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时空性H2O2脉冲协调肌动蛋白细胞骨架重塑，并调控细胞迁移与伤口愈合

发布时间：

2026-11-11 21:03

时空性H₂O₂脉冲协调肌动蛋白细胞骨架重塑，并调控细胞迁移与伤口愈合

Maurice O’Mara、张穗盛及 Ulla G. Knaus(C)

受损屏障上皮的有序修复对于控制感染、缓解炎症及维持物理保护至关重要。半胱氨酸硫醇与蛋氨酸氧化与细胞迁移和伤口愈合中的细胞骨架重排相关，但如何实现局部氧化还原信号传导以调控这些动态过程仍不清楚。本研究鉴定出黏膜屏障 NADPH 氧化酶 DUOX2 为囊泡结合型来源，其定位于细胞骨架重组位点，并促进隧道纳米管与片状伪足的形成。利用可示踪的荧光 DUOX2 及膜结合型传感器 HyPer7-MEM，可深入了解 DUOX2 囊泡运输及肌动蛋白聚合与动态重塑位点的生成。稳定表达或敲除实验证实，DUOX2 产生的是细胞间连接、随机运动及定向迁移的催化剂。我们鉴定出一条信号轴，从机械传感器 PIEZO1 到 DUOX2 及 FER 酪氨酸激酶激活，进而启动上皮细胞中回缩波介导的高效伤口闭合，这是屏障完整性的先决条件。

肌动球蛋白细胞骨架会响应机械与生化信号而持续重塑。肌动蛋白丝与微管对于细胞形态、细胞器组装、囊泡运输、增殖及运动至关重要。细胞迁移需要细胞骨架的全面重组，将前缘的突出力与后缘的收缩力相结合。氧化还原信号长期以来被认为是运动相关过程的重要调控因子，包括肌动蛋白聚合与解聚、F-肌动蛋白分支、细胞突起延伸及后缘回缩。会氧化 -肌动蛋白(Cys376)和 -肌动蛋白(Cys374)C 端半胱氨酸残基上的 F-肌动蛋白与 G-肌动蛋白，影响肌动蛋白聚合组装与伸长率。黄素依赖性单加氧酶 MICAL 对 F-肌动蛋白 Met44 和 Met47 的氧化会导致肌动蛋白丝解聚与切割。细胞内的增加会激活氧化还原调控的酪氨酸激酶，如 SRC、ABL 或 FER，进而导致皮质肌动蛋白结合蛋白(一种结合活化的 Arp3 并稳定分支肌动蛋白网络的成核促进因子)的酪氨酸磷酸化。许多其他与细胞骨架重塑相关的蛋白也受氧化调控，其中包括 GTPase RhoA、MHC II 型、丝切蛋白-1 及蛋白磷酸酶。

胞质中丰富的降解酶(如过氧化还原蛋白)表明，有必要快速、局部地产生，以实现信号分子的时空氧化。NADPH 氧化酶(NOX)是实现这一功能的理想候选酶，这是由于其区室化定位以及对催化活性的复杂调控。尽管所有七种哺乳动物 NOX 酶(NOX1-5、DUOX1-2)都含有对将电子从 NADPH 转移至氧气至关重要的同源结构元件，但它们的酶复合物组成、翻译后修饰和调控机制各不相同。NADPH 氧化酶已被证实参与多种细胞类型中的细胞迁移，并通过不同机制发挥作用。在斑马鱼和果蝇中，对损伤的即时反应会诱导钙闪烁，通过结合 DUOX 的 EF 手结构基序激活 DUOX，进而触发的产生；该物质可作为中性粒细胞的趋化剂，并改变信号反应。哺乳动物中存在两种高度同源的 DUOX 酶，二者主要表达于甲状腺以及胃肠道、呼吸系统、胰腺和胆囊的黏膜屏障上皮中。

收稿日期:2024 年 11 月 23 日

接收日期:2025 年 7 月 14 日

在线出版:2025年7月25日

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爱尔兰都柏林，都柏林大学学院医学院康威研究所。 \电子邮件:ulla.knaus@ucd.ie

在植物中，钙触发的细胞间波与NOX5相关的NADPH氧化酶RBOHD 有关，且该过程已通过熏蒸的或光学纳米传感器得到证实。基因编码的探针(如氧化还原敏感荧光蛋白roGFP-Orp1)的开发，或将细菌传感蛋白(OxyR)与环状排列GFP(HyPer)偶联，实现了的实时检测。将这些工具与NOX亚型在不同细胞区室的定位相结合，可深入了解NADPH氧化酶产生的信号的时空起始与终止及其下游效应。在此，我们确定DUOX2是不同膜区室的来源，可在延伸和收缩的肌动蛋白结构处动态产生爆发。DUOX2衍生的有助于片状伪足形成，促进细胞迁移，并通过向FER酪氨酸激酶和皮质肌动蛋白结合蛋白传递机械感受信号，对高效伤口闭合和屏障功能恢复至关重要。

结果

DUOX2囊泡运输的表征

为研究DUOX2如何参与时空调控的细胞骨架动态变化，我们对因表观遗传沉默而缺乏DUOX1/2且不表达其他NADPH 的肺上皮细胞NCI-H661进行慢病毒转导，导入DUOXA2(对照)——DUOX2的关键二聚化伴侣，随后分别导入多表位标记的野生型DUOX2(DUOX2 WT)或催化失活的DUOX2突变体(DUOX2 E843Q) (图1a)。通过表位标签(HA)和DUOX2特异性抗体检测，DUOX2 WT与突变体的表达量(180 kDa)相当(图1b)。正如预期，仅表达DUOXA2或DUOX2 E843Q/DUOXA2的H661细胞在刺激时不产生，而DUOX2 WT/DUOXA2产生的能力与之前使用的野生型或单HA标记的DUOX2相当(图1c) 。DUOX2突变体的内膜和细胞表面定位与DUOX2 WT一致(图1d，补充图1a)。为进行活细胞分析，我们通过在DUOX2的N端附近插入胆红素诱导型荧光蛋白UnaG 构建了荧光标记的DUOX2(图1e)。选择UnaG是因为其桶状结构(PDB 4I3B)且分子量较小(UnaG为15.6 kDa，GFP为28 kDa)。与HA-DUOX2相比，H661-DUOXA2细胞中UnaG-DUOX2(195 kDa，图1f)的表达略有下降，这与生成能力的小幅降低相关(图1g)。免疫荧光显微镜检测显示，UnaG荧光信号与抗DUOX染色检测到的DUOX2共定位(图1h，补充图1b)，证实成功构建了功能完整的荧光DUOX2。

DUOX2的质膜定位已有描述，但DUOX2阳性囊泡的性质仍未明确。在活细胞成像中，我们观察到小型UnaG-DUOX2阳性囊泡持续从内膜运输至质膜，UnaG-DUOX2在细胞表面停留后，内吞进入更大的囊泡(图1i，补充视频1)。活细胞成像显示，这些UnaG-DUOX2囊泡被运输至细胞发生膜延伸的区域。我们证实这些荧光囊泡确实为DUOX2阳性(图1j)。囊泡共染色显示，早期内体抗原1(EEA1)与DUOX2在大型细胞内囊泡上强烈共定位，而小型囊泡仅为DUOX2阳性(图1k)。进一步分析表明，大型DUOX2囊泡分选连接蛋白4(SNX4)(图1l)和RAB11(补充图1c)呈阳性，二者均参与内体回收途径。DUOX2与溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)无共定位(补充图1d)，提示含DUOX2的大型囊泡主要用于回收而非降解。通过成像分析对囊泡直径的量化证实了这些不同的DUOX2阳性囊泡群体，其中小型囊泡将经高尔基体修饰的DUOX2 运输至质膜，而大型囊泡则用于内吞和回收(图1m，补充图1e)。囊泡回收与肌动蛋白重排所需的空间受限信号通路相关，包括细胞突起形成和定向迁移，提示DUOX2介导的氧化还原信号在肌动蛋白重塑的特定位点发挥作用。

DUOX2 活性诱导隧道纳米管形成

对表达 DUOX2 WT 的 H661 细胞产生的细胞突起进行更仔细观察后，可见新生或完全形成的隧道纳米管(TNTs)，尤其在以血清剥夺为触发条件时更为明显。TNTs 是由细胞骨架延伸形成的细胞间膜通道，包含肌动蛋白，有时还含乙酰化微管蛋白。免疫荧光和活细胞成像显示，在 TNT 形成初期以及沿成熟 TNT 运输的囊泡中均存在 DUOX2。在新生 TNT 中，DUOX2 定位于正在形成的 TNT 尖端，通常与肌动蛋白聚合的既定驱动因子 cortactin 共定位，且位于 TNT 沿线的囊泡“凸起”处(图 2a；见尖端和凸起定位)。在具有乙酰化微管蛋白骨架的成熟细胞间连接 TNT 中，DUOX2 明显存在于 TNT 沿线的囊泡样结构中(图 2b)。相应地，UnaG-DUOX2 与 cortactin 共同定位于延伸中 TNT 的尖端(图 2c)。对 H661 细胞系中成熟 TNT 的定量分析显示，与表达催化失活的 DUOX2 E843Q 突变体的细胞或不表达 DUOX2 的细胞相比，野生型 DUOX2 存在时连接型 TNT 显著增加(图 2d)。添加 NOX/DUOX 抑制剂 GKT137831 也会显著减少 TNT 形成。进一步分析表明，DUOX2 在延伸中 TNT 的尖端与 TNT 标记物 RAB11(图 2e)、Myo10(图 2f)和 GAP43(图 2g)共定位。含 UnaG-DUOX2 的囊泡沿成熟 TNT 的全长移动。在 90 分钟的过程中，我们记录到 UnaG-DUOX2 囊泡从一个细胞进入 TNT，并沿 TNT 移动至受体细胞(图 2h, i；补充视频 2)。

