搜索历史清除全部记录

最多显示8条历史搜索记录噢~

全部

全部
产品管理
新闻资讯
介绍内容
企业网点
常见问题
企业视频
企业图册

昵称 | 退出

首页

促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP肽通过刺激增殖和诱导促生存相关基因，保护SH - SY5Y细胞免受、叔丁基过氧化氢和氰化物的细胞毒性

发布时间：

2026-08-10 21:32

促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP肽通过刺激增殖和诱导促生存相关基因，保护SH - SY5Y细胞免受、叔丁基过氧化氢和氰化物的细胞毒性

米哈伊尔·G·阿基莫夫 D，叶连娜·V·福米娜-阿盖耶娃，波琳娜·V·杜迪娜，柳德米拉·A·安德烈耶娃，尼古拉·F·米亚索耶多夫和弗拉基米尔·V·别祖格洛夫

1 俄罗斯科学院谢马金-奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所，米克卢霍-马克拉亚街16/10号，117997莫斯科，俄罗斯；evfa56@gmail.com(E.V.F.-A.)；polinadudkinz@gmail.com(P.V.D.)；vvbez@ibch.ru(V.V.B.)

2俄罗斯莫斯科市库尔恰托夫广场2号库尔恰托夫研究所国家研究中心分子遗传学研究所；landr@img.ras.ru (L.A.A.)；nfm@img.ras.ru (N.F.M.)

* 通信地址:akimovmike@gmail.com；电话:+7-495-330-6592

摘要:稳定化的促黑素类似物肽促肾上腺皮质激素(6-9)PGP(HFRWPGP)具有广泛的神经保护活性。然而，其作用机制仍知之甚少。在本文中，我们展示了在氧化应激相关毒性模型中，与肽脯氨酸-甘氨酰-脯氨酸相连的促肾上腺皮质激素片段6-9(HFRW)对SH-SY5Y细胞的促增殖和细胞保护活性的研究。该肽以剂量依赖的方式保护细胞免受、叔丁基过氧化氢和KCN的损伤，并表现出促增殖活性。其作用机制是调节与增殖相关的NF- 基因，刺激促生存的NRF2基因相关途径，并减少细胞凋亡。

关键词:促肾上腺皮质激素(6 - 9)；神经保护；1-甲基-4-苯基吡啶鎓离子；氢离子；叔丁基过氧化氢；氰化物；促黑素；氧化应激

1. 引言

内源性肽调节剂中一类正在积极研究的是促肾上腺皮质激素(ACTH)/促黑素细胞激素(MSH)样肽，目前它们被统称为黑皮质素(MCs)。过去40年对这些肽的作用研究表明，这些肽的生理活性谱非常广泛。MCs参与记忆和注意力、情绪状态、性行为和饮食行为、疼痛敏感性以及其他一些生理功能的调节[1]。MC家族包括ACTH和MSH 、以及 MSH ，以及这些激素的片段及其合成类似物。特别令人感兴趣的是ACTH和MSH以及它们缺乏激素活性的片段能够加速动物训练并改善技能保持。研究中最具活性的肽是ACTH(4 - 10)。保留促智活性的最小ACTH片段是ACTH(4 - 7)。然而，也表明ACTH(7 - 10)片段具有微不足道的促智活性。将分子延长至ACTH(7 - 16)会导致活性增加到与ACTH(4 - 7)和ACTH(4 - 10)相当的水平[2,3]。

所述的促黑素皮质素广泛的生理活性为这类药物在各种病理状况的临床实践中的应用提供了机会。然而，这些化合物在临床应用中的一个障碍是生物利用度低和作用持续时间不足。天然促肾上腺皮质激素(4-10)片段的神经营养作用持续时间为 [4]。在大多数温血动物的器官和组织中，肽通常会被广泛存在的特异性较低的外肽酶和内肽酶水解。然而，它们不会切割AA-脯氨酸键(其中AA为任何氨基酸)以及其他富含脯氨酸残基的序列中的键[5]。特定的脯氨酰羟化酶主要少量集中在个别器官和组织中。因此，通过在分子结构中引入富含脯氨酸残基的位点，发现有可能延长肽的作用并提高其对肽酶的抗性。此前曾报道过一种利用天然蛋白质中发现的脯氨酸基序来稳定合成肽以防止肽酶作用的方法[6]。基于此，有人提出在促肾上腺皮质激素片段的C末端添加富含脯氨酸的链会导致肽的作用增强及其持续时间延长。

