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与THO或Yra1结合的DEAD-box ATPase Sub2的结构与生化分析

发布时间：

2026-11-11 10:41

*通讯作者:yren@rockefeller.edu(YR)；blobel@rockefeller.edu(GB)

竞争利益:作者声明不存在任何竞争利益。

资助:见第15页

接收日期:2016年8月2日

接受日期:2016年12月22日

发布日期:2017年1月6日

审阅编辑:瑞士苏黎世联邦理工学院卡斯滕·魏斯

与THO或Yra1结合的DEAD-box ATPase Sub2的结构与生化分析

任毅*、Philip Schmiege、Günter Blobel*

美国纽约洛克菲勒大学霍华德·休斯医学研究所细胞生物学实验室

摘要 mRNA在细胞核内会在转录过程中被加工并组装成信使核糖核蛋白颗粒(mRNPs)。在通过核孔输出之前，mRNPs需要经历多次必需的重塑反应。在酵母中，其中一项反应是在异五聚体THO复合物的协助下，DEAD-box ATPase Sub2加载mRNA结合蛋白Yra1。为深入了解该反应的分子机制，我们解析了两个相关复合物的晶体结构:分辨率为6.0 Å、结合Sub2的THO异五聚体；以及结合ATP类似物、RNA和Yra1 C端片段(Yra1-C)的Sub2，分辨率为2.6 Å。我们发现，长度为25 nm的THO以半开放构象夹住Sub2；相比之下，当Sub2结合ATP类似物、RNA和Yra1-C时，会呈现闭合构象。THO和Yra1-C均能刺激Sub2的固有ATPase活性。我们提出，THO会检测每个核mRNP中的常见特征位点，从而定位Sub2，以实现Yra1的靶向加载。

DOI: 10.7554/eLife.20070.001

引言

真核生物的基因表达需要一系列高度协调的核内事件，包括转录、前体mRNA加工以及用于核输出的mRNP包装。在这些事件中，进化上保守的TREX(转录-输出)复合物是关键参与者，它可促进具有输出能力的mRNP组装，并在功能上连接转录与核输出(Masuda等人，2005；Rehwinkel等人，2004；Rodríguez-Navarro和Hurt，2011；Strässer等人，2002)。

酵母中的TREX复合物由异五聚体THO复合物、DEAD-box ATP酶Sub2以及mRNA结合蛋白Yra1组成(Chávez等人，2000；Strässer和Hurt，2000、2001)。TREX会与RNA聚合酶II(Pol II)一同沿活跃转录的基因移动(Meinel等人，2013；Strässer等人，2002)。经过加帽、剪接和多聚腺苷酸化的成熟核mRNP是TREX的潜在“底物”。从本质上讲，TREX介导的重塑会使Yra1靶向沉积在核mRNP上(Abruzzi等人，2004)，而Yra1又可作为结合异二聚体Mex67-Mtr2的平台(Strässer和Hurt，2000；Zenklusen等人，2001)。后者能够结合核孔蛋白的苯丙氨酸-甘氨酸(FG)重复区域，从而使其能够进入核孔复合物(NPC)(Fribourg等人，2001；Segref等人，1997)。尽管Mex67-Mtr2并非TREX复合物的真正成员，但Mex67可通过其泛素相关(UBA)模块与THO的Hpr1亚基结合(Gwizdek等人，2006)。总的来说，这些数据表明，TREX介导的反应会使Yra1和Mex67-Mtr2同时靶向且协同地沉积在核mRNP上，为其通过NPC输出做准备。

Sub2 ATP酶属于DEAD-box家族的RNA-蛋白质复合物重塑酶，是这些TREX介导反应的核心。先前的研究表明，Sub2 与活跃基因的结合需要完整的THO复合物，且人们认为它会在共转录mRNP包装过程中转移到mRNA上(Abruzzi等人，2004；Zenklusen等人，2002)。此外，Sub2和Mex67-Mtr2会结合到Yra1的相同区域，这表明Sub2可将Yra1招募到mRNP上，随后被Mex67.Mtr2取代(Strässer和Hurt，2001)。这些观察结果提出了一个问题:TREX如何协调Sub2的ATP水解与Yra1和Mex67.Mtr2在mRNP上的沉积。

在此，我们报告了两种相关复合物的晶体结构，以深入了解TREX进行的mRNP重塑反应。首先，与Sub2结合的360 kDa THO复合物的6.0 Å分辨率结构显示，THO在其25 nm的细长结构中间，将Sub2的两个叶以半开放的构型夹住。其次，Sub2与ATP类似物、聚(U)RNA以及Yra1的C端片段结合的2.6 Å结构显示，Sub2的两个叶处于闭合构型。我们认为，THO的作用是检测成熟核mRNP的特征，以介导Yra1和Mex67.Mtr2的ATP依赖性靶向沉积，从而启动核mRNP跨NPC输出所必需的一系列反应。

结果

THO-Sub2复合物的结构测定

THO是将Sub2招募至活跃转录基因所必需的(Zenklusen等人，2002)。然而，它们的相互作用在mRNP重塑中的分子作用尚不清楚。为了表征THO-Sub2的相互作用，我们着手利用昆虫细胞表达系统组装酵母THO复合物。先前的研究表明，THO在体内是一个稳定的结构和功能单元，敲低单个亚基会导致其他亚基的表达下调(Huertas等人，2006)。与此一致，我们只能通过共表达的方式获得THO。由于全长THO的产量较低，我们根据二级结构预测去除了潜在的无序区域，并将酿酒酵母(Saccharomyces cerevesiae)的Tex1亚基替换为海湾酵母(Saccharomyces bayanus)的Tex1，以组装THO的稳定核心模块(记为THO*)。纯化的THO*显示每个亚基的化学计量比(图1A、B)。

