA的50 bp片段的电泳迁移率变动分析(EMSA)。(B)SOG1 与长度递减的pBRCA1双链DNA寡核苷酸的EMSA，所有寡核苷酸中央均含有结合基序。(C)SOG1 与野生型和突变型pBRCA1的31 bp双链寡核苷酸的EMSA。(D)SOG1 NAC与野生型和突变型pRAD51的31 bp双链寡核苷酸的EMSA。

光漂白后荧光恢复

样品制备与上述显微镜实验中所述的相同。首先，每隔拍摄10张漂白前图像。接下来，用强度为的激光进行50毫秒的漂白。最后，每秒记录一次漂白后图像，持续。对含有聚A、mRNA或BRCA1启动子序列(310 bp)的五个液滴进行光漂白后荧光恢复(FRAP)实验。

生物层干涉术

使用Octet 96 Red仪器在室温下1000 rpm振荡的条件下，于含有75 mM NaCl、0.5 mM TCEP且pH为7.5的磷酸盐中进行使用核酸、DNA和RNA以及感兴趣蛋白(POI)诱饵的生物层干涉术(BLI)竞争分析。将镍 - 氮三乙酸(Ni - NTA)生物传感器(赛多利斯公司)用的组氨酸标签化的加载，以获得4至的偏移，随后在缓冲液中基线保持。接下来，进行聚A与的结合以及与不同浓度的BRCA1或随机31个非靶标寡核苷酸的第二次结合。使用Octet 数据分析软件对值进行拟合。选择部分拟合选项，通过2:1异质配体模型对从10到的窗口中的解离进行拟合。

结果

SOG1 二聚体在体外与DNA特异性结合

拟南芥SOG1在体内的DNA结合特异性先前已被研究[19, 20]。通过染色质免疫沉淀测序(ChiP - seq)和微阵列实验，小田等人提出回文共有序列CTT(N) AAG作为SOG1的基本结合基序[19]。然而，这个“小田基序”仅出现在51%的已鉴定SOG1靶标中，这些作者认为不存在或不完美的“小田基序”的靶标是间接靶标。在另一项研究中，布尔布瑟等人鉴定出在基因毒性应激响应中被SOG1上调的基因组启动子中存在的富集序列基序，作为潜在的SOG1结合位点(补充图S1)[20]。这些“布尔布瑟基序”彼此相似，比纯CTT(N) AAG共有序列限制更少，允许其变化并在CTT和AAG三联体之外有一些更弱的偏好。

为了在体外证实这些体内实验结果，我们使用SOG1NAC和BRCA1基因启动子(pBRCA1)的一个49 bp双链片段进行了电泳迁移率变动分析(EMSA)实验，pBRCA1是植物中已确定的SOG1靶点(图1A和表1)[19]。片段包含严格的CTT(N) AAG Ogita基序，并且也与Bourbousse基序匹配(补充图S1)。SOG1NAC显示出与pBRCA1片段的特异性结合，但不与缺乏Ogita和Bour - bousse基序的相同长度的随机生成的双链DNA片段结合(表1)，从现在起称为非靶标DNA(图1A)。对于后者，仅可见一个瞬时的蛋白质 - DNA复合物，其可能是通过带负电荷的DNA与整体带正电荷的NAC结构域之间的非特异性静电相互作用形成的(图2D)。在过量SOG1 存在的情况下，pBRCA1 DNA也可见这种复合物(图1A)。

图2. SOG1 二聚体以纳摩尔亲和力与pBRCA1 DNA结合。(A，B)分别用31 bp的pBRCA1双链寡核苷酸(包含符合要求的结合位点)和随机生成的31 bp非靶标双链DNA片段对SOG1 进行等温滴定量热法(ITC)分析。上图显示原始热图；下图显示积分热图。所示的化学计量比(蛋白质二聚体) 和值是三次测量的平均值(两次生物学重复和一次技术重复)。(C)SOG1 NAC与靶标31 bp pBRCA1 DNA结合的特征图，显示三次测量(两次生物学重复和一次技术重复)的平均ΔG、ΔH和―TΔS值。(D)如AlphaFold3预测的，与双链DNA复合的SOG1NAC二聚体的表面电荷图。

