搜索历史清除全部记录

最多显示8条历史搜索记录噢~

全部

全部
产品管理
新闻资讯
介绍内容
企业网点
常见问题
企业视频
企业图册

昵称 | 退出

首页

由NFIC/METTL3负反馈回路通过外泌体miR-194-5p引发的肿瘤-巨噬细胞串扰促进非小细胞肺癌进展

发布时间：

2026-08-14 21:16

由NFIC/METTL3负反馈回路通过外泌体miR-194-5p引发的肿瘤-巨噬细胞串扰促进非小细胞肺癌进展

舒芳郝明月韩梦蒋宇航李启文梁姣胡毅王乾润卓启源石克松 ©

湖北医药学院武当特色中药研究湖北省重点实验室生物医学研究所，中国十堰

湖北医药学院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室，中国十堰

湖北医药学院基础医学院，中国十堰

通信

石克松，湖北医药学院武当特色中药研究湖北省重点实验室生物医学研究所，中国十堰；湖北医药学院胚胎干细胞研究湖北省重点实验室，中国十堰442000

邮箱:sks.number1@hbmu.edu.cn

资助信息

湖北省自然科学基金，资助编号:2026AFB020；湖北医药学院教师发展基金，资助编号:2024QDJZR038

摘要

背景:肿瘤微环境中肿瘤细胞与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)之间的相互作用对于非小细胞肺癌(NSCLC)的进展至关重要。涉及RNA修饰和外泌体通信的潜在机制仍未完全了解。

方法:进行多重免疫荧光和流式细胞术以评估M2巨噬细胞极化。通过超速离心分离外泌体，并通过透射电子显微镜、纳米颗粒跟踪分析和外泌体标志物印迹进行验证。为了研究分子机制，使用甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)-qPCR和双荧光素酶报告基因测定来验证NFIC和miR-194-5p上的修饰位点；RNA免疫沉淀(RIP)证实了ZNF106与白细胞介素-6(IL-6)mRNA之间的相互作用；染色质免疫沉淀(ChIP)用于检测STAT3与METTL3启动子的结合。使用NSCLC原位异种移植小鼠模型评估所鉴定的反馈回路的体内功能。

结果:在NSCLC细胞中证实了METTL3和NFIC之间的负反馈回路。METTL3通过甲基化抑制miR-194-5p表达及其加载到外泌体中。NSCLC来源的外泌体miR-194-5p被巨噬细胞内化并直接靶向ZNF106，从而抑制M2极化。在巨噬细胞中，ZNF106稳定IL-6 mRNA并促进外泌体IL-6分泌，从而激活JAK2/STAT3途径并上调METTL3。这种IL-6驱动的METTL3上调形成了一个

这是一篇根据知识共享署名许可协议的开放获取文章，允许在任何媒介中使用、分发和复制，前提是原始作品得到适当引用。

结论:这些发现建立了一个由NFIC/METTL3负反馈回路启动的封闭调节回路。在这个回路中，METTL3介导的非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中外泌体miR-194-5p的修饰解除了巨噬细胞中ZNF106的表达抑制，导致白细胞介素-6(IL-6)产生，激活JAK2/STAT3通路并上调肿瘤细胞中的METTL3，从而使M2极化和恶性进展持续存在。该回路为NSCLC的治疗干预提供了潜在的节点。

关键词

外泌体，巨噬细胞极化，METTL3，miR-194-5p，非小细胞肺癌，ZNF106

要点

1. NSCLC细胞中的NFIC/METTL3负反馈回路通过m6A甲基化抑制外泌体miR-194-5p；miR-194-5p减少抑制巨噬细胞中的ZNF106，促进M2极化和IL-6分泌；巨噬细胞衍生的IL-6激活NSCLC细胞中的JAK2/STAT3以上调METTL3，形成正反馈回路。

1 | 引言

肺癌在全球癌症发病率中排名第二。非小细胞肺癌(NSCLC)约占这些病例的84%。尽管靶向治疗和免疫治疗取得了进展，但NSCLC的5年生存率仍约为，部分原因是肿瘤微环境中癌细胞与免疫细胞之间的相互作用了解不足。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在这种环境中起关键作用，影响肿瘤动态、抗肿瘤免疫和免疫治疗反应，使其成为关键的治疗靶点。其中，M2极化的巨噬细胞通过分泌免疫抑制因子、促进血管生成和重塑细胞外基质来促进NSCLC进展。反过来，NSCLC细胞分泌细胞因子、外泌体和信号分子，驱动巨噬细胞向M2表型发展，从而在肿瘤细胞和巨噬细胞之间建立自分泌-旁分泌正反馈回路。尽管M2极化的TAM在NSCLC中的促肿瘤作用已有充分记录，但通过肿瘤与M2巨噬细胞相互作用进行微环境重塑的精确机制仍需进一步研究。

METTL3是主要的甲基转移酶，主要通过介导非编码RNA 或mRNA的修饰在NSCLC中发挥致癌作用。此外，我们之前的研究表明，NFIC通过抑制METTL3转录来抑制NSCLC进展。然而，METTL3通过修饰调节NFIC的机制仍有待阐明，特别是这种调节如何参与肺癌细胞与TAM之间的相互作用并介导微环境重塑。

外泌体在细胞间通讯和癌症进展中起关键作用，尤其是在肺癌中。外泌体介导的信息交换建立了一个关键的基因调控网络，控制肿瘤微环境中肿瘤细胞与TAM之间的双向相互作用，深刻影响肿瘤生长、转移、免疫抑制和治疗耐药性。外泌体富含多种生物活性分子，包括蛋白质、miRNA、lncRNA和circRNA，它们发挥重要的生物学功能。例如，来自各种供体细胞的外泌体miRNA与肺癌发病机制和治疗有关。最近的研究表明，外泌体介导肿瘤细胞与TAM之间的通讯；然而，控制这一过程的详细分子机制仍不完全清楚。

微小RNA-194是一种关键的肿瘤调节因子，已通过调节关键信号通路在多种癌症中表现出肿瘤抑制作用。其表达水平与患者预后和治疗结果密切相关。微小RNA-194通过靶向细胞周期蛋白D1抑制胃癌。在非小细胞肺癌转移的背景下，外泌体长链非编码RNA-SOX2OT通过破骨细胞分化促进骨转移，从而使微小RNA-194-5p海绵化。然而，修饰调节的外泌体微小RNA-194介导肿瘤细胞与巨噬细胞之间通讯的机制在很大程度上仍未被探索。