在神经元和星形胶质细胞中，用非生理浓度的 (100-200 )进行长时间处理会诱导。我们的观察结果表明，由 DUOX2 时空产生的纳摩尔级是 TNT 形成的生理触发因素。为了可视化局部的产生，我们使用了基因编码的荧光指示剂 HyPer7，它是一种 pH 稳定的超敏传感器，并标记了 H-RAS 的最后 23 个 C 端氨基酸(HyPer-MEM)。该基序包含两个棕榈酰化位点和 CAAX 法尼基化位点，从而靶向从高尔基体发出并转运至质膜的囊泡(图 2j) 。对表达 HyPer7-MEM 的 H661 细胞系的表征显示，DUOX2 WT 细胞中 HyPer7 488/405 nm 的平均强度信号高于对照细胞系(补充图 2a)。加入 BAPTA-AM 或二苯基碘鎓(DPI)后，该信号会降低，已知这两种物质均为 DUOX2 活性的抑制剂(补充图 2a、b)。通过将 HyPer7 488/405 nm 比值的平均强度与不敏感的 HyPer7 突变体 SypHer7-MEM 的平均强度进行比较，进一步验证了 HyPer7-MEM 对的特异性(补充图 2c)。这些对照实验证实了 H661 DUOX2 WT 细胞中 HyPer7-MEM 信号的特异性。对 HyPer7-MEM 比率电影的分析表明，像素强度峰值在通道中重现(补充图 2d、补充视频 3)，这表明通道可用于需要更长像素驻留时间和帧采集的更高分辨率显微镜。在 H661 DUOX2 WT 细胞中，质膜突起的前沿处 HyPer7-MEM 比率信号会增加(补充图 2e)。在固定细胞中，HyPer7-MEM 488 nm 信号峰值与质膜处 DUOX2 的定位重叠(补充图 2f)。培养基的酸化不会改变 HyPer7-MEM 的信号，表明信号具有稳定性，适用于强度成像。

图 1 | DUOX2 囊泡运输的表征。a 表位标记的 DUOX2 构建体示意图。b 通过免疫印迹法确认 DUOX2 转基因在 H661 细胞系中的表达，使用抗 HA 或抗 DUOX2 抗体；微管蛋白作为上样对照。c 由稳定表达 DUOXA2(对照)或同时表达 DUOXA2 与 DUOX2 WT 或无活性 DUOX2 E843Q 的细胞产生的，经毒胡萝卜素/PMA 刺激(见“方法”)。d 通过免疫荧光显微镜观察 DUOX2 WT 及其突变体的定位(HA，红色)。e 荧光标记的 UnaG-DUOX2 示意图。f 用抗 DUOX2 抗体检测转染的 H661 细胞中的 DUOX2 表达；黏着斑蛋白作为上样对照。由瞬时转染 DUOXA2(对照)或同时转染 DUOXA2 与 UnaG-DUOX2 或 HA-DUOX2 的 H661 细胞产生的，经毒胡萝卜素/PMA 刺激。h 固定细胞中 UnaG-DUOX2 信号(绿色荧光)与抗 DUOX 抗体染色(红色)的共定位；插图显示白色框区域的数字放大，白色箭头指示 UnaG-DUOX2 的质膜定位。i UnaG-DUOX2 在 H661 细胞中的细胞表面和囊泡定位；插图显示从黄色框区域的活细胞动态图像中提取的帧(补充视频 1)。j UnaG-DUOX2(绿色)与抗 DUOX 抗体的共染色 (红色)位于固定化H661细胞的细胞内囊泡上，插图为白色方框所示区域的数字放大图，白色箭头指示囊泡。DUOX2(HA，红色)在(k)早期内体(EEA1，绿色)和(l)循环内体(SNX4，绿色)中定位的免疫荧光染色，这些细胞为表达DUOX2 WT的H661细胞；插图为白色方框所示区域的数字放大图，白色箭头指示囊泡，(k)中的黄色箭头指示不含EEA1的DUOX2囊泡。m 细胞内DUOX2囊泡测量示意图，显示共定位的囊泡标记物和囊泡大小(向质膜运输、；内吞运输 )。c、g 每个点代表单次测量，为独立实验，数据以均值 ± 标准差表示，采用Brown-Forsythe和Welch方差分析及Dunnett T3事后检验；。与鬼笔环肽共染以标记肌动蛋白(d为绿色，为紫色)和DAPI(蓝色)。d、比例尺，显微镜分析代表。a、e、m 由BioRender创建。Knaus, U. (2025) https://BioRender.com/xgrzcpe、https://BioRender.com/k6zyosb、https://BioRender.com/mnaww5s，在Adobe Illustrator中修改。

DUOX2与HyPer7-MEM在新生TNT的尖端共定位(图2k)。TNT尖端处HyPer7-MEM的像素强度(热图)表明，在TNT延伸点处有大量生成。在活细胞成像中，生成不仅在尖端明显，还存在于沿TNT移动的囊泡凸起中(图2I，补充视频4)，重现了UnaG-DUOX2在TNT中的定位。除血清剥夺外，小鼠成纤维细胞条件培养基也会促进TNT形成。该处理还诱导了含DUOX2、皮层肌动蛋白和肌动蛋白的同心环状突起，这些突起形成于表达DUOX2 WT的H661细胞的顶膜上(图2m)。z-stack的3D重建显示，向顶端延伸，DUOX2在这些环状结构中生成 (图2n、o；与HyPer7-MEM高像素强度峰共定位)。在UnaG-DUOX2活细胞成像中观察到含DUOX2的同心环，且在固定化的DUOX2 WT H661细胞中，与TNT标记物RAB11、Myo10和GAP43共定位(补充图2g-j)。为将这些突起与类似的肌动蛋白结构区分开，我们在表达DUOX2 WT的H661细胞中诱导了背部环形褶皱(CDRs)(补充图2k)。DUOX2定位于CDRs，但CDRs形成了内部中空、尺寸大于同心环的独特结构(补充图2k)，且寿命极短，而顶端突起则持续存在。此外，初级纤毛标记物CEP164和Arl13b均未定位于DUOX2阳性的顶端突起(补充图2l、m)。据我们所知，这些环形肌动蛋白结构尚未见报道，但它们可能与TNT形成相关。

BxPC3细胞内源性DUOX消融的表征

我们希望将外源性表达活性或非活性DUOX2的H661细胞中的发现，与具有内源性DUOX的细胞类型进行比较

图2 | DUOX2活性诱导隧道纳米管(TNT)形成。a. 在表达DUOX2野生型(WT)的H661细胞(肌动蛋白，绿色；皮层肌动蛋白，紫色)中，新生TNT尖端(插图，黄色箭头)处含有DUOX2(HA，红色)的囊泡。b. 在两个表达DUOX2 WT的H661细胞之间连接的成熟TNT中，含有DUOX(红色)的囊泡(白色箭头)，插图为数字放大(肌动蛋白，绿色；乙酰化微管蛋白，紫色)。图像由63×油镜下的2个视野拼接而成。c. 在H661细胞中，UnaG-DUOX2(绿色)定位于两个新生TNT(标记为1和2)的尖端，与抗DUOX抗体(红色)、肌动蛋白(紫色)和皮层肌动蛋白(浅蓝色)共染色。d. 定量分析表达DUOXA2(对照)、DUOXA2联合DUOX2 WT或DUOX2 E843Q GKT137831的H661细胞中，至少有一个成熟连接TNT的细胞比例。每个点代表4次实验中5个视野的平均值，每次实验设3个重复，数据以均值表示，采用Brown-Forsythe和Welch方差分析及Dunnett T3事后检验，。在表达DUOX2 WT的H661细胞中，DUOX2(DUOX e，HA f、g，红色)与新生TNT中的RAB11(e，紫色)、Myo10(f，紫色)和GAP43(g，紫色)共定位。h. H661细胞中TNT内UnaG-DUOX2囊泡的活细胞图像，插图为白色箭头所示区域的数字放大。i. 在表达UnaG-DUOX2的H661细胞活细胞成像过程中，UnaG-DUOX2在沿TNT的运输囊泡内的定位，插图为白色箭头所示区域的数字放大(补充视频2)。j. 膜嵌入型HyPer7-MEM被DUOX2氧化的示意图。k. 在固定的表达DUOX2 WT的H661细胞中，延伸中TNT尖端处产生，HyPer7信号与DUOX2(HA，红色)共定位。l. 在表达DUOX2 WT的H661细胞中，囊泡内及未附着TNT尖端处的HyPer7信号峰的活细胞共聚焦视频显微镜图像，插图为白色箭头所示TNT的数字放大(补充视频4)。m. DUOX2(HA，红色)与肌动蛋白(绿色)、皮层肌动蛋白(紫色)共同定位于顶端双环突起。白色箭头表示顶端表面突起，箭头A的数字放大见插图。n. 图(m)的z-stack三维渲染图，白色箭头指示顶端突起，黄色框放大为z-stack的投影，显示突起距离。o. 表达DUOX2 WT和HyPer7-MEM的H661细胞的z-stack最大投影，显示DUOX2(HA，红色)和HyPer7(绿色及热图)在顶端突起中的定位。插图为白色框的数字放大，z层切片显示DUOX2及在整个顶端突起中的产生。a-c、e-i、k:细胞在固定或活细胞成像前用进行血清饥饿处理。m-o:细胞在固定前用小鼠成纤维细胞条件培养基孵育。、o:HyPer7在合并图像中显示为绿色，在插图中显示为热图(HyPer像素强度)以可视化峰。比例尺:a-c、e-h、k-o ，i ，显微镜分析代表。j. 由BioRender创建。Knaus, U.(2025)https://BioRender.com/fodhypa，在Adobe Illustrator中修改。DUOX2表达。胰腺癌细胞BxPC3表达DUOX2和低水平的DUOX1，但不表达其他NADPH氧化酶(我们的数据及 )。BxPC3细胞具有功能性DUOX2表达的所有特征，包括被IFNγ/LPS上调(DUOX2(Ct 24→19)，DUOXA2(Ct 26→21))，这通过抗DUOX2免疫印迹得到证实(图3a、b)。此外，低基础水平的产生可被PMA/毒胡萝卜素刺激显著增强(图3c)。我们随后利用CRISPR技术构建了DUOX2(DUOX2 KO)和DUOX1/DUOX2联合敲除(DUOX1/2 KO)的BxPC3细胞系。在CRISPR KO细胞系中，DUOX表达可忽略不计(免疫印迹，图3d)，且内源性DUOX(DUOX1/2 WT)如预期定位于质膜，而在DUOX2 KO和DUOX1/2 KO细胞系中均未观察到膜定位(图3e)。DUOX2 KO细胞中的产生显著减少(图3f，红色)，额外敲除DUOX1后进一步减少(图3f，紫色)。血清饥饿后表达DUOX1/2的BxPC3细胞形成TNT的速率低于表达DUOX2 WT的H661细胞，但在该细胞类型中，内源性DUOX也定位于新生和成熟TNT(补充图3a、b)。