通过探测两个设计的95 bp双链DNA寡核苷酸，进一步证实了SOG1 对pBRCA1片段上结合位点的特异性:一个包含通过随机接头连接的两个31 bp pBRCA1结合位点，另一个包含仅一个这样的31 bp位点，通过相同接头连接到一个31 bp非靶标DNA片段(表1和补充图S2)。获得的数据表明，SOG1 特异性靶向pBRAC1片段上的结合位点，因为第一个DNA寡核苷酸存在两条特异性结合的蛋白质 - DNA复合物条带，而第二个寡核苷酸仅观察到一条条带。

使用长度递减的片段进一步确定了SOG1 在pBRCA1上的结合位点。SOG1 NAC结合位点的最小长度在17至23 bp之间(图1B和表1)。在CTT(N) AAG Ogita基序中被接头隔开的六个CTT - AAG核苷酸似乎对pBRCA1的结合至关重要，因为其中的突变仅导致弱的非特异性结合(图1C)。当在RAD51启动子片段的背景下对该基序进行突变时，也得到相同的结果。后者也是一个已证实的SOG1靶点，并且包含一个符合Bourbousse基序的结合基序，包括CTT(N) AAG序列(图1D、补充图S1和表1)。特异性DNA结合的丧失可能解释了为什么植物中RAD51启动子中的相同突变在遗传毒性胁迫下导致拟南芥转基因植物出现ΔRAD51表型[19]。

SOG1NAC以纳摩尔亲和力作为二聚体与pBCRA1结合

一般来说，NAC转录因子形成同型二聚体并以二聚体形式结合DNA。使用分析型尺寸排阻色谱法(SEC)，测定溶液中SOG 的表观分子量为55.7 kDa(补充图S3A)。该值大于同型二聚体的理论值，这可能是由于SOG1 二聚体的非球状形状所致。为了评估SOG1 与DNA相互作用的化学计量和亲和力，对含有结合位点的31 bp pBRCA1双链寡核苷酸和相同长度的非靶标双链DNA片段进行了等温滴定量热法(ITC)实验(图2A和B)。ITC结果证实了在电泳迁移率变动分析(EMSA)实验中观察到的SOG1 对pBRCA1 DNA的特异性。此外，结果表明NAC结构域与DNA的结合是一个放热反应，并且SOG1 以二聚体形式结合到DNA上，这与其他NAC转录因子的行为一致[31,32]。解离常数被确定为，并且该反应是由焓驱动的(图2A和C)。与pBRCA1 DNA结合的SOG1 NAC的AlphaFold3结构预测表明，NAC表面的一组正电荷参与DNA结合(图2D)，这与之前对ORE1的观察结果类似[32]。这些带正电荷的区域被认为导致了在EMSA实验中观察到的非特异性、瞬时DNA结合。因此，改变缓冲液盐含量从而改变离子强度会影响SOG1NAC与pBRCA1之间相互作用的亲和力(补充图S4)。

SOG1 特异性靶向布尔布索结合基序

严格的CTT(N) AAG荻田基序仅覆盖了体内鉴定的SOG1靶标的一半，这表明仅该基序的存在不足以作为SOG1结合唯一前提条件。相比之下，布尔布索基序更为复杂。

到目前为止，本研究中广泛使用的pBRCA1位点与荻田基序以及所有三个布尔布索基序都匹配。SOG1的另一个体内靶标SMR5基因(pSMR5)的启动子区域包含三个潜在的SOG1结合位点(表1和图3A)[19, 33]。其中，位点1包含CTT(N) AAG荻田基序，并且也与布尔布索基序兼容。位点2不包含CTT(N) AAG，但仍然与一个布尔布索基序兼容。最后，位点3再次包含CTT(N) AAG荻田基序，但在CTT和AAG三联体之间七个核苷酸的(较弱)序列偏好背景下，与任何布尔布索基序的兼容性较差(补充图S1)。用pSMR5双链DNA进行的EMSA显示出两条蛋白质 - DNA复合物带，表明仅存在两个功能性结合位点(图3A)。为了检测结合到哪两个位点，用较短的双链DNA片段进行EMSA，每个片段包含三个推定结合位点之一(图3B)。这些结果表明SOG1 仅结合到包含已鉴定布尔布索基序的两个位点。对于位点3，即使存在CTT(N) AAG序列，也未观察到特异性结合，这表明相邻核苷酸在SOG1特异性中起作用。同样，位点2确实与相互作用，即使荻田共有序列不完美。