本研究通过NFIC/METTL3反馈环探索修饰对非小细胞肺癌细胞外泌体微小RNA-194-5p的调控功能，旨在阐明诱导M2巨噬细胞极化并促进肿瘤进展的分子机制。我们发现了NFIC和METTL3之间的负反馈环。METTL3通过甲基化抑制微小RNA-194-5p的表达，并减少微小RNA-194-5p加载到外泌体中。非小细胞肺癌来源的外泌体微小RNA-194-5p被巨噬细胞内化，并直接靶向锌指蛋白106，从而抑制M2巨噬细胞极化。在巨噬细胞中，锌指蛋白106稳定白细胞介素-6信使核糖核酸并促进外泌体白细胞介素-6的分泌，从而激活非小细胞肺癌细胞中的JAK2/STAT3信号通路。JAK2/STAT3信号通路的激活上调METTL3的表达，形成正反馈环。因此，本研究阐明了非小细胞肺癌微环境中肿瘤-巨噬细胞的相互作用机制，并提出了针对这种相互作用的潜在治疗策略用于非小细胞肺癌的治疗。

2 | 材料与方法

2.1 | 来自GEO的外泌体微小RNA测序数据集分析

从基因表达综合数据库(GEO)下载外泌体微小RNA测序数据集GSE114711和GSE111803(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。GSE114711包含来自26名个体的血浆来源外泌体小RNA测序数据，包括7名健康吸烟者和19名非小细胞肺癌患者。GSE111803包含来自5名肺腺癌患者和5名健康对照的外周血外泌体小RNA测序数据。使用GEO2R管道分析原始测序数据，采用limma软件包进行差异表达分析，标准为和log2倍数变化。按照原始提交者提供的方法评估每个数据集的质量控制指标。

2.2 | 非小细胞肺癌组织样本

55例非小细胞肺癌组织和43例相邻非癌组织(HLugA098Bc01)来自Outdo Biotech。本涉及人类参与者的研究经Outdo Biotech伦理委员会批准(批准号YB M-05-02)。获得了所有参与者的书面知情同意，并且研究过程中进行的所有程序均符合赫尔辛基宣言的原则。相邻非癌组织定义为距肿瘤边缘的肺实质，经组织学确认无肿瘤细胞。详细的患者人口统计学和临床信息(包括组织类型、性别、吸烟史、病理类型和肿瘤位置)见表S1。

2.3 | 巨噬细胞极化和稳定细胞系构建

将THP-1细胞暴露于佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 (PMA，MCE) 以促进巨噬细胞成熟。通过分别在补充有脂多糖(LPS，100 ng/mL；Solarbio)或白细胞介素-4(IL-4，Proteintech)的培养基中培养，将THP-１来源的巨噬细胞极化为M1或M2表型。METTL3和NFIC敲低或过表达的程序如我们之前发表的研究中所述。由GenePharma构建了锌指蛋白106敲低(sh-ZNF106)或过表达(oe-ZNF106)的稳定细胞系及其各自的对照组。表S3列出了shRNA序列。

2.4 | CRISPR/Cas9介导的基因敲除

使用Benchling和金斯瑞在线工具设计靶向METTL3编码区的引导RNA(gRNA)，以创建METTL3基因敲除细胞系。所用寡核苷酸序列见表S2。按照标准方案将寡核苷酸组装到慢病毒CRISPR v2载体(Addgene，#52961)中。将构建好的质粒转染至汇合度为60%的A549和H460细胞中。细胞在后用嘌呤霉素处理，然后通过有限稀释法分离单细胞克隆。蛋白质免疫印迹法证实了METTL3基因被敲除。

2.5 | 多重免疫荧光和原位杂交

将针对METTL3、ZNF106、CD68、CD206和/或STAT3的一抗在下过夜孵育于已脱蜡、复水、在柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中进行抗原修复并用5%正常山羊血清封闭的组织切片上，用于多重免疫组化(mIHC)。在用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗孵育后，使用不同的荧光团(Opal试剂盒，Akoya Biosciences)进行酪胺信号放大。

对于原位杂交(ISH)，使用Gene-Pharma Co., Ltd. 生成的、在端带有Cy3荧光团且碱基经锁核酸(LNA)修饰的针对miR-194-5p的Cy3标记LNA探针检测miR-194-5p的表达和亚细胞定位。脱蜡和蛋白酶消化后，切片在下与探针杂交过夜。经过严格洗涤后，在荧光显微镜(Olympus FV3000RS)下直接观察信号。

为了联合检测miR-194-5p和METTL3蛋白，先进行原位杂交(ISH)，然后按照上述mIHC程序进行，ISH先完成。使用ImageJ对每切片的五个随机视野中的阳性细胞进行定量。

2.6 | 外泌体分离、追踪和共培养模型

在后，从指定细胞(1个孔)中在无囊泡培养基中分离外泌体。条件培养基先通过低速离心进行澄清，然后在下超速离心以获得外泌体沉淀。将沉淀重悬于PBS中，并在下于再次超速离心进行洗涤。最终的外泌体沉淀重悬于 PBS中，并在保存以备后续实验。对于透射电子显微镜(TEM)和纳米颗粒追踪分析(NTA)，将外泌体浓度调整至。使用负染法通过TEM检查分离的外泌体的形态。通过NanoSight NS30(Malvern)使用NTA 3.0评估外泌体大小和浓度。对于外泌体蛋白的蛋白质免疫印迹分析，每泳道的最终上样量为。

按照制造商的说明制备PKH67/PKH26标记的外泌体(Sigma-Aldrich)，然后在时添加到未标记的巨噬细胞、A549和H460中进行体外共培养。在共孵育后，使用共聚焦激光扫描显微镜(Olympus FV3000RS)观察细胞。对于体内小鼠实验，每只小鼠通过尾静脉注射接受外泌体(用PBS稀释，每只小鼠 )。

2.7 | 流式细胞术

通过用5%正常山羊血清封闭THP-1衍生的巨噬细胞15分钟来评估巨噬细胞极化，然后在用PE偶联的抗人CD206抗体(PE-FcA98031，Proteintech)孵育它们40分钟。使用同型匹配抗体作为阴性对照。用PBS洗涤并重悬于染色缓冲液后，在流式细胞仪(BD Biosciences)上分析细胞。

对巨噬细胞的所有流式细胞术分析采用以下门控策略。首先在FSC-A与SSC-A上设门以去除碎片并选择主要群体，然后通过FSC-H与FSC-A排除双联体。然后使用PE偶联的抗人CD68抗体将巨噬细胞鉴定为CD68阳性细胞。最后，在CD68 +门内，定量CD206 +细胞的百分比，使用同型对照设置阈值。本研究中所有流式细胞术实验均一致应用此门控策略。