图3 | BxPC3细胞内源性DUOX敲除的表征。a 未经处理或经IFNγ(10 ng/ml)/ LPS(100 ng/ml)处理(24小时)的BxPC3细胞中DUOX2和DUOXA2的表达。每个点代表3次独立实验中各3次技术重复的单次测量的平均值。b 经与未经IFNγ/LPS预处理的BxPC3细胞中DUOX2的表达。c 经与未经IFNγ/LPS预处理的BxPC3细胞在未刺激或经PMA/毒胡萝卜素刺激后的生成情况。d、e 从DUOX1/2野生型BxPC3细胞中通过CRISPR介导敲除DUOX2或DUOX1/2，分别通过d的免疫印迹和 e的显微镜观察(DUOX，红色；肌动蛋白，绿色；比例尺，代表的显微镜分析)。DUOX1/2野生型、DUOX2敲除和DUOX1/2敲除BxPC3细胞系的生成情况，经IFNγ/LPS预刺激，所有条件均经PMA/毒胡萝卜素刺激。b、d 肌动蛋白作为上样对照。c、f 数据以平均值 ±标准差表示，采用Brown-Forsythe和Welch方差分析及Dunnett T3事后检验；为各含3次技术重复的生物学重复次数。

DUOX2 产生的促进片状伪足形成及单细胞迁移速度

DUOX2 与存在于与肌动蛋白相关的动态结构上，提示 DUOX2 在细胞骨架重排中发挥作用。板状伪足形成是膜延伸的显著特征，需要肌动蛋白细胞骨架重塑。在 H661 和 BxPC3 细胞中，DUOX2 与肌动蛋白在成熟板状伪足处共定位(图 4a、b；补充图 4a-c)。在早期板状伪足(图 4c)中检测到 DUOX2，该结构为包含肌动蛋白和皮质肌动蛋白的交联“晶格”结构。相应地，活细胞视频显微镜显示，UnaG-DUOX2 在板状伪足延伸过程中转运至质膜，延伸停止后则被内吞(图 4d；补充视频 5)，这进一步证实了 DUOX2 在需要局部产生的肌动蛋白结构上存在动态“开-关”循环的概念。动态图像分析表明，表达 DUOX2 WT 的 H661 细胞的延伸速度显著高于对照细胞系(图 4e)。

DUOX2 产生的可促进片状伪足形成并提高单细胞迁移速度。DUOX2 在(a)中延伸的片状伪足中的定位，表达 DUOX2 WT 的 H661 细胞(DUOX2(HA，红色)；白色箭头表示多个片状伪足)以及在(b)中，BxPC3 DUOX1/2 WT 细胞(DUOX，红色)，插图显示分开的通道 DUOX(顶部，红色)和肌动蛋白(底部，绿色)。c DUOX2(HA，红色)定位于新生片状伪足(白色箭头)，与典型网格结构中的皮层肌动蛋白(紫色)和肌动蛋白(绿色)共定位，插图显示片状伪足形成的分开通道数字放大图。d 片状伪足形成过程中 UnaG-DUOX2(白色)的定位；从活细胞共聚焦视频显微镜中提取的指定时间点的帧(补充视频 5)。e 对照组和表达 DUOX2 WT 的 H661 细胞中片状伪足突出速度的动态图分析，每个点代表 3 次独立实验中不同细胞的单个片状伪足，Welch’s 检验，。f、H661 和 g、BxPC3 细胞系中的单细胞迁移速度，，每个点代表 3 次实验的平均值独立实验，每次实验追踪 25 个细胞；采用 Brown-Forsythe 和 Welch ANOVA 及 Dunnett’s T3 事后检验，在迁移的 DUOX1/2 WT BxPC3 细胞的前缘和后收缩区产生，这些细胞表达 HyPer7-MEM。从活细胞视频显微镜中提取的静态图像(补充视频 6)。i H661 DUOX2 WT 细胞中的 PIEZO1(紫色)染色，与 DUOX2(红色)在片状伪足的前缘共定位，与肌动蛋白(绿色)共染色，白色箭头处片状伪足的数字放大图突出显示共定位。j DUOX1/2 WT BxPC3 细胞中 DUOX(红色)与 PIEZO1(紫色)的共定位；白色框所示区域的数字放大图突出显示在突起处的共定位。k DUOX1/2 WT BxPC3 细胞中 ± GsMTx4 的单细胞迁移速度，每个点代表 3 次独立实验的平均值，每次实验追踪 25 个细胞，采用 Welch’s 检验，。e-g、k 数据以平均值 ± SD 表示；a-c、i、j 与 DAPI(蓝色)共染色。a-d、h-j 比例尺，显微镜分析代表。

膜突起是前沿细胞迁移的主要方式。趋化实验显示，DUOX2活性缺失会显著降低H661和BxPC3细胞系的迁移速度(图4f、g)。表达催化失活型DUOX2 E843Q的细胞，其迁移速度与仅表达DUOXA2(对照)的H661细胞相当，表明DUOX2产生的是定向迁移的驱动因素(图4f)。在BxPC3细胞中，敲除DUOX2或同时敲除两种DUOX酶(DUOX1/2 KO)，都会使迁移速度出现相似幅度的下降(图4g)，说明在BxPC3细胞中，是DUOX2而非DUOX1参与了定向迁移。在表达HyPer7-MEM的BxPC3 DUOX1/2 WT细胞中，可检测到迁移细胞前沿的生成(图4h，补充视频6)。在未添加任何胞外刺激的情况下，可在质膜突起处观察到高强度的HyPer7信号，这与固定细胞中DUOX2的定位相似(见图4b、c)。片状伪足延伸与质膜处的脉冲同时发生。这些氧化型HyPer7-MEM信号的时间范围，与UnaG-DUOX2定位于质膜的持续时间(1-2分钟)相当，支持这些爆发由DUOX2产生的结论。我们还观察到迁移细胞后部出现氧化型HyPer7-MEM信号。迁移细胞前端和后端的快速钙内流是细胞运动所必需的，也是DUOX2激活所必需的。钙通道PIEZO1在多种细胞类型中表达，可将机械信号转化为促进细胞铺展、黏着斑形成、单细胞迁移和集体迁移的信号。PIEZO1富集于延伸区、伤口边缘以及单个迁移角质形成细胞的后收缩区。在H661 DUOX2 WT和表达DUOX2的BxPC3细胞中，PIEZO1与DUOX2在明显的突起处共定位(图4i、j；补充图4d)。用GsMTx4抑制PIEZO1等机械敏感通道，会使BxPC3 DUOX1/2细胞的迁移速度下降，其幅度与DUOX2敲除细胞相似(图4k)。因此，PIEZO1可能与钙内流诱导的DUOX2激活以及后续细胞骨架动态过程中的生成相关。

激活的 FER 酪氨酸激酶与 DUOX2 结合，以增强肌动蛋白聚合

快速、局部的爆发可促进空间定位的氧化还原信号传导，触发与肌动蛋白动态相关的酪氨酸激酶激活。介导的 FER 酪氨酸激酶激活已与皮质肌动蛋白(cortactin)的酪氨酸磷酸化(Y421、Y466)及细胞迁移直接相关。免疫荧光染色显示，FER、DUOX2 与 HyPer7-MEM 在沿膜突起分布的囊泡上存在明显共定位(图 5a；插图:白色箭头所指的囊泡)。在 H661 DUOX2 WT 细胞(图 5b)和 BxPC3 DUOX1/2 WT 细胞(补充图 5a)两种细胞类型中，DUOX2 与 FER 均在质膜处共定位。此外，FER 与 DUOX2 也在纳米管(TNT)和顶端环形突起中存在共定位(补充图 5b、c)。质膜突起处的 DUOX2/FER 共定位伴随高强度的氧化型 HyPer7-MEM 信号(图 5c)，为 FER 的局部氧化与激活奠定了基础。鉴于 DUOX2 与 FER 的密切关系，研究人员使用了新开发的 FER 抑制剂 E260 。抑制 FER 会导致单细胞迁移速度下降(图 5d)。通过免疫印迹和免疫荧光验证的 FER 敲低(siRNA)也显著降低了单细胞的迁移速度(补充图 5e、f)。

在两种细胞类型中使用多种抗体均观察到 DUOX2 与 FER 的明显共定位，表明这两种蛋白之间存在局部复合物形成。从对照或表达 DUOX2 WT 的 H661 细胞裂解液中免疫沉淀 FER，检测到与 FER 结合的 DUOX2，使用抗 HA 和抗 DUOX2 抗体仅在含 DUOX2 WT 的裂解液中检测到(图 5e)。仅用毒胡萝卜素(thapsigargin)适度激活 DUOX2，会增加 H661 细胞(图 5f； )和 BxPC3 细胞(补充图 5g， )中 FER 的酪氨酸磷酸化。但考虑到 DUOX2/FER 相互作用位点处 HyPer7-MEM 信号强度的局部限制性，全细胞裂解液无法充分反映这种动态情况。皮质肌动蛋白(cortactin)是 FER 的磷酸化靶标，且与 DUOX2 共定位(见图 2a、c、m，图 4c)，因此研究人员评估了 DUOX2/FER 定位位点处的皮质肌动蛋白磷酸化情况。研究人员确实在 H661 DUOX2 WT 细胞的前沿和纳米管(TNT)中检测到了磷酸化皮质肌动蛋白(Y421)，同时伴有 DUOX2 和氧化型 HyPer7-MEM 信号(图 5g、h；补充图 5h-j)。在 H661 细胞和 BxPC3 细胞中，均可见 FER、磷酸化皮质肌动蛋白(pCortactin)和 HyPer7-MEM 明显定位于质膜。在 H661 DUOX2 WT 细胞和 BxPC3 DUOX1/2 WT 细胞中，观察到 pCortactin 水平显著升高(补充图 5k)。对膜突起处 pCortactin 强度的检测显示，在活性 DUOX2 存在时，皮质肌动蛋白磷酸化显著增加(补充图 5l、m)。这些结果强烈表明，DUOX2/FER/pCortactin 通路驱动了肌动蛋白聚合。事实上，通过 G/F 肌动蛋白比值定量评估的聚合型 F-肌动蛋白，在 DUOX2 存在时，BxPC3 细胞和 H661 细胞中均有所增加(图 5i、j)，表明 DUOX2 活性增强了动态细胞骨架重塑所需的肌动蛋白聚合速率。