THO*与单独表达的全长Sub2形成复合物并进行结晶。我们利用经磷钨酸盐或溴化钽簇浸泡的晶体，通过单波长反常散射(SAD)确定了分辨率为6.0 Å的THO*-Sub2结构(图1C、表1及图1补充图1)。尽管该分辨率不足以追踪单个残基，但足以让我们表征二级结构。在该结构中，Sub2的两个RecA结构域Sub2-N和Sub2-C是利用本研究报道的Sub2结构分别建模的；Tex1的多丙氨酸模型源自WDR5，其在50-344位残基范围内与Tex1具有41%的序列同源性；THO的其余部分则由多丙氨酸螺旋构建。本文呈现的THO*-Sub2模型揭示了THO的整体结构，更重要的是，揭示了THO与Sub2之间的相互作用。

THO的结构

360 kDa的THO*-Sub2复合物显示出细长的THO*，从“头部”到“尾部”约25 nm(图1C)。其尺寸与之前从酵母中分离并通过负染电镜分析的全长THO的尺寸相近(Peña等人，2012)。两个结构从细长的基部伸出，一个靠近头部的延伸结构，以及一个代表Tex1亚基的短结构。Tex1折叠成七叶 β- propeller，其较小的顶面朝向头部。它通过propeller两侧的接触被固定在基部。

为进一步探究THO的亚基结构，我们通过N端或C端麦芽糖结合蛋白(MBP)标记，利用负染电镜定位了各亚基的位置(图1-图补充2)。我们发现Tho2和Hpr1的N端靠近头部，而它们的C端位于尾部。这些数据表明Tho2和Hpr1亚基跨越了THO*的最长维度。此外，Mft1和Thp2的N端被定位于头部，而它们的C端无法可靠定位。

图1. THO*+Sub2复合物的结构概述。(A) THO和Sub2的示意图。用于结晶的重组蛋白片段用线条标示。THO核心复合物(THO*)包含酿酒酵母(S. cerevisiae)的Tho2、Hpr1、Mft1和Thp2，以及bayanus酵母(S. bayanus)的Tex1(与酿酒酵母Tex1的序列同源性为81%)。DEAD-box ATPase Sub2包含两个类似重组酶A(RecA)的结构域，分别命名为Sub2-N和Sub2-C。(B) 纯化的THO*复合物和全长Sub2的考马斯亮蓝染色SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)结果。(C) THO*-Sub2复合物的三个视图，其中THO*为卡通表示，Sub2为表面表示。(D) Sub2的实验电子密度图，经密度修正后，在对应于C图左上方视图的水平上进行等值线绘制。

DOI: 10.7554/eLife.20070.002

图1的以下图补充可用:

图补充1. THO*-Sub2复合物的结晶。

DOI: 10.7554/eLife.20070.003

图补充2. THO的亚基结构。

DOI: 10.7554/eLife.20070.004

eLIFE 研究论文

表1. THO*-Sub2复合物结构的数据收集与精修统计。

	W-I	W-II	W-III	Ta-I	Ta-II
数据收集
空间群	P2,	P2,	P2,	P2,	P2
晶胞参数
a、b、c(Å)	152.9,	153.3,	152.7,	153.3,	153.3,
	323.0,	319.5,	322.2,	327.3,	328.1,
	176.8	176.4	175.6	175.2	174.4
β(°)	101.3	101.0	101.1	101.9	101.9
波长(Å)	1.2123	1.2141	1.2141	1.2524	1.2553
分辨率(埃)	50-6.0	50-6.8	50-7.2	50-7.6	50-7.5
	(6.1-6.0)*	(6.92-6.80)*	(7.32-7.20)*	(7.73-7.60)*	(7.63-7.50)*
Rmerge(%)	14.0 (75.1)	18.2 (112.7)	17.7 (87.6)	11.5 (85.2)	11.2 (90.5)
	13.3 (2.1)	14.4 (2.7)	11.5 (2.5)	17.3 (2.2)	17.6 (2.1)
完整性(%)	98.8 (94.8)	89.8 (78.3)	99.8 (100.0)	100.0 (100.0)	100.0 (100.0)
	99.3 (68.5)	99.5 (70.2)	99.1 (72.8)	99.7 (77.4)	99.7 (79.8)
冗余度	6.5 (4.8)	9.8 (9.7)	7.1 (7.2)	6.8 (6.8)	6.8 (6.8)
SAD phasing
分辨率	50-8.5	50-7.5	50-8.0	50-8.0	50-8.0
位点数量	11	19	19	18	18
品质因子	0.41	0.45	0.46	0.45	0.45
精修
分辨率(埃)	50-6.0
反射数
总计	41038
测试集	2078
(%)	43.6/43.4
原子数
蛋白质	30205
配体/离子	583
B-factors	200
拉氏图(%)
有利/允许/不允许	99.4/0.6/0.0
均方根偏差
键长(Å)	0.010
键角(°)	1.408

*最高分辨率壳层显示在括号中。

DOI: 10.7554/eLife.20070.005

THO 可刺激 Sub2 的 ATPase 活性

THO*-Sub2 复合物具有 Sub2 的双叶结构(图 1C 和图 2A)。有趣的是，THO* 的中间区域同时与 Sub2 的 N 端叶和 C 端叶结合，诱导形成半开放构象。Sub2 这类 DEAD-box ATPase 在 ATP 水解周期中会呈现不同构象。在无核苷酸和 RNA 的情况下，两个 RecA 结构域相互分离，代表“开放”构象(Caruthers 等，2000；Shi 等，2004)。ATP 和 RNA 的结合会诱导形成“闭合”构象，该构象对 ATP 水解具有促进作用(Sengoku 等，2006；von Moeller 等，2009)。THO*-Sub2 复合物中 Sub2 的半开放构象接近其 ATP/RNA 结合的活性状态(图 2A 和图 2—图补充件 1)。此