图3. Bourbousse鉴定出的基序最能描述SOG1 结合位点。(A) pSMR5上存在的假定结合基序:位点1和位点2包含Bourbousse基序，而位点1也符合Ogita基序。位点3仅包含一个Ogita基序。用包含所有三个位点的pSMR5的95 bp双链DNA片段对SOG1 NAC进行电泳迁移率变动分析(EMSA)。(B) 用pSMR5上存在的三个假定结合位点的31 bp双链DNA片段对SOG1 进行EMSA，结果显示其仅对Bourbousse基序有亲和力。(C) pXRI1和pTKa1上存在的结合基序，二者均包含一个Bourbousse基序，但不包含严格的CTT(N) AAG Ogita基序。用pXRI1和pTKa1的31 bp双链DNA片段对SOG1 进行EMSA。

利用XR1和TKA1启动子片段(pXRI1和pTKa1)进行的电泳迁移率变动分析(EMSA)实验进一步证实了Bourbousse基序是SOG1 的真正相互作用位点。这两个体内SOG1靶点均包含Bourbousse基序(补充图S1)，但不包含严格的CTT(N) AAG基序(基序最后一位发生G到T的替换；图3C)[19]。SOG1NAC能够以与pBRCA1结合位点相似的亲和力结合这两个双链启动子片段。这证实了Bourbousse及其同事定义的更通用的基序能更好地描述SOG1的靶点结合位点，而严格的CTT(N) AAG共有位点限制过严。CTT(N) AAG基序周围的其他碱基对可能也起作用，在此背景下该基序的变体也是可能的。

SOG1 NAC在体外经历核酸驱动的相分离

为了更好地理解我们所观察到的现象，即纯化的SOG1 与核酸的混合物会随着时间的推移而变浑浊，我们在将SOG1 与聚腺苷酸RNA混合后，测量了处的光密度。SOG1 呈现出一种许多相分离蛋白典型的浑浊度变化曲线: 先增加，随后下降并稳定至基线水平(图4A)[34]。从这些数据中，可以观察到一种折返相行为。在与时间的关系曲线中达到的最大值随着聚腺苷酸浓度的升高而增加，但从聚腺苷酸浓度在100至之间开始下降，直到信号最终无法检测到(图4B)。使用荧光显微镜确认了不同蛋白质和聚腺苷酸浓度下球形液滴的形成(图4C和补充图S5)。通过双色标记，证明SOG1 和聚腺苷酸共整合到液滴中(图4D)。有趣的是，观察到了具有空心壳状荧光模式的液滴和具有均匀实心荧光模式的液滴(图4E)。离子强度的变化确实会影响SOG1 -聚腺苷酸混合物的浑浊度曲线，这表明静电相互作用参与了相行为(图4F)，这在DNA结合实验中也有观察到。与68至之间的盐浓度相比，含有150 mM NaCl的更高盐浓度下观察到浑浊度大幅下降。通过动态光散射(DLS)绘制了的液滴随时间的生长情况(图4G)。流体动力学半径随时间的变化在最初的阶段遵循奥斯特瓦尔德熟化过程[35]，突出了最初形成的液滴的动态和类似液体的性质[36]。2小时后，液滴尺寸稳定。对10分钟龄的反应进行荧光恢复后光漂白实验(FRAP)显示，漂白后的恢复有限(图4H)。为了排除周围未漂白蛋白质数量不足可能限制恢复的可能性，液滴仅进行了部分漂白。漂白区域的恢复曲线与完全漂白的液滴相似，两种情况下恢复百分比平均高达 (补充图S6A)。应该注意的是，对于一部分液滴(约25%)，主要在其外层观察到恢复(补充图S6B)，这让人想起前面提到的具有壳状荧光模式的液滴。壳层、核心和整个液滴的恢复平均值分别达到28.8%、20.6%和17.3%。这表明虽然凝聚物中存在大量可移动部分，但也存在较少可移动部分。然而，在某些情况下，内部和壳层的荧光会随着时间变得更加均匀。