DUOX2 活性对于上皮伤口愈合过程中的回缩波至关重要

DUOX 酶在遭遇机械损伤、创伤或感染的屏障上皮中表达，需要高效的伤口愈合机制来实现保护。为探究 DUOX2 在调控集体细胞迁移中的作用，研究人员开展了多项单层细胞迁移实验，包括屏障实验、伤口(划痕)实验以及用于 HyPer7-MEM 定量的原位划痕实验(图 6a)。仅选用 BxPC3 细胞系进行集体迁移实验，因为 H661 细胞倾向于单个细胞迁移，不适合该实验。在 IBIDI 屏障插入物中，其可反映自驱动片状伪足驱动的集体爬行以闭合间隙，对比表达 DUOX 的 BxPC3 细胞(DUOX1/2 野生型)与不表达 DUOX 的细胞(DUOX2 敲除、DUOX1/2 敲除)，未检测到细胞前沿迁移速度或伤口闭合动力学的显著差异(图 6b)。

相比之下，当存在 DUOX2 时，汇合单层机械损伤后的伤口闭合动力学存在显著差异。在表达 DUOX1/2 WT 的 BxPC3 细胞中，细胞前沿速度在 (峰 1)和 (峰 2)处出现两个显著升高的峰值，在处急剧下降；而缺失 DUOX2 则会显著降低细胞前沿迁移速度(图 6c)。这种 DUOX2 依赖性两步过程的结果是伤口闭合动力学发生完全改变:伤口面积最初比初始损伤面积增加 50%，随后细胞前沿反转方向，开始集体运动以闭合伤口(补充图 6a)。活细胞成像显示，损伤后，表达 DUOX1/2 的 BxPC3 细胞的前沿最初回缩，在处短暂暂停运动，随后反转方向以闭合 (图 6d；补充视频 7)。相比之下，缺失 DUOX 的 BxPC3 细胞(DUOX2 KO、DUOX1/2 KO)在损伤后立即开始向内运动，在 16 至之间完全闭合(图 6d；绿线为初始伤口，红线为时间点的伤口边缘)。为确认该过程中 DUOX2 催化活性的必要性，在钙螯合剂 BAPTA-AM 和非特异性 NADPH 氧化酶抑制剂 GKT137831 存在的情况下，对 BxPC3 DUOX1/2 WT 细胞进行划痕实验。两种处理均消除了回缩波并降低了细胞前沿速度(图 6e)。对 BxPC3 DUOX1/2 WT 细胞伤口闭合过程中 HyPer7-MEM 信号的比率定量分析显示，损伤后的产生增加(补充图 6b、c；补充视频 8；记录至 )，且在回缩波期间也增加(补充图 6d、e；补充视频 8；记录至 9 小时)。向 BxPC3 DUOX1/2 KO 细胞中添加外源性可增加细胞前沿速度，并延迟但部分恢复回缩波(图 6f、g；红线)。用处理 BxPC3 DUOX1/2 WT 细胞会降低速度并延迟回缩波(图 6f、g；紫线)。这些效应可能是由于外源性对单层细胞的全局作用，而机械损伤仅诱导伤口边缘细胞中时空特异性的产生。

图可诱导型 FER 酪氨酸激酶由 DUOX2 激活，以增强肌动蛋白聚合。a H661 DUOX2 野生型细胞内囊泡上 DUOX2(HA，红色)、FER(紫色)与 HyPer7-MEM(绿色)的共定位；插图为数字放大图，白色箭头所示为囊泡。b 表达 DUOX2 野生型的 H661 细胞中，DUOX2(HA，红色)与 FER(紫色)在质膜上的共定位。c H661 DUOX2 野生型细胞中，DUOX2(HA，红色)、FER(紫色)与 HyPer7 像素强度热图在质膜上的共定位。d DUOX1/2 野生型 BxPC3 细胞的单细胞迁移速度 FER 抑制(E260 5 )，每个点代表 3 次独立实验的平均值，每次实验追踪 25 个细胞，Welch 检验，。e 从 H661 细胞裂解物中进行 FER 的免疫沉淀(IP)，以评估 pY-FER 和 FER-DUOX2 在有无 DUOX2 刺激(毒胡萝卜素 )时的相互作用。注明了用于免疫印迹(IB)的抗体。f 对 FER IP 中的 pY FER 进行光密度分析 H661细胞，每个点代表一次独立重复，每个点对应4次独立分析，Welch’s 检验，图中显示值。g. DUOX2(HA，红色)与磷酸化皮质肌动蛋白(紫色)在DUOX2 WT表达的H661细胞中的膜共定位。h. 在活跃产生的部位(HyPer7信号)的片状伪足(白色箭头)中，DUOX2(HA，红色)与磷酸化皮质肌动蛋白(紫色)的共定位。如所示，通过G-肌动蛋白/F-肌动蛋白测定法对BxPC3(i)和H661(j)细胞系中的F-肌动蛋白进行定量；每个点代表3次独立实验中的一次技术重复。i. Welch’s 检验，，，Brown-Forsythe和Welch ANOVA及Dunnett’s T3事后检验，。数据以平均值表示，HyPer7在合并图像中显示为绿色，在插图中显示为热图(HyPer7像素强度)以可视化峰。比例尺，显微镜分析代表。

对损伤后早期时间点固定细胞中DUOX2的位置与活性进行可视化，结果显示在时间点前DUOX2会被募集至伤口边缘(图6h)。在同一时间段内，伤口边缘的HyPer7-MEM 像素强度升高(图6h)。DUOX2的激活需要钙离子，该钙离子很可能由PIEZO1通道开放提供。使用可穿透细胞膜的Fluo4-AM染料对机械损伤后的钙离子内流进行可视化，结果显示损伤后的最初几秒内会出现快速的钙离子波(补充图6f、g，补充视频9)。对活细胞中Fluo4AM染色的进一步观察显示，含钙离子的囊泡会转运至前沿细胞膜(补充图6h)，且在单细胞中，质膜收缩与延伸前的Fluo4-AM强度均会升高(补充视频9)。综上，机械损伤上皮细胞层后，DUOX2介导的生成会诱导产生收缩波，同时迁移速度加快，整体导致伤口愈合变慢。

图6 | DUOX2活性对于上皮伤口愈合过程中的回缩波至关重要。a 伤口愈合分析的实验设计。b 采用IBIDI插入式培养板进行屏障实验时的细胞前沿速度，实验对象为BxPC3 DUOX1/2野生型(蓝色)、DUOX2敲除型(红色)及DUOX1/2敲除型(紫色)细胞系，观察时长为24小时。c BxPC3 DUOX1/2野生型(蓝色)、DUOX2敲除型(红色)及DUOX1/2敲除型(紫色)细胞系的划痕实验中细胞前沿速度，观察时长为24小时；数字表示BxPC3 DUOX1/2野生型细胞中代表细胞前沿回缩(1)和细胞前沿延伸(2)的峰值。d 从BxPC3 DUOX1/2野生型细胞(上排)和BxPC3 DUOX1/2敲除型细胞(下排)的伤口愈合影片中提取的单个帧，展示伤口闭合动态的差异。绿线表示时的伤口边缘，红线表示指定时间点的伤口边缘(补充视频7)。e BxPC3 DUOX1/2野生型细胞的划痕实验中，细胞前沿速度要么未处理(蓝色)，要么在NOX/DUOX抑制剂GKT137831(10 µM，橙色)或细胞通透性钙螯合剂BAPTA-AM(20 µM，绿色)存在的条件下。BxPC3 DUOX1/2野生型或DUOX1/2敲除型细胞系的细胞前沿速度(f)和伤口宽度变化(初始伤口的百分比)(g)，在划痕实验中外源性添加。h BxPC3 DUOX1/2野生型HyPer7-MEM细胞的固定细胞免疫荧光染色，显示DUOX(红色)、HyPer7(热图)和肌动蛋白(紫色)；在受伤后指定时间点固定盖玻片。b、c、e、f、g，每个点代表每的平均速度或伤口面积，数据来自3次独立实验，每次实验设6个重复。d，比例尺，代表的显微镜分析。a 由BioRender创建。Knaus, U. (2025) https://BioRender.com/1rsz4wv，在Adobe Illustrator中修改。

细胞前沿回缩波同时需要FER激酶和机械感受器PIEZO1

DUOX2的关联及其氧化还原介导的激活表明，FER酪氨酸激酶是细胞前沿回缩波潜在的下游调控因子。事实上，在伤口边缘，FER与HyPer7-MEM共定位(图7a)；在表达DUOX1/2野生型的BxPC3细胞中，抑制FER活性会降低细胞前沿速度并消除回缩波(图7b、c；紫色线条)。在DUOX1/2敲除细胞中，FER抑制剂并未显著改变细胞前沿速度或伤口闭合情况(图7b、c；红色线条)。机械诱导角质形成细胞层损伤后的局部集体回缩，近期已被证实与PIEZO1激活相关。在回缩的伤口处，PIEZO1富集；同时，FER和DUOX2也定位于相同区域(图7d、e)。在的时间内观察到边缘，同时FER和DUOX2定位于相同区域(图7d、e)。用PIEZO1激动剂Yoda1处理会降低BxPC3 DUOX1/2野生型细胞的前沿速度，这可能是由于全局激活与时空激活的差异，但并未阻碍回缩波(图7f，深蓝色线)。向DUOX1/2敲除细胞中添加Yoda1并未产生明显的回缩波(图7f，红色线)，但我们注意到伤口边缘某些区域的细胞试图回缩却无法推进，这可能是因为DUOX2产生的不存在(图7g，红色箭头；补充视频10)。用GsMTx4抑制PIEZO1会显著降低细胞前沿速度(图7f，浅蓝色线)，并消除DUOX1/2野生型细胞的回缩波(图7h)。在不存在DUOX2的情况下，用GsMTx4处理并未显著改变DUOX1/2敲除细胞的行为(图7f，粉色线与图7b，绿色线相比)。