2.8 | qRT-PCR和蛋白质印迹分析

使用TRIzol(Invitrogen)从细胞中分离总RNA，并使用PrimeScript RT试剂试剂盒(Takara)将其转化为cDNA。使用ABI 7500实时PCR系统(Applied Biosystems)进行qRT-PCR。引物序列见表S4。对于蛋白质印迹，细胞在补充有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液(Solarbio)中裂解。含有等量蛋白质的裂解物通过10% SDS-PAGE分离并印迹到 PVDF膜(Servicebio)上。膜在室温下用脱脂牛奶封闭，然后在与一抗孵育过夜，然后与二抗孵育。表S5列出了使用的一抗和二抗。

2.9 | MeRIP-qPCR和染色质免疫沉淀(ChIP)

使用商业试剂盒(P-9018，EPIGENTEK)按照制造商的方案进行MeRIP分析。简而言之，将总RNA随机片段化为100 - 200个核苷酸片段，然后使用特异性抗体对RNA进行免疫沉淀并进行qRT-PCR。

对于ChIP分析，使用SimpleChIP酶促染色质IP试剂盒(9003S，CST)。A549和H460细胞用1%甲醛交联10分钟以保留DNA-蛋白质相互作用。细胞裂解和超声处理后，使用指定抗体进行免疫沉淀。然后分离沉淀的染色质DNA并通过qRT-PCR测量。

2.10 | 酶联免疫吸附测定(ELISA)

将样品和系列稀释的标准品加载到包被有捕获抗体的96孔板上，在室温下保持。然后依次用生物素化检测抗体和链霉亲和素-HRP缀合物处理板(45分钟)。加入四甲基联苯胺底物溶液并在室温下孵育15分钟后，停止反应并立即在读取吸光度(Thermo Fisher)。

2.11 | 原位肺癌模型与免疫组织化学(IHC)

湖北医药学院动物伦理委员会批准了所有动物实验(批准号:03125110R)。使用2%异氟烷对4周龄雄性BALB/c裸鼠进行麻醉。将A549细胞(1 个细胞)与指定成分(PBS、经外泌体预处理的巨噬细胞、巨噬细胞)混合，并重悬于RPMI培养基和基质胶1:1混合物的中。每只小鼠接受将细胞悬液直接注射到左肺。4周后使用IVIS Lumina II体内成像系统监测肿瘤生长。安乐死后，收获左右肺，固定并石蜡包埋以进行进一步分析。

对于免疫组织化学，组织切片进行脱蜡、水化和抗原修复。然后在下用抗METTL3、p-JAK2、p-STAT3和Ki67的一抗过夜孵育。洗涤后，切片在室温下用生物素化二抗孵育。使用链霉亲和素-HRP偶联物和二氨基联苯胺底物检测信号。使用显微镜(尼康)采集图像。

2.12 | 统计分析

使用GraphPad Prism 8.0.2(GraphPad软件)进行统计分析。所有实验至少包括三个生物学重复，数据以平均值标准差表示。两组比较采用双尾学生检验，而多重比较使用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。

其他材料和方法的详细信息见支持信息。

3 | 结果

3.1 | METTL3/NFIC负反馈环调节M2巨噬细胞极化

为了探究METTL3在巨噬细胞极化中的作用，我们首先使用多重免疫荧光检查NSCLC组织中METTL3表达与M2巨噬细胞浸润之间的相关性。结果显示，与相邻非癌组织相比，NSCLC组织中METTL3表达水平和CD206/CD68阳性率均显著升高，表明M2巨噬细胞浸润增加(图1A - C)。相关性分析进一步揭示METTL3表达与M2巨噬细胞浸润之间呈正相关(图1D)。相反，对同一NSCLC组织中METTL3表达与M1标志物(CD86 +)浸润的分析显示无显著相关性(r = -.2309，p = .0759)(图S1A，B)。

使用过表达METTL3的A549和H460细胞的条件培养基(oe-METTL3-CM)刺激用佛波醇12 - 肉豆蔻酸酯13 - 乙酸酯(PMA)诱导24小时的M0型THP-1巨噬细胞。与对照组(oe-NC-CM)相比，用oe-METTL3-CM刺激显著增加了M0巨噬细胞中CD206的阳性率和M2巨噬细胞标志物(Arg1和CD206)的表达水平(图1E，F；图S1C)。相反，METTL3敲低的A549和H460细胞的条件培养基(sh-METTL3-CM)产生相反的效果，而M1巨噬细胞标志物(IL-1 和TNF- )的表达未检测到显著变化(图1E - G)。此外，用NFIC敲低细胞的条件培养基(sh-NFIC-CM)处理逆转了sh-METTL3-CM诱导的CD206阳性率和M2标志物表达的降低(图S1D - F)。

为了揭示METTL3如何调节NFIC，我们首先使用SRAMP在线工具预测NFIC中的潜在位点。分析揭示了NFIC mRNA的3’UTR(1865 bp)内的一个保守位点(图1H)。该位点通过MeRIP-qPCR和双荧光素酶报告基因测定得到验证(图1H，I)。同时，METTL3敲低显著增加了NFIC蛋白表达，而不影响其mRNA表达(图1J)。

为进一步确认METTL3功能的特异性，我们使用CRISPR/Cas9技术构建了METTL3基因敲除(KO)的A549和H460细胞。蛋白质免疫印迹法证实METTL3表达完全缺失(图S2A)。在METTL3基因敲除细胞中，NFIC蛋白表达显著增加(图S2A)。功能分析表明，METTL3基因敲除显著抑制A549和H460细胞的增殖、迁移和侵袭(图S2B - E)。此外，来自METTL3基因敲除的A549和H460细胞的条件培养基(KO - METTL3 - CM)显著抑制M0巨噬细胞中CD206的阳性率以及M2巨噬细胞标志物(Arg1和CD206)的表达水平(图S2F - H)。这些结果与shRNA介导的敲低数据一致，并证实观察到的表型特异性依赖于METTL3。