图 2. THO 复合物刺激 Sub2 的结构基础。(A) THO* 结合诱导 Sub2 形成半开放构象。上方面板显示对应中间面板在 THO*-Sub2 复合物中的位置。THO* 的 Tex1 亚基不与 Sub2 结合，为清晰起见在中间面板中省略。Sub2 的相互作用残基(已在 B 中进行诱变处理)以绿色高亮显示。图 2 后续内容见下一页

图 2 后续内容

下方面板为放大视图，展示密度修饰后 THO* 的实验密度图，等值线水平为 1.5σ。(B) 破坏 THO*-Sub2 的相互作用会削弱 THO* 对 Sub2 ATPase 活性的刺激作用(每摩尔 Sub2 每秒产生的 ADP 摩尔数)。误差线代表三次独立实验的标准偏差。

DOI: 10.7554/eLife.20070.006

图 2 有以下图补充件:

图补充件 1. ATP 水解周期中 Sub2 的不同构象。DOI: 10.7554/eLife.20070.007

图补充件 2. THO 和 Yra1-C 共同调控 Sub2 的 ATPase 活性。DOI: 10.7554/eLife.20070.008

图补充件 3. THO*-Sub2 与 Gle1-Dbp5、elF4G*-elF4A 以及 CNOT1-DDX6 的结构比较。DOI: 10.7554/eLife.20070.009 观察结果促使我们研究 THO 是否调控 Sub2 的 ATPase 活性。事实上，我们发现 THO* 使 Sub2 的 ATPase 活性加快了约 3.5 倍(图 2B)。THO* 对 Sub2 的刺激活性与全长 THO 的相似，表明 THO* 保留了 THO 的全部刺激效应(图 2—图补充件 2)。总体而言，我们的结果证明 THO 是一种此前未被鉴定的 Sub2 ATPase 调控因子。

值得注意的是，这种通过将两个 RecA 结构域配置为半开放构象来激活 ATPase 的机制，与其他几种 DEAD-box 蛋白的机制相同:mRNA 输出中的 Dbp5、翻译起始中的 eIF4A 以及 miRNA 介导的翻译抑制中的 DDX6，分别由 Gle1、elF4G 和 CNOT1 激活(图 2—图补充件 3)(Folkmann 等，2011；Mathys 等，2014；Montpetit 等，2011；Schütz 等，2008)。此外，THO*-Sub2 界面处的螺旋对排列方式与 Gle1、elF4G 和 CNOT1 的 MIF4G(elF4G 中间区域)结构域相似，进一步表明 DEAD-box ATPase 激活机制具有保守性。

含MIF4G结构域的激活因子对DEAD-box蛋白C端RecA结构域的识别是激活ATP水解的关键相互作用(Hilbert et al., 2011；Montpetit et al., 2011)。在Sub2的C叶，由E356、K357和R358形成的环朝向THO*(图2A)。我们发现，Sub2 E356A/K357A/R358A突变体的ATP酶活性不再被THO*激活，这表明THO与Sub2-C之间的相互作用具有关键作用(图2B)。在Sub2的N叶，THO*识别由Sub2的两个螺旋形成的凹槽(图2A)。Sub2在该界面的D66A和L68D突变体削弱了THO*的刺激效应(图2B)。综上，这些基于结构的诱变研究表明，THO对Sub2 ATP酶活性的刺激需要与Sub2的两个叶均发生相互作用。

结合THO的Sub2的半开放构象可能代表了有效结合mRNP的“预备”状态。Sub2这类DEAD-box蛋白缺乏RNA特异性，因此它们需通过其结合伙伴被引导至生理RNA底物(Linder and Jankowsky, 2011)。最近研究表明，THO可直接结合最大的Pol II亚基的磷酸化C端结构域(CTD)(Meinel et al., 2013)。此外，Sub2在活跃基因上的共转录加载需要THO的Hpr1亚基(Zenklusen et al., 2002)。因此，THO非常适合将Sub2招募至转录机器、使其预备并靶向合适的mRNP底物，可能是那些已被正确加工的底物。

Sub2·Yra1-C-RNA复合物的结构表征

根据对Sub2人类同源物的研究，Sub2可通过ATP依赖方式将Yra1加载到mRNP上(Dufu等人，2010；Luo等人，2001；Taniguchi和Ohno，2008)。为阐明Sub2介导Yra1沉积的分子基础——这是TREX介导的重塑反应之一，我们尝试确定二者复合物的结构。Yra1在两端(N盒和C盒)含有两个保守基序，参与Sub2结合(图3A)。Yra1的这两个基序通过可变区(N-vr和C-vr)与中央保守RRM结构域相连，这些可变区参与RNA结合(Hautbergue等人，2008；Zenklusen等人，2001)。全长Yra1在常规缓冲液条件下不溶。遗传研究表明，N盒和C盒基序在功能上具有冗余性，但缺失C盒的Yra1突变体表现出更强的生长表型(Zenklusen等人，2001)。因此，我们聚焦于Yra1的C端片段Yra1-C(氨基酸185-226)，其包含C-vr和C盒，以研究其与Sub2的相互作用。

图3. Sub2·Yra1-C*·RNA复合物的晶体结构。(A) Yra1的示意图。Yra1-C和Yra1-C*分别用于生化实验和结晶研究。(B) Sub2·Yra1-C*·RNA复合物的两种取向卡通图。(C和D) Sub2-RNA和Sub2-Yra1相互作用的细节，对应于B右侧面板的视图。极性相互作用网络以黑色虚线表示。(E) Sub2-Yra1相互作用的示意图。黑色虚线表示极性相互作用，黑线表示范德华相互作用。DOI: 10.7554/eLife.20070.010