因此，在上皮层受到机械破坏后，细胞运动早期阶段PIEZO1-DUOX2-FER轴的联合活性会导致伤口闭合速度减慢。伤口的快速再上皮化被认为是有益的，但这种复杂的细胞行为反而指向一种生理优势。细胞前沿闭合的比较在DUOX1/2野生型与DUOX1/2敲除的BxPC3细胞系之间，揭示了机械损伤导致的伤口边缘细胞清除存在显著差异。在DUOX1/2野生型细胞中，细胞前沿回缩直至活细胞形成前沿，坏死/凋亡细胞和细胞碎片被清除(图7i)。在实现较慢的伤口闭合后，受损细胞消失(图7i；绿色箭头)。相比之下，当因缺乏DUOX2而无法发生回缩波时，受损的细胞前沿不会被清除，而是在伤口闭合后被整合入单层细胞中(DUOX1/2敲除，图7i；红色箭头)。在DUOX1/2野生型细胞中抑制PIEZO1时，这种在闭合前清理伤口边缘的失败也很明显(图7h；红色箭头)。我们推测，整合入的细胞碎片和死细胞会增加上皮层的通透性。正如预期，DUOX1/2敲除细胞层(红色线条)更

图7 | 细胞前沿同时需要FER激酶与PIEZO1

收缩波。a FER(红)在BxPC3 DUOX1/2 WT HyPer7-MEM细胞伤口愈合中的定位，HyPer7(绿；或强度热图)和肌动蛋白(紫)，盖玻片于指定时间点固定。b BxPC3 DUOX1/2及KO细胞系的前缘速度，c 伤口面积变化，FER抑制(E260 20 µM)。d 固定BxPC3 DUOX1/2 WT细胞划痕中，边缘处PIEZO1(紫)与FER(红)共定位。e 同条件下PIEZO1(紫)与DUOX(红)共定位。f BxPC3 DUOX1/2 WT(蓝，Yoda1；浅蓝，GsMTx4)或KO细胞(红，Yoda1；浅红，GsMTx4)在PIEZO1刺激(Yoda1 5 µM)或钙通道抑制(GsMTx4 5 μM)下的前缘速度。g 活细胞划痕明场帧显示:Yoda1处理的BxPC3 DUOX1/2 KO细胞随时间闭合，红箭头指前缘停滞区(补充影片10)，以及 GsMTx4处理的WT细胞，绿线指示初始边缘。红线指示指定时间点的伤口边缘，红箭头显示受损细胞区域。i 活细胞划痕实验明场图像:BxPC3 DUOX1/2 WT细胞受损前缘消失(上排，绿箭头)，而KO细胞整合效率低(下排，红箭头)。j FITC-葡聚糖(4 kDa)单层通透性分析:比较WT(蓝)与 (红)细胞系，于 (伤前)及、 (伤后)测量。采用独立Welch’s 检验，。每点为3次独立实验均值(各3重复)，数据以均值±SEM表示。k PIEZO1-DUOX2-FER相互作用示意图。每点代表3次独立实验中每的平均前缘速度或伤口面积(各6重复)。a, d, e, g, h, i 比例尺，显微镜图代表。由BioRender创建。Knaus, U.(2025)https://BioRender.com/putget1，经Adobe Illustrator修改。受伤后(图7j)，其通透性高于DUOX1/2 WT细胞层(蓝色线条)。含DUOX2的细胞层在受伤后变得更加紧密，而不含DUOX2表达的细胞层未恢复至受伤前状态。因此，初始细胞前缘收缩促进了伤口的高效闭合和上皮屏障功能，这一情况在图7k的示意图中进行了总结。

讨论

动态细胞骨架过程，包括肌动蛋白丝的组装与解聚、探索性细胞行为、细胞间通讯、前后极化以及定向迁移，都需要快速变化的信号。氧化还原信号为信号向调控肌动蛋白重组的网络传递提供了理想的开关，但在高度动态的情况下如何实现活性氧(ROS)信号的特异性仍是未解之谜。我们设想，将产生ROS的酶与膜结合后递送至动态肌动蛋白重塑位点，随后通过短暂升高浓度进行原位激活，可实现靶向且可逆的氧化。荧光标记的UnaG-DUOX2显示，含有DUOX2的囊泡持续转运至全面肌动蛋白重塑区域，伴随在延伸或收缩位点出现爆发，随后DUOX2被内化并循环利用。这些含DUOX2/ 的囊泡不仅聚集在片状伪足的活跃延伸区域、迁移细胞的前后端或背侧褶皱处，还位于新生隧道纳米管(TNT)的尖端，并作为货物通过TNT在两个细胞之间穿梭。在含有囊泡、肌动蛋白、乙酰化微管蛋白和运动蛋白的膜凸起中，活性DUOX2的细胞间转移与神经元细胞中通过TNT进行的线粒体转运类似。

这些细胞骨架事件的共同点是需要快速、局部的肌动蛋白聚合。缺乏活性DUOX2的细胞仍具备迁移、形成TNT和片状伪足的能力，这可能是由于其他产生的酶(如LOX、LOXL2)的存在，但DUOX2/ 显著提高了聚合态F-肌动蛋白的含量，并明显加快了细胞执行这些过程的速率和速度。DUOX2作为一种钙激活的NADPH氧化酶，非常适合作为局部释放的钙脉冲的传导通道，这些钙脉冲调控细胞边缘局部扩张、粘附和收缩的循环。这些细胞骨架重排对细胞迁移至关重要，但细胞外刺激、所涉及的细胞类型以及迁移方式会强烈影响哪些信号网络会被激活。在BxPC3细胞中，集体运动填补缺口并不需要DUOX2的活性，但DUOX2对于介导快速收缩波和随后加速伤口愈合的峰值至关重要。损伤后这种高效的愈合反应与屏障修复相结合，在DUOX2高表达于顶端表面的肠上皮中至关重要。在肺上皮中，DUOX2和DUOX1均存在，可在伤口边缘产生。事实上，Wesley 及其同事报道，在支气管上皮细胞中，损伤诱导、ATP刺激的DUOX1产生可加速伤口愈合。DUOX产生的还与角质形成细胞、斑马鱼和果蝇的伤口愈合及长距离信号传导相关。在某些细胞类型中，包括癌细胞，产生的NADPH氧化酶(如DUOX1/2或NOX4)为细胞骨架动态、增强的迁移和转移提供氧化还原信号，而在其他细胞类型中，NOX4是必不可少的，NOX1则在受伤时促进定向迁移。本研究中使用的胰腺BxPC3细胞内源性表达DUOX2和DUOX1，但DUOX1对细胞骨架动态的贡献不大。许多细胞类型同时表达多种NADPH氧化酶，但要深入了解ROS信号的功能特异性，仍需开发用于在空间和时间上追踪不同氧化酶同工型的新工具，以及严格的同工型特异性氧化酶抑制剂。

在迁移细胞中，内质网与质膜接触形成的空间梯度决定了前后极化、局部酪氨酸激酶和磷酸酶信号传导以及迁移速度。附着于膜的 HyPer7 活细胞成像显示，迁移细胞前缘出现短暂的闪光，而的生成在后缘则更为持久。囊泡相关的将通过可逆氧化改变酪氨酸激酶、磷酸酶以及细胞骨架相关含巯基蛋白的激活状态。对于非受体酪氨酸激酶，氧化还原依赖的 SRC 激酶激活已与细胞运动性相关。在此，我们展示了 DUOX2 与非受体酪氨酸激酶 FER 在生成的运输囊泡中、质膜处、TNT 货物中以及迁移细胞和受伤细胞边缘的前缘共定位。DUOX2-FER 结合以及 FER 中 pTyr 掺入增加，支持了介导的 FER 激活；其下游靶标皮质肌动蛋白的磷酸化也在迁移细胞后部含有 DUOX2 的囊泡中产生。后部的氧化靶点可能与肌球蛋白激活、肌动球蛋白收缩和后缘回缩有关(例如，氧化激活的 RhoA GTPase) 。

伤口愈合需要炎症反应、感染控制和上皮再形成之间的平衡。DUOX2 的活性显著改变了伤口愈合过程，产生了回缩波，该波将促进 efferocytosis(凋亡细胞清除)和微生物清除，从而确保屏障功能的恢复。值得注意的是，DUOX2 主要表达于物理屏障组织的顶侧，包括肠道和肺上皮，以及表皮角质形成细胞中，因此其处于调节伤口愈合过程的理想位置。在上皮层机械损伤后，DUOX2 诱导的氧化还原信号对于集体“后退-停止-前进”细胞运动的方向性和速度至关重要。这让人联想到机械传感器 PIEZO1 参与角质形成细胞和果蝇胚胎早期伤口边缘回缩。敲除 Piezo 会减少钙内流、损伤诱导的 ROS(活性氧)以及巨噬细胞募集，导致伤口愈合更快但无效，且受伤胚胎的死亡率更高。我们在此表明，在机械损伤的上皮层中，DUOX2-FER 通路传递了 PIEZO1 信号，以诱导加速、同步的回缩波。回缩波的缺失会增加未充分密封的细胞层的通透性，使上皮即使在伤口愈合后仍易受影响。这对携带 DUOX2 功能缺失变异的炎症性肠病患者具有重要意义，因为肠道屏障将易受微生物和微生物产物转移的影响，导致慢性炎症。从更广泛的角度来看，细胞将囊泡包裹的酶运输到与感知、细胞间通讯和运动相关的活跃肌动蛋白重塑部位，以实现的短暂、局部爆发的能力，表明氧化还原信号在细胞骨架动力学中发挥着基础作用。