为模拟更具生物学相关性的条件，调整了缓冲液条件，并使用植物源mRNA而非聚腺苷酸进行实验。除单价盐外，缓冲液中还添加了二价阳离子，因为镁在核酸凝聚中尤其起着关键作用[37]。镁调节涉及SOG1 和聚腺苷酸RNA的凝聚物形成，浓度升高会导致形成更少、更小的凝聚物。在和的生理相关条件下，凝聚明显减少(图5A)。有趣的是，当使用mRNA时，在这种生理条件下凝聚受到的干扰较小(图5B)。此外，荧光漂白恢复技术(FRAP)表明，这些由mRNA驱动的凝聚物具有高动态性，恢复百分比达到约80%(图5C)。

接下来，我们研究了向SOG1 中添加双链DNA是否同样能诱导相分离。使用的DNA片段包括BRCA1的完整310 bp启动子序列、包含Ogita/Bourbousse结合基序的31 bp pBRCA1双链寡核苷酸以及非靶向管家基因UBQ10的293 bp启动子(图6A)。在SOG1 与短的31 bp pBRCA1片段的混合物中形成了小凝聚物，而在存在较长的310 bp片段或293 bp非靶向序列时形成了壳状液滴和不规则的非球形结构。双链DNA浓度越高，存在的非球形凝聚物就越多(图6B)。此外，在更相关的生理条件(150 mM NaCl和5 mM )下，确实与DNA(BRCA1 31 bp)发生了相分离(图6C)。有趣的是，FRAP实验证实了那些不规则形成的凝聚物具有动态行为，在某些情况下2分钟后恢复率约为80%(图6D和E)。并非所有凝聚物似乎都具有那么高的动态性，也观察到了仅20%的恢复率。通过荧光显微镜和不同孵育时间后的FRAP实验绘制了凝聚物的成熟过程。在5和后，恢复百分比呈现出广泛的分布，表明早期凝聚物成熟存在异质性。相比之下，对于30和60分钟，恢复值收敛到一个更窄的范围(图6F)。从形态学上看，在较早时间点看到的不规则形状的凝聚物随着孵育的进行逐渐转变为大的球形液滴(图6G)。这表明孵育30分钟后凝聚物成熟导致结构和动态均匀性增加。

双链DNA、聚腺苷酸和mRNA驱动的液-液相分离(LLPS)之间恢复率的这种差异可能表明内部结构不同。这可能与SOG1对不同RNA和DNA伙伴的亲和力差异有关。实际上，SOG1 对聚腺苷酸的结合亲和力高于对用作明显亲和力的短DNA片段，从用2:1(异质配体)结合模型拟合的生物层干涉(BLI)数据中获得了皮摩尔的亲和力(数据未显示)。由于复合物稳定性增加，升高的结合亲和力通常与构象动力学降低相关。然而，由于结合模型未知，所获得的亲和力应谨慎考虑。还应考虑到，在多价系统中，诸如亲合力、协同性(正或负)、局部浓度效应以及结合位点之间的空间接近度等因素会显著影响所测量的亲和力。

SOG1 NAC结构域的二聚化是球形液滴形成和适当DNA结合所必需的

接下来，我们研究了二聚化对于SOG1NAC与DNA结合及相分离行为是否必要。基于SOG1NAC二聚体的AlphaFold3结构预测，设计了一个缺失N端 -链(ΔL58-K63)的截短突变体，现称为SOG1 (补充图S7A)。使用分析型尺寸排阻色谱法测得，SOG1 蛋白的估计分子量为19.8 kDa，这证实其处于(球状)单体状态，与之形成对比的是，未截短的SOG1 以二聚体形式洗脱(补充图S3A)。SOG1 和SOG1 的圆二色光谱相似，在220 nm左右有一个负峰，表明这两种蛋白质中主要存在 -折叠(补充图S3B)。

