DNA超螺旋增强ParB蛋白介导的DNA凝聚
发布时间：
2026-05-02 11:53
DNA超螺旋增强ParB蛋白介导的DNA凝聚
亚历杭德罗·马丁 - 冈萨雷斯 ，米洛什·蒂什马 ，布莱恩·T·阿纳利库 ，安德斯·巴特 ，理查德·贾尼森 ，哈马姆·安塔尔 ，詹卢卡·肯普斯 ，斯特凡·格鲁伯 和塞斯·德克尔01,*
代尔夫特理工大学卡夫利纳米科学研究所生物纳米科学系，范德马斯韦格9号，2629HZ代尔夫特，荷兰
洛桑大学(UNIL)生物与医学学院(FBM)基础微生物学系(DMF)；瑞士洛桑CH - 1015
比特茨转化实验室，德根多夫理工学院，94363上施奈德，德国
*通信应寄往此处。电话:+31 15 2786094；电子邮件:C.Dekker@tudelft.nl
前两位作者应被视为贡献相等的共同第一作者。
摘要
ParABS系统在细菌染色体分离中起关键作用。该系统的关键组分ParB，加载并沿DNA扩散以形成称为分区复合物的局部蛋白质 - DNA凝聚物。由于RNA聚合酶、拓扑异构酶和类核相关蛋白的持续作用，细菌染色体高度超螺旋，因此研究DNA超螺旋对ParB - DNA分区复合物形成影响很重要。在此，我们使用体外单分子测定法来可视化超螺旋DNA上的ParB。与大多数DNA结合蛋白不同，发现单个ParB蛋白不会在超螺旋DNA上固定麻花状结构，而是沿超螺旋DNA自由扩散。我们发现DNA超螺旋增强ParB - DNA凝聚，其在比扭转松弛的DNA更低的ParB浓度下启动。ParB蛋白诱导一种DNA - 蛋白质凝聚物，其显著吸收所有超螺旋扭曲。我们的发现提供了机制见解，对我们理解细菌染色体组织和分离具有重要意义。
图形摘要
引言
染色体可靠地分离到子细胞中是所有生物体稳定繁殖的基本要求。ParABS系统是大多数细菌中负责染色体忠实分离的主要机制(1,2)。它由一种ATP水解酶分区蛋白A(ParA)(3,4)、一种CTP水解酶分区蛋白B(ParB)(5,6)和一个16碱基对的着丝粒序列parS组成，parS在复制起点附近有多个拷贝(7)。虽然ParA蛋白非特异性地结合到DNA上以覆盖整个染色体(8,9)，但ParB蛋白在parS序列处特异性地加载到DNA上(6,10,11)。在此结合之前，两个单体的
收到日期:2024年7月17日。修订日期:2024年9月27日。编辑决定:10月 这是一篇开放获取文章，根据知识共享许可协议发布，允许在任何媒介中进行无限制的重用、分发和复制。ParB蛋白通过其C末端形成一个开放的二聚体，暴露DNA结合结构域以识别parS位点(6,11)(图1A)。ParB的N末端结构域可以结合CTP核苷酸，这是ParB活性的关键调节因子(6,10 - 13)。结合parS后，ParB二聚体改变构象，围绕DNA分子形成封闭状态(“夹子”)，同时将两个先前结合的CTP分子夹在两个N末端之间(11,12)。形成夹子后，ParB二聚体失去对parS位点的亲和力，并沿DNA横向扩散，扩散距离可达10 kb(图1B)(11)。在 之后，两个CTP分子最终水解，使ParB夹子不稳定，单体恢复到开放状态 。这个开放的夹子现在可以从DNA分子上解离，或者连接到附近的ParB二聚体上，形成一个动态的蛋白质 - 蛋白质桥(14 - 17)。解离确保ParB蛋白循环并重新加载到parS位点，确保在原点附近维持高局部ParB浓度，而动态桥接对于形成称为分区复合物的高阶核蛋白结构很重要(18 - 20)。分区复合物形成有多种模型，如ParB与DNA之间的成核和笼化(20,21)、液 - 液相分离(22,23)或桥接诱导的凝聚(14 - 18,24,25)，但它们都依赖于存在与DNA结合的ParB蛋白，这些蛋白表现出自相互作用和远端片段的桥接。在复制起点附近形成分区复合物进一步促进了SMC蛋白(染色体结构维持蛋白)的加载(26 - 28)，并与沿类核的ParA梯度相互作用(图1C)(23,29 - 31)，这诱导了新生起点向子细胞的定向移动。
图1. ParB与DNA的结合及分区复合物的形成。(A)ParB二聚体结构及加载到DNA 的示意图。ParB的单体单元在其N末端结构域各自结合一个CTP核苷酸(6)。识别parS位点后，ParB二聚体发生构象变化，围绕DNA形成拓扑夹子(11 - 13)。(B)ParB在DNA上的加载、扩散和桥接。加载到parS位点(左上角)后，ParB二聚体失去对parS的亲和力并开始沿DNA扩散(6,10)。CTP水解后，ParB蛋白要么(i)从DNA上解离并循环到parS(11)，(ii)从周围环境中招募新的ParB蛋白到DNA上(44)，要么(iii)与另一个与DNA结合的ParB二聚体形成动态的ParB - ParB桥 - 这对于分区复合物的形成至关重要(14,17,24,41)。(C)描绘分区复合物在染色体分离中定向移动的示意图。起源复制后立即形成一个大型的ParB分区复合物，其中包含几乎所有细胞中的ParB蛋白。分区复合物招募SMC复合物(示意图中未显示)，有助于分离两个新生起点(27,28)。新生的分区复合物与附近的ParA分子相互作用，并通过扩散棘轮机制开始向细胞的细菌极定向移动(29 - 31)。