方法

试剂

使用以下试剂:BAPTA-AM(196419)、二苯基碘鎓氯化物(DPI)(300260)，均购自Calbiochem；佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)(P8139)、毒胡萝卜素(T9033)、大肠杆菌LPS(L2630)、高香草酸(306-08-1)、N-乙基马来酰亚胺(04260-5G-F)、过氧化氢(H1009-5mL)和表皮生长因子(E4127-1MG)，均购自Sigma Aldrich；BODIPY FL鬼笔环肽(B607)、BODIPY 558/568鬼笔毒素(B3475)、DAPI(D-1306)和Fluo4-AM(F14201)，均购自Invitrogen；重组人IFNγ(Biolegend，570202)；FITC-葡聚糖4 kDa(TdB Labs，60842-46-8)；GKT137831(DC Chemicals，DC8118)；Yoda1(HY-18723)、GsMTx4(HY-P1410)、E260(HY-112097)，均购自MedChemExpress；SPY555 FastAct(CY-SC2-5)，来自Cytoskeleton Inc.；ON-TARGETplus非靶向siRNA #1(D-001810-01-05)、ON-TARGETplus人FER(2241)siRNA SMARTpool(L-003129-00-0005)和DharmaFECT 2转染试剂(T-2002-01)，均来自Horizon Discovery Biosciences。

抗体

一抗:小鼠抗肌动蛋白单抗(Cytoskeleton, AAN02-S)1:1000；兔抗F-肌动蛋白多抗(Sigma Aldrich, A0266)1:4000；小鼠抗乙酰化α微管蛋白单抗(Sigma Aldrich, T7451)1:100；兔抗EEA1单抗(Cell Signaling Technology, 3288S)1:100；小鼠抗LAMP1单抗(DSHB, H4A3-c)1:100；兔抗GAP43单抗(Invitrogen, MA5-32256)1:100；兔抗β微管蛋白单抗(Epitomics, EP1331Y)1:1000；小鼠抗磷酸酪氨酸抗体(Upstate, 05-321)1:500；兔抗Cortactin抗体(Epitomics, EP1922Y)1:100；兔抗磷酸化Cortactin (Tyr421)多抗(Invitrogen, 44-854 G)1:100；小鼠抗FER单抗(Invitrogen, MA5-15357)，IF 1:100，IB 1:500；兔抗FER多抗(Proteintech, 25287-I-AP)，IF 1:100，IP 2μg；小鼠抗PIEZO1单抗(Invitrogen, MA5-32876)1:100；兔抗Myo10多抗(Invitrogen, PA5-55019)1:100；小鼠抗RAB11抗体(BD Transduction, 610656)1:100；兔抗SNX4多抗(Synaptic Systems, 392 003)1:100；兔抗ARL13B多抗(Proteintech, 17711-1-AP)1:100；兔抗CEP164多抗(Proteintech, 16851765)1:800；小鼠抗HA标签单抗(Covance, MMS-101P)，IF 1:100，IB 1:1000；兔抗DUOX定制抗体#7936 ，IF 1:100；兔抗DUOX2定制抗体#79592，IB 1:1000。详见补充数据1。

二抗:山羊抗小鼠IgG-HRP(Southern Biotech，货号1030-05)，稀释比例1:10000；山羊抗兔IgG-HRP(Southern Biotech，货号4030-05)，稀释比例1:10000；山羊抗兔IgG(H + L)Alexa Fluor 488偶联物(货号A11008)、山羊抗兔IgG(H + L)Alexa Fluor 546偶联物(货号A11035)、山羊抗兔IgG(H + L)Alexa Fluor 594偶联物(货号A11012)、山羊抗兔IgG(H + L)Alexa Fluor 647偶联物(货号A21244)、山羊抗小鼠IgG(H + L)Alexa Fluor 488偶联物(货号A11029)、山羊抗小鼠IgG(H + L)Alexa Fluor 546偶联物(货号A11030)、山羊抗小鼠IgG(H + L)Alexa Fluor 647 偶联物(货号A21236)、山羊抗小鼠IgG藻红蛋白偶联物(货号M30004-1)(均为Invitrogen产品，稀释比例1:1000)。

质粒

pcDNA3.1 中的质粒:HA-DUOX2 ；DUOXA2 ；DUOX2 WT 指人源 DUOX2，在氨基酸 27-28 之间插入 HA-HA 和 Strep(St)标签，通过亚克隆带有 BamH1 和 BstX1 酶切位点的 188 bp 合成 DNA(Eurofins)构建而成；在 DUOX2 WT 中引入了 DUOX2 E843Q 点突变；UnaG-DUOX2:密码子优化的 UnaG 序列已合成(Eurofins MWG)，其带有框内酶切位点(BamH1-BstX1)，并通过接头插入到 DUOX2 的氨基酸 27-28 之间。pCMV-HyPer7-MEM 是 Vsevolod Belousov 馈赠的礼物(Addgene 质粒编号:136465；http://n2t.net/addgene:136465；RRID:Addgene_136465)；SypHer7-MEM C121S 突变体通过诱变生成。慢病毒:将 DUOX2 和 DUOXA2 克隆到 CGW 慢病毒表达载体中。使用双顺反子载体实现 DUOX2(WT、E843Q)与 DUOXA2 共表达 CFP 或 mCherry，以促进逐步流式细胞术分选。

细胞培养与转染

培养缺乏NOX/DUOX酶的NCI-H661细胞(ATCC HTB-183) ，以及主要表达DUOX2(平均Ct值为24)的BxPC3细胞(ATCC CRL-1687)，将其分别置于和条件下，在添加了GlutaMAX(Gibco 61870036)、10%热灭活胎牛血清(FBS；F7524，ThermoFisher Scientific)和1%丙酮酸钠(11360070，ThermoFisher Scientific)的RPMI-1640培养基中培养。HEK293FT细胞则在添加了10%胎牛血清(补充数据1)的高糖DMEM培养基(11965092，ThermoFisher Scientific)中，于和条件下培养。NCI-H661细胞采用FuGene HD(E2311，Promega)按照制造商方案进行瞬时转染，转染后进行检测。所有DUOX2构建体均与DUOXA2共转染。慢病毒转导:病毒颗粒按照其他文献所述方法在HEK293FT细胞中制备。病毒颗粒浓度采用PEG-it病毒沉淀溶液(LV810A-1，Cambridge Biosciences)按照制造商方案进行。BxPC3细胞和NCI-H661细胞在聚brene( ；Sigma)存在下，与浓缩病毒孵育。NCI-H661细胞采用两步法转导:首先生成表达DUOXA2的细胞，通过mCherry进行分选；随后转导DUOX2 WT或DUOX2 E843Q，通过CFP进行分选。将HyPer7-MEM转导至DUOX2 WT/DUOXA2和仅表达DUOXA2(对照)的H661细胞系，以及BxPC3 DUOX1/2 WT细胞中。在存在下，通过HyPer7 488 nm荧光对表达HyPer7-MEM的细胞进行分选。由此生成以下稳定表达细胞系:NCI-H661 DUOXA2、NCI-H661 DUOXA2/DUOX2 WT、NCI-H661 DUOXA2/DUOX2 E843Q、NCI-H661 DUOXA2/HyPer7-MEM、NCI-H661 DUOXA2/DUOX2 WT/HyPer7-MEM、BxPC3 DUOX1/2 WT HyPer7-MEM。

CRISPR/Cas9介导的DUOX2和DUOX1敲除

通过转染携带pSpCas9(BB)-2A-Puro(Addgene，62988)的向导RNA，实现BxPC3细胞中DUOX2的敲除以及剩余低水平DUOX1的敲除，该载体共表达Cas9核酸酶并带有嘌呤霉素抗性筛选标记(PuroR)。由Eurofins(Ebersberg)合成两端带有BbsI粘性末端的互补寡核苷酸(正链:5’-CACCGAAGTGCAGCGCTATGACGGC-3’；反链:5’-AAACGCCGTCATAGCGCTGCACTTC-3’)，以及靶向DUOX2第3外显子的20核苷酸向导RNA。同样地，靶向DUOX1第4外显子(正链:5’-CACCGAGCTCAGAACCCCATTTCGT-3’；反链:5’-AAACACGAAATGGGGTTCTGAGCTC-3’)。利用T4多核苷酸激酶(M0201S，New England Biolabs)磷酸化、退火和连接，将含向导RNA的寡核苷酸亚克隆到Cas9共表达质粒载体中。使用EZT-BXPC-1(EZ Biosystems)和嘌呤霉素将靶向质粒转染到BxPC3细胞中，持续三周以筛选靶向菌落。通过PCR和DNA测序验证靶向的BxPC3细胞。

SiRNA介导的FER敲低

将BxPC3 DUOX2 WT细胞以每孔个细胞的密度接种于12孔培养板中。接种24小时后，按照制造商的方案使用DharmaFECT 2 (Horizon T-2002)进行细胞转染，设置三种处理条件:阴性对照siRNA、FER SmartPool siRNA或不处理。转染后小时洗涤细胞，再孵育小时，转染后小时通过免疫印迹和免疫荧光分析FER敲低情况。迁移分析方面，siRNA转染后小时用胰蛋白酶消化细胞，计数后重新接种于趋化性载玻片(IBIDI 80326)中，小时后处理以检测单细胞迁移速度。

测量

DUOX2 产生的，在添加 PMA 和毒胡萝卜素并在含钙、镁的 PBS 中孵育后，通过高香草酸(HVA)法进行测量。细胞接种于 12 孔板中，在进行 HVA 检测前。采用 Synergy MX 酶标仪(Bio-Tek)测定荧光强度。通过 BCA 法测定细胞裂解液蛋白浓度，并结合标准曲线对的产生量进行定量。