图4. SOG1 的RNA依赖性相行为。(A)在390 nm下NAC的浊度随时间变化曲线(左图，个生物学重复，每个生物学重复有个技术重复)以及基于浊度曲线绘制的不同聚腺苷酸浓度下NAC的相图(右图，个技术重复)。(B) 与聚腺苷酸浓度的关系:随着聚腺苷酸浓度增加，信号呈现再入相行为，当聚腺苷酸浓度更高时信号再次下降。不同浓度聚腺苷酸RNA存在下，DyLight488标记蛋白(SOG1 、SOG1 突变体、SOG1 突变体和SOG1 )的显微镜图像(比例尺；在个生物学重复中观察到类似结果)。(D)DyLight488标记的NAC与Cy5标记的聚腺苷酸RNA在球形液滴中共整合的荧光显微镜图像(比例尺；在个生物学重复中观察到类似结果)。(E)未标记聚腺苷酸存在下，DyLight488标记的NAC形成的壳状和完全着色的液滴。(F) 吸光度与NaCl浓度的关系，用于 SOG1 和聚腺苷酸不同浓度(5、20和40 μM)的SOG1 的反应。(G)20 μM SOG1 和25 μg/ml聚腺苷酸反应的液滴生长情况，随后进行动态光散射分析( 个技术重复；在个浓度略有不同的生物学样品中观察到类似结果)。(H)20 SOG 和聚的液滴的荧光恢复后漂白分析(比例尺个生物学重复，每个生物学重复有个技术重复)。

图5。(A) 在存在25 μg/m1聚腺苷酸RNA的情况下，不同浓度和的20 μM DyLight488标记的SOG1 的荧光显微镜图像(比例尺；在次技术重复中观察到类似结果)。(B) 在存在 mRNA的情况下，不同浓度NaCl和MgCl 的 DyLight488标记的SOG1 的荧光显微镜图像(比例尺；在次技术重复中观察到类似结果)。(C) 含有 SOG 和 mRNA 的液滴的荧光恢复动力学分析(FRAP)。

尽管SOG1NACA1 - 6是单体，但它仍与31 bp的pBRCA1双链寡核苷酸结合，但其亲和力低于野生型SOG1 (图7A和B)。由于SOG1 蛋白在用于此实验的较高浓度下会沉淀，因此无法通过等温滴定量热法(ITC)进一步评估其亲和力和化学计量比。这意味着二聚化对于分离的NAC结构域的内在稳定性是必需的。亲和力的降低可能是由于单体的独立结合，与通过稳定二聚体产生的亲合力相比，尽管SOG1 较低的热力学稳定性也可能起作用。

SOG1NACΔ1 - 6表现出改变的液 - 液相分离行为，因为在存在聚腺苷酸的情况下不再观察到球形液滴的形成。相反，形成了不规则结构，类似于凝胶状凝聚物或纤维[38](图4C和补充图S5)。如在ITC实验中观察到的，蛋白质在高蛋白浓度下可能开始聚集。这可能在凝聚开始后蛋白质浓度增加时立即发生。在存在DNA的情况下，相分离再次出现缺陷。没有观察到球形液滴，但偶尔会出现非球形结构。这表明二聚化对于RNA或/和DNA驱动的液 - 液相分离形成球形液滴是必需的。

SOG1 的两个带正电荷的簇将DNA结合与RNA和DNA驱动的液 - 液相分离联系起来

与31 bp pBRCA1片段结合的SOG1 的AlphaFold3结构预测显示，有两个富含带正电荷氨基酸的片段，由于它们靠近构成目标结合位点的核苷酸，可能决定了DNA特异性。这些片段是一个包含R136 - R139残基的环和一个包含R150 - T157残基的 -链(这些残基位于全长蛋白质上)(补充图S7B和C)。ANAC019和ORE - 1的NAC结构域中的相应片段在氨基酸序列上有所不同，但也构成了DNA结合位点[31,32]。设计了在这两个假定的DNA结合片段中携带突变的两个突变体。对于这两个突变蛋白，正电荷被突变为不带电荷的氨基酸。本文中提到的第一个突变体是SOG1NAC - RKRR突变体，其具有以下突变:R79A、K80A、R81A和R82A。第二个称为SOG1NAC - DNAstrand突变体，其突变位点为R93S、H95S、T97A、R99S和T100S，这些突变位于对接至DNA大沟的 -链中。两个突变体的CD光谱与野生型SOG1 蛋白的光谱非常相似，表明折叠正确(补充图S3B)。在分析型尺寸排阻色谱中，两者的洗脱体积与野生型SOG1NAC大致相同:SOG1NAC - RKRR和SOG1NAC - DNAstrand突变体的表观分子量分别为67.4和。因此，我们假设，与SOG1NAC一样，突变体在溶液中保持形成同二聚体的能力(补充图S3A)。