在细胞中，转录对基因组DNA施加显著的力和扭曲(32,33)。转录基因的RNA聚合酶会在转录位点下游持续产生正超螺旋，并在转录位点上游产生负超螺旋(34 - 37)。当这种扭转张力积累时，DNA会扭曲并形成麻花状结构，即伸展的相互缠绕的DNA螺旋(37 - 39)。许多其他细胞过程通过拓扑异构酶和类核相关蛋白的作用来调节和控制基因组内的超螺旋。反之，超螺旋已知会通过改变DNA的蛋白质结合亲和力和空间组织来影响细菌细胞中的许多过程(32,40)。最近的计算机模拟研究(41,42)表明，例如，超螺旋可能通过调节DNA远端片段之间的相互作用，强烈改变ParB - DNA分区复合物的动力学。
在这里，我们使用单分子可视化分析方法(43)研究了DNA超螺旋对ParB扩散和凝聚动力学的影响。我们测量了单个ParB二聚体在超螺旋和非超螺旋DNA分子上的扩散，发现超螺旋的存在会减少ParB在DNA上的停留时间。此外，我们测量了超螺旋DNA上ParB蛋白诱导的ParB-DNA凝聚程度，以及在ParB存在下螺线管动力学和定位的变化。我们观察到所有的螺线管结构都被吸收在ParB-DNA凝聚物中。横向DNA流动和原子力显微镜(AFM)证实，在ParB存在下的超螺旋DNA产生了一种塌陷结构，该结构吸收了所有的超螺旋扭曲。这项实验研究揭示了DNA超螺旋和ParB-DNA凝聚之间的相互作用，这两个基本且重要的过程控制着细菌基因组的组织和分离。
材料与方法
ParB的纯化与荧光标记
表达构建体是使用带有插入的枯草芽孢杆菌ParBL5C基因的pET-28a(+)质粒骨架制备的[最初发表于(16)并由Soh等人(6)修改]。简而言之，使用引物STM682和STM683从基因组中扩增ParB，这两个引物将BamHI和NcoI限制性位点引入聚合酶链反应(PCR)产物中(表1)。此外，引物STM683在parB基因的Lys5处引入突变并将其转化为Cys，随后通过与马来酰亚胺染料的点击化学反应用于蛋白质标记。最终质粒使用用于BamHI和NcoI消化的标准NEB方案构建，该方案用于ParBL5C PCR产物和pET-28a(+)质粒(诺唯赞)，然后在转化至化学感受态BL21-Gold细胞之前，用T4 DNA连接酶(新英格兰生物实验室，M0202L)在室温下连接15分钟。我们在 的ZYM-5052自诱导培养基中于 在大肠杆菌BL21-Gold(DE3)中表达重组蛋白。用于荧光标记的ParB 变体的纯化如前所述(6,44)进行。简而言之，我们通过离心沉淀细胞，并在缓冲液A[50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、500 mM NaCl、1 mM EDTA、5 mM β-巯基乙醇、5%(v/v)甘油和蛋白酶抑制剂混合物(西格玛-奥德里奇)]中通过超声处理使其裂解。Tris-HCl缓冲液使用1 M Tris-HCl(pH 7.5)(超纯™，英杰公司)配制。然后我们在搅拌下于 向含有 饱和度的上清液中加入硫酸铵并持续 。我们离心样品，收集上清液，随后加入硫酸铵至 饱和度并在 持续搅拌 。我们收集沉淀(含有ParBL5C蛋白)并将其溶解在缓冲液B[50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、1 mM EDTA和2 mM β-巯基乙醇]中。在加载到肝素柱(通用电气医疗集团)上之前，将样品在缓冲液B中稀释以达到18 的电导率。我们使用含有 的缓冲液B的线性梯度洗脱蛋白质。收集峰馏分后，我们在缓冲液B中重复稀释至 电导率并将其加载到HiTrap SP柱(通用电气医疗集团)上。为了洗脱，我们使用含有1 M NaCl的缓冲液B的线性梯度。我们将收集的峰馏分直接加载到预先在 Tris-HCl(pH 7.5)、 和1 mM TCEP[三(2-羧乙基)膦](赛默飞世尔科技)中平衡的Superdex 200-16/600 pg柱(通用电气医疗集团)上。为了进行荧光标记，我们将纯化的ParBL5C变体与Alexa647-马来酰亚胺以1:2的摩尔比(蛋白质:染料)孵育。我们将混合物在冰上孵育 ，离心 ，然后从旋转脱盐柱(Zeba)上洗脱并在液氮中快速冷冻。我们通过Nanodrop上的内置功能估计ParB-Alexa647的荧光团标记效率为74%(导致93%的标记ParB二聚体)，该功能通过在280 nm处的吸光度测量蛋白质浓度，通过在峰值波长处的吸光度测量染料浓度(此处对于Alexa647为 )。基于其蛋白质序列，我们对Alexa647使用 的消光系数，对ParB蛋白使用 的消光系数。
表1. 本研究中用于克隆和质粒构建的DNA引物
| 引物名称 | 序列 至 |
| STM682 | ATTCGGATCCTTATGATTCTCGTTCAGACAAAAGCTC |
| STM683 | ATATACCATGGCTAAAGGCTGTGGAAAAGGGATTAATGCG |
| CD21 | GACCGAGATAGGGTTGAGTG |
| CD22 | CAGGGTCGGAACAGGAGAGC |
| MT30 | CTGCAGGAAGGTTTAAACGCATTTAGG |
| MT31 | TAATACGACTCACTATAGGGAGACGC |
| MT32 | CCTGTAGTCTTCTTAATTAAGACGTCAG |
| MT33 | GTACCAAGTCTTCGAATTCGGATC |
| MT39 | GATCCGAATTCGAAGACTTGGTACGGTCTCATCGTAAAGCTTCTTGATAACGGGGAC |