图3的以下补充图可用:

补充图1. DEAD-box蛋白的RNA结合能力比较。DOI: 10.7554/eLife.20070.011

补充图2. Yra1-C的多物种序列比对。

DOI: 10.7554/eLife.20070.012 (Zenklusen等人，2001)。因此，我们聚焦于Yra1的C端片段Yra1-C(氨基酸185-226)，其包含C-vr和C盒，以研究其与Sub2的相互作用。

我们解析了 Sub2(氨基酸残基 62-446)与截短型 Yra1-C(Yra1-C*，氨基酸残基 200-226)、聚尿嘧啶 15 聚体 RNA 以及不可水解的 ATP 类似物 ADP-BeF₃ 的 2.6 埃分辨率晶体结构(图 3B 和表 2)。在该 Sub2-Yra1-C*-RNA 复合物中，Sub2 呈闭合构象，ADP-BeF₃ 与 6 个核苷酸的 RNA(U1 至 U6)结合在 Sub2-N 与 Sub2-C 之间(图 3B、C 及图 2—图补充 1)。与其他结合 RNA 的 DEAD-box ATP 酶结构中观察到的情况类似，RNA 在 U4 和 U5 之间发生急剧弯曲(图 3—图补充 1)。Sub2 被 Yra1 的保守 C-box(氨基酸残基 208-226)识别，该区域折叠为螺旋结构，恰好嵌入 Sub2-N 的两个螺旋形成的凹槽中(图 3—图补充 2)。可能由于柔性较高，晶体结构中缺失了 C-vr 区域和 9 个核苷酸 RNA 的电子密度。Sub2 与 Yra1 之间的相互作用涉及多个 Yra1 残基(图 3D、E)。具体而言，Yra1 的 D216、E218 和 Y222 与 Sub2 形成关键的极性相互作用，而 L215、M219 和 Y222 则在界面处参与范德华相互作用。

表2. Sub2·Yra1*-C*RNA复合物结构的数据收集和修正统计。

Sub2·Yra1-C*-RNA

数据收集
空间群	P3,21
晶胞参数
a、b、c(Å)	99.3, 99.3, 247.5
	90, 90, 120
波长(Å)	0.9792
分辨率(埃)	50-2.6 (2.69-2.60)*
Rmerge(%)	16.4 (101.6)
	13.3 (2.3)
完整性(%)	100.0 (100.0)
CC1/2	99.4 (72.9)
冗余度	9.9 (8.9)
精修
分辨率(埃)	50-2.6
反射数
总计	44,413
测试集	2235
(%)	21.9/26.8
原子数
蛋白质	9644
RNA	360
配体/离子	96
水	27
B-factors
蛋白质	56.3
RNA	68.1
配体/离子	46.2
水	34.9
拉氏图(%)
favored/允许/不允许	97.6/2.4/0.0
均方根偏差
键长(Å)	0.007
键角(°)	1.076

*最高分辨率壳层显示在括号中。

DOI: 10.7554/eLife.20070.013

Sub2与Yra1协同结合RNA

Sub2与其他DEAD-box蛋白类似(Linder和Jankowsky，2011)，主要与RNA的磷酸核糖骨架相互作用，其中Sub2的N端和C端分别与RNA的3’端和5’端接触(图3B、C及图3—图补充1)。值得注意的是，Yra1的C-vr区域位于C-box之前，且靠近RNA，这增加了其延伸Sub2-Yra1-C-RNA复合物中RNA结合位点的可能性。因此，我们研究了Yra1是否会影响Sub2的RNA结合特性。

通过使用聚尿嘧啶 RNA 的电泳迁移率变动分析，我们发现，在不可水解的 ATP 类似物 ATP-γ-S 存在时，Sub2 与 RNA 会形成复合物(图 4A，比较泳道 1 和 2)。此外，Yra1-C 能够结合 RNA，而单独的 C-box 则不能，这表明 RNA 结合能力确实存在于 C-vr 区域(图 4A，比较泳道 3 和 8)。Yra1-C 的存在促进了 Sub2-RNA 的相互作用，形成了三聚体 Sub2-Yra1-C-RNA 复合物(图 4A，比较泳道 2 和 4-6)。重要的是，Yra1-C 对 Sub2 结合 RNA 的这种促进作用依赖于 ATP-γ-S 和 Yra1 的 C-vr 区域的同时存在(图 4A，比较泳道 6、7 和 9)。我们的结构生物学和生物化学研究表明，Sub2 和 Yra1-C 通过在空间上并置它们的 RNA 结合区域，协同结合 RNA。

图4. Sub2与Yra1协同结合RNA。(A) Yra1对Sub2 RNA结合特性的影响。使用荧光标记的20聚体多聚尿嘧啶RNA进行电泳迁移率变动分析。注意，Sub2•RNA复合物(用星号标记)的迁移速度略快于Sub2•Yra1-C•RNA复合物。(B) 破坏Yra1-Sub2或Yra1-RNA的相互作用会削弱Yra1对Sub2 ATP酶活性的刺激作用。误差线代表三次独立实验的标准偏差。单独Sub2的反应速率与图2B中的相同。(C) Sub2、Yra1-C与RNA相互作用的示意图。箭头表示Yra1的C-vr区域与RNA之间的潜在相互作用，该相互作用基于A部分的生化研究以及Sub2•Yra1-C*•RNA结构中C-box的位置。