图6. SOG1 及其突变体与pBRCA1 31 bp寡核苷酸的DNA驱动相分离(A)，以及与不同浓度的BRCA1靶标启动子序列的靶标与非靶标DNA启动子序列(B)(比例尺；在次生物学重复中观察到类似结果)。在所有情况下蛋白质浓度均为。(C)在不同浓度的NaCl和MgCl 存在下，12.5 μg/ml BRCA1 31 bp DNA寡核苷酸存在时 DyLight488标记的SOG1 的荧光显微镜图像(比例尺 )(D，E)10分钟后20 μM NAC和12.5 μg/ml BRCA1启动子序列(310 bp)的凝聚物的荧光恢复率分析(比例尺生物学重复，每个重复有次技术重复)。(F)20μM NAC和12.5μg/mI BRCA1启动子序列(310 bp)的凝聚物在不同时间点的荧光恢复率分析总结( 次技术重复)。(G)随着时间推移，在12.5 µg/mI BRCA1启动子序列(310 bp)存在下 Dylight488标记的SOG1 的荧光显微镜图像，从小的不规则形成的凝聚物演变为大的球形液滴(比例尺；在次技术重复中观察到类似结果)。

用两个突变体和31 bp pBRCA1片段进行的电泳迁移率变动分析实验显示DNA结合能力完全丧失(图7C和D)。这表明在这些NAC结构域变体中发生突变的两个结构元件都是DNA结合位点的重要组成部分。此外，这意味着SOG1NAC采用了与ANAC019和ORE - 1类似的结合机制，推测在整个NAC转录因子家族中是保守的[31,32]。

接下来，我们研究了对DNA结合至关重要的正电荷簇是否也是DNA或RNA介导的相分离(图6B)。两种突变体的DNA介导的相分离均被消除，这证实了完整的DNA结合位点，或至少正电荷的存在，对于多价蛋白质-DNA相互作用至关重要。

与野生型SOG1NAC相比，两种突变体的RNA驱动的相行为发生了改变。然而，RNA诱导的相行为并未完全消除。对于SOG1NAC-DNAstrand突变体，在大多数测试条件下仍会形成小液滴(图4C和补充图S5)。完整的RKRR环被认为对于支持SOG1NAC-DNAstrand突变体与DNA的液-液相分离潜力至关重要。总之，这些结果建立了SOG1 的DNA结合潜力与其与RNA和DNA进行相分离能力之间的功能联系。

SOG1 的相分离行为受DNA和RNA结合之间的紧密相互作用控制

上述结果表明，RNA和DNA都与表面的重叠区域结合。因此，随之而来的问题是DNA和RNA是否可以在SOG1 凝聚物中共整合，或者其中一个是否会排斥另一个。我们首先通过添加pBRCA1 31 bp寡核苷酸来挑战聚A-SOG1 凝聚物。在SOG1NAC二聚体和DNA的等摩尔浓度以下，DNA片段可以整合到RNA诱导的凝聚物中(图8A)。然而，增加pBRCA1 31 bp寡核苷酸的浓度会削弱RNA驱动的相行为。在SOG1 二聚体和pBRCA1 31 bp靶序列的等摩尔浓度下，聚A诱导的凝聚物完全溶解。pBRCA1 31 bp DNA靶标与RNA竞争，并通过将聚A排除在液滴之外来阻止聚A驱动的凝聚。这与聚A和pBRCA1 31 bp寡核苷酸结合到SOG1 上相同或重叠位点的假设一致。pBRCA1 31 bp寡核苷酸与SOG1 的结合可能会破坏稳定凝聚物的多价动态SOG1 -RNA相互作用，尽管仍会形成少量小凝聚物。

图7. SOG1 及其突变体的DNA结合。(A)-(D)分别为野生型SOG1 、SOG1 、SOG1 突变体和SOG1 NAC-RKRR突变体与含有SOG1 结合位点的pBRCA1的31 bp双链寡核苷酸的电泳迁移率变动分析。

当用相同长度的非特异性DNA片段重复此竞争实验时(图8B)，同样在1:1摩尔比下聚A被排除在液滴之外。不同的是，在这个等摩尔比下，SOG1NAC和非靶标DNA组装形成了更多的液滴(有关定量，请参见补充图S8)。可能没有形成稳定的可溶性SOG1NAC_非同源DNA复合物，涉及非同源DNA序列的瞬时和弱多价蛋白质-DNA相互作用实现了DNA驱动的凝聚。