| MT40 | GACGTCTTAATTAAGAAGACTACAGGGGTCTCAATGGTCCAGTCCCATTTCCCCTATCGC |
用于荧光实验的可卷曲 构建体的构建与纯化
为了制备适用于流动槽实验的线性片段，我们使用Qiafilater质粒中提试剂盒(Qiagen)通过中提方法分离了约38 kb的质粒pBS-parS。这个大质粒由多个较小的组件构建而成，详情见Tišma等人(17)的描述。我们使用NotI-HF或XhoI限制性内切酶(New England Biolabs)在 对pBS-parS进行 消化，并在 热失活20分钟。这产生了一个线性片段，其parS位点靠近DNA分子中部，更具体地说是在相对于DNA末端的0.4相对位置处。为了制备一个在插入染料浓度变化时能够引入DNA超螺旋的线性片段，我们构建了一个在末端带有多个生物素的片段，这些生物素会从扭转角度限制分子绕其轴旋转。 构建体的手柄通过PCR制备，使用来自较大模板pJT186的514 bp的引物CD21/CD22[详情和序列见表格1和Tišma等人(17)]，生物素-16-dUTP(Jena Bioscience，NU-803-BIO16-L)与dTTP(Thermo Fisher Scientific，10520651)的比例为1:5。这允许将生物素化核苷酸随机多次插入到最终的DNA 末端。我们使用NotI-HF或XhoI在 对这些生物素化的PCR片段进行 消化，得到长度为 的手柄。我们将消化后的手柄与大 片段以10:1的摩尔比(生物素手柄与 )混合，并加入T4 DNA连接酶(New England Biolabs，M0202L)和1 mM ATP进行连接。连接在 过夜进行，随后在第二天在 热失活 。为了从大片段中去除多余的生物素手柄，我们使用ÄKTA pure，配备含有 的Sephacryl S-1000 SF凝胶过滤介质(Cytiva)的自制凝胶过滤柱，用含有 的TE缓冲液运行。样品以 的速度运行。从ÄKTA纯化中收集的含有预期DNA大小的馏分保存在 ，直至使用，以避免引入DNA分子缺口的冻融循环。最终混合物包含 可卷曲分子，其余为不可卷曲/有缺口的分子，在整个工作中用作对照比较。
单分子可视化分析
我们使用超螺旋DNA和ParB蛋白在定制的流动池中进行了实验，该流动池是通过使用双面胶带连接表面钝化的载玻片和盖玻片制成的(45,46)。表面的制备方法如Chandranoss等人(45)所述，并略有修改。经过彻底清洁后，使用3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(10% v/v)和乙酸 甲醇溶液对表面进行硅烷化处理。我们用NHS-酯聚乙二醇(N-羟基琥珀酰亚胺酯聚乙二醇，5000 Da)和生物素化的NHS-酯聚乙二醇(5000 Da)进行表面钝化， 。这一步骤重复 次，以确保ParB蛋白与表面的低粘附性。此外，我们在T20缓冲液[40 mM Tris-HCl(pH 7.5)，20 mM NaCl]中用 超纯 牛血清白蛋白(BSA)(赛默飞世尔科技)处理表面30分钟。这进一步降低了标记的ParB与表面的非特异性粘附。
为了固定 ，我们以 的流速在不含氧清除酶的成像缓冲液[40 mM Tris-HCl(pH 7.5)，65 mM KCl，2.5 mM MgCl ，2 mM Trolox，1 mM TCEP，30 mM葡萄糖，0.25 mg ml BSA，1 mM CTP，25 - 400 nM SYTOX Orange(SxO，赛默飞世尔科技)]中引入生物素化 - DNA 分子的 的 。流动后立即，我们以相同流速进一步流动 的洗涤缓冲液 [Tris-HCl(pH 7.5)，20 mM NaCl，65 mM KCl，25 - 400 nM SxO]，以确保DNA的另一端拉伸并系留在表面。通过调节流速，我们获得了约为DNA轮廓长度20 - 50%的拉伸。在 的初始系留期间和成像期间通过改变SxO浓度来诱导正超螺旋和负超螺旋。即，为了诱导系留DNA的正超螺旋，我们在初始25 nM SxO下系留DNA，而最终实验在成像缓冲液[40 mM Tris-HCl(pH 7.5)， Trolox， TCEP，10 nM过氧化氢酶，18.75 nM葡萄糖氧化酶，30 mM葡萄糖， BSA，50 - 250 nM SxO]中的250 nM SxO下进行。相反，为了诱导负超螺旋，初始系留在 下进行，而最终成像在 下进行。DNA固定后预结合的SxO染料的释放以及现在DNA中较低量染料的存在导致DNA的负超螺旋。表面结合DNA内的最终超螺旋水平与先前报道的细菌基因组水平相似(40)
接下来，我们以非常低的流速 在不含ParB蛋白的成像缓冲液中流动，以便在添加蛋白前后对DNA分子造成最小的干扰。通过在成像缓冲液中引入ParB(0.2 - 25 nM)来进行ParB扩散的实时观察。我们使用了一台自制的物镜 - TIRF显微镜，配备Di01 - R405/488/561/635 - 25二向色镜(BrightLine®，IDEX H&S)和NF03 - 405/488/561/635E - 25四陷波发射滤光片(StopLine®，IDEX H&S)进行荧光成像。在高倾斜层叠光学片(HiLo)显微镜模式下，我们交替激发 和647 激光，分别对SxO染色的DNA和Alexa647标记的ParB进行成像。HiLo允许对表面附近的薄切片进行成像，穿透深度为几微米，这使得能够捕获DNA分子，但减少了来自周围荧光团的离焦信号。所有图像均使用PrimeBSI sC - MOS互补金属氧化物半导体相机在曝光时间为 ( 帧率)下采集，使用 油浸、1.49 NA CFI APO TIRF(尼康)。