检查

更新

引用:Akimov, M.G.; Fomina-Ageeva, E.V.; Dudina, P.V.; Andreeva, L.A.; Myasoyedov, N.F.; Bezuglov, V.V. ACTH(6-9)PGP肽通过刺激增殖和诱导促生存相关基因保护SH-SY5Y细胞免受、叔丁基过氧化氢和氰化物的细胞毒性。《分子》2021年，26卷，1878页。https://doi.org/10.3390/molecules26071878

学术编辑:Antonia Patruno和Mirko Pesce

收到日期:2021年2月28日

接受日期:2021年3月24日

发表日期:2021年3月26日

出版商说明:MDPI在已发表地图的管辖权主张和机构隶属关系方面保持中立。

这种富含脯氨酸的链之一是源自胶原蛋白的基质细胞因子三肽脯氨酸 - 甘氨酸 - 脯氨酸(PGP)，它被描述为一种中性粒细胞趋化因子。PGP作为在感染或损伤期间产生的一种原始且保守的损伤相关分子模式，随后作用于塑造随后的炎症和修复过程。PGP在人肺支气管上皮细胞中还具有促进增殖、径向扩散和显著形成片状伪足的强大能力[7]。

PGP已成功用于稳定各种益智肽[8]，包括促肾上腺皮质激素片段。例如，肽药物Semax(MEHFPGP)由一个促肾上腺皮质激素(4-7)片段组成，该片段在C末端侧翼连接有PGP肽。Semax在T形迷宫学习测试中的生理作用持续时间是天然促肾上腺皮质激素(4-10)肽的50倍[9]。通过常规肽合成获得了相应的融合肽ACTH(6-9)PGP(HFRWPGP)，并研究了其对各种肽酶的稳定性。在所有实验条件下，该肽中色氨酸和脯氨酸之间的键(HFRW-PGP)对水解裂解具有抗性[10]，证明了上述延长肽活性策略的正确性。

所有促肾上腺皮质激素(MCs)的共同序列是促肾上腺皮质激素(6-9)或HFRW，这是与所有已知类型的MC受体结合所必需的[11]。动物实验表明，促肾上腺皮质激素(6-9)PGP(HFRWPGP)具有益智和抗焦虑活性。腹腔注射促肾上腺皮质激素(6-9)PGP有助于通过其心理调节作用降低实验性社会应激条件下具有攻击型和顺从型行为的动物的高焦虑水平[12]。该肽还具有心理调节作用，可缓解由社会应激引起的焦虑抑郁障碍症状[13]。此外，促肾上腺皮质激素(6-9)PGP在谷氨酸兴奋性毒性作用下增强了培养的皮质神经元的活力[14]。

尽管促肾上腺皮质激素(6-9)PGP具有深刻的生物活性，但其神经保护活性的机制仍知之甚少。

在本文中，我们首次表明，修饰的促肾上腺皮质激素片段促肾上腺皮质激素(6-9)PGP在模拟帕金森病和缺血性中风中细胞死亡诱导机制的、叔丁基过氧化氢和KCN毒性环境中具有神经保护活性。我们证明，该肽的神经保护活性是通过调节增殖相关的基因增加增殖、刺激促生存的NRF2基因相关途径以及减少细胞凋亡来实现的。

2. 结果

2.1. 促肾上腺皮质激素(6-9)PGP在、叔丁基过氧化氢、MPP 和KCN处理后刺激细胞增殖并提高细胞存活率

为了研究促肾上腺皮质激素(6-9)PGP的神经保护活性，使用了四种与氧化应激相关的模型:由、叔丁基过氧化氢(tBH)、KCN和细胞毒性诱导的氧化应激。和的细胞毒性事先已确定[15]，和的细胞毒性已明确测量(图1)；对为 (置信区间87.05至 )，对tBH为27.5μM(置信区间24.52至30.97μM)。

在肽的实验中，选择添加的有毒剂浓度以在中诱导50%至的细胞死亡；肽与毒素一起添加。

图1. KCN(A)和tBH(B)对SH-SY5Y细胞的细胞毒性。孵育时间24小时，MTT测定数据，平均标准误差，次实验。

促肾上腺皮质激素(6-9)PGP在和KCN处理下提高了细胞活力，但在处理下未提高(图2A-D)。对于和，保护活性在肽浓度约为时增加直至最大值(图2A、B)，然后下降。对于KCN，细胞存活率呈剂量依赖性增加，在时达到最大值(图2C)。

tBH模型中的效应比模型中更为显著。然而，是在氧化应激期间于体内产生的[16,17]，因此代表了一种更符合生理的环境。所以，在模型中对促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP的作用机制进行了进一步研究。