图1 METTL3/NFIC负反馈环促进非小细胞肺癌中的M2巨噬细胞极化。(A - C)非小细胞肺癌及癌旁正常组织中代表性的多重免疫荧光染色图像(A)以及METTL3表达的定量分析(B)和CD206/CD68阳性率的定量分析(C)。标尺，。(D)非小细胞肺癌组织中METTL3表达水平与CD206/CD68阳性率的相关性分析。(E和F)用METTL3过表达或敲低的A549和H460细胞的条件培养基刺激后，对CD206阳性的M0巨噬细胞进行流式细胞术分析(E)和定量分析(F)。(G)通过qRT - PCR检测M1(IL - 1β，TNF - )和(CD206，Arg1)巨噬细胞标志物的表达。(H)NFIC 3’UTR内预测的位点示意图以及MeRIP - qPCR分析，显示METTL3敲低对该位点m A富集的影响。(I)双荧光素酶报告基因检测，显示METTL3敲低对野生型或突变型NFIC 3’UTR报告基因荧光素酶活性的影响。(J)METTL3敲低后NFIC蛋白和mRNA表达的蛋白质免疫印迹和qRT - PCR分析。数据表示为平均值标准差。。

基于我们之前发现NFIC转录抑制METTL3表达，这些结果表明存在一个METTL3/NFIC负反馈环，其中NFIC抑制METTL3转录，而METTL3通过修饰抑制NFIC翻译，从而通过非小细胞肺癌细胞的分泌活性调节M2巨噬细胞极化。

3.2 | METTL3通过非小细胞肺癌来源的外泌体miR - 194 - 5p促进M2巨噬细胞极化

为研究METTL3是否通过调节非小细胞肺癌来源的外泌体miRNA诱导M2巨噬细胞极化，将A549和H460细胞的条件培养基与THP - 1巨噬细胞在有或没有外泌体抑制剂GW4869的情况下孵育。A549和H460细胞的条件培养基增加了CD206 巨噬细胞的比例(图2A，B)；然而，用GW4869处理可逆转M2标志物表达(CD206，Arg1)的上调，表明非小细胞肺癌细胞以外泌体依赖的方式诱导M2巨噬细胞极化。随后从非小细胞肺癌细胞的培养上清液中分离外泌体。分别通过透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析检查外泌体的形态和大小分布(图2C，D)。通过蛋白质免疫印迹检测外泌体标志物CD9、CD81和TSG - 101验证了成功分离(图2E)。此外，共孵育后，源自非小细胞肺癌(A549，H460)细胞的PKH67标记的外泌体被巨噬细胞摄取(图2F)。

对来自非小细胞肺癌(NSCLC)和正常肺组织的外泌体miRNA测序数据集(GSE114711和GSE111803)进行分析，结果显示，与源自正常肺组织的外泌体miRNA相比，GSE114711和GSE111803数据集中分别有7个和24个差异表达的miRNA(图2G)。其中，miR - 194、miR - 100和miR - 144在两个数据集中均有共同的差异表达(图2H)。使用SRAMP在线工具预测这三种共享miRNA中的潜在位点，结果显示只有miR - 194 - 5p(而非miR - 194 - 3p)含有一个位点(图3A)。METTL3敲低显著上调了A549和H460细胞中miR - 194 - 5p的表达(图3B、C)，而miR - 100 - 3p、miR - 100 - 5p、miR - 144 - 3p或miR - 144 - 5p的表达未观察到显著变化。同样，使用CRISPR/Cas9敲除METTL3也导致miR - 194 - 5p表达显著上调(图S3A)。此外，miR - 194 - 5p在NSCLC组织和细胞中均下调(图3D、E；图S3B)，并且它与METTL3共定位(图3D)，与METTL3表达呈显著负相关(图3F)。

功能实验表明，转染miR - 194 - 5p抑制剂显著促进了A549和H460细胞的增殖(图S3C、D)、迁移(图S3E、F)和侵袭(图S3G、H)，而转染miR - 194 - 5p模拟物则产生相反的效果(图S3C - H)。此外，METTL3过表达显著逆转了miR - 194 - 5p模拟物介导的抑制作用(图S4A - D)。MeRIP - qPCR显示，METTL3敲低降低了包含预测位点的miR - 194 - 5p片段内的富集(图3G)。双荧光素酶实验进一步证明，METTL3敲低降低了野生型miR - 194 - 5p报告基因的活性，而不影响突变型报告基因(图3H)。此外，当使用miR - 194 - 5p的位点突变体时，METTL3对细胞增殖、迁移和侵袭的逆转作用完全消除(图S4E、F)。这些发现表明，METTL3通过NSCLC细胞中的甲基化调节miR - 194 - 5p的表达，从而调节NSCLC的进展。

为了确定METTL3是否通过甲基化调节miR - 194 - 5p加载到外泌体中以影响巨噬细胞极化，将源自A549和H460细胞的外泌体与巨噬细胞一起孵育。这导致巨噬细胞中miR - 194 - 5p表达显著增加(图3I、J)。此外，用核糖核酸酶A联合Triton X - 100处理显著降低了NSCLC细胞培养基中miR - 194 - 5p的水平(图3K)。放线菌素D(ActD)，一种RNA转录抑制剂，并未改变与源自NSCLC的外泌体共同孵育的巨噬细胞中miR - 194 - 5p的水平(图3L)。此外，METTL3过表达降低了外泌体miR - 194 - 5p水平，而METTL3敲低或敲除则提高了NSCLC细胞中外泌体miR - 194 - 5p水平(图S4G)。这些结果表明，细胞外miR - 194 - 5p主要包装在膜结合的外泌体中(而非游离形式)，并通过这些囊泡从NSCLC细胞传递到巨噬细胞。

图2 非小细胞肺癌细胞以依赖外泌体的方式诱导M2巨噬细胞极化。(A和B) 对用来自A549和H460细胞的条件培养基刺激的CD206 M0巨噬细胞进行qRT-PCR (A) 和流式细胞术 (B) 分析，条件培养基有或没有GW4869处理。(C和D) 从A549和H460细胞培养上清液中分离的外泌体的代表性透射电子显微镜图像 (C) 和纳米颗粒跟踪分析 (D)。比例尺，50 nm。(E) 对外泌体中外泌体标记蛋白CD9、CD81和TSG-101进行蛋白质印迹分析。(F) THP-1巨噬细胞对源自A549和H460细胞的PKH67标记的外泌体的内化。比例尺，50 µm。(G) 火山图显示非小细胞肺癌和正常肺组织之间GSE114711和GSE111803数据集中差异表达的外泌体miRNA。对GEO衍生的外泌体miRNA-seq数据集GSE114711 (n = 26: 7名健康吸烟者，19名非小细胞肺癌患者) 和GSE111803 ( 肺腺癌患者，5名健康对照) 进行分析。(H) 维恩图显示两个数据集中差异表达的外泌体miRNA之间的重叠。数据表示为平均值标准差。。