图像处理与分析
使用Fiji(48)从原始图像序列中裁剪出单个DNA分子所在的区域，并使用先前发表的python软件(49,50)进行单独分析。在这里，选择单个分子周围的矩形区域并裁剪成一个仅包含单个分子的新视频。对单个视野中的所有分子重复此操作。为了分析这些区域，该软件使用窗口大小设置为10像素的中值滤波器对裁剪后的图像部分进行平滑处理，并使用scipy python模块(51)中提供的“white_tophat”操作减去背景。我们仅出于可视化目的手动调整所得图像的对比度(即图4C)。手动标记DNA的末端。为了获得我们图像序列的动态图像，我们在DNA轴上获取11个像素的总荧光强度，并将它们沿时间轴堆叠(即图3B)。我们选择完全相同的DNA轴来获取ParB荧光通道的动态图像，并通过将第二个通道移动一帧使帧时间匹配为相同。
为了进一步分析肌动蛋白纤维电泳图，我们通过使用scipy Python模块在每一帧中找到局部最大值，来识别高DNA和蛋白质肌动蛋白纤维电泳图的“峰值”。如果两个最大值在7个像素距离内且彼此相距5帧(1秒)，则将这些最大值合并为单个轨迹。从这些轨迹中，我们根据跟踪峰值中的荧光强度分数相对于DNA的总荧光强度，计算了超螺旋或DNA凝聚物的大小。峰值像素扩展了 个像素以覆盖信号的宽度。我们使用11帧移动窗口来计算随时间变化的表观扩散常数 (图4D和H)。我们从在2到20帧的滞后时间内计算的MSD中，为每个分析的DNA分子计算超螺旋的扩散常数(即图5B)，然后通过拟合函数 ，其中 是滞后时间。如图5A所示，凝聚分数是通过基于ParB-Alexa647的存在、高DNA信号和低表观扩散常数的手动识别来计算的。由于DNA超螺旋可能会与DNA的凝聚片段混淆，在将一个事件分类为“超螺旋凝聚物”而不仅仅是局部扩散的超螺旋之前，我们在延长的时间段(200帧，即40秒)内筛选了ParB的存在以及超螺旋扩散动力学 的显著变化。使用窗口大小为9帧的中值滤波器对1D曲线扩散信号、凝聚物大小信号和ParB强度信号(图4)进行滤波。使用Igor Pro V6.39(Wavemetrics，美国)中的自定义脚本对超螺旋大小与DNA位置以及超螺旋位置与ParB簇位置进行分析。
用于原子力显微镜实验的4.2 kb DNA 构建体的构建
为构建用于原子力显微镜(AFM)实验的环状DNA，我们使用了市售的pGGA质粒骨架(新英格兰生物实验室)。我们通过使用MT032和MT033引物(表1)进行PCR反应，制备了pGGA质粒的线性化片段，该片段用作插入含parS片段的骨架。与此同时，我们通过使用引物MT039和MT040(表1)进行菌落PCR，从枯草芽孢杆菌基因组中提取了metS基因下游包含parS位点的区域。我们将质粒骨架与菌落PCR插入片段按1:3的摩尔比在 高保真混合物(新英格兰生物实验室)中混合，以获得4175 bp的最终质粒。我们将反应在 孵育60分钟，然后冷却至 30分钟。然后，我们将该反应的 转化到 大肠杆菌NEB5alpha细胞(新英格兰生物实验室)中，并在第二天通过使用MT030和MT031(表1)进行测序来验证生长菌落中插入片段的存在。我们在 含有选择性抗生素氯霉素(Cm) 的条件下，将序列阳性克隆过夜培养以进行质粒提取。为了获得超螺旋质粒，我们将过夜培养物以1:100的比例稀释在 新鲜的LB-Cm(Luria-Bertani)培养基中，并在 培养，直到培养物达到 。然后，我们将培养物置于冰上 ，然后离心收集 的培养物，接着使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)进行最终质粒的分离。样品保存在 ，以避免任何可能在DNA分子中引入切口并降低超螺旋质粒产量的冻融循环。将要产生切口的质粒直接从过夜培养物中提取。这些质粒使用针对Nb. BbvCI切口酶(新英格兰生物实验室)的改良方案进行切口处理，利用metS基因中预先存在的识别位点。我们将切口酶(1:50 NEB原液稀释)加入提取的质粒溶液中，并在 孵育 ，然后立即通过PCR提取膜(Wizard® SV，Promega)进行纯化，并特别跳过推荐的 失活步骤，这将导致我们的AFM实验中出现一部分单链DNA。接下来的步骤是使用相同的QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)进行三轮质粒纯化，以去除所有可能通过非特异性粘附在表面而破坏AFM图像的残留酶。
原子力显微镜实验与成像
我们在美国马萨诸塞州布鲁克公司的Multimode 2原子力显微镜以及布鲁克公司的Scanassyst-Air-HR探针的帮助下，在干燥条件下获得了图像。我们将样品与不同摩尔比的DNA、CTP和ParB在Eppendorf管中，于缓冲溶液[40 mM Tris(pH 7.5)，70 mM 和 ]中孵育2 - 5分钟。然后，我们将溶液滴加到新鲜劈开的云母上 。之后，我们用 的超纯水彻底冲洗表面，并在氮气流下干燥，直到明显干燥。原子力显微镜采用峰值力敲击模式操作。在原子力显微镜实验中，我们使用WSxM软件(52)对所有原始数据进行图像处理和数据提取。