DOI: 10.7554/eLife.20070.014

Yra1 可刺激 Sub2 的 ATP 酶活性

此前研究表明，人源 Alyref(酵母中的 Yra1)是 UAP56(酵母中的 Sub2)ATP 酶的激活因子(Chang 等，2013；Taniguchi 和 Ohno，2008)。为验证该机制是否在酵母中保守，我们检测了 Yra1-C 对 Sub2 ATP 酶活性的影响。结果发现，Yra1-C 可将 Sub2 的 ATP 酶活性提升约 2 倍(图 4B)，这与全长 Alyref 对 UAP56 约 3 倍的刺激效果相当。由于 Yra1-C 可在 Sub2-Yra1-C-RNA 复合物中同时与 Sub2 和 RNA 结合，我们进一步评估了每种相互作用对 Sub2 刺激的贡献。我们在 Yra1 上引入 L215D 或 D216K 突变，分别破坏 Sub2-Yra1 界面的疏水或极性相互作用(图 3D)。结果发现，这两种突变均会消除 Yra1-C 的刺激作用(图 4B)。同样，缺失 C-vr RNA 结合区域的单独 C-box 也无法刺激 Sub2。综上，我们得出结论:Yra1-C 具有双重相互作用模式，其中 C-box 结合 Sub2-N，C-vr 结合 RNA，两者均对 Sub2 的激活起作用(图 4C)。

为进一步探究 THO 和 Yra1 如何共同调控 Sub2 的活性，我们在同时存在 THO 和 Yra1-C 的条件下进行了 ATP 酶实验(图 2—图补充 2)。有趣的是，Sub2 的 ATP 酶活性提升了约 4.2 倍，效果比单独使用 THO 或 Yra1-C 更强。我们的结果表明，THO 和 Yra1 会协同调控 Sub2。

需要注意的是，Sub2 的 RNA 结合在 ATP 酶循环中是瞬时的，仅在 ATP 周转被抑制时才能检测到。ADP-BeF 捕获的 Sub2、Yra1-C 和 RNA 的稳定三聚体复合物，是 Sub2 在 mRNP 上依赖 ATP 招募 Yra1 的关键快照。在该阶段，Yra1 通过 C-vr 区域与转录本结合。随后 ATP 水解会触发 Sub2 释放，其在 mRNP 上的位置可能由 Yra1 中嵌入的其他 RNA 结合区域(N-vr 和 RRM)占据。我们对 Sub2-Yra1 相互作用的研究明确表明，Sub2 的 ATP 水解循环与 Yra1 加载到 mRNP 的过程相偶联。

其他一些蛋白也被证实含有 C-box 基序，例如 Uif、Chtop 和 Luzp4，它们均能结合 RNA(Chang 等，2013；Hautbergue 等，2009；Viphakone 等，2015)。其中，Chtop 已被报道可刺激 UAP56 的 ATP 酶活性(Chang 等，2013)。除 Alyref 外，UAP56 可能通过相同机制将这些因子加载到 mRNP 上。与 Sub2 和 Yra1 类似，翻译起始因子 elF4A 与其激活因子 elF4B 和 eIF4H 也存在类似的相互作用模式(Rozovsky 等，2008)。eIF4B 和 eIF4H 结合在 eIF4A 的同一区域，该区域包含 Yra1 识别 Sub2 的类似区域。此外，eIF4B 和 eIF4H 还会与 RNA 形成额外的瞬时相互作用，从而提高其与 eIF4A 复合物的 RNA 亲和力。eIF4B 和 eIF4H 刺激 eIF4A 的机制可能类似于 Yra1 刺激 Sub2 的机制。因此，含 C-box 的蛋白与 elF4B、eIF4H 一起，可能代表了除含 MIF4G 结构域的激活因子之外的一类新的 DEAD-box ATP 酶调控因子。

讨论

TREX 复合物在招募输出因子以形成具备输出能力的 mRNP 的过程中发挥关键作用(Rodríguez-Navarro 和 Hurt，2011；Stewart，2010)。本研究中，我们的结构观察结合生化研究，提供了这些由 TREX 介导的 mRNP 重塑反应的分子快照(图 5)。我们的数据支持这样一种模型:THO 通过 ATP 依赖的过程，介导 Yra1 和 Mex67.Mtr2 在 mRNP 上的靶向沉积。

先前的研究表明，Sub2 ATP 酶通过 THO 复合物被招募到转录机器上，而 THO 复合物可直接结合磷酸化的 Pol II CTD(Meinel 等，2013；Zenklusen 等，2002)。通过这种方式，THO 会使 Sub2 与正在延伸的 mRNA 转录本在空间上靠近。我们的研究表明，THO 的结合不仅仅是物理上的附着。在与 THO 的复合物中，Sub2 呈现半开放构象，这与其催化活性状态相似。有趣的是，我们发现 THO 可刺激 Sub2 的 ATP 酶活性。我们的数据支持这样一种观点:THO 通过使 Sub2 形成半开放构象，使其做好与 mRNA 结合的准备。目前，限制 TREX 活性仅作用于正确加工的转录本的机制尚不清楚。THO 可能在识别 mRNP 的某种特征后将 Sub2 沉积下来。先前的研究表明，TREX 在全基因组范围内发挥作用，既作用于无内含子基因，也作用于含内含子基因(Abruzzi 等，2004；Lei 等，2011；Masuda 等，2005)。然而，THO 是否识别这两种类型转录本的通用特征仍有待确定。

图 5. 核输出前 TREX 介导的 mRNP 重塑工作模型。THO 识别正确加工的 mRNP 的某些特征，使 Sub2 预形成半开放构象，并介导 Sub2 和 Yra1 在 mRNP 上的靶向沉积。随后，THO 和 Yra1 协助输出受体 Mex67-Mtr2 的加载，从而启动 mRNP 核输出所需的一系列必需反应。