免疫印迹与免疫沉淀

用于免疫印迹的蛋白质在含蛋白酶抑制剂(cOmplete Mini；罗氏)的RIPA缓冲液(110 mM Tris-HCL pH 7.5、140 mM NaCl、2% NP-40、2%脱氧胆酸钠和0.2% SDS)中提取，经SDS-PAGE分离、转膜后，与一抗孵育过夜，随后与HRP标记的抗兔二抗(Southern Biotech)或抗鼠二抗(Cell Signaling, Danvers)孵育1小时。使用ECL试剂(Pierce, 32106)显影蛋白质。免疫沉淀时，细胞在TX-100缓冲液(1% TX-100、50 mM HEPES pH 7.35、2.5 mM EDTA、150 mM NaCl、30 mM β-甘油磷酸钠、原钒酸钠、 PMSF、亮抑肽酶、胃蛋白酶抑制剂及cOmplete MINI蛋白酶抑制剂片，溶于 )中裂解。细胞裂解物与兔多克隆抗FER抗体(Proteintech)在振荡条件下孵育。将PBS中的蛋白A Sepharose珠(75mg/mL, P3381, Sigma Aldrich)以1:1的比例加入裂解物中，在下孵育过夜。洗涤和离心后，将珠子在2X Laemmli缓冲液中于加热，并以离心。取等体积的上清液经SDS-PAGE分离，按上述方法进行免疫印迹。随后用小鼠单克隆抗FER抗体(Invitrogen)对样品进行免疫印迹。磷酸化FER的定量通过ImageJ软件的光密度分析进行，使用抗FER免疫印迹进行标准化。图中所示的印迹使用ICY成像软件进行裁剪和对齐，未进行其他处理。

HyPer7-MEM 成像与定量

将表达 HyPer7-MEM 的细胞接种到 8 孔载玻片(80826，IBIDI)中，在配备 Andor Fusion 整合的 Yoko-gawa 转盘的倒置尼康 Ti 显微镜上进行成像，使用和物镜。显微镜环境控制保持在和。对细胞成像，丢弃前以实现探针均衡。在成像暂停时，将指定的刺激剂或抑制剂直接添加到显微镜载物台上的孔中。进行了以下对照实验:首先，在添加后加入 BAPTA-AM ，并对细胞再记录 (帧率:初始为 2 分钟间隔；刺激后 30 分钟为 4 分钟间隔)。其次，NCI- H661 DUOX2 WT/DUOXA2 细胞瞬时转染 HyPer7-MEM，用或二苯基碘鎓氯化物(DPI) 处理(帧率:初始为间隔，刺激后 2 小时为 1 分钟间隔)。第三，NCI-H661 DUOX2 WT/DUOXA2 细胞和 DUOXA2(对照)细胞瞬时转染 HyPer7-MEM 或 SypHer7-MEM；测量 HyPer7 和 SypHer7 的比例，随后用处理并再记录 (帧率:初始为间隔，处理后为间隔)。在所有条件下，HyPer7 荧光在和处激发，在 499-560 nm 处检测。每个孔成像 3 个视野，每个条件设 2 个孔。使用 ICY 生物图像分析软件(巴斯德研究所)分析时间序列。从每个通道中减去背景，将系列除以系列，得到 HyPer7 比例。在单个细胞周围放置感兴趣区域(ROI)，使用 ROI 强度演化插件获取整个时间序列的平均像素强度值。每个视野测量 3-6 个细胞，标准是 ROI 内仅包含单个细胞。将测量细胞的 HyPer7 强度合并，绘制每个条件的平均 HyPer7 比例/时间曲线。膜突起处的 HyPer7-MEM 信号按上述方法定量，不同之处在于 ROI 专门放置在延伸的质膜区域周围。

免疫荧光

固定细胞成像:将细胞接种在置于24孔板中的盖玻片(631-0148，VWR)上。对于部分定位研究，在接种后或瞬时转染后对细胞进行固定。TNT染色在后续操作后进行，血清饥饿以促进水平TNT的形成，或添加小鼠成纤维细胞条件培养基(mFCM；实验室自制)以，促进顶端突起的形成。通过表皮生长因子刺激圆形背褶的形成，持续。对于固定化伤口愈合分析，培养BxPC3细胞直至达到100%汇合度。用P10移液器吸头刮擦细胞单层，并在指定时间点进行固定。所有固定均使用2%多聚甲醛(PFA)在室温下进行15分钟。表达HyPer7-MEM的细胞在固定前用N-乙基马来酰亚胺(50 mM)洗涤，以保留HyPer7的氧化还原状态。用皂苷(0.5%，溶于PBS)透化10分钟后，进行封闭(3%山羊血清、1% BSA和3%甘氨酸)。随后将盖玻片与一抗在含3% BSA、0.1%皂苷的PBS中，于室温(RT)下避光孵育3小时。若需进行肌动蛋白染色，可在一抗溶液中加入BODIPY FL鬼笔环肽或BODIPY 558/568鬼笔环肽(稀释比例1:100)。洗涤后，将盖玻片与Alexa Fluor二抗在含3% BSA、0.1%皂苷的PBS中，于室温下避光孵育1小时。用DAPI染色盖玻片3分钟，洗涤后用Fluoromount-G(00-4958-02，ThermoFisher Scientific)封片。固定细胞成像使用蔡司LSM800 Airyscan共聚焦显微镜，搭配Plan-Apochromat 63X油浸物镜。使用ICY生物图像分析软件处理图像。

活细胞成像:将细胞接种到8孔载玻片(80826，IBIDI)中。使用FuGene HD在IBIDI载玻片中瞬时转染NCI-H661 DUOXA2细胞的UnaG-DUOX2，48小时后进行成像。将稳定表达HyPer7-MEM的细胞系直接接种到孔中。在接种后或按上述TNT成像的处理后对细胞进行成像。将培养基更换为不含酚红的RPMI-1640培养基(11835030，ThermoFisher Scientific)，该培养基要么不含血清，要么添加了含胆红素的10%胎牛血清(FBS)。活细胞成像使用奥林巴斯IX83(FV3000)共聚焦显微镜，搭配UPLFLN 60X/NA1.35油浸物镜。显微镜环境控制维持在和5% 。对于活细胞影片，以的帧率对HyPer7-MEM进行成像分辨率，每张图像的帧率为 (帧，间隔 )。UnaG荧光对光氧化敏感，在较高激光功率下会发生漂白。为尽量减少漂白，在低激光功率下对UnaG-DUOX2进行成像，每张图像的帧率为 (帧5.8秒，间隔15秒)。Fluo4-AM活细胞成像按上述方法进行，额外添加预孵育，使用 Fluo4-AM和1X浓度的活细胞肌动蛋白染料SPY555-FastAct。

在未进行定量的 HyPer7-MEM 固定细胞与活细胞成像中，图像以通道显示。图像以绿色伪彩色显示，或转换为热图。ICY 中应用的热图基于像素强度值，高值以红色表示，低值以蓝色表示。

片状伪足的动态膜分析

用于HyPer7-MEM定量的时间序列被用于生成动态膜。从预刺激时间点中选择了稳定表达HyPer7-MEM的NCI-H661 DUOX2 WT/DUOXA2和DUOXA2细胞，以定量片状伪足的突出速度。HyPer7 荧光被用于可视化片状伪足的形成。ImageJ被用于从每个条件下的20-25个单独细胞中生成片状伪足的动态膜，共进行了3次实验。

单细胞迁移

将BxPC3细胞(DUOX1/2野生型、DUOX2敲除、DUOX1/2敲除)和NCI-H661细胞(DUOXA2对照、DUOX2野生型/DUOXA2、DUOX2 E843Q/DUOXA2)接种至趋化性μ载玻片(IBIDI 80326)中。接种后，将培养基更换为不含酚红且不含FBS的RPMI-1640培养基。使用含20% FBS的RPMI-1640培养基作为趋化剂，以刺激细胞定向迁移。使用尼康Ti显微镜搭配10倍物镜，在处，每隔对细胞进行成像。使用ImageJ手动追踪插件对单个细胞进行追踪。每个细胞系在3次独立实验中，每次重复追踪20-25个细胞，以计算平均迁移速度。

TNT 定量

在个细胞接种于12孔细胞培养板后，于小时血清饥饿处理后，使用光学显微镜(尼康 TMS)对 NCI-H661 细胞(DUOXA2 对照组、DUOX2 WT/DUOXA2 组、DUOX2 E843Q/DUOXA2 组)进行观察。在血清饥饿期间，向选定的孔中加入的 GKT137831，在后重新添加。每个孔观察5个视野，每个细胞系设3个孔，共进行4次独立实验。将至少含有1个 TNT 的细胞数表示为视野内总细胞数的百分比。

伤口愈合实验

伤口愈合划痕实验:将BxPC3细胞(DUOX1/2野生型、DUOX2敲除、DUOX1/2敲除)接种到24孔细胞培养板中，培养至汇合状态。用P10移液器吸头刮擦细胞单层，形成线性伤口。洗涤孔板后，将培养基更换为添加了10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(不含酚红)。使用尼康Ti显微镜对细胞单层进行成像，环境控制保持在。伤口愈合实验期间不使用，细胞培养基用 HEPES缓冲液维持。每使用物镜拍摄一次图像，共拍摄次。使用ICY生物成像软件对生成的时间序列进行处理。由于不同孔板位置产生的对比度差异，自动细胞前沿检测不准确:孔板边缘的孔会出现阴影，而中央孔则过亮。因此，手动计算细胞前沿速度。对每个时间序列，沿伤口全长的6个点测量距离。使用每的移动距离计算细胞前沿的平均速度，将其转换为分钟。在造伤前30-40分钟，将抑制剂或激动剂添加到细胞培养基中，然后在新鲜RPMI-1640培养基中再次添加，培养基不含酚红，之后开始成像。使用的浓度如下:BAPTA-AM (造伤后时再次添加到培养基中)、、E260 20 μM、GKT137831 10 μM、Yoda1 5 μM、GsMTx4 5 μM。从时间序列中提取单个明场帧，以观察不同细胞系的伤口愈合动态。

使用IBIDI培养插入物进行屏障实验:按照制造商的说明，将BxPC3细胞(DUOX1/2野生型、DUOX2敲除、DUOX1/2敲除)接种到μ-皿(81176，IBIDI)中的2孔培养插入物中。当两个孔都达到100%汇合度后，小心取出培养插入物，向皿中添加培养基。使用尼康Ti显微镜进行成像，环境控制保持在；每拍摄一次图像，共拍摄次。为了全面评估单层动态，将培养插入物从皿中取出，并固定在24孔细胞培养板的孔中。向孔中加入培养基，静置过夜以确保无泄漏。将单层细胞在插入物中培养，并按照上述方法进行伤口闭合实验/速度计算。DUOX2野生型细胞在3次实验中进行测量，DUOX2敲除和DUOX1/2敲除细胞系在1次实验中进行测量。