一项表面等离子体共振竞争分析(图8C)支持了具有特定SOG1结合基序的DNA能够胜过RNA这一发现。在将多聚腺苷酸与固定化的SOG1 结合后，随后浸入pBRCA1 31 bp寡核苷酸中，会产生一种解离曲线，观察到的速率随着DNA浓度的升高而增加，范围从到。对于非靶向DNA，未观察到这种解离(图8D)，因此与等温滴定量热法的结果一致，即未检测到非靶向DNA的结合。然而，由于SOG1 -多聚腺苷酸相互作用的结合模型尚未确定，因此应谨慎考虑获得的速率。

讨论

SOG1是植物转录因子，在DNA损伤反应中起核心作用，其作用类似于哺乳动物的p53 [23]。在基因毒性应激下，它直接或间接控制约300个基因的转录。此前，有两个研究小组通过染色质免疫沉淀测序和RNA测序在体内研究了SOG1的靶标结合位点 [19,20]。在这里，我们表明SOG1 的靶标序列与Bour-bousse描述的三个序列标识兼容，即比Ogita等人 [19] 确定的CTT(N) AAG共有基序宽松。该基序可以被两个核苷酸干扰而不丧失结合，并且CTT(N) AAG共有基序之外的残基也会影响体外结合。

我们进一步表明，SOG1 在体外表现出由DNA和RNA驱动的相分离。有点令人惊讶的是，SOG1 是一个孤立的完全折叠的球状蛋白。截至目前，大多数现有文献通常关注内在无序和低复杂性结构域在液-液相分离中的重要性 [16]。当折叠结构域以串珠形式重复出现以产生多价性时，或者当与液-液相分离伙伴的相互作用诱导展开时(综述见 [16])，折叠结构域通常会驱动液-液相分离。

完全折叠蛋白的功能性液-液相分离很少见。虽然通常可以使用拥挤剂在高浓度下诱导液-液相分离，如最初在溶菌酶中观察到的那样 [39]，但只有少数在生理条件下会发生，一个罕见的例子是。大肠杆菌硫辛酸蛋白连接酶A [40]。然而，不同的研究表明，结合多价生物分子链(如核酸或内在无序区域 (IDR))的球状结构域可能代表一种可推广的调节液-液相分离的机制。第一个原理以SH3-富含脯氨酸基序 (PRM) 和多聚SUMO-多聚SIM系统为例，其中折叠结构域(SH3或SUMO)的重复通过与IDR中的短肽序列(如富含脯氨酸基序)的多价相互作用驱动液-液相分离 [1, 12]。支持这一点的是，Su等人 [41] 表明，T细胞受体信号传导依赖于衔接蛋白Grb2中两个SH3结构域介导的液-液相分离，这两个结构域将信号分子聚集到液状凝聚物中。这些结构通过浓缩激酶和排除磷酸酶来增强信号传导，说明了嵌入多价网络中的折叠结构域如何驱动生理相关的液-液相分离。除通过SOG1 的DNA结合位点进行核酸结合外，所需的多价性必然来自弱蛋白质-蛋白质相互作用和/或弱蛋白质-核酸相互作用。

鉴于SOG1在植物中与动物p53具有相似作用，比较它们的物理化学性质以及它们如何将DNA结合与凝聚物形成联系起来是很有意义的。p53既能形成液体凝聚物也能形成聚集体。然而，其核心DNA结合结构域本身并不会发生相分离，只会因错误折叠而发生聚集(近期综述见[42])。全长p53形成的液体凝聚物会成熟为固体聚集体[43, 44]，其四聚化结构域中的突变，尤其是那些影响多价性的突变，会降低液-液相分离(LLPS)[45]，这与我们在SOG1 二聚体中观察到的情况类似。此外，p53的凝聚受翻译后修饰影响，特别是磷酸化[44 - 46]。因此，研究全长SOG1及其磷酸化变体也将很有意义，因为SOG1和p53在DNA损伤时都会通过ATM或ATR的磷酸化而被激活[26, 27, 47 - 50])。