DOI: 10.7554/eLife.20070.015

目前尚不清楚 Sub2 触发核 mRNP 上特定重塑事件的本质。我们的生化和结构分析揭示了稳定的 Sub2-Yra1-C-RNA 复合物的存在，这表明 Sub2 与 mRNP 的 ATP 依赖结合与 Yra1 的加载相关联。由于 THO 和 Yra1 在体外可共同刺激 Sub2 的 ATPase 活性(图 2-图补充 2C)，THO 和 Yra1 可能共同作用，将 Sub2 和 Yra1 加载到 mRNP 上。在后续的重塑反应中，THO 可能会在协助加载 Mex67.Mtr2 时留在原位(见下文讨论)。先前研究表明，TREX 的功能与 pre-mRNA 3’端加工相关，这是通过 Yra1 与 Pcf11 的相互作用实现的，Pcf11 是切割-多聚腺苷酸化因子 CF1A 的 Pol II CTD 结合亚基(Johnson 等，2009、2011)。已有研究表明，Yra1 被 Pcf11 招募至转录机制，随后与 Sub2 协同沉积到 mRNP 上。pre-mRNA 3’端加工与 TREX 介导的 mRNP 组装之间这种交叉对话的精确机制有待进一步研究。还应注意的是，Yra1 的 C 盒(介导 Sub2 结合)已在其他 mRNA 结合蛋白中发现，包括 Uif、Chtop 和 Luzp4，所有这些蛋白都与 UAP56 ATPase、RNA 以及输出受体 TAP•p15(酵母中为 Mex67•Mtr2)相互作用(Chang 等，2013；Hautbergue 等，2009；Viphakone 等，2015)。因此，在高等真核生物中，ATP 依赖的输出因子在 mRNP 上的沉积可能是含 C 盒蛋白的保守机制。

由于Mex67•Mtr2与Sub2对Yra1的结合相互排斥，因此认为Mex67•Mtr2的结合会驱动Sub2从mRNP上解离(Strässer和Hurt，2001)。此外，THO还通过Hpr1亚基参与Mex67.Mtr2的加载(Gwizdek等人，2006)。同样，对人类TREX复合物的研究表明，Alyref和Thoc5(人类THO的一个亚基)均与TAP-p15相互作用，并促进RNA与TAP-p15的结合(Viphakone等人，2012)。因此，TREX作为招募平台，将输出因子在空间上与新生转录本靠近，并协调mRNP组装的多个步骤。我们当前的工作为未来研究核输出前TREX介导的mRNP重塑提供了起点。

材料与方法

蛋白制备

酵母THO复合物在High-Five昆虫细胞中表达，方法是共感染编码THO亚基的重组杆状病毒(如无特别说明，均为酿酒酵母蛋白)。为制备全长THO复合物，除Thp2未加标签外，每个亚基均带有可被TEV切割的N端His标签。为结晶，研究人员检测了多种包含酿酒酵母和S. bayanus THO亚基的嵌合THO复合物；其中一种稳定的嵌合THO核心复合物(THO*)已成功结晶。为制备THO*，Tho2(残基1-1207)和Tex1(S. bayanus，残基1-380)亚基带有可被TEV切割的N端His标签，而Hpr1(残基1-603)、Mft1(残基1-256)和Thp2(残基1-261)未加标签。为负染电镜，THO*亚基还在N端或C端带有麦芽糖结合蛋白(MBP)标签。

感染后收获High-Five细胞。蛋白纯化在进行。将细胞沉淀、重悬后，在含 Tris-HCl(pH 8.0)、300 mM NaCl、10 mM咪唑、1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF)、5 mg/L抑肽酶、1 mg/L胃蛋白酶抑制剂、1 mg/L亮抑肽酶和0.5 mM Tris(2-羧乙基)膦(TCEP)的裂解缓冲液中超声处理。用于结晶和生化研究的THO复合物通过亲和层析纯化，随后用TEV酶切去除N端His标签。用于电镜研究的MBP标签THO复合物在直链淀粉树脂上纯化。亲和层析后，蛋白复合物进一步经Mono Q阴离子交换柱(GE Healthcare, Piscataway, NJ)纯化，并在10 mM Tris-HCl(pH 8.0)、150 mM NaCl和0.5 mM TCEP中使用Superose 6柱(GE Healthcare)进行尺寸排阻色谱。纯化后的蛋白浓缩，液氮速冻后于保存。

Sub2和Yra1变体(Yra1 C-box除外)在大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL细胞(Stratagene)中表达，带有可被TEV切割的N端GST标签。定点突变通过重叠延伸PCR完成。在为1.0时，用异丙基-β- -D-硫代半乳糖苷(IPTG)在诱导蛋白表达。将细胞沉淀、重悬后，在裂解缓冲液中超声处理。GST标签蛋白使用谷胱甘肽琼脂糖4 Fast Flow亲和柱(GE Healthcare)纯化。用TEV去除GST标签后，样品上样至Mono Q柱(用于Sub2变体)或Mono S柱(GE Healthcare，用于Yra1变体)，随后在10 mM Tris-HCl(pH 8.0)、150 mM NaCl和0.5 mM TCEP中使用Superdex 200柱(GE Healthcare)进行尺寸排阻色谱。纯化后的蛋白浓缩，液氮速冻后于-80℃保存。Yra1的C-box(氨基酸208-226)由GenScript合成。

THO*-Sub2复合物的结晶与数据收集

在和1 mM ADP存在下，将THO*复合物与Sub2以1:1.5的摩尔比混合。采用坐滴气相扩散法，在16℃下利用该蛋白质混合物的、储存液的 (100 mM Tris-HCl，pH 8.4，17.5% PEG3350，2%甲醇)以及0.2 μl的3.0 M NDSB-195(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)，获得了THO*-Sub2复合物的晶体。要获得高质量晶体，需进行 streak seeding。