结果
为了观察ParB与超螺旋DNA分子的结合，我们采用了单分子DNA拉伸试验(53)，使用荧光标记的ParB 蛋白(44)。我们通过在DNA两端的多个生物素-链霉亲和素相互作用，将一个38 kb的DNA分子(其中parS位点靠近中间位置(DNA ))连接到玻璃表面(图2A；详细信息见“材料与方法”部分)。由于两端有多个生物素附着点，大部分这样的 分子受到扭转限制，不能绕其中心轴旋转以释放分子上的任何扭转应变。我们利用这一特性直接将所需手性的超螺旋，即正超螺旋或负超螺旋，引入到DNA分子中。我们通过改变用于DNA荧光可视化的嵌入染料SxO的浓度来实现这一点(46,47,54)(图2B)，并且SxO不会阻止ParB蛋白的结合、滑动或DNA凝聚(17,44)。当一个SxO荧光团嵌入到dsDNA螺旋中时，它会局部推开两个碱基对，因此，由于碱基对距离和角度的诱导变化(55,56)，会局部解开DNA，由于分子的连接数由于系链而固定，这会在分子的其余部分产生一个过度缠绕的扭曲。对于足够高的 浓度，这种过度缠绕会在DNA分子中产生正扭曲，即正卷曲的螺旋(图2B)。后者在线性拉伸的DNA分子上被观察为动态移动的局部高密度斑点(53)(补充视频S1)。在同一视野中监测了超螺旋和无扭转限制的DNA分子上超螺旋对ParB结合和凝聚的影响(47)(补充图S1)。
ParB蛋白在超螺旋DNA上有效结合并扩散
形成正超螺旋DNA后，我们添加了ParB Alexa647(图2C和D)来观察蛋白质的定位及其沿DNA的扩散行为，这与我们之前关于无扭转限制DNA的报告类似(44)。观察到ParB蛋白在parS位点加载到DNA上，并立即从结合位点开始一维扩散，在波形图中观察得最为清楚(补充图S2)。虽然之前在非卷曲DNA分子上显示了ParB扩散(14,24,44)，但我们在这里观察到ParB蛋白在超螺旋DNA分子上的有效加载和扩散。出乎意料的是，我们观察到ParB似乎没有强烈固定螺旋(图2E和F)。结合ParB后，螺旋的动力学继续不受干扰，并且没有观察到ParB与螺旋的明显共定位(图3A和B，以及补充图S2B-F)。这与许多其他DNA结合蛋白形成对比，这些蛋白被证明会在蛋白质的结合位点诱导螺旋的定位(37,57 - 63)，推测是因为结合诱导了DNA曲率的局部变化，从而降低了螺旋形成的能量。然而，我们观察到ParB的连续一维扩散。在正超螺旋DNA上扩散的ParB二聚体显示出比在非卷曲DNA分子上略高的扩散系数 (中位数 (标准误差)；n = 66，补充图S3A和B，以及表2)(D ，中位数 ，图3D - F，补充图S3C和D)。
我们观察到ParB分子在DNA上的停留时间呈非指数分布(图3C)，这与大多数DNA结合蛋白典型的指数解离速率形成对比(64,65)。这表明存在多个限速步骤。对于ParB，夹在ParB单体之间的两个CTP分子可能都需要水解，以便打开二聚体并使其从 上脱离。为了描述在DNA分子上的长时间扩散，我们应用了我们之前描述的模型(44)，该模型将CTP水解作为限速步骤，这延长了ParB在DNA上的扩散和扩散范围。从模型中，我们获得了ParB分子在超螺旋DNA上扩散的70秒停留时间(分布众数；图3C和表2)，与在非卷曲DNA上扩散的分子相比显著更低(91秒，P值<0.005；图3F和表2)。
图2. 用于研究超螺旋DNA上ParB蛋白的体外单分子荧光。(A) 单分子DNA拉伸试验的示意图，38 kb的DNA 拴在玻璃表面。(B) 添加或减少嵌入染料后同一分子，该染料诱导超螺旋和麻花状结构形成。(C, D) 与(A, B)图相同，但分别向带切口或超螺旋的DNA分子中添加了ParB。(E) 在不同时间拍摄的DNA分子图像，显示超螺旋DNA分子上麻花状结构的动态运动。(F) 图(E)中DNA分子上单个ParB 二聚体的可视化，显示在0.1nM浓度下沿DNA 的结合和一维扩散。
虽然上述所有数据都是关于正超螺旋DNA的，但我们观察到ParB蛋白在负超螺旋DNA上的行为非常相似。我们以之前描述的相同方式在 分子中引入负超螺旋，只是在DNA结合后我们降低而不是增加染料浓度(见“材料和方法”部分)。随后添加ParBAlexa647分子显示ParB与负超螺旋DNA分子有效结合(补充图S4A和B)，典型停留时间为66秒(分布众数；补充图S4C和表2)，扩散系数为 (中位数 ，补充图 和 )。结果表明，DNA超螺旋的存在并不妨碍单个ParB分子的加载和扩散。然而，它确实通过降低停留时间和略微增加扩散系数影响了扩散分子的动力学，尽管只有边际统计学意义水平 ，表明存在微弱但值得注意的趋势。
超螺旋促进ParB蛋白介导的DNA凝聚
在之前的体内和体外研究中，ParB蛋白被证明在parS位点周围形成ParB-DNA凝聚物(14,15,17,22,24,25)，目前的各种模型表明强烈依赖于ParB扩散和自身相互作用(14 - 18,20 - 25)。值得注意的是，由于超螺旋相关的接近性导致的远距离位点结合可能会严重改变ParB-DNA凝聚物的形成，如Connolley等人最近所提出的(41)。