图8. SOG1 的RNA与DNA结合竞争实验:荧光显微镜观察聚腺苷酸(poly - A)诱导的SOG1 凝聚物中RNA和DNA的共整合。在25 μg/ml聚腺苷酸存在下(左图:未标记，右图:红色荧光)的10 μM SOG1 二聚体(绿色荧光)，用不同量的DNA(左图:红色荧光，右图:未标记)进行滴定，DNA为pBRCA 131 bp DNA寡核苷酸(B)或随机31 bp DNA寡核苷酸(B)(比例尺；左图在次生物学重复中观察到类似结果，右图在次重复中观察到类似结果)。固定化SOG1NAC和聚腺苷酸RNA与不同浓度pBRCA1 31 bp DNA寡核苷酸的生物层干涉测量( 次技术重复)(C)以及与pBRCA1 31 bp DNA寡核苷酸和无DNA相比的随机非靶向DNA寡核苷酸。

液-液相分离是转录和翻译调控的关键组成部分，涉及相关组分之间复杂的相互作用:转录因子、DNA、RNA聚合酶、RNA、中介体复合物、染色质以及多种其他调控蛋白[7, 51]。保守的SOG 的RNA依赖性相行为意味着在转录起始位点形成凝聚物存在一种RNA介导的反馈控制机制，这与Henninger等人提出的模型[11]一致。根据该模型，在mRNA浓度过高时，转录位点的凝聚物形成会被消除。聚腺苷酸存在时SOG1 的折返相行为模拟了这种情况。在人类雄激素受体中也观察到类似的折返RNA依赖性相行为，其折叠的DNA结合结构域是驱动液-液相分离的最小区域[14]。

DNA(靶标与非靶标)与RNA结合之间紧密而复杂的相互作用控制着转录位点凝聚物的形成。对于SOG1 ，RNA和双链DNA(ds - DNA)在液-液相分离方面相互竞争。与野生型蛋白相比，消除SOG1 特异性DNA结合的突变也会诱导改变的DNA和RNA依赖性相分离行为。这表明特异性DNA结合位点与驱动液-液相分离的非特异性DNA和RNA识别位点重叠，使得DNA特异性能够影响SOG1 的液-液相分离行为。这与其他转录因子的类似差异行为一致，即RNA和DNA介导的凝聚都受益于序列特异性相互作用(综述见[52])。

RNA和DNA诱导的液-液相分离之间的相互作用是转录的重要组成部分；通常，转录因子首先经历DNA驱动的液-液相分离以启动转录，而随后产生的RNA积累会使转录因子转变为RNA驱动的液-液相分离。本手稿中报道的SOG1在RNA和DNA之间竞争方面表现出的行为反映了液-液相分离驱动力的这种转变。DNA和RNA对共享或重叠结合位点的竞争可能构成两种转录相关凝聚物之间转变的结构基础。

致谢

我们感谢因陀罗·贝弗茨博士发起放射性电泳迁移率变动分析实验，感谢莎拉·海泽茨协助蛋白质纯化，感谢约瑟芬·赫布斯特制备植物信使核糖核酸。

作者贡献:金·米尼翁(概念化[同等贡献]、形式分析[同等贡献]、资金获取[同等贡献]、调查[主导]、方法学[主导]、验证[同等贡献]、可视化[同等贡献]、撰写原始草案[同等贡献]、撰写评审与编辑[同等贡献])、拉尼·范德·埃肯(概念化[同等贡献]、形式分析[同等贡献]、调查[主导]、方法学[主导]、验证[同等贡献]、可视化[同等贡献]、撰写原始草案[同等贡献]、撰写评审与编辑[同等贡献])、玛戈特·加勒(调查[支持]、方法学[支持]、资源[同等贡献]、撰写评审与编辑[同等贡献])、马农·德穆尔德(调查[支持]、方法学[支持]、资源[同等贡献]、撰写评审与编辑[同等贡献])、乔里斯·范·林特(调查[支持]、方法学[支持]、撰写评审与编辑[同等贡献])、亨利·德·格雷夫(概念化[支持]、监督[支持]、撰写评审与编辑[同等贡献])、利文·德·维尔德(概念化[支持]、监督[支持]、撰写评审与编辑[同等贡献])以及雷米·洛里斯(概念化[同等贡献]、资金获取[主导]、项目管理[主导]、监督[主导]、撰写原始草案[同等贡献]、撰写评审与编辑[同等贡献])。