为制备磷钨酸簇 (德国Jena Bioscience)衍生物晶体，将结晶滴中的溶液替换为100 mM HEPES(pH 7.5)、17.5% PEG3350；将溶解于该缓冲液的以最终浓度加入滴中。3天后，将蛋白质晶体通过三步逐步提高PEG400浓度转移至冷冻保护液(100 mM HEPES，pH 7.5，17.5% PEG3350，20% PEG400)，并快速冷冻于液氮中。为制备溴化钽簇([Ta Br ]Br ，Jena Bioscience)衍生物，将晶体浸泡于和 Tris-HCl(pH 8.4)、17.5% PEG3350中。1天后，将蛋白质晶体通过三步逐步提高PEG400浓度转移至冷冻保护液(100 mM Tris-HCl，pH 8.4，17.5% PEG3350，20% PEG400)，并快速冷冻于液氮中。

X射线衍射数据在APS的ID24-C光束线以及NSLS的X25和X29光束线收集。所有数据均使用HKL程序包处理(表1)(Otwinowski and Minor, 1997)。THO*-Sub2复合物的晶体属于P2₁空间群，晶胞尺寸为。这些晶体通常可衍射至6-8Å分辨率。重原子浸泡虽使晶胞缩小至，但并未提高分辨率。

THO*-Sub2复合物的结构测定

初始相位通过单波长反常衍射(SAD)获得，所用软件为Phenix(Adams等人，2010)。实验图谱由3个浸泡了磷钨酸簇的晶体(W-I、W-II和W-III)以及2个浸泡了溴化钽簇的晶体(Ta-I和Ta-II)独立计算得到。重原子亚结构使我们能够通过PROFESSS(Collaborative Computational Project, Number 4，1994)识别出THO*-Sub2晶体的二重非晶体学对称性(NCS)。所得电子密度图谱质量足够高，可清晰识别出对应Tex1亚基的七叶 - propeller。与其他THO亚基的二级结构预测结果一致，对应 - 螺旋的杆状电子密度构成了电子密度图谱的主要区域。

我们利用从W-II计算得到的实验图谱进行了第一轮模型构建。在适用情况下，使用COOT(Emsley和Cowtan，2004)将理想的聚丙氨酸 - 螺旋拟合到杆状密度中。本研究报道的Sub2结构(图3B)中的Sub2 N端和C端RecA样结构域，通过Molrep(Vagin和Teplyakov，1997)独立定位到实验密度图谱中。THO*的Tex1亚基以 - 螺旋桨蛋白WDR5(PDB 2CNX)为模板进行建模，在50-344位残基范围内，其与S. bayanus的Tex1序列同源性为41%。将WDR5中连接 - 链的所有环删除，剩余残基均突变为丙氨酸，再通过Molrep(Vagin和Teplyakov，1997)将其定位到实验密度图谱中。由于Tex1螺旋桨的七重旋转对称性，我们无法明确确定其N/C端，因此此处的Tex1模型仅用于展示整体折叠情况。

初始模型使我们能够生成结构域掩模，用于后续使用DMMULTI(Cowtan，1994)进行多晶体、多结构域NCS平均和相位扩展。通过检查不同重原子衍生物的实验图谱差异，将THO*-Sub2模型拆分为多个结构域。上述5组数据集(W-I、W-II、W-III、Ta-I和Ta-II)用于密度修饰。所得图谱的扩展相位达到6.0 Å，显著降低了噪声并提高了电子密度的连续性。THO*-Sub2模型使用COOT(Emsley和Cowtan，2004)进行了相应重建。

我们使用Phenix(Adams等人，2010)在6.0 Å分辨率下进行了刚体精修。共定义了11个刚体，包括Sub2 N端结构域、Sub2 C端结构域、Tex1以及8个THO结构域。精修后的图谱与实验相位图谱高度相似。对螺旋进行修剪/延伸和/或居中处理，以适配2Fo-Fc图谱。Sub2 N端延伸区(残基1-61)可能无序，因为未观察到连接至Sub2模型现有N端的电子密度。虽然ADP是获得THO*-Sub2晶体的必要条件，但目前尚不清楚ADP是否结合在Sub2上。在此分辨率下，连接螺旋的许多环不可见，因此除Sub2和Tex1外，其他亚基的身份无法确定。为验证模型，我们生成了省略图谱，该图谱在省略螺旋的预期位置显示出电子密度(图1 - 图补充1)。分子图形使用PyMOL(http://www.pymol.org)生成。

Sub2.Yra1-C*-RNA复合物的结晶与结构测定

将Sub2(氨基酸残基62-446)、Yra1-C*(氨基酸残基200-226)与poly(U) 15聚体RNA按1:1.2:1.2的摩尔比混合，加入和 (ADP:Be:F的制备比例为1:4:20)。采用坐滴气相扩散法，在条件下培养晶体， reservoir溶液包含100 mM Bis-Tris(pH 5.5)、20% PEG3350和0.2 M乙酸铵。晶体经三步逐步提高PEG400浓度转移至冷冻保护液(100 mM Bis-Tris，pH 5.5，20% PEG3350，0.2 M乙酸铵，20% PEG400)，随后投入液氮快速冷冻。

X射线衍射数据在APS的ID24-C光束线收集。数据采用XDS和AIMLESS处理(表2)(Collaborative Computational Project, Number 4, 1994；Kabsch, 2010)。利用Phenix AutoMR解析结构，通过搜索UAP56(PDB 1XTJ，人源Sub2)的每个RecA样结构域的三个拷贝实现分子置换(Adams等人，2010)。基于该分子置换结果，在COOT中重建模型，随后用Phenix在2.6 Å分辨率下进行精修(Adams等人，2010；Emsley和Cowtan，2004)。最终的Sub2-Yra1-C*•RNA结构包含Sub2(氨基酸残基62-444)、Yra1(氨基酸残基208-224)和poly(U) 6聚体RNA。分子图形使用PyMOL生成(http://www.pymol.org)。