因此，我们着手测试在较高浓度的ParB蛋白存在下，DNA超螺旋状态下的DNA凝聚情况。为作比较，我们将低浓度(3 nM；图4A - D)或高浓度的ParB(25 nM；图4E - H)添加到超螺旋DNA 分子上。在低ParB浓度下，添加ParB后，DNA上快速移动的麻花状超螺旋在位置上(图4A)以及超螺旋DNA上共存的麻花状超螺旋数量上(图4B和补充图S5A - E)基本保持不变。每个麻花状超螺旋内的DNA量也没有显著变化，并且在麻花状超螺旋上整合的DNA总量对于该设定的超螺旋量保持在相同值， (图4C和D)。此外，发现小的ParB簇与DNA上麻花状超螺旋的位置随时间并不严格相关，这证实了不存在显著的麻花状超螺旋固定(补充图S5F和G)。在低ParB浓度下DNA的动态行为与不存在该蛋白质时的对照在动力学和定位方面具有相似性(分别为补充图S5B和C，以及补充图S5H和I)。
图3. ParB有效结合并沿超螺旋DNA扩散。(A) 超螺旋DNA和ParB蛋白添加的示意图。(B) 显示单个ParB4lexa647二聚体(顶部)在0.1 mM浓度下的一维扩散以及DNA麻花状超螺旋(中间)的荧光强度随时间变化图。合并后的荧光强度随时间变化图下方的线条表示ParB信号与麻花状超螺旋不重叠的部分。(C) 扩散的ParB二聚体与parS位点结合后的停留时间。数据拟合到一个假设两个核苷酸的CTP水解后ParB从DNA延迟解离的模型[实线，见Tiśma等人(44)]。(D - F) 非卷曲DNA分子的与(A - C)图相同内容。
表2. DNA超螺旋存在下ParB停留时间量化
| 均值 | 均值的标准误差 | 中位数 | 众数 | 显著性 | |||||
| 非卷曲 | 141 s | 10 s | 129 s | 91 s | 59 | 分子量 | 柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验 | ||
| 正超螺旋 | 109 s | 8 s | 95 s | 70 s | 80 | 0.0028 | 0.0052 | ||
| 负超螺旋 | 106 s | 8 s | 100 s | 66 s | 58 | 0.0026 | 0.0072 | ||
与未卷曲样本相比的显著性检验:MW和KS。MW和KS是非参数统计检验，用于评估两个分布之间的差异。KS对分布形状和离散度的差异更敏感，而MW对中位数的变化更敏感。在此，两者均显示出高度显著性 。KS，柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫检验；MW，曼-惠特尼检验。
然而，在高浓度ParB下，行为却截然不同。发现所有DNA超螺旋扭结都汇聚并固定在一个点上，即ParB-DNA凝聚物的位置(图4E和F，以及补充图S6A-F)。未观察到凝聚点沿DNA的动态移动(图4G)，这与裸的非超螺旋DNA分子的数据形成对比，在裸的非超螺旋DNA分子中，凝聚物大小保持高度可变[如先前在(17)中所示]。对主要扭结簇内DNA量的定量分析表明，簇内DNA量随时间增加了 (从凝聚前扭结中的 增加到最终凝聚物的 ；图4H)。凝聚物外没有任何扭结表明ParB-DNA凝聚物将所有超螺旋缠绕吸收到一个我们称为“超螺旋凝聚物”的簇中。这个超螺旋凝聚物是一个静态物体，其扩散系数 极低(图 ，中间)。总体而言，DNA上大量ParB蛋白的存在极大地改变了超螺旋DNA的动态。
为了量化超螺旋对ParB-DNA凝聚的影响，我们在正负超螺旋DNA上筛选了一系列ParB浓度(0.5-25 nM)(图5)。我们观察到，DNA超螺旋的存在在任何浓度下都不会阻碍ParB蛋白在整个DNA分子上扩散(补充图S7)，这与最近的一项体内研究(66)一致。在非卷曲、负超螺旋和正超螺旋DNA分子上，由于扩散，ParB信号跨越了分子的整个长度(补充图S7)。
一个重要的观察结果是，DNA超螺旋的存在将DNA凝聚所需的最小ParB浓度从 降低到了 。正超螺旋(图5A)和负超螺旋(补充图S8A)均观察到了这一点。虽然在ParB浓度低于 时，无扭转约束的DNA分子不会形成凝聚物，但超螺旋DNA分子(无论超螺旋方向如何)显示，相当一部分分子(约25%)在 时就已经出现凝聚。局部DNA点的一维扩散常数(即分别在低和高ParB浓度下的扭结或超螺旋凝聚物)随着ParB浓度的增加而逐渐降低(图5B)。在使用的最高浓度 下，几乎所有扭结都固定在DNA分子的中间附近(parS位点周围)，扩散常数接近零(图5B)。发现扭结动态的这种强烈降低与超螺旋的方向无关，因为我们的负超螺旋数据(补充图S8B)显示出与正超螺旋(图5B)相同的现象。当凝聚的扭结固定在DNA上时，它们随时间逐渐增加其中的DNA含量(图4G和H)。在我们实验中的较高ParB浓度下，我们观察到超螺旋凝聚物内的平均DNA量有相当大的增加(约40%)(图5C和补充图S8C)，尽管这在不同实验中有所变化。
图4. 多个ParB蛋白将DNA超螺旋结构固定成单个静态簇。(A) 在3 nM ParB蛋白存在下，超螺旋结构大小与DNA位置的概率分布。黄色虚线表示parS序列的位置。(B) 在ParB存在下，超螺旋DNA上观察到的超螺旋结构数量。(C) 单分子实验中的动态图像，显示超螺旋DNA(顶部)和ParBAlexa647蛋白(底部)。(D) 动态图像(C图)中，超螺旋结构DNA量(顶部)、其扩散系数(中间)和ParB 强度信号(底部)随时间的量化。(E - H) 25 nM ParB浓度下与(A - D)图相同。(I - J) 多个ParB蛋白存在下超螺旋凝聚物的示意图。
