CYP3A通过ROS介导的m6A对ATG12的调控触发BDE47诱导的生精细胞铁蛋白自噬和铁死亡
发布时间：
2026-08-13 20:58
CYP3A通过ROS介导的m6A对ATG12的调控触发BDE47诱导的生精细胞铁蛋白自噬和铁死亡
舒宇 ，闻霞 ，钱江雪 ，岳文 ，春锦 ，陈超 ，王莉 ，涌泉 ，王超 ，王寿林
南京医科大学毒理学研究所生殖医学与子代健康国家重点实验室，江苏南京211116；
南京医科大学公共卫生学院全球健康中心现代毒理学教育部重点实验室，江苏南京211116。
摘要
细胞色素P450 CYP3A(CYP3A)是肝脏中最丰富的细胞色素P450亚家族之一，也介导外源性物质的代谢和毒性。先前的研究报道CYP3A在睾丸中也有表达；然而，其在介导雄性生殖损伤中的作用和分子机制仍不清楚。在本研究中，通过体外和体内实验，我们证明了CYP3A在2,2’,4,4’-四溴二苯醚(BDE47)诱导的生殖毒性中的作用。结果表明，BDE47诱导小鼠睾丸中CYP3A表达，通过过量的活性氧(ROS)和亚铁离子(Fe2+)过载导致氧化应激和铁死亡，这在GC-2细胞中通过CYP3A过表达或敲低实验得到证实。机制上，除了代谢过程中直接产生ROS外，铁蛋白自噬导致细胞内 积累。具体而言，BDE47诱导的ROS与Atg12 mRNA的N6-甲基腺苷 修饰减少和自噬相关(ATG12)表达增加有关，从而促进铁蛋白重链1(FTH1)降解和随后的Fe 过载。这些结果在GC-2细胞中使用过氧化氢或抗氧化剂的实验以及小鼠Atg12单倍体不足的实验中得到进一步验证。我们的研究结果表明，CYP3A在BDE47诱导的雄性生殖毒性中起关键作用。
关键词:细胞色素P450 3A，2,2’,4,4’-四溴二苯醚，活性氧，铁蛋白自噬，N6-甲基腺苷，雄性生殖损伤
引言
流行病学数据表明，全球 的夫妇患有不孕症，其中男性因素占病例的30%-50%[1]。尽管先天性异常、内分泌失调和衰老会导致这种情况，但越来越多的证据表明环境毒物是一个主要的可改变风险因素[2]。多溴二苯醚(PBDEs)作为典型的环境内分泌干扰物(EDCs)，已经被限制使用并逐步淘汰数年，但大量含PBDEs的商业产品仍在使用，并且每年都被丢弃。迄今为止，在环境和各种人类生物样本中，包括血液和母乳 中，仍可检测到高浓度的PBDEs。其中，2,2’,4,4’-四溴二苯醚(BDE47)是一种主要的PBDE同系物，很容易在生物体内富集，可在各种生物样本中检测到。研究表明，BDE47在人类头发中的平均含量达到 干重，在指甲中为 干重，在血清中为 脂质重量[5]。尽管BDE47已被禁止，但它仍在环境和人体中积累，并产生毒性作用。研究表明，它对男性生殖有有害影响，包括精子发生紊乱、精子活力降低和睾丸萎缩[6]。BDE47对生精细胞有毒性作用，特别是对睾丸中的一种生殖细胞——精母细胞[7]。先前的研究表明，BDE47通过涉及细胞色素P450 3A(CYP3A)介导的代谢激活和氧化应激的机制诱导精母细胞凋亡；然而，其潜在的分子机制仍不清楚 。
这些作者对本工作贡献相同。
通讯作者:王寿林，电子邮箱:wangshl@njmu.edu.cn，ORCID:0000-0003-3070-7560；王超，电子邮箱:wangchao@njmu.edu.cn，ORCID:0000-0001-8452-1214。
收到日期:2026年3月18日；修订日期:2026年5月12日；接受日期:2026年5月14日；在线发布日期:2026年5月21日；出版日期:2026年7月28日
中国图书馆分类法编号:R114；R698.2，文献代码:A