图2. 和氰化钾处理后促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP对SH - SY5Y细胞活力的影响。在的情况下，细胞用或不同肽浓度的处理，在的情况下用氰化钾或处理。未处理的细胞用作对照。MTT检测数据，平均值标准误差，实验。*，与未处理对照相比有统计学显著差异；，与无肽对照相比有统计学显著差异；采用Holm - Sidak事后检验的方差分析，。

2.2. 促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP降低凋亡并提高细胞活力，但不影响急性活性氧水平

促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP保护作用的三种可能机制可被提出:增殖刺激、凋亡抑制以及作为直接的活性氧清除作用或通过激活适当的细胞酶系统来降低活性氧水平。后一种假设是可能的，因为所有使用的有毒剂都与活性氧的产生有关[18,19]。

为了检验前两个假设，我们研究了促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP处理后SH - SY5Y的增殖增加以及该肽与联合应用后的凋亡水平。为了评估细胞增殖，使用了MTT检测和BrdU掺入检测。肽处理后，与未处理对照相比，MTT染色和BrdU掺入均增加，因此该肽刺激了细胞增殖(图3A, B)。处理增加了磷脂酰丝氨酸传感器的荧光，表明凋亡的诱导；与无肽对照相比，肽处理细胞中的这种荧光降低，因此该处理降低了凋亡，但仅在肽的时该效应具有统计学显著性(图3A)。最后，我们使用DCFH - DA染料检测活性氧水平。处理后其荧光增加，表明活性氧的积累，但促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP处理后未改变。因此，1小时孵育后未观察到活性氧清除作用(图3C)。2.3. 促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP对氰化钾细胞毒性的保护作用被MEK、PKC、PLC和Ras抑制剂抑制

图3.促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP对SH - SY5Y细胞增殖(A、B)、诱导的细胞凋亡(C)和活性氧水平(D)的影响。在增殖研究中，将细胞与该肽孵育7天，并使用MTT(A)或BrdU(B)试验进行分析。在细胞凋亡和活性氧生成研究中，将细胞单独或与该肽一起用处理，然后测定活性氧水平(使用DCFH - DA染料)和凋亡细胞计数(使用与7 - AAD细胞不可渗透染料结合的磷脂酰丝氨酸反应染料)。未处理的细胞用作对照。平均值标准误，次实验，*，与单独使用相比，活性氧和细胞凋亡有统计学显著差异，与未处理对照相比，增殖有统计学显著差异；采用Holm - Sidak事后检验的方差分析，。**，与不含的对照相比有统计学显著差异，采用Holm - Sidak事后检验的方差分析，

为了评估参与该肽保护活性的信号通路，我们使用了一组受体和细胞内信号转导成分抑制剂。由于像这样的细胞外活性氧产生的氧化应激诱导剂会氧化这些抑制剂，我们使用了基于KCN的毒性模型。在所测试的抑制剂中，只有蛋白激酶C和A(PKC + PKA)、磷脂酶C(PLC)、丝裂原活化蛋白激酶1和2(MEK1,2)以及Ras的抑制剂消除了该肽的保护作用(图4)，因此这些成分参与了该肽的作用。总体而言，观察到的抑制剂反应表明PLC->PKC->Ras->MEK信号转导通路被激活[20 - 22]。

图4.细胞内信号转导成分参与促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP对SH - SY5Y细胞KCN细胞毒性的保护作用。在加入KCN之前加入CREB(666 - 11, 1 μM)、JNK(SP 600125, "SP", 1 μM)、p38(SB 202190, "SB", 1 μM)、CaMKII + IV(KN - 93, 4 μM)、PKC + PKA(HA - 1004, 10 M)、PLD(FIPI, 0.5 μM)、PKA(KT - 5720, 0.5 μM)、PLC(U - 73122, "U73", 10 μM)、MEK1/2(U - 0126, )、NOS(L - NAME, )和Ras(salirasib, )的抑制剂，然后与KCN(85.0μM)和肽(50μM)一起加入。将细胞与抑制剂、KCN和肽孵育24小时。MTT试验数据，平均值标准误。，与不含任何抑制剂的KCN +肽相比有统计学显著差异；**，与未处理对照相比有统计学显著差异；，采用Tukey事后检验的方差分析，次实验。

2.4.促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP未改变细胞内cAMP含量

鉴于全长促肾上腺皮质激素(ACTH)的受体是一种与亚基偶联的G蛋白偶联受体(GPCR)，该亚基进而激活环磷酸腺苷(cAMP)的合成，且其中一种活性抑制剂是混合的蛋白激酶A(PKA)/蛋白激酶C(PKC)抑制剂，我们决定检查促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP的作用是否会影响这种第二信使的浓度。在用该肽孵育20分钟后，我们分析了细胞内的cAMP含量，同时使用前列腺素作为阳性对照(图5)。我们未检测到cAMP浓度的升高或降低，因此参与的激酶是PKC而非cAMP依赖性的PKA。