图5. DNA超螺旋促进ParB蛋白介导的DNA凝聚。(A) 在非卷曲(灰色)和正超螺旋DNA(蓝色)上，随着ParB蛋白浓度增加，凝聚分子的比例。误差条表示二项式95%置信区间。[N: 0.5 nM:0(无凝聚)；3 nM: 12；7 nM: 34；15 nM: 21；25 nM: 6]。(B) 在(A)图所示超螺旋分子上，测量ParB蛋白存在下DNA超螺旋结构或超螺旋凝聚物的扩散常数(蓝色条)。蓝色:ParB进入流动通道之前。红色:ParB添加到流动通道并覆盖 分子后的 ( 值 0.5 nM: 无数据；3 nM: 0.54；7 nM: <0.01；15 nM: 0.19；25 nM: 0.011)。(C) 在所示浓度下添加ParB之前(蓝色)和之后(红色)， 分子上超螺旋结构或超螺旋凝聚物中的DNA总量。
ParB凝聚物的形成使线性延伸的超螺旋结构坍塌
虽然我们的数据清楚地表明ParB能使超螺旋DNA发生明显的凝聚，但上述实验并未解析出凝聚物的许多内部结构，即它是球状凝聚簇还是线性延伸物体(如超螺旋结构)。目前关于ParB蛋白介导DNA凝聚的模型提出了远距离片段的随机桥连相互作用(14,17)以及由DNA片段阶梯化形成的可能的DNA发夹结构(41)。
为了进一步解析内部结构，我们使用了DNA拉伸实验和原子力显微镜。在我们的单分子可视化实验中，如同图2那样，我们固定分子、诱导超螺旋并诱导ParB凝聚。然而，除此之外，我们现在施加了一个平面内的横向流，使分子在表面侧向移动，从而揭示DNA的内部拓扑结构(图6A)。在这种对扭转无约束的DNA实验中，横向流将分子在缓冲液流动方向上延伸成一个U形弧(图6B，左)。然而，在高浓度 下添加ParB后进行此类实验时，DNA分子在DNA中间附近显示出一个高强度的凝聚点(图6B，右)。这类似于先前多项研究报道的分区复合物的凝聚结构(14,15,17,24,25)。
在没有ParB的超螺旋DNA实验中，横向流动反而使一个长的螺旋结构沿流动方向排列(53)(图6C，左)，这可能是由于多个动态螺旋合并成一个单一的长螺旋。然而，在相同条件下( )将ParB加载到超螺旋DNA上后，发现延伸结构坍塌成DNA中间附近的一个非延伸高强度斑点(图6C，右)，这与之前的延伸螺旋结构明显不同。事实上，该簇的形状与非卷曲DNA分子上的簇相同。这些图像表明，对于超螺旋DNA上的ParB，螺旋完全凝聚成一个紧凑的ParB-DNA簇，该簇吸收了所有的超螺旋扭曲。
为了观察低于光学分辨率的DNA结构，我们在4.2 kb的环状DNA( )上使用了原子力显微镜，该DNA要么是超螺旋的，要么是有切口的。有切口的分子在原子力显微镜表面显示出典型的开放构象(补充图S9A)。在向这些非超螺旋DNA中添加ParB后，我们观察到DNA分子的大片区域甚至整个DNA分子都有高度压缩(补充图S9B)——这与之前的研究一致(14,17)。对于超螺旋DNA分子(没有ParB)，我们观察到具有多个交叉的延伸DNA分子，这是螺旋DNA的典型特征(补充图S9C)。在向超螺旋DNA分子中添加ParB后，质粒显示出完全凝聚的结构，由于ParB-DNA簇中的高度压缩和蛋白质覆盖，无法分辨任何螺旋区域(补充图S9D)。原子力显微镜数据证实了荧光测定实验中螺旋结构坍塌的观察结果。
图6. 在ParB存在下，DNA螺旋凝聚成一个紧凑的簇。(A)侧流实验的示意图。DNA平行于流动方向系住，然后施加横向平面内流动，将DNA以U形推动，仅其生物素化的DNA末端附着在表面。(B)在没有(左)和存在(右)25 nM ParB的情况下，有切口的DNA在侧流中的情况。(C)与(B)图相同，但针对正超螺旋DNA分子。(D)在有和没有DNA超螺旋的情况下，ParB-DNA凝聚时分子构象的示意图。
讨论
DNA超螺旋是许多基本过程的重要调节因子，如转录、复制以及DNA压缩和分离(32,67,68)。反之，这些过程，例如RNA聚合酶的转录，会在基因组DNA中诱导超螺旋(34,35,37)。因此，细菌DNA在细菌染色体和质粒DNA中都持续处于超螺旋状态(69,70)。DNA超螺旋和ParABS系统都通过分别形成螺旋(39)和通过ParB-ParB桥接形成凝聚的DNA结构(14,15,17,23,25,30)来促进远距离分子内相互作用。在这项工作中，我们解决了这两个过程如何相互影响的问题。
DNA超螺旋对ParB的影响
ParB作用机制的标志性行为包括:(i)加载到parS位点；(ii)夹紧和扩散；(iii)ParB-ParB桥接，从而实现DNA凝聚。我们观察到，DNA超螺旋的存在并不妨碍ParB在DNA分子上的结合、扩散或凝聚物形成(图2-4)，这与最近关于质粒DNA分子的体内数据一致(66)，但它确实在数量上影响了ParB机制中扩散和凝聚物形成的动力学。ParB分子能有效地结合到负超螺旋DNA、非卷曲DNA和正超螺旋DNA上，并且在所有这些情况下都能沿着这些DNA底物扩散。未观察到螺旋结构对局部结合的ParB的局部固定作用。这可能归因于ParB与DNA的非典型拓扑结合:虽然大多数DNA结合蛋白牢固地结合在紧密的DNA-蛋白质界面上，但ParB蛋白仅与其parS识别序列短暂相互作用(12,13)，随后它们从该序列释放并拓扑环绕DNA(6,11)。DNA的拓扑捕获可能使它们能够沿着DNA自由扩散，而与DNA的序列或扭曲无关。我们观察到，在存在DNA超螺旋的情况下，ParB的扩散速度有所加快，但停留时间缩短，有趣的是，不同超螺旋方向(正和负)之间没有显著差异。一维扩散增加可能是由于夹紧的ParB(即从parS释放后)对超螺旋DNA的亲和力改变，从而使其能够在含有扭曲的DNA上更快地滑动，尽管这种差异很小(补充图S4E)，这表明对该效应的解释应谨慎。或者，在某些物种(如枯草芽孢杆菌)中报道的C末端结构域与DNA主链之间的直接静电相互作用可能会减弱，从而允许更快的扩散。从结构角度来看，停留时间的减少并非微不足道，因为ParB的CTP结合口袋(N末端)与捕获扭曲DNA的内腔(C末端)相距较远。虽然CTP水解速率不受影响，但ParB更快的释放时间可能是由于水解后C末端对超螺旋DNA主链的亲和力降低。