将非小细胞肺癌(NSCLC)细胞用miR-194-5p抑制剂或模拟物转染，收集相应的外泌体(Exo-抑制剂-miR-194-5p或Exo-模拟物-miR-194-5p)并与巨噬细胞共同孵育。Exo-抑制剂-miR-194-5p处理导致巨噬细胞中miR-194-5p表达降低，而Exo-模拟物-miR-194-5p处理则导致显著增加(图4A、B)。此外，Exo-抑制剂-miR-194-5p处理显著上调M2标志物基因(CD206、Arg1)的表达以及CD206+巨噬细胞的比例，而Exo-模拟物-miR-194-5p处理则产生相反的效果，两组中M1标志物表达均未观察到显著变化(图4C - G)。此外，源自过表达METTL3的NSCLC细胞的外泌体逆转了M2标志物基因表达的上调和CD206+巨噬细胞比例的增加(图4H - J)。作为额外的对照，将从正常人肺上皮HBE细胞收集的外泌体与巨噬细胞共同孵育。如图S4H和S5A所示，源自HBE的外泌体并未显著改变巨噬细胞的百分比或M2标志物基因的表达，证实了源自NSCLC的外泌体的特异性。此外，我们验证了用miR-194-5p抑制剂或模拟物转染不会影响外泌体产量(图S5B)。此外，纳入了一个非外泌体对照组(超速离心后的最终上清液，无外泌体培养基)；如图S5C所示，无外泌体培养基并未提高巨噬细胞中miR-194-5p水平，证实了观察到的miR-194-5p转移确实依赖于外泌体。这些结果表明，METTL3通过NSCLC细胞中的甲基化抑制miR-194-5p表达，从而减少其加载到外泌体中并促进M2巨噬细胞极化。源自NSCLC的外泌体miR-194-5p进入巨噬细胞并调节M2极化的分子机制值得进一步研究。

图3 METTL3通过甲基化调节NSCLC细胞中miR - 194 - 5p的表达及其外泌体转运。(A) miR - 194 - 5p内预测的m 位点示意图。(B和C) METTL3敲低后A549和H460细胞中miR - 194 - 5p表达的qRT - PCR分析。(D)代表性的多重免疫荧光染色显示NSCLC组织中METTL3和miR - 194 - 5p的共定位。标尺，50 µm。(E) NSCLC组织和相邻正常组织中miR - 194 - 5p的表达。(F) NSCLC组织中METTL3和miR - 194 - 5p表达水平的相关性分析。(G) MeRIP - qPCR分析显示METTL3敲低对miR - 194 - 5p预测位点处m A富集的影响。(H)双荧光素酶报告基因检测显示METTL3敲低对野生型或突变型miR - 194 - 5p荧光素酶活性的影响。(I和J)在ISH (I)和qRT - PCR (J)中用于检测与A549和H460细胞来源的外泌体共孵育后THP - 1巨噬细胞中miR - 194 - 5p的表达。(K)用RNase A和/或Triton X - 100处理后A549和H460细胞培养基中miR - 194 - 5p水平的qRT - PCR分析。(L)在有或没有放线菌素D的情况下与NSCLC来源的外泌体共孵育的巨噬细胞中miR - 194 - 5p表达的qRT - PCR分析。数据表示为平均值标准差。。

图4 METTL3介导的miR - 194 - 5p的甲基化通过减少其外泌体负载来抑制M2巨噬细胞极化。(A和B)实验设计示意图及THP - 1巨噬细胞中miR - 194 - 5p的表达。(C - F)用Exo - inhibitor - miR - 194 - 5p (C - D)或Exo - mimic - miR - 194 - 5p (E - F)处理的巨噬细胞中M2 (CD206, Arg1)和M1 (IL - 1β, TNF - )标志物表达的qRT - PCR分析。(G和H) CD206 M0巨噬细胞的流式细胞术分析。(I) M1 (IL - 1β, TNF - α)和M2 (CD206, Arg1)标志物表达的qRT - PCR分析。(J) M2 (CD206, Arg1)标志物表达的蛋白质印迹分析。数据表示为平均值标准差。** *** ，与NC组相比；* ## #### ，与Exo - minic - miR194 - 5p组相比。

3.3 | NSCLC来源的外泌体miR - 194 - 5p通过靶向ZNF106抑制M2巨噬细胞极化

为了探究非小细胞肺癌(NSCLC)来源的外泌体miR-194-5p如何控制M2巨噬细胞极化，我们首先检测了其在巨噬细胞中的亚细胞定位。结果显示，miR-194-5p主要定位于细胞质中(图5A、B)，这表明它可能通过靶向mRNA发挥作用。此外，原位杂交(ISH)显示，与M0巨噬细胞相比，M2巨噬细胞中miR-194-5p的表达较低(图5B)。使用ENCORI数据库(整合了PITA、RNA22、miRmap、microT和miRanda算法)预测了miR-194-5p的潜在靶基因。ZNF106和VPS13B被鉴定为候选靶基因(图5C)。用来自miR-194-5p模拟物转染的NSCLC细胞的外泌体(Exo-mimic-miR-194-5p)处理的巨噬细胞显示ZNF106 mRNA和蛋白水平降低，而VPS13B mRNA保持不变(图5D、E；图S5D)。此外，与相邻正常组织相比，NSCLC组织中ZNF106上调，且与M2巨噬细胞浸润呈正相关(图S5E - G)。巨噬细胞中ZNF106的敲低显著降低了细胞的比例和M2巨噬细胞标志物的表达，而ZNF106的过表达则产生相反的效果(图S5H；图S6A - C)。值得注意的是，Exo-mimic-miR-194-5p逆转了ZNF106过表达诱导的M2巨噬细胞极化增强(图5F - H)。生物信息学分析揭示了ZNF106的非翻译区(UTR)内存在一个假定的miR-１９４-５ｐ结合位点(图5I)。双荧光素酶报告基因检测进一步证实，miR-194-5p直接与ZNF106的 UTR结合并抑制其荧光素酶活性，而对突变体构建体未观察到显著影响(图5J)。综上所述，这些结果表明，NSCLC来源的外泌体miR-194-5p通过靶向ZNF106抑制M2巨噬细胞极化。