图5. 促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP处理SH - SY5Y细胞后的cAMP产生情况。细胞用80或的该肽或用的 (阳性对照)处理，之后使用竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测量cAMP浓度。未处理的细胞用作对照。平均值标准误，次实验。，与对照相比有统计学显著差异；采用Holm - Sidak事后检验的方差分析，。

2.5. 促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP降低了与核因子κB(NF - κB)和核因子E2相关因子2(Nrf - 2)相关基因的表达，但未降低抗氧化酶的表达

抵御活性氧(ROS)细胞毒性的下游机制可能是细胞抗氧化基因的诱导。

为了检验这种可能性并进一步阐述该肽的促增殖活性，我们分析了单独应用促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP以及与联合应用 [23]后一组信号通路的mRNA水平:

NF - κB通路:AKT3、IκB和NF - κB；
Nrf - 2通路:Nrf2、血红素加氧酶 - 1(HO - 1)、谷胱甘肽 - S - 转移酶(GST)、醌氧化还原酶1(NQO1)、谷氨酸 - 半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、超氧化物歧化酶(SOD2)和过氧化氢酶(CAT)；
丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路:应激活化蛋白激酶(JNK)、P38、双特异性磷酸酶1(MKP1)、蛋白磷酸酶2A(PP2A)、蛋白磷酸酶5(PP5)和增殖细胞核抗原(Ki - 67)；
与DNA损伤相关的通路:P53。

AKT3、CAT、SOD1和PP2A基因的mRNA水平低于非特异性扩增(无模板对照)阈值(数据未显示)。单独的肽处理激活了NF - κB通路的表达，刺激了P38蛋白激酶，并激活了几个Nrf2通路成分的表达(图6)。与联合使用时，NF - 通路的刺激有所降低，并且还观察到Ki - 67基因表达略有下降。P38表达进一步增强。对于肽与联合使用观察到两个特定的基因表达变化:第一，添加促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP使P53和PP5的水平恢复到对照水平，第二，GCLC基因的表达增加。这些变化与该肽促生存和促增殖的作用一致。

图6. 有无时，ACTH(6 - 9)PGP处理后NF-κB(A)、MAPK(B)和NRF2(C)信号通路的基因表达变化。将SH-SY5Y细胞单独用的处理，或与肽的共同处理，之后使用RT-qPCR测定mRNA水平。未处理的细胞用作对照。数据以B2M、RPII和GPDH进行标准化。均值±标准误，N = 3次实验；每个数据点代表一次生物学重复；技术重复取平均值。*，与未处理对照相比有统计学显著差异；**，与单独使用相比有统计学显著差异；采用Holm-Sidak事后检验的方差分析，。

3. 讨论

近期关于ACTH(6 - 9)PGP肽神经调节和神经保护特性的数据[12 - 14]清楚地表明该分子作为一种新型药物具有广阔前景。本研究的目的是确定参与ACTH(6 - 9)PGP肽神经保护活性的细胞内系统。这些数据有助于深入了解其与其他神经保护药物可能的相互作用，以便未来开发出活性增强的药物组合。所获结果表明该肽具有以下两个特性:(1)该肽可引发促增殖效应；(2)该肽刺激NF - B和Nrf2信号通路。

该肽在和KCN细胞毒性模型中增强了细胞活力，但在细胞毒性模型中未增强。该肽增强细胞活力的能力按顺序增加。

ACTH(6 - 9)PGP处理后模型中细胞存活率的增加与该肽的促增殖效应相当。在该模型中，为诱导细胞死亡，向细胞中大量添加。因此，即使细胞的抗氧化系统受到该肽刺激，也难以应对来自的ROS，ACTH(6 - 9)PGP处理后细胞活力的净增加应归因于增殖增加。tBH的细胞毒性浓度低20多倍，因此该肽在该模型中能够保护更多细胞是完全可以预期的。观察到的该肽的细胞保护活性与富硒酵母蛋白水解物中的富硒肽组分[24]以及线粒体靶向肽SS31[25]相当。

该肽在KCN细胞毒性模型中的作用与和tBH有所不同，因为它仅在相当高的浓度下才有活性。这种差异可以解释为，由于tBH和在培养基中的寿命较短，产生的应激相对较短[26]，而靶向线粒体的KCN[27]会产生长期的ROS生成，因此可能需要更高程度地激活抗氧化系统。