虽然DNA超螺旋对单个ParB蛋白在DNA上的行为影响不大，但我们观察到它对多个ParB蛋白形成的DNA凝聚物有非常强烈的影响。在存在DNA超螺旋的情况下，在DNA上形成凝聚物所需的浓度大幅降低(>5倍)，这与之前使用磁镊的报告结果相反(25)。因此，超螺旋极大地促进了分配复合物的形成。这可能是由于在纽结DNA中，远距离DNA片段之间的分子内相互作用增加所致。在这里，无论超螺旋是否存在，ParB蛋白都会在DNA上加载并扩散(图1)。在CTP水解后，ParB蛋白打开并解离或形成ParB-ParB桥。在没有超螺旋的情况下ParB蛋白形成这样的桥完全依赖于聚合物的热涨落，因此DNA分子远距离片段相遇的概率很低(图6D)。然而，随着分子内相互作用的增加以及超螺旋DNA中DNA链的接近，ParB-ParB桥形成的概率更高(图6D)。在之前的建模研究中也有类似的观察结果，表明引入DNA超螺旋促进了分配复合物的形成(41,42)。然而，Alaoui等人最近的一项研究(66)表明，超螺旋对质粒中分配复合物的形成没有强烈影响。这是根据ChIP-seq和体内荧光数据得出的结论，由此很难推断ParB-DNA复合物的三维结构。我们的数据证实了他们的发现，即ParB仍然可以有效地在超螺旋DNA上扩散[类似于ChIP-seq数据(66)]，与超螺旋方向无关。值得注意的是，同一研究表明，在靠近parS位点处将质粒线性化，会使质粒丢失率增加>25倍。当在较大距离(13和 )处诱导质粒线性化时，ParB蛋白以及可能的超螺旋(71,72)在体内扩散无法到达此处，质粒丢失情况与未处理的对照相同。我们的数据通过实验支持了DNA超螺旋强烈促进三维分配复合物的形成这一观点，并且我们推测这在复制起点之后可能尤为重要，因为此时分配复合物外可用的ParB浓度非常低(23)。
ParB对超螺旋DNA的影响
虽然超螺旋强烈影响ParB蛋白在DNA上的凝聚，但ParB也极大地改变了超螺旋DNA的动力学。随着ParB蛋白引起的DNA凝聚过程的进行，快速移动的纽结的运动速度减慢，直到最终在DNA上出现一个单一的静态点(图4和图5)。我们将这种结构称为“超螺旋凝聚物”，因为它是一个吸收了所有扭曲(即所有纽结超螺旋)的ParB-DNA凝聚物。DNA纽结动力学的变化在正超螺旋和负超螺旋DNA中同样存在，这可能是因为这种效应是由促进ParB-ParB桥接的相互缠绕的纽结结构引起的。由于ParB的相互作用，超螺旋凝聚物失去了特征性的线性延伸纽结结构(图6)。值得注意的是，数据表明ParB分配复合物可以作为超螺旋的拓扑屏障，因为它将所有附近的超螺旋固定在凝聚结构中。
有趣的是，之前的研究表明，用利福平短暂处理细菌细胞会导致起始区域内任何高阶组织完全丧失(73 - 75)，这很令人惊讶，因为ParB蛋白在分配复合物中局部凝聚DNA的能力应该不受影响。这一观察结果与超螺旋是维持ParB-DNA分配复合物的关键促进因素这一假设一致，特别是考虑到细菌细胞中ParB蛋白数量较少(约250 - 700个)(23,30)。事实上，超螺旋似乎是细菌细胞中大多数大规模染色体压缩的基础(76)，而且正如我们在此所示，也是分配复合物形成的基础。
ParABS系统还促进了许多质粒在细菌细胞中的分离和复制(77,78)。由于使它们得以存活的基因持续高表达以及连续的复制周期(79)，质粒通常呈超螺旋状态，并且由于其小尺寸[~1 - 100 kb(80)]，超螺旋常常对整个分子而非局部片段产生显著影响。因此，在DNA超螺旋存在的情况下促进分区复合物形成的效应，对质粒生物学也具有重要意义，因为它们向子细胞的分离可能会受到其超螺旋密度的影响，而超螺旋密度由转录水平和细胞周期阶段决定。
总体而言，本研究为细菌细胞内的两个基本过程——DNA超螺旋和DNA分离机制——如何相互作用提供了有趣的机制性见解。
数据可用性
实验的所有原始数据可应通讯作者要求提供。
补充数据
补充数据可在NAR在线获取。
致谢
我们感谢Jaco van der Torre就分析、数据解释和DNA构建体进行的有益讨论。
作者贡献:由M.T.进行概念构思。由A.M.G.和M.T.进行荧光实验。由A.M.G.、B.T.K.、R.J.和A.B.进行形式分析。由H.A.进行蛋白质纯化。由A.M.G.进行原子力显微镜实验和分析。由M.T.进行DNA构建体和克隆。由A.M.G.和M.T.进行可视化。由S.G.和C.D.获得资金。由C.D.进行监督。由M.T.撰写(初稿)。所有作者进行撰写(审阅和编辑)。
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