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作者声明无利益冲突。
细胞色素P450(CYP450)超家族是一组重要的I相代谢酶，在异源生物氧化中占主导地位，催化超过90%的药物生物转化 。在这个超家族中，CYP3A亚家族因其双重突出地位而成为药理学和毒理学上最重要的亚型:它占肝脏CYP450酶总量的30%-40%，并且对多种结构各异的亲脂性化合物表现出显著的底物选择性，包括30%的临床药物和各种环境毒物[11-12]。这种代谢多样性源于CYP3A独特灵活的活性位点结构，它通过构象可塑性容纳庞大的底物[12]。因此，CYP3A是参与许多异源生物代谢的主要酶。先前的研究表明，CYP3A不仅在肝脏中高度表达，在睾丸等肝外器官中也有表达；然而，其肝外表达受到的关注较少[8]。肝外CYP介导的代谢活化可能通过双重机制放大组织特异性毒性:(1)亲电代谢物生成，以及(2)活性氧(ROS)过度生成，使细胞抗氧化防御不堪重负[13-14]。CYP3A同时产生活性氧和调节铁氧化还原循环(通过 中间体)的能力使其成为磷脂过氧化的潜在主要调节因子，磷脂过氧化是铁死亡的生化标志之一[15-17]。
铁死亡是一种由铁依赖性磷脂过氧化驱动的独特形式的程序性细胞死亡，它受到包括氧化还原稳态、铁代谢、线粒体生物能学和营养物质加工在内的相互关联的代谢途径的复杂调控[18]。先前的研究表明，NADPH-细胞色素P450还原酶(POR)和NADH-细胞色素b5还原酶(CYB5R1)产生活性氧有助于铁死亡过程中的磷脂过氧化[19]。还原酶与CYPs，尤其是CYP3A之间的相互作用密不可分。然而，虽然目前的研究已经描述了氧化还原酶在铁死亡中的作用，但CYPs，特别是CYP3A的参与仍了解较少。因此，我们提出CYP3A介导的代谢产生的副产物作为铁死亡的上游触发因素，使生殖细胞中的铁稳态失调与脂质过氧化物积累协同作用。
已知铁死亡通过多层控制进行调节，包括表观遗传、转录、转录后和翻译后机制，如N6-甲基腺苷 修饰 。铁死亡中涉及的一个关键自噬过程是铁蛋白自噬——一种选择性自噬过程，通过核受体辅激活因子4(NCOA4)介导的铁蛋白重链1(FTH1) 识别来降解铁储存铁蛋白复合物。这个过程导致细胞内不稳定铁增加，从而促进脂质过氧化物的积累，这是铁死亡执行过程中的一个核心事件[22]。作为一种重要的表观遗传修饰， 修饰在调节铁蛋白自噬方面具有潜在作用[23]。活性氧、 修饰和铁蛋白自噬在外源化学物质的毒性作用中密切相关。
基于上述背景，本研究旨在探讨CYP3A介导的氧化代谢在铁死亡中的作用及其对异源生物诱导的生殖损伤的贡献。具体而言，我们使用体外和体内模型，采用以铁蛋白自噬为中心的方法，研究CYP3A介导的氧化代谢如何破坏铁和氧化还原稳态，从而促进生殖细胞中的铁死亡。本研究旨在深入了解CYP3A介导的代谢、氧化应激和铁死亡之间的机制联系，最终推进对异源生物诱导的男性不育的理解。
材料与方法
试剂
BDE47购自麦克林公司(产品编号:O885862，中国上海)。过氧化氢 购自西格玛公司(产品编号:H1009，美国密苏里州圣路易斯)。N-乙酰半胱氨酸(NAC)购自美迪西(产品编号:HY-B0215，中国上海)。去铁酮(DFP)购自美迪西(产品编号:HY-B0568)。抗体信息见补充表1。
实验动物
所有动物实验程序均经南京医科大学实验动物管理与使用委员会批准，并按照美国国立卫生研究院《实验动物饲养与使用指南》进行(许可证号:SYXK(苏)2020-0006；伦理编号:2003001)。野生型C57BL/6雄性小鼠(22 - 25克)购自南京医科大学。基于C57BL/6背景的Atg12 小鼠由上海邦耀生物采用CRISPR-Cas9技术构建。将Cas9 mRNA和sgRNAs显微注射到受精卵中以诱导靶向基因编辑。小鼠饲养在特定病原体-free设施中，处于受控条件下(温度: ；湿度: ；12小时光照/黑暗周期)，可自由获取无菌食物和水。