是一种神经毒素，在选择性损伤包括多巴胺能神经元在内的儿茶酚胺能神经元方面起主要神经毒性作用，已广泛应用于帕金森病(PD)实验模型中，它可在细胞外或细胞内发生氧化反应，产生活性氧(ROS)，进而导致下游毒性分子形成并造成神经元损伤 [28]。研究表明，用处理 SH - SY5Y 细胞会导致 ROS 浓度显著增加 [18]。然而，相当不稳定，因此仅会引起 ROS 浓度的暂时升高。在这种情况下，物质的抗氧化活性应发挥重要作用，例如 -硫辛酸就有此表现 [29]。促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP 在一小时后未能降低 ROS 浓度，因此它并非直接的 ROS 清除剂。其结构(组氨酸 - 苯丙氨酸 - 精氨酸 - 色氨酸 - 脯氨酸 - 甘氨酸 - 脯氨酸)并不完全排除这种活性，因为苯丙氨酸和色氨酸残基可能与 ROS 发生反应 [30]。在该实验中，该肽的表现似乎不如类氧化还原蛋白模拟肽 PSELT [31] 和胰高血糖素样肽 - 2 [32]。可以推测，该肽的浓度不足以表现出这种活性。诱导细胞毒性所需的大量 MPP 也使得细胞抗氧化机制几乎无法应对这种应激，这很可能是该肽在此模型中无活性的原因。

促肾上腺皮质激素(6-9)PGP活性背后的信号传导需要进一步研究；然而，可以提出几个假说来解释它。由于活性肽浓度远低于有毒物质的浓度，促肾上腺皮质激素(6-9)PGP应该与一些细胞信号传导机制相互作用，而不是直接使添加的毒素失活或产生ROS。这与抑制PLC->PKC->Ras->MEK信号转导途径后观察到的肽的保护作用消失一致。该信号通路的参与与垂体腺苷酸环化酶激活肽神经肽相似。垂体腺苷酸环化酶激活肽在帕金森病模型中显示出神经保护作用，但其复杂的药理作用以及短半衰期限制了其临床应用[33]。促肾上腺皮质激素(6-9)PGP预计会更稳定，但缺乏关于其受体的数据使得难以预测其副作用。

在这些信号传导成分的下游，肽处理后，mRNA表达根据几种模式发生了变化。

单独使用肽治疗可激活NF- 的表达并降低其抑制剂的表达；在存在的情况下也观察到了后者的变化。这种变化应激活促增殖的NF- B途径[34,35]，并与观察到的肽的促增殖作用一致。肽治疗后表达的增加也与检测到的抑制剂活性一致，因为该基因活性由Ras激活[36]。

促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP处理也刺激了P38蛋白激酶和几种Nrf2信号通路成分的表达。在存在的情况下，P38表达进一步增强。PKC是检测到的肽信号的成分之一，已知它也能刺激Nrf2转录因子的活性[37]，因此在肽处理后观察到的Nrf2靶标NQO1和HO - 1表达的激活似乎是合乎逻辑的。

观察到该肽与组合后有三种特定的基因表达变化:第一，添加促肾上腺皮质激素(6-9)PGP可将P53和PP5水平恢复到对照水平；第二，GCLC基因的表达增加；最后，观察到Ki-67基因表达略有下降。这些变化大多与该肽的促生存和促增殖作用一致，在存在细胞毒性剂的情况下，有一些向促生存作用的转变。谷胱甘肽生物合成中限速酶GCLC的基因激活[38]特别令人感兴趣，因为它提供了一种长期抵御该肽诱导的氧化应激的有趣方式。

该肽的直接靶点尚不清楚。基于该肽是促肾上腺皮质激素的一部分这一事实，其受体可能是首要候选对象。促肾上腺皮质激素受体(ACTHR)与一个亚基偶联[39]，因此其激活应会导致环磷酸腺苷(cAMP)浓度升高。然而，应用促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP后cAMP水平并未改变(图5)，因此促肾上腺皮质激素受体可从潜在靶点列表中排除。

最近发现孤儿大麻素受体GPR18和GPR55可刺激增殖[40,41]；最近，已证明存在GPR55肽调节的可能性[42]。在我们的实验设置中，这两种受体的抑制剂(2 μM的ML - 193和0.5 μM的PSB CB5)可阻止促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP对氰化钾(KCN)细胞毒性的保护作用(补充图S1)。因此，这些受体可能至少是该肽的变构靶点；然而，本文不涉及对这种相互作用更详细的研究。

