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NAD/NADH比率检测试剂盒(红色荧光法)

NAD/NADH比率检测试剂盒(红色荧光法)，Amplite® Fluorimetric NAD/NADH Ratio Assay Kit Red Fluorescence，提供了一种高灵敏度检测NAD、NADH及其比值的创新解决方案。更多视频请关注视频号【艾维缔】。哔哩哔哩【IVDSHOW】。抖音【军哥聊表观】。

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所属分类

细胞生物学

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烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）及其磷酸化形式烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP⁺）是细胞内至关重要的辅因子。其中NADH作为NAD⁺的还原形态，而NAD⁺则是NADH的氧化形态。当腺苷核苷酸2'位通过酯键连接磷酸基团时，NAD⁺即转化为NADP⁺。NADP⁺主要参与需要还原剂NADPH的合成代谢过程，如脂肪酸与核酸的生物合成。传统NAD/NADH与NADP/NADPH检测依赖于340nm处NADH或NADPH吸光度的监测。由于该方法需在紫外波段使用昂贵的石英微孔板进行检测，存在灵敏度低且干扰性强的缺陷。

NAD/NADH比率检测试剂盒(红色荧光法)提供了一种高灵敏度检测NAD、NADH及其比值的创新解决方案。该检测体系中的特异性酶通过酶循环反应精准识别NAD/NADH，无需对样本混合物进行预先纯化。这种酶循环反应机制使检测灵敏度得到显著提升，同时反应在可见红光区进行，可大幅降低生物样本的背景干扰。

该检测体系兼具高灵敏度与低干扰特性。Amplite®荧光法NAD/NADH检测试剂盒支持96孔或384孔微孔板操作，无需分离步骤即可轻松实现自动化检测。

实验方案

96孔板测定示例

概述

准备25μLNADH标准品和/或测试样品

添加25μLNADH或NAD提取溶液

在室温下孵育15分钟

加入25μLNAD或NADH萃取溶液

加入75μLNAD/ NADH反应混合物

在室温下孵育15分钟至2小时

监测Ex / Em = 540 / 590nm处的荧光强度

注意：在开始实验之前，在室温下解冻每个试剂盒组分中的一个。

操作方法

1.准备NADH储备溶液：

将200μLPBS缓冲液加入到NADH标准品（组分C）的小瓶中，得到1mM（1nmol / L）NADH储备溶液。

注意：未使用的NADH储备溶液应分成单次使用的等分试样并储存在-20℃。

2.准备NAD / NADH反应混合物：

将10mL NADH传感器缓冲液（组分B）加入NAD / NADH再循环酶混合物（组分A）的瓶中，并充分混合。

注意：这种NAD / NADH反应混合物足以用于两个96孔板。未使用的NAD / NADH反应混合物应分成一次性等分试样并储存在-20℃。

3.准备连续稀释的NADH标准品（0至10μM）：

3.1将30μL1mMNADH储备溶液（来自步骤1）加入970μLPBS缓冲液（pH7.4）中，得到30μM（30pmol / L）NADH标准溶液。

注意：稀释的NADH标准溶液不稳定，应在4小时内使用。

3.2取200μL30M NADH标准溶液（来自步骤3.1）进行1：3连续稀释，得到10,3,1,0.3,0.1,0.03和0 M系列稀释的NADH标准品。

3.3如表1和2中所述，将连续稀释的NADH标准品和/或含NAD / NADH的测试样品添加到固体黑色96孔微量培养板中。

注意：根据需要准备细胞或组织样本。

表1.实心黑色96孔微孔板中NADH标准品和测试样品的布局

BL	BL	TS	TS	TS (NADH)	TS (NADH)	TS (NAD)	TS (NAD)
NS1	NS1	….	….	….	….	….	….
NS2	NS2
NS3	NS3
NS4	NS4
NS5	NS5
NS6	NS6
NS7	NS7

注意：NS = NAD / NADH标准; BL =空白对照; TS =测试样品; TS（NADH）=用NADH萃取溶液处理10至15分钟的测试样品，然后用NAD萃取溶液中和; TS（NAD）=用NAD提取溶液处理10至15分钟的测试样品，然后用NADH提取溶液中和。

表2每个孔的试剂组成

NADH Standard	Blank Control	Test Sample (NAD/NADH)	Test Sample (NADH Extract)	Test Sample (NAD Extract)
Serial Dilutions*: 25 μL	PBS: 25 μL	Test Sample: 25 μL	Test Sample: 25 μL	Test Sample: 25 μL
Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component D: 25 μL	Component E: 25 μL
Incubate at room temperature for 10 to 15 minutes
Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component F: 25 μL	Component E: 25 μL	Component D: 25 μL
Total: 75 μL	Total: 75 μL	Total: 75 μL	Total: 75 μL	Total: 75 μL

*注意：将连续稀释的NADH标准品从0.03μM至30μM加入NS1至NS7的孔中，一式两份。高浓度的NADH（例如，>300μM，终浓度）可能由于NADH传感器（非荧光产物）的过度氧化而导致荧光信号降低。

3.4对于NADH提取（NADH）：将25μLNADH提取溶液（组分D）加入含有NAD / NADH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μLNAD提取溶液（组分E）以中和NADH提取物，如表1和2中所述。

对于NAD提取（NAD）：将25μLNAD提取溶液（组分E）加入含有NAD / NADH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后加入25μLNADH提取溶液（组分D）以中和NAD提取物，如表1和2中所述。

对于总NAD和NADH：将25μLNAD/ NADH对照溶液（组分F）加入NADH标准品和含有NAD / NADH的测试样品的孔中。在室温下孵育10至15分钟，然后如表1和2中所述添加25μL对照溶液（组分F）。

注意1：根据需要准备细胞或组织样本。 NAD / NADH裂解缓冲液（组分G）可用于裂解细胞（详见附录）。

注意2：在健康的哺乳动物细胞中，与NADH相比，NAD更多，因此可以简单地使用总NAD和NADH减去NAD来计算NADH的量。

4.在上清液反应中运行NAD / NADH测定：

4.1将75μLNADH反应混合物（来自步骤2）加入NADH标准品，空白对照和测试样品（来自步骤3.4）的每个孔中，使得总NADH测定体积为150μL/孔。

4.2在室温下孵育反应15分钟至2小时，避光。

4.3用Ex / Em = 540 / 590nm（截止值570nm）的荧光板读数器监测荧光增加。

注意：也可以将板的内容物转移到白色透明底板上，并用吸光度酶标仪在576±5nm的波长下读数。与荧光读数相比，吸收检测具有较低的灵敏度。

产品组分

内容	型号	规格	储存温度
NAD/NADH比率检测试剂盒(红色荧光法)	15263	250次	-20°C
操作手册	1	1	常温

文件资源

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