根据现有文献，人血清中BDE47的平均含量约为20 ng/g脂质，范围为4.3至 脂质 。基于先前报道的人体暴露水平、已发表的实验研究以及我们之前对BDE47的药代动力学/毒理学研究[8,24]，选择1.5 mg/kg的剂量来模拟相对较高的BDE47暴露水平。小鼠接受如下口服灌胃:BDE47组通过每日口服灌胃(每周6天)给予1.5 mg/kg BDE47(溶解于DMSO并用无菌盐水稀释)，持续8周。对照组接受等量含等量DMSO的无菌盐水。所有实验每组使用五只小鼠，随机分配至对照组或实验组。
细胞培养与处理
GC-2精母细胞(美国典型培养物保藏中心，产品编号:CRL-2196，美国弗吉尼亚州马纳萨斯)培养于杜氏改良 Eagle培养基(DMEM；产品编号:BC-M-005，南京生物通道)，补充10%(v/v)热灭活胎牛血清(FBS；产品编号:BC-SE-FBS01，南京生物通道)、100 U/mL青霉素和 链霉素(产品编号:C0222，上海碧云天)。细胞在 、湿度为 的环境中培养，当汇合度达到80% - 90%时传代。根据细胞活力结果，GC-2细胞用0、15和 BDE47处理 。在拯救实验中，GC-2细胞单独用BDE47(30 μmol/L)或与NAC(5 mmol/L)或DFP(1 μmol/L)联合处理 。在过氧化氢 实验中，GC-2细胞用0、25和 处理 。
细胞转染
靶向Alkbh5(siAlkbh5)和Cyp3a11(siCyp3a11)的小干扰RNA(siRNA)以及阴性对照(NC)siRNA(siNC)由汉恒生物科技(中国上海汉恒)设计并合成。siRNA双链序列(正义链/反义链)如下(5’-3’):siNC，UUCUCCGAACGUGUCACGUTT/ACGUGACACGUUCGGAGAATT；siCyp3a11，GGUUCAGCAAGGAGAACAATT/UUGUUCUCCUUGCUGAACCTT；siAlkbh5，GGAAAUGGACAAAGAAGAATT/UUCUUU CUUUGUCCAUUUCCTT。简要地说，将GC-2细胞接种到6孔板中，培养至60%汇合度。在转染前，将细胞在不含胎牛血清或抗生素的DMEM中饥饿 。转染混合物的制备如下:a) DMEM；b) 含有 siRNA(每孔)的DMEM；c) 含有 Lipofectamine 2000转染试剂(产品编号TL201-01，南京维真生物)的DMEM。将溶液b和c分别轻轻混合，在室温下孵育 ，然后合并并再孵育 。然后将合并的混合物(b + c)与溶液A混合并加入到GC-2细胞中。进行 转染，之后将培养基换成完全培养基。转染后 再次用新鲜的完全培养基更换培养基。
用于扩增构建质粒的CYP3A4编码序列的引物为 :CTAGACTAGTCACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGGCCA/GATCTGATCAGTGGTACCGAGAGTAGGGTCTGAACCGGT。随后，将含有目标基因CYP3A4的重组质粒pLVX CYP3A4-mCMV-ZsGreen导入293T细胞以产生高滴度慢病毒。在转染后48小时和 收集慢病毒上清液，合并，通过 过滤器过滤，并在 以 超速离心浓缩 。将病毒沉淀重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，通过qPCR测定病毒滴度约为 TU/mL。对于慢病毒转导，将GC-2细胞以 汇合度接种到6孔板中，并在存在 聚凝胺的情况下以感染复数10与慢病毒一起孵育。孵育 后，将培养基换成新鲜的完全培养基。在转导 后获得稳定过表达CYP3A4的细胞(CYP3A4-OE)，随后用 嘌呤霉素筛选7天。