促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP的其他可能靶点包括胰高血糖素样肽 - 1受体(GLP1R)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)和热休克蛋白等受体。GLP1R是肽Glp - 1神经保护作用的受体[43]。该受体信号传导具有偏向性[44]，因此它可能与促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP相互作用。然而，它也与偶联，因此不符合观察到的数据。代表碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)受体结合域的肽激活FGFR已显示在SH - SY5Y细胞中引发神经保护反应[45]。FGFR是一种受体酪氨酸激酶，它与Akt信号转导途径相关联[46]。因此，这种或类似的受体可能是促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP的靶点。热休克蛋白与其他生物活性肽相互作用[47]并增加细胞增殖[48]，应牢记这一途径。有必要对所讨论的受体靶点进行更详细的研究，以阐明修饰后的促肾上腺皮质激素(6 - 9)肽的细胞保护活性机制。

4. 材料与方法

4.1. 材料

L - 谷氨酰胺、胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素B、汉克斯盐、胰蛋白酶、杜氏改良 Eagle培养基(DMEM)和(4,5 - 二甲基噻唑 - 2 - 基)- 2,5 - 二苯基四氮唑溴盐(MTT)购自俄罗斯莫斯科的PanEco。2’,7’ - 二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH - DA)、4 - (2 - 羟乙基)- 1 - 哌嗪乙磺酸(HEPES)、二甲基亚砜(DMSO)、D - 葡萄糖、1 - 甲基 - 4 - 苯基吡啶离子(MPP )、氰化钾(KCN)、1 - 甲基 - 4 - 苯基 - 1,2,3,6 - 四氢吡啶(MPP )、左旋精氨酸甲酯(L - NAME)、叔丁基过氧化氢、牛血清白蛋白购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma - Aldrich。666 - 11、SB 202190、SP 600125、法尼基硫代水杨酸(salirasib)、FIPI、KN - 93、ML - 193、PSB C5、HA - 1004、U - 012六、KT - 5720和U - 73购自英国布里斯托尔的Tocris Bioscience。总RNA纯化试剂盒购自德国耶拿的Jena Biosciences。莫洛尼氏鼠白血病病毒(MMLV)逆转录试剂盒和qPCR预混液qPCRmix - HS SYBR购自俄罗斯莫斯科的Evrogen。cAMP测定试剂盒和5 - 溴 - 2’-脱氧尿苷(BrdU)细胞增殖检测试剂盒购自美国马萨诸塞州剑桥的Abcam。脱氧核糖核酸酶I(DNase I)购自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)。

如前所述[49]，该肽通过经典的溶液肽化学方法，使用受保护和游离的L - 氨基酸合成。最终化合物的纯度不低于98%(高效液相色谱分析，补充S2)。

4.2. 细胞培养

人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y(ATCC CRL-2266)培养于1:1的MEM/F12培养基中，添加胎牛血清、 L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、青霉素、链霉素和两性霉素B，置于培养箱中，培养箱内气氛为，湿度为，温度为。细胞每隔72至传代一次，用Versene溶液洗涤后，用含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶在汉克斯平衡盐溶液中处理。

4.3. 氧化应激诱导

对于细胞活力实验，将细胞以每孔15,000个的密度接种于96孔板的培养基中，孵育。之后，将含有或不含毒性剂的物质溶液加入到新鲜细胞培养基中，加入到孔中的培养基中，再孵育。通过的氰化钾、1.3 mM 1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP ，新鲜制备)或叔丁基过氧化氢(均添加的pH 7.4的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES))诱导细胞毒性。

4.4. 细胞活力测定

使用MTT试验[50]分析细胞活力。简而言之，从孔中吸出培养基，向每个孔中加入含葡萄糖的 MTT溶液，在培养箱中于孵育。之后，向每个孔中的MTT溶液中加入含的异丙醇，在平板振荡器上于孵育。使用酶标仪(俄罗斯Efos 9226，MZ Sapphire)在波长、参比波长下测定溶液的吸光度。

4.5. 环磷酸腺苷(cAMP)测定

根据制造商的说明，使用cAMP测定试剂盒测量cAMP水平。将细胞以每孔60,000个的密度接种于96孔板中，培养。将物质加入到新鲜细胞培养基中，加入到孔中的培养基中，孵育。之后，吸出细胞培养基，对细胞进行cAMP测定。