3.4 | 巨噬细胞ZNF106通过外泌体IL-6促进NSCLC进展

在确定NSCLC来源的外泌体miR-194-5p通过靶向巨噬细胞中的ZNF106抑制M2极化后，我们接下来研究ZNF106诱导的M2巨噬细胞是否反过来可以相互调节NSCLC细胞的恶性进展。鉴于肿瘤细胞与巨噬细胞之间已确立的相互作用，从过表达ZNF106的巨噬细胞(Exo-oe-ZNF106)的条件培养基(CM)中分离出外泌体，然后与NSCLC细胞共同孵育。Exo-oe-ZNF106增强了A549和H460细胞的增殖、迁移和侵袭(图S6D - F)。为了阐明巨噬细胞ZNF106如何驱动NSCLC细胞进展，我们筛选了潜在的细胞因子介质。先前的研究表明，M2极化的巨噬细胞分泌多种细胞因子，包括IL-10、TGF-β、CCL1、VEGF和IL-6，以促进NSCLC进展。鉴于ZNF106的RNA结合特性，我们假设它可能调节外泌体内特定细胞因子的表达。ELISA检测了ZNF106过表达或敲低后巨噬细胞来源外泌体中的细胞因子水平。结果表明，ZNF106过表达特异性增加了外泌体中IL-6的分泌和mRNA表达，而ZNF106敲低则产生相反的效果(图6A - C)。值得注意的是，ZNF106不与IL-6启动子区域结合(图6D)，这表明存在转录后调控机制。

为阐明ZNF106调节IL-6表达的机制，使用RNA聚合酶抑制剂放线菌素D(ActD)阻断mRNA合成。ZNF106基因敲低显著缩短了IL-6 mRNA的半衰期，而ZNF106过表达则显著延长了其半衰期(图6E、F)。catRAPID数据库预测在IL-6 mRNA的76 - 127 bp区域内存在一个潜在的ZNF106结合位点(图6G)。RNA免疫沉淀(RIP)分析证实ZNF106与IL-6 mRNA之间存在直接相互作用(图6H)。双荧光素酶报告基因分析进一步表明，ZNF106直接与IL-6 mRNA结合并增强其稳定性，而对突变体构建体未观察到显著影响(图6I)。总之，这些发现表明ZNF106通过与其转录本结合来调节IL-6 mRNA的稳定性。

图5 非小细胞肺癌(NSCLC)来源的外泌体miR-194-5p通过靶向ZNF106抑制M2巨噬细胞极化。(A)通过核质分离分析miR-194-5p在巨噬细胞中的亚细胞定位。(B)原位杂交(ISH)显示miR-194-5p在M0和M2巨噬细胞中的亚细胞定位和表达。标尺，50 µm。(C)ENCORI数据库中五种算法(PITA、RNA22、miRmap、microT和miRanda)预测的miR-194-5p靶基因的重叠情况。(D和E)巨噬细胞中ZNF106和VPS13B mRNA表达的qRT-PCR分析。(F和G)CD206 +巨噬细胞的流式细胞术分析。(H)巨噬细胞中M1(IL-1 ，TNF-α)和M2标志物(CD206，Arg1)表达的qRT-PCR分析。(I)示意图显示预测的miR-194-5p在ZNF106 3’UTR内的结合位点。(J)双荧光素酶报告基因分析显示miR-194-5p模拟物对野生型(WT)或突变型(Mut)ZNF106 UTR报告基因荧光素酶活性的影响。数据表示为平均值标准差。，与阴性对照(NC)组相比；，与ZNF106过表达(oe-ZNF106)组相比。

图6 ZNF106增强巨噬细胞中IL-6 mRNA稳定性并促进外泌体IL-6分泌。(A - C)ZNF106过表达或敲低后巨噬细胞来源外泌体中所示细胞因子水平的酶联免疫吸附测定(ELISA)(A和B)和qRT-PCR(C)分析。(D)染色质免疫沉淀 - 定量PCR(ChIP-qPCR)分析显示ZNF106与IL-6启动子区域的结合。(E和F)在用ActD处理的巨噬细胞中ZNF106敲低(E)或过表达(F)后IL-6 mRNA的半衰期。(G)基于catRAPID数据库预测的ZNF106在IL-6 mRNA(76 - 127 bp)内的结合位点示意图。(H)RNA免疫沉淀(RIP)分析证实ZNF106与IL-6 mRNA之间存在直接相互作用。(I)双荧光素酶报告基因分析显示ZNF106对野生型(WT)或突变型(Mut) 报告基因构建体荧光素酶活性的影响。数据表示为平均值标准差。。

此外，将NSCLC细胞与巨噬细胞来源的Exo-oe-ZNF106共同孵育显著促进了A549和H460细胞的增殖(图7A - D)、迁移(图7E、F)和侵袭(图7E、F)，并且添加IL-6中和抗体可强烈减弱这些作用(图7A - F)。总之，巨噬细胞ZNF106增强IL-6 mRNA稳定性，促进外泌体IL-6分泌，从而推动NSCLC细胞的恶性进展。

图7巨噬细胞衍生的外泌体白细胞介素-6介导ZNF106诱导的非小细胞肺癌细胞进展促进作用。(A - D)CCK - 8(A)、集落形成(B)和EdU检测(C和D)显示，在存在或不存在白细胞介素-6中和抗体(抗IL - 6)的情况下，A549和H460细胞与巨噬细胞衍生的Exo - oe - ZNF106共孵育后的增殖情况。(E和F)通过Transwell检测评估A549和H460细胞的迁移和侵袭。比例尺，100 µm。数据表示为平均值标准差。** *** ，与NC组相比；“# ### ，与抗IL - 6组相比。

3.5|M2巨噬细胞衍生的白细胞介素-6通过激活JAK2/STAT3信号通路上调非小细胞肺癌细胞中METTL3的表达

先前的研究表明，M2巨噬细胞可以通过外泌体白细胞介素-6/STAT3信号通路上调肝癌细胞中METTL3的表达。因此，我们进一步研究了非小细胞肺癌中是否存在类似的调节机制。值得注意的是，将A549和H460细胞与暴露于非小细胞肺癌细胞衍生外泌体(Exo - CM)的巨噬细胞的外泌体共培养，导致白细胞介素-6和METTL3表达升高。用miR - 194 - 5p模拟物(Exo - mimic - CM)处理暴露于非小细胞肺癌细胞衍生外泌体的巨噬细胞的外泌体，可显著降低共培养的非小细胞肺癌细胞中白细胞介素-6的表达，ZNF106过表达可逆转这种作用(图S8A、B)。向共培养系统中引入白细胞介素-6中和抗体可显著抑制Exo - CM诱导的A549和H460细胞中METTL3的增加(图S8B)。