电子显微镜与图像处理

样品采用0.75%(w/v)甲酸铀负染法制备(Ohi等人，2004年)。数据采集使用配备肖特基场发射枪的Tecnai F20(FEI)，加速电压为。采用SerialEM(Mastronarde，2005年)，在经校准的放大倍数和散焦值下，通过低剂量程序自动采集数据。图像记录于 CCD Tietz相机，合并因子为2，对应样品级像素尺寸为。

使用BOXER(Ludtke等人，1999年)从原始显微照片中手动筛选出总计8070个THO*、6988个MBP-Tho2 THO*、6501个Tho2-MBP THO*、5288个MBP-Hpr1 THO*、8321个Hpr1-MBP THO*、7492个MBP-Mft1 THO*和8394个MBP-Thp2 THO*颗粒。使用EMAN2软件包(Tang等人，2007年)进行对比度传递函数校正后，这些颗粒经SPIDER(Frank等人，1996年)进行旋转和平移对齐，并进行无参考对齐和K均值分类，指定输出类别数为100-125个。

ATP酶测定

采用NADH酶偶联吸光度分析法对稳态ATP酶活性进行分析(Montpetit等人，2012年)。简要来说，标准ATP酶反应体系包含指定蛋白(Sub2或THO的浓度为2 µM，Yra1的浓度为10 µM)、20 mM HEPES(pH 7.0)、100 mM NaCl、2 mM MgCl、1 mM TCEP、10 µM聚(U) 20聚体RNA(除非另有说明)、1 mM ATP、2 mM磷酸烯醇式丙酮酸、0.2 mM NADH以及1%(体积/体积)丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶(Sigma)。使用BioTek Synergy NEO微孔板读数仪在处监测处的紫外吸光度。反应速率根据线性阶段的斜率计算，该斜率显示NADH吸光度随时间的降低。

电泳迁移率变动分析

针对图4A中的实验，将5’端用Alexa488标记的20 nM poly(U) 20聚体RNA与Sub2、Yra1变体以及1 mM核苷酸混合，混合液置于含20 mM HEPES(pH 7.0)、100 mM NaCl、1 mM TCEP、2 mM MgCl 、5%甘油和0.5 U/μl SUPERase-In RNase抑制剂(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司)的缓冲液中。将混合物在室温下孵育。样品在含45 mM Tris-硼酸制备的5%非变性PAGE凝胶上分离。使用Typhoon 9400可变模式成像仪(GE Healthcare)对RNA进行可视化。

登录号

已报道晶体结构的原子坐标和结构因子已存入蛋白质数据库，登录号为5SUP和5SUQ。

致谢

我们感谢国家同步辐射光源X25和X29光束线的Annie Heroux，以及高级光子源24ID-C光束线的Raj Rajashankar和Sukumar Narayanasami在X射线数据采集方面提供的帮助；感谢纽约结构生物学中心(NYSBC)的Edward Eng和William Rice在电镜数据采集与分析方面提供的帮助；感谢Phil Jeffrey在X射线结构测定方面给予的支持；感谢Elias Coutavas和李晓春对稿件提出的重要意见。NYSBC采集的数据得益于NYSTAR的资助。本研究是在得到研究设施改进计划支持建造的设施中开展的

eLIFE 研究论文

美国国立卫生研究院国家研究资源中心的资助编号C06RR017528-01-CEM。YR获得了洛克菲勒大学的“女性与科学奖学金”支持。

补充信息

资金

资助方	作者
霍华德·休斯医学研究所	任艺
教程	Philip Schmiege
	Gunter Blobel
资助方未参与研究设计、数据收集与解读，也未参与将该研究成果提交发表的决策。

作者贡献

YR:概念构思、数据管理、形式分析、撰写初稿、审阅与编辑；PS:数据管理、形式分析、审阅与编辑；GB:概念构思、形式分析、资金获取、撰写初稿、审阅与编辑

作者 ORCID

Günter Blobel, http://orcid.org/0000-0002-7839-8341

附加文件

主要数据集

已生成以下数据集:

作者	年份	数据集标题	Dataset URL	数据库、许可及获取信息
Ren Y, Schmiege P, Blobel G	2016	mRNA 输出因子的结构	http://www.rcsb.org/ pdb/explore/explore.do? structureld=5SUP	可在 RCSB 蛋白质数据库公开获取(登录号:5SUP)
Ren Y, Blobel G	2016	mRNA 输出因子的结构	http://www.rcsb.org/ pdb/explore/explore.do? structureld=5SUQ	可在 RCSB 蛋白质数据库公开获取(登录号:5SUQ)

参考文献

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Adams PD, Afonine PV, Bunkóczi G, Chen VB, Davis IW, Echols N, Headd JJ, Hung LW, Kapral GJ, Grosse-Kunstleve RW, McCoy AJ, Moriarty NW, Oeffner R, Read RJ, Richardson DC, Richardson JS, Terwilliger TC, Zwart PH. 2010. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 66:213-221. doi: 10.1107/S0907444909052925, PMID: 20124702

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Chang CT, Hautbergue GM, Walsh MJ, Viphakone N, van Dijk TB, Philipsen S, Wilson SA. 2013. Chtop is a component of the dynamic TREX mRNA export complex. The EMBO Journal 32:473-486. doi: 10.1038/emboj. 2012.342, PMID: 23299939

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酵母TREX,THO,Sub2,ATP酶,mRNP,mRNA

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