4.6.活性氧(ROS)测定

使用DCFH-DA染料测量ROS生成。将细胞以每孔60,000个的密度接种到96孔板中，并培养。之后，用含有染料的新鲜培养基替换培养基，将细胞在培养箱中于孵育。孵育后，用培养基洗涤细胞两次，并在用培养基中的物质处理细胞。用不含和物质的培养基处理的细胞用作对照。孵育后，用含有 HEPES和无脂肪酸牛血清白蛋白的Hanks平衡盐溶液(pH 7.4)洗涤细胞两次，并使用酶标仪Hidex Sense Beta Plus(芬兰图尔库的Hidex公司)测量荧光，。

4.7. 凋亡检测

使用凋亡/坏死检测试剂盒(ab176749，英国剑桥的Abcam公司)分析凋亡水平。将细胞以每孔15,000个的密度接种到96孔板中，并培养。之后，将的单独或与肽一起添加到的新鲜培养基中，加入到孔中的旧培养基中，并在培养箱中于孵育。之后，去除培养基，并根据制造商的说明使用磷脂酰丝氨酸传感器(凋亡细胞，绿色荧光)、膜不透性染料7-AAD(坏死细胞，红色荧光)和活细胞细胞质染料CytoCalcein Violet 450对细胞进行染色。使用配备Semrock GFP-3035D滤光片组、放大倍数为100×的尼康Ti-S倒置荧光显微镜对染色细胞进行拍照。对于每个孔，捕获5个不相交的视野，并对凋亡细胞进行计数。

4.8. mRNA检测

mRNA levels were analyzed using RT-qPCR. The cells were seeded at the density of 240,000 per well of a 24-well plate in of culture medium and incubated for . The substances were added in of fresh culture medium to the medium in the wells and incubated for . Total RNA was extracted using a Total RNA isolation kit according to the manufacturer’s protocol. The isolated RNA was treated with DNase I according to the manufacturer’s protocol. cDNA was synthesized using an oligo-dT primer using the MMLV reverse transcription kit. qPCR was performed using a SYBR Green containing master mix qPCRmix-HS SYBR with the following amplification protocol: for , cyclic for for for for 40 cycles using a Bio-Rad C1000 thermal cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). After the amplification, PCR product melting curve was recorded in the range from 65 to . Primer sequences were generated using the IDT PrimerQuest service (https://eu.idtdna.com/PrimerQuest, accessed on 26 March 2021) and validated using the NCBI PrimerBLAST service [51], or they were taken from the paper by Jaafru et al. [23]. The primer sequences were as follows (5’-3’):

AKT3 forward AGGTGACACTATAGAATAAGACATTAAATTTCCTCGAA, reverse GTACGACTCACTATAGGGAATCCTCATCATATTTTTCAGGT;

Beta-2 microglobulin forward CAGCAAGGACTGGTCTTTCTAT, reverse ACATGTCTC-GATCCCACTTAAC;

Catalase forward AGGTGACACTATAGAATAAGAAATCCTCAGACACATCT, reverse GTACGACTCACTATAGGGAATGTCATGACCTGGATGTAA;

GST forward AGGTGACACTATAGAATAATACATGGCAAATGACTTAAA, reverse GTACGACTCACTATAGGGATGATGTCTTCATTCCTTGAC;

GCLC forward AGGTGACACTATAGAATAATGAAGCAATAAACAAGCAC, reverse GTACGACTCACTATAGGGATGGAATGTCACCTGGAG;

GAPDH forward GAATGGGAAGCTGGTCATCAA, reverse CCAGTAGACTCCAC-GACATACT;

HO-1 forward AGGTGACACTATAGAATAACTGCGTTCCTGCTCAACAT, reverse GTACGACTCACTATAGGGAGGGCAGAATCTTGCACTTTGT;

IKBA forward AGGTGACACTATAGAATACTGCAGCAGACTCCAC, reverse GTAC-GACTCACTATAGGGAGGGTATTTCCTCGAAAGT;

JNK forward AGGTGACACTATAGAATAAAGGAAAACGTGGATTTATG, reverse GTACGACTCACTATAGGGACCAGCATATTTAGGTCTGTT;

MKP1 forward AGGTGACACTATAGAATAAGAAGAACCAAATACCTCAA, reverse GTACGACTCACTATAGGGACAGGTCATAAATAATCAGCA;

MKI67 forward GCTGAGAACTCCTAAGGGAAAG, reverse GCTGTGAAGCTCTG-TAGGATAC;

NFkB forward AGGTGACACTATAGAATACGTTTTAGATACAAATGTGAAG, reverse GTACGACTCACTATAGGGACACTTTTCCTTTTCCATAAT;

NQO1 forward AGGTGACACTATAGAATACTGCGAACTTTCAGTATCC, reverse GTACGACTCACTATAGGGAGAAGGGTCCTTTGTCATAC;