鉴于JAK2/STAT3是白细胞介素-6信号的关键下游效应通路，我们接下来探讨白细胞介素-6是否通过激活JAK2/STAT3轴促进METTL3表达。结果表明，与Exo - CM共培养显著增加了非小细胞肺癌细胞中JAK2和STAT3的磷酸化水平，而添加白细胞介素-6抗体则显著抑制了这种作用(图S6G)。此外，STAT3抑制剂Stattic逆转了Exo - CM诱导的A549和H460细胞中METTL3表达的增加(图S8C、D)。在非小细胞肺癌组织中，METTL3和STAT3表达水平呈正相关(图S8E和S7H)。JASPAR数据库分析预测了METTL3启动子区域潜在的STAT3结合位点(图S8F)。染色质免疫沉淀实验证实，STAT3抗体显著富集了结合位点(位于启动子上游-49至-59 bp处)(图S6I)。双荧光素酶报告基因实验结果表明，Exo - CM显著增强了野生型启动子的荧光素酶活性，但对突变型启动子没有显著影响。此外，添加外源性白细胞介素-6抗体减弱了Exo - CM诱导的荧光素酶活性增加(图S8G)。染色质免疫沉淀实验进一步证实，Exo - CM处理增强了STAT3在METTL3启动子区域的富集，而白细胞介素-6抗体处理抑制了这种富集(图S8H)。总之，这些结果表明，M2巨噬细胞衍生的白细胞介素-6通过激活JAK2/STAT3上调非小细胞肺癌细胞中METTL3的表达，形成正反馈环。

3.6|机制的体内验证和示意图模型

我们建立了一个原位异种移植小鼠模型，以进一步评估非小细胞肺癌(NSCLC)外泌体诱导的M2巨噬细胞对NSCLC细胞增殖和转移的影响。将A549细胞与以下成分混合，并原位植入左肺:PBS(仅A549组)；用NSCLC细胞衍生的外泌体预处理的M0巨噬细胞(Exo-M0)；用miR-194-5p模拟物转染的NSCLC细胞衍生的外泌体预处理的M0巨噬细胞(Exo-mimic-M0)；用阴性对照siRNA处理的M2巨噬细胞(M2/sh-NC)；以及用IL-6 siRNA处理的M2巨噬细胞(M2/sh-IL-6)(图9A；图S7A)。结果显示，相对于仅A549组，与Exo-M0或M2/sh-NC共同植入的组在对侧肺(右肺)和胸壁中表现出更大的肿瘤体积、更大的肿瘤重量以及更明显的转移信号(图9B-F；图S7B-F)。相反，Exo-mimic-M0和M2/sh-IL-6组的肿瘤体积和重量显著减小(图9B-F；图S7B-F)。免疫组织化学(IHC)染色进一步证实，注射了与Exo-M0或M2/sh-NC混合的A549细胞的小鼠的肿瘤组织中，METTL3、p-JAK2、p-STAT3和Ki67的表达水平显著升高，而Exo-mimic-M0和M2/sh-IL-6组这些蛋白的水平显著恢复到与仅A549组相当的值(图9G，H；图S7G-H)。此外，对p-STAT3和肿瘤细胞标志物Pan-CK进行多重免疫荧光染色显示，相对于仅A549组，A549 + M2/sh-NC组在总Pan- 肿瘤细胞中p-STAT3 Pan- 双阳性细胞的百分比显著更高。在A549 + M2/sh-IL-6组中，这种增加显著逆转(图S7I，J)，表明增强的p-STAT3信号主要源自肿瘤细胞。

本研究阐明了NSCLC微环境中M2巨噬细胞与肿瘤细胞之间的串扰机制。在NSCLC细胞中，NFIC转录抑制METTL3表达，而METTL3通过甲基化抑制NFIC翻译，形成NFIC/METTL3负反馈环。随后，NSCLC细胞中的METTL3通过修饰抑制外泌体miR-194-5p表达，导致分泌的外泌体中miR-194-5p水平降低。外泌体miR-194-5p的下调减轻了其对巨噬细胞中RNA结合蛋白ZNF106的抑制，从而上调ZNF106表达并促进M2巨噬细胞活化。这些活化的M2巨噬细胞分泌IL-6，其作用于相邻的NSCLC细胞以促进其恶性进展。此外，IL-6触发JAK2/STAT3信号传导，导致NSCLC细胞中METTL3上调，从而形成正反馈环(图10)。

图8 M2巨噬细胞衍生的IL-6通过激活JAK2/STAT3信号通路上调NSCLC细胞中METTL3的表达。(A) IL-6表达的ELISA分析。(B) 与外泌体条件培养基共培养的NSCLC细胞中METTL3表达的qRT-PCR分析。(C-D) 用有或无STAT3抑制剂Static的外泌体条件培养基处理的A549和H460细胞中METTL3表达的qRT-PCR (C)和蛋白质印迹(D)分析。(E) NSCLC组织中METTL3与STAT3表达的相关性分析。(F) 根据JASPAR数据库显示METTL3启动子区域内预测的STAT3结合位点的示意图。(G) 双荧光素酶报告基因测定显示外泌体条件培养基对野生型或突变型METTL3启动子构建体荧光素酶活性的影响。(H) 用外泌体条件培养基处理的A549和H460细胞中METTL3启动子区域STAT3富集的ChIP-qPCR分析。数据表示为平均值标准差。。

图9 NSCLC外泌体诱导的M2巨噬细胞促进体内肿瘤生长和转移。(A-D) 每组小鼠的代表性生物发光图像(A)、肿瘤重量(B)、肿瘤体积(C)和光子通量定量(D)。(E和F) 对侧肺(右肺，E)和胸壁(F)中的转移信号。(G和H) 肿瘤组织中METTL3、p-JAK2、p-STAT3和Ki67表达的代表性免疫组织化学染色(G)和定量(H)。标尺，50 µm。数据表示为平均值标准差。。

图10 NSCLC中提出的肿瘤-巨噬细胞串扰机制的示意图模型。NSCLC细胞中的NFIC/METTL3负反馈环通过甲基化抑制外泌体miR-194-5p；减少的miR-194-5p抑制巨噬细胞中的ZNF106，促进M2极化和IL-6分泌；巨噬细胞衍生的IL-6激活NSCLC细胞中的JAK2/STAT3以上调METTL3，形成正反馈环。

4 | 讨论

在本研究中，我们在NSCLC中鉴定了一个由METTL3/miR-194-5p/ZNF106/IL-6轴介导的肿瘤-巨噬细胞串扰网络。在这个机制中，修饰重新编程肿瘤衍生的外泌体miRNA，导致M2巨噬细胞极化并形成驱动恶性进展的正反馈环。我们的发现为NSCLC微环境内的肿瘤-免疫细胞相互作用提供了新的分子见解。