细胞活力测定
使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8；产品编号C0038，碧云天)评估细胞活力。简要地说，将 个细胞/孔接种到96孔板中，使其贴壁 。细胞单独用BDE47 处理或与 去铁酮(DFP)联合处理 。处理后，用PBS 将细胞洗涤两次，然后向每个孔中加入 的CCK-8试剂(无血清DMEM中10%)。在 孵育2小时后，使用EnSpire多模式酶标仪(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市珀金埃尔默公司)在 处测量吸光度。结果以六个样品的平均值 标准差(SD)表示。
计算机辅助精子分析(CASA)
为了进行精子采集和分析，将 的PBS置于一个 的Eppendorf管中，贴上标签，并在 水浴中预热。安乐死后，切开暴露小鼠的下腹壁，取出整个右侧附睾。然后解剖附睾尾部，用眼科剪刀做一个约1毫米的小切口。将组织放入含有PBS的预热EP管中，在 孵育 ，以使精子自由分散。轻轻吹打混匀悬浮液后，将 的样品加载到用于CASA系统的圆形载玻片上。盖上盖玻片，每个样品选择15个不同视野记录包括精子计数和活力在内的参数。
组织学分析
将睾丸组织在戴维森固定液中于 在 固定。所有样品依次在梯度乙醇中脱水、二甲苯中透明、石蜡包埋。使用旋转切片机(德国韦茨拉尔徕卡RM2235)切取 厚度的切片，并用苏木精(5分钟)和伊红(2分钟)染色进行组织学评估。在光学显微镜(日本东京尼康Eclipse E100)下对玻片成像。
超微结构观察
实验前将细胞培养 ，样品先用 戊二醛固定，用 磷酸盐缓冲液冲洗，随后用 四氧化锇固定。再次冲洗后，样品在丙酮中脱水并包埋在包埋剂中。超薄切片用柠檬酸铅染色。使用JEM-1400Flash透射电子显微镜(日本东京JEOL)获取超微结构显微照片。
RNA提取和逆转录定量PCR(RT-qPCR)
使用RNA Isolater总RNA提取试剂(产品编号:R401-01，Vazyme)按照制造商的方案分离总RNA。使用NanoDrop(赛默飞世尔科技，中国上海)评估RNA的浓度和质量，260/280光密度比值在1.8 - 2.0范围内被认为是可接受的。使用HiScript II Q RT Supermix for qPCR(产品编号:R222-01，Vazyme)合成互补DNA(cDNA)。为了分析相对mRNA表达水平，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(产品编号:Q711-02，Vazyme)在LightCycler 96(罗氏，中国北京)上进行RT-qPCR。反应程序如下:在 预变性 ，在 变性 ，在 退火 持续 ，在 持续 ，然后在 冷却30秒。使用Gapdh作为内参，使用 方法计算相对mRNA表达水平。本文中使用的引物序列由Generay(中国上海)合成(5’-3’):Alkbh5-F，ACGTTGACCCCATCCA CATC；Alkbh5-R，AATGTCCTGAGGCCGTATGC；Atg12-F，TCCTTAAACTGGTGGCCTCG；Atg12-R，CTCTTCCCACAGCACCGAAA；Gapdh-F，AACTT TGGCATTGTGGAAGGG；Gapdh-R，GACACATT GGGGGTAGGAACA。