NRF2 forward AGGTGACACTATAGAATATCGCAAACAACTCTTTATCT, reverse GTACGACTCACTATAGGGAAGAGGAGGTCTCCGTTA;

P38 forward AGGTGACACTATAGAATATGAGCTGAAGATTCTGGA, reverse GTAC-GACTCACTATAGGGATGTCAGACGCATAATCTG;

P53 forward AGGTGACACTATAGAATAATGGAAACTACTTCCTGAAA, reverse GTACGACTCACTATAGGGAATTCTGGGAGCTTCATCT;

PP5 forward AGGTGACACTATAGAATACAAGGACTACGAGAACGCCA, reverse GTACGACTCACTATAGGGAGCTTCACCTTGACCACCGTC;

PP2A forward AGGTGACACTATAGAATACCGCCATTACAGAGAG, reverse GTAC-GACTCACTATAGGGAAGGATTTCTTTAGCCTTCT;

RPII正向引物CCCAGCTCCGTTGTACATAAA，反向引物TCTAACAGCACAAGTG-GAGAAC;

SOD1正向引物AGGTGACACTATAGAATAAAGTACAAAGACAGGAAACG，反向引物GTACGACTCACTATAGGGATGACAAGTTTAATACCCATCT;

SOD2正向引物AGGTAGCATGGACCGAATTTAC，反向引物GATAGCCAGGTGTTTGCTTCT。

每个实验重复进行三次，每个处理变体包含2个孔。在qPCR阶段，每个生物样品使用3个技术重复。

4.9. 通过BrdU掺入进行增殖检测

使用BrdU细胞增殖试剂盒(美国马萨诸塞州剑桥的Abcam公司)验证ACTH(6-9)PGP肽对细胞增殖的刺激作用。将细胞以每孔4000个的密度接种到96孔板中并过夜培养。之后，将新鲜培养基中的肽溶液加入细胞中并完全更换培养基；在接种后的第1天和第4天添加肽。在第6天，向细胞中加入BrdU试剂，并根据制造商的方案完成检测。

4.10. 统计学分析

所有实验至少重复进行三次。使用GraphPad Prism 6.0软件进行统计分析，采用ANOVA和Holm-Sidak事后检验；被认为具有统计学显著差异。

5. 结论

首次，我们证明了结合促肾上腺皮质激素(6-9)片段和三肽PGP(HFRWPGP)的肽可保护SH-SY5Y细胞免受和KCN细胞毒性的影响，但不能抵御细胞毒性。其作用机制是通过调节增殖相关的基因促进增殖，刺激促生存的NRF2基因相关途径，并减少细胞凋亡。

补充材料:图S1:GPR55和GPR18参与促肾上腺皮质激素(6-9)PGP对SH-SY5Y细胞KCN细胞毒性的保护作用。图S2:所研究肽HFRWPGP的物理化学分析。图S3:合成肽的全质谱图。图S4:具有的离子的碎片化。图S5:具有的离子的碎片化。

作者贡献:概念化，M.G.A.和V.V.B.；方法学，M.G.A.、V.V.B.和L.A.A.；软件，M.G.A.；形式分析，M.G.A.和V.V.B.；调查，M.G.A.、E.V.F.-A.、L.A.A.和P.V.D.；资源，N.F.M.和V.V.B.；数据管理，M.G.A.和V.V.B.；撰写原始草案，M.G.A.；撰写 - 审阅和编辑，V.V.B.；可视化，M.G.A.；监督，V.V.B.；项目管理，V.V.B.；资金获取，N.F.M.和V.V.B.。所有作者都已阅读并同意该稿件的发表版本。

资金:本研究部分由俄罗斯基础研究基金会资助，资助编号为17 - 00 - 00104 KOMFI、17 - 00 - 00105 KOMFI、17 - 00 - 00109 KOMFI。文章处理费由俄罗斯基础研究基金会资助，资助编号为17 - 00 - 00105 KOMFI。

机构审查委员会声明:不适用。

知情同意声明:不适用。

数据可用性声明:本研究中呈现的数据可应通讯作者要求提供。由于法律问题，数据不公开。

利益冲突:作者声明无利益冲突。资助者在研究设计、数据收集、分析或解释、稿件撰写或决定发表结果方面均无参与。

化合物促肾上腺皮质激素(6 - 9)PGP的样本可从作者处获得。

SH-SY5Y,H₂O₂,帕金森,NF-κB,PGP修饰,脑损伤

无

线粒体中的生化背景影响乳腺癌中IDH2和ADHFE1产生2HG

无

线粒体中的生化背景影响乳腺癌中IDH2和ADHFE1产生2HG

表观信息