最初，研究发现METTL3的表达与非小细胞肺癌(NSCLC)组织中M2巨噬细胞浸润呈正相关。我们之前的研究表明，NFIC通过抑制METTL3转录来抑制NSCLC进展。此外，一项研究报道，在根尖周炎中，METTL3通过修饰调节NFIC表达。基于这些发现，我们推测METTL3可能在NSCLC中通过修饰类似地调节NFIC表达。实验结果证实，METTL3通过甲基化抑制NFIC翻译，而NFIC转录抑制METTL3表达，形成一个负反馈环，调节NSCLC进展并促进M2巨噬细胞极化。本研究进一步揭示了这种负反馈环在肿瘤免疫微环境重塑中的新功能。

外泌体通过选择性包装充当促肿瘤信使的miRNA，在细胞间通讯中起关键作用，并重塑肿瘤微环境。在本研究中，通过分析来自NSCLC和正常肺组织的外泌体miRNA测序数据，我们鉴定出miR-194-5p为差异表达的miRNA。进一步的实验表明，NSCLC细胞通过外泌体将miR-194-5p递送至巨噬细胞，抑制M2极化。作为一种肿瘤抑制因子，miR-194-5p调节多种癌症中的关键信号通路，其表达与胃癌患者的预后相关。目前的证据强调lncRNA介导的调节，肿瘤来源的外泌体lncRNA-SOX2OT充当miR-194-5p海绵以驱动骨转移。然而，miR-194-5p在肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中的调节机制及其修饰尚未见报道。在本研究中，我们在miR-194-5p内鉴定出一个修饰位点，并证明METTL3通过甲基化抑制其在NSCLC细胞中的表达和外泌体装载，从而促进M2巨噬细胞极化。

进一步的机制研究表明，源自NSCLC的外泌体miR-194-5p进入巨噬细胞后，直接靶向ZNF106的3’UTR并抑制其表达。ZNF106是一种先前与前体mRNA加工相关的RNA结合蛋白，并被鉴定为急性胰腺炎多器官功能衰竭的遗传危险因素，但其在癌症中的功能尚不清楚。我们的研究结果表明，ZNF106通过与IL-6 mRNA的 UTR结合，增强其稳定性，促进IL-6分泌和外泌体装载，在促进M2巨噬细胞极化中起关键作用。IL-6是一种经典的促炎细胞因子，据报道参与各种肿瘤的恶性进展。我们进一步发现，M2巨噬细胞衍生的IL-6通过激活JAK2/STAT3信号通路上调NSCLC细胞中METTL3的表达。在肝细胞癌中也报道了类似的机制。我们的研究通过揭示肿瘤-巨噬细胞相互作用中的新调控层次扩展了这一发现:巨噬细胞衍生的外泌体IL-6作用于NSCLC细胞以激活JAK2/STAT3途径，导致METTL3上调并形成正反馈调节环。在体内，使用原位异种移植模型，我们验证了该环在NSCLC进展中的作用。用miR-194-5p模拟物或IL-6敲低处理的巨噬细胞减少了肿瘤生长和转移，同时METTL3、p-JAK2、p-STAT3和Ki67水平降低。这验证了体外机制，并指出该环是NSCLC中潜在的治疗靶点。

我们的研究结果提示了几个潜在的治疗靶点。首先，使用小分子抑制剂(STM2457)对METTL3进行药理学抑制可能会破坏正反馈回路。STM2457已通过降低白血病致癌mRNA上的水平显示出抗白血病活性，并在口腔鳞状细胞癌以及非小细胞肺癌中显示出疗效。其次，可以开发外泌体递送miR-194-5p模拟物来抑制ZNF106介导的M2巨噬细胞极化。作为天然的miRNA载体，外泌体——特别是装载有miRNA模拟物的工程化外泌体——在临床前模型中已显示出明显的抗肿瘤作用。此外，我们的研究证实miR-194-5p参与了NSCLC中的巨噬细胞极化和免疫调节，为使用工程化外泌体递送miR-194-5p模拟物用于NSCLC治疗提供了理论依据。第三，ZNF106作为一种RNA结合蛋白，可能适合通过PROTAC技术进行靶向降解。PROTAC已被用于在去势抵抗性前列腺癌中降解BET蛋白，最近基于RNA的PROTAC已成功使用基于适体的平台靶向RNA结合蛋白FMRP 以及核仁素和SOX2。基于ZNF106已知的RNA结合基序，可以合理设计基于寡核苷酸的PROTAC。此外，将METTL3抑制与外泌体miR-194-5p模拟物递送相结合可能会协同破坏正反馈回路并使肿瘤微环境重新极化，与单独使用任何一种策略相比，可能实现更优的抗肿瘤疗效。未来的研究有必要在临床前模型中评估这些策略。

应该认识到几个局限性。商业购买的组织芯片缺乏长期随访数据和全面的临床病理参数(TNM分期、淋巴结状态)，这排除了生存分析和基于分期的可靠相关性分析。因此，关于预后价值的转化结论仍然是初步的。需要未来具有完整临床注释的前瞻性队列来确认METTL3/miR-194-5p/ZNF106轴的临床重要性。

5 | 结论

本研究揭示了NSCLC中NFIC和METTL3之间的负反馈回路。该回路通过修饰调节外泌体miR-194-5p，从而诱导M2巨噬细胞极化。极化的M2巨噬细胞通过ZNF106/IL-6/JAK2/STAT3轴进一步上调NSCLC细胞中METTL3的表达，建立促进肿瘤进展的正反馈回路。这些结果推进了我们对免疫微环境重塑的理解，并为靶向该回路进行治疗奠定了基础。

作者贡献

石克松、方舒、郝明月和孟晗构思并设计了本研究。石克松、方舒、郝明月和孟晗进行了所有实验。石克松、方舒、郝明月、孟晗、蒋宇航、李启文、梁娇、何晓露、胡毅、周琳琳、王乾润、卓启元、吴季分析了数据。石克松、方舒、郝明月和孟晗撰写了论文。周琳琳、王乾润、卓启元和吴季编辑并修订了论文。所有作者阅读并批准了最终稿件。

致谢

我们感谢湖北医药学院生物医学研究所提供本研究中使用的仪器设备。本研究得到湖北省自然科学基金(青年B项目，编号2026AFB020，石克松)和湖北医药学院教师发展基金(编号2024QDJZR038至石克松)的支持。本研究得到湖北省自然科学基金(青年B项目，资助编号:2026AFB020至石克松)和湖北医药学院教师发展基金(资助编号:2024QDJZR038至石克松)的支持。