HyPer7-MEM 细胞划痕愈合实验:将 BxPC3 DUOX1/2 WT HyPer7-MEM 细胞接种至 8 孔 μ 载玻片(80826，IBIDI)中，培养至汇合状态。在 Nikon Ti 倒置显微镜(配备 Yokogawa 转盘，由 Andor Fusion 整合)上，于和条件下对单层细胞进行成像。在划痕前，以为间隔对细胞进行时长的成像，舍弃前 5 分钟的图像以确保探针均衡。成像暂停后，在显微镜载物台上用 P10 移液枪头划痕单层细胞，以保持位置。使用物镜，每对伤口愈合的前进行一次成像。共进行 5 次独立实验，每次实验成像 2 个孔，每个孔取 3 个视野。此外，在划痕后，使用 20X 物镜每对 HyPer7 荧光进行时长的成像，每次实验 2 个孔，5 次独立实验均各取 3 个视野。HyPer7 在和处激发，在处检测。时间序列按前述方法处理以量化 HyPer7。为生成伤口愈合的平均 HyPer7 比值，在 (划痕时间)时，于细胞覆盖最广的区域放置 ROI。使用 ICY 中的 ROI Intensity Evolution 插件，获取该 ROI 内整个时间序列的平均像素强度。随后，利用 ROI 测量值追踪视野内细胞前沿回缩及后续延伸过程中，单层细胞覆盖面积的变化。将平均 HyPer7 比值标准化为各时间点细胞的覆盖率。从两个时间序列中提取单个帧，以可视化图中呈现的 HyPer7 488/405 nm 比值变化。

钙波划痕实验:将 BxPC3 DUOX1/2 WT 细胞接种至 8 孔载玻片(80826，IBIDI)中，培养至汇合状态。在 Nikon Ti 倒置显微镜(配备 Yokogawa 转盘，由 Andor Fusion 整合)上，于条件下对单层细胞进行成像，培养基中添加 5% Fluo4-AM，孵育后开始成像。首先对载玻片上汇合的单层细胞进行成像，随后用 p10 移液枪头划痕单层细胞，同时持续成像以捕捉中发生的快速钙信号传导。划痕时信号短暂丢失，但移液枪头压力释放后，信号恢复至正确焦平面。随后对划痕后的单层细胞进行时长的成像。通过在 (划痕时间)时，于细胞覆盖最广的区域放置 ROI，量化 Fluo4-AM 结合钙的变化。使用 ICY 中的 ROI Intensity Evolution 插件，获取该 ROI 内整个时间序列的平均像素强度。Fluo4-AM 量化结果来自 6 次生物学重复中的一次代表性实验，由于划痕差异及生物反应速度的影响，无法展示平均值。划痕后 Fluo4-AM 强度波增强的相同趋势在每个重复中均有体现。 Fluo4-AM 划痕实验的图像和视频以伪彩色红色热图呈现，以与 HyPer7-MEM 热图区分。

通透性

采用FITC-葡聚糖(TbD Labs)跨孔试验测量单层细胞通透性。将BxPC3细胞(DUOX1/2野生型及DUOX1/2敲除型)接种至Millicell悬挂式细胞培养插入物( 直径孔；PTSP24H48，Merck Millipore)，该插入物置于24孔培养板中。当细胞达到完全汇合后，更换两个腔室的培养基为新鲜培养基。上腔室培养基中含有 FITC-葡聚糖。将培养板放回孵箱中，从每个下孔取培养基，用Synergy MX酶标仪(Biotek)进行三次重复测量荧光强度。通过标准曲线定量FITC-葡聚糖浓度。测量未受损的汇合单层后，用PBS洗涤上下孔，在下用新鲜培养基孵育。然后用P10移液器吸头刮擦单层，重复上述步骤(在损伤后进行测量)。在损伤后和进行进一步测量。每次测量后洗涤细胞并更换新鲜培养基。实验重复5次，每个细胞系设3个重复。以未刮擦的单层和空孔作为对照。

F-肌动蛋白定量

按照制造商方案，使用G-肌动蛋白/F-肌动蛋白体内检测试剂盒(Cytoskeleton Inc.，BK037)对F-肌动蛋白进行定量。将细胞接种到6孔细胞培养板中，使其过夜贴壁。将培养基更换为预热的 LAS01缓冲液(裂解和F-肌动蛋白稳定缓冲液)。通过刮取收集细胞，将裂解液移至管中。通过涡旋振荡和使用P20吸头反复吹打使样品均质化。将裂解液在下孵育，并在室温下以离心。将上清液在下以超速离心。将含有总G-肌动蛋白的上清液转移至新管中，同时将F-肌动蛋白沉淀重悬于肌动蛋白解聚缓冲液中，并在冰上孵育。然后对G-肌动蛋白和F-肌动蛋白样品进行免疫印迹处理，并用抗肌动蛋白小鼠单克隆抗体(Cytoskeleton；7A8.2.1)进行检测。使用ImageJ处理印迹图像，并计算每个样品中F-肌动蛋白占总肌动蛋白的百分比。

定量PCR

以的浓度将BxPC3 DUOX1/2 WT细胞接种至6孔细胞培养板中。接种后，对细胞进行洗涤，用RLT缓冲液(79216，Qiagen)裂解，通过刮取法分离。使用RNeasy Mini试剂盒(74104，Qiagen)进行RNA提取。使用nanodrop ND-1000分光光度计(ThermoFisher)评估RNA浓度和纯度。使用High-Capacity cDNA反转录试剂盒(10400745，Applied Biosystems)制备浓度为的cDNA。在Quantstudio 7 Flex热循环仪(Applied Biosystems)中，于Micro-Amp™光学384孔反应板(10005724，Applied Biosystems)中进行实时PCR。使用以下TaqMan探针:DUOX1 Hs01047827-m1；DUOXA1 Hs00328806_m1；DUOX2 Hs00204187_m1；DUOXA2 Hs 01595311_g1；GAPDH Hs02786624_g1。以无反转录酶和样品作为对照。每次板运行中，每个基因均进行三次重复样品运行。

流式细胞术

将 NCI-H661 DUOXA2 细胞以每孔个细胞的密度接种于12孔培养板中，并使用 FuGene HD 进行瞬时转染，以表达 DUOX2 WT、DUOX2 E843Q 或空载体，每组设置3个孔构建体。转染后，洗涤细胞，用胰蛋白酶消化，合并3个孔的细胞悬液并计数。将个细胞重悬于200 µl FACS 缓冲液(含2% FBS 的 PBS)中，以转速离心，然后重悬于封闭缓冲液(含10% 山羊血清的 FACS 缓冲液)中15分钟。离心细胞后，将其重悬于一抗溶液(含1:100 抗 HA 抗体和1:1000 eFluor780 死活染色剂的 FACS 缓冲液)中。样品在室温下避光孵育20分钟。洗涤细胞3次，然后重悬于二抗溶液(含1:100 抗小鼠 PE 的 FACS 缓冲液)中，在室温下避光孵育20分钟。再洗涤细胞2次，最终重悬于 FACS 缓冲液中。使用 Accuri C6 Plus 流式细胞仪(BD Biosciences)进行流式细胞术分析。首先通过前向散射和侧向散射对细胞进行单门设门，然后通过死活染色和 PE 确定 HA 标签阳性的细胞，且未进行细胞膜通透化，表明 HA-DUOX2 定位于质膜。未染色和仅二抗染色的样品用作设门对照。

统计学与可重复性

统计分析使用GraphPad Prism 8(美国圣地亚哥Graph-Pad软件公司)完成。统计检验详情见图注。两组比较采用Welch校正的未配对检验。多组分析采用Brown-Forsythe和Welch单因素方差分析及Dunnett T3事后检验。图注中值显示为高于的值。未采用随机化或设盲方法。对于HVA定量，每个点代表3次独立实验中3次技术重复的单次测量值，误差棒为标准差(SD)。对于动态轮廓线分析，每个点代表3次独立实验中不同细胞的单个片状伪足。对于BxPC3和NCI-H661细胞的单细胞迁移速度，每个点代表3次独立实验的平均值，每次实验追踪20-25个细胞。对H661细胞间至少具有1个TNT的细胞数量进行定量时，每个点代表5个视野中具有TNT的细胞平均数，以占视野内细胞总数的百分比表示。实验重复4次，每个细胞系每次实验设3个复孔。在伤口愈合分析中，每个点代表每的平均速度，来自3次独立实验，每次实验设3-6个复孔。

报告摘要

有关研究设计的更多信息，可在与本文关联的《Nature Portfolio 报告摘要》中查阅。

数据可用性

支持本研究结果的所有数据均可在正文或补充信息中获取。本文提供了原始数据。

参考文献

1. Seetharaman, S. & Etienne-Manneville, S. Cytoskeletal crosstalk in cell migration. Trends Cell Biol. 30, 720-735 (2020).

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3. Rudzka, D. A., Cameron, J. M. & Olson, M. F. Reactive oxygen species and hydrogen peroxide generation in cell migration. Commun. Integr. Biol. 8, e1074360 (2015).

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5. Rajan, S., Terman, J. R. & Reisler, E. MICAL-mediated oxidation of actin and its effects on cytoskeletal and cellular dynamics. Front Cell Dev. Biol. 11, 1124202 (2023).

6. Liu, T. et al. Cortactin stabilizes actin branches by bridging activated Arp2/3 to its nucleated actin filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 31, 801-809 (2024).

NADPH,DUOX2,囊泡,肌动蛋白,H₂O₂,上皮屏障

无

与THO或Yra1结合的DEAD-box ATPase Sub2的结构与生化分析

无

与THO或Yra1结合的DEAD-box ATPase Sub2的结构与生化分析

表观信息

时空性H2O2脉冲协调肌动蛋白细胞骨架重塑，并调控细胞迁移与伤口愈合

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