蛋白质免疫印迹分析
组织和细胞在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(产品编号:04693132001，罗氏)的RIPA缓冲液(产品编号:P0013，碧云天)中裂解。使用BCA检测试剂盒(产品编号:E112，Vazyme)和标准曲线定量蛋白质浓度。等量的蛋白质(每泳道30μg)在10% SDS-PAGE凝胶上分离，并转移到硝酸纤维素膜(0.45μm；产品编号:10600002，通用电气医疗集团，中国上海)上。膜在室温下用5%脱脂牛奶在TBST(含0.1%吐温20的Tris缓冲盐水)中封闭 ，然后在 与一抗孵育过夜。在TBST中洗涤三次后，膜在室温下用HRP偶联的二抗(1:2000；AB0101，Abways，中国上海)孵育 。使用ECL试剂盒(产品编号:E411-05，Vazyme)在Tanon 5200化学发光成像系统上显影条带。使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)对所有条带进行定量。抗体信息见补充表1。
斑点印迹分析
使用RNA Isolater试剂提取总RNA。用无RNase水将RNA浓度调整至500、250和 。样品在 变性 ，在冰上骤冷，然后点样到硝酸纤维素膜(货号#RPN303B，GE Healthcare)上。膜进行紫外线交联(120 mJ/cm²；CX - 2000，UVP)，用0.05%亚甲蓝染色(5分钟)，并在无RNase水中脱色。用5%脱脂牛奶封闭后，膜在 与抗m6A抗体孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育。根据蛋白质印迹方案进行信号检测和标准化。
免疫荧光(IF)分析
组织样本处理:从小鼠获取睾丸组织并立即在 多聚甲醛(PFA)中于 固定 。所有样本依次在梯度乙醇中脱水、在二甲苯中透明并进行石蜡包埋。使用旋转切片机(徕卡RM2235)切取 厚度的切片。为进行抗原修复，切片在柠檬酸钠缓冲液 中于 加热 ，然后冷却至室温。
样品(组织切片或培养细胞)在室温下用 Triton X - 100(货号#P0096，碧云天)在 PBS中通透处理 ，然后用 牛血清白蛋白在 PBS中于 封闭 。对于培养细胞，用BDE47或 处理的GC - 2细胞在通透处理前于室温用 PFA固定30分钟。一抗(针对目标蛋白)在封闭缓冲液(不含Triton X - 100)中稀释，并在 与样品孵育过夜。用 PBS洗涤三次(每次5分钟)后，样品在37°C与荧光团标记的二抗孵育 。再用 PBS洗涤三次后，细胞核在室温下用DAPI(货号#C1002，碧云天)染色15分钟。所有样品用荧光显微镜(LSM700，德国蔡司)拍照。使用ImageJ软件定量荧光强度。分析三个独立样品的平均荧光强度。
免疫荧光共定位染色
使用双标记三色多重荧光染色试剂盒(艾方生物，中国长沙)进行免疫荧光共定位染色。所有步骤按照制造商说明进行。使用荧光显微镜(LSM700)采集图像。使用ImageJ软件定量荧光强度。分析三个独立样品的平均荧光强度。
细胞中活性氧(ROS)、亚铁离子(Fe2+)和脂质过氧化物(LPO)水平的检测
使用荧光探针按照制造商的方案检测活细胞中活性氧(ROS)、 和脂质过氧化(LPO)水平:用于ROS检测的二氢乙锭(DHE；货号#S0063，碧云天)，用于 检测的FerroOrange(货号#F374，日本同仁化学研究所，中国上海)，以及用于LPO评估的Liperfluo(货号#L248，日本同仁化学研究所)。将细胞与各自的探针孵育推荐时间，然后使用荧光显微镜(LSM700)进行分析。使用ImageJ软件测量荧光强度。对于三个独立样本中的每一个，分析三个随机视野。
谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平的评估
按照制造商的方案，使用以下试剂盒评估细胞和小鼠组织中GSH水平、SOD活性和MDA水平:GSH和GSSG检测试剂盒(货号#S0053，碧云天)、总超氧化物歧化酶活性检测试剂盒(货号#S0109，碧云天)和丙二醛检测试剂盒(货号#S0131S，碧云天)。根据试剂盒说明制备样品，并使用微孔板读数仪测量吸光度。使用BCA测定法通过标准曲线定量蛋白质含量。最后，根据每个样品的蛋白质含量对水平进行标准化。
组织铁水平
根据制造商的方案，使用比色法铁检测试剂盒(货号#I291，日本同仁化学研究所)测定小鼠组织中的铁浓度。将样品匀浆，对所得上清液进行铁含量分析。在样品制备前对组织进行均匀称重，并通过组织重量对结果进行标准化。
m6A特异性甲基化RNA免疫沉淀-qPCR(MeRIP-qPCR)
使用SRAMP(http://www.cuilab.cn/sramp)预测Atg12上的所有 位点。设计针对高可信度 位点的特异性引物用于MeRIP-qPCR。选择编码序列编号为285、531和1247的三个高可信度 位点通过MeRIP-qPCR进行验证。引物序列(5’-3’)如下:Atg12-285-F，GAAATGGG CTGTGGAGCGAA；Atg12-285-R，GTTCCGAGG CCACCAGTTTA；Atg12-531-F，TCAGAGACATTT CGGTGCTGT；Atg12-531-R，ACAGGTCCTAACAG ATTCATGCT；Atg12-1 247-F，CCATACCTGCTGT CTCAGCG；Atg12-1 247-R，GCAGTGCAGTCTAG TTGTGGA。使用EpiQuik m6A RNA富集试剂盒(货号#P-9018-24，美国纽约州法明代尔市Epigentek公司)进行MeRIP-qPCR。使用RNA Isolater总RNA提取试剂从GC-2细胞中提取总RNA。RNA 与 珠子 在 孵育并旋转 。通过RT-qPCR定量 修饰的丰度，并使用标准化输入计算 富集。免疫球蛋白G(IgG)用作阴性对照。引物由上海生工合成。
染色质免疫沉淀-qPCR(ChIP-qPCR)
使用Magna ChIP A/G试剂盒(产品编号:Magna0017，美国马萨诸塞州比勒里卡市默克密理博公司)按照制造商的方案进行染色质免疫沉淀(ChIP)分析。以 个细胞的密度接种GC - 2细胞，用 处理BDE47 ，随后在室温下用 甲醛交联 。通过加入 甘氨酸并孵育 来终止交联反应。使用无菌细胞刮从每个培养皿中收获细胞，收集的细胞在 以 离心 使其沉淀。然后将细胞沉淀重悬于核裂解缓冲液中。为了将染色质剪切成最佳大小的片段，裂解物用超声破碎仪(美国Covaris E220)进行超声处理，产生250至1000 bp的DNA片段。对于免疫沉淀，使用抗HIF - 1α抗体并在 孵育过夜，以IgG作为阴性对照，RNA聚合酶II(Pol II)作为ChIP一般程序对照。通过qPCR对富集的DNA进行定量。引物由Generay 合成:Alkbh5 - F，GAGAGCTTTAAAGTGCGGGC；Alkbh5 - R，GGACGTCATGGACTTGAGCTT；Atg12 - F，TCCTTAAACTGGTGGCCTCG；Atg12 - R，CTCTTCCCACAGCACCGAAA。
统计分析
所有数据均以平均值 标准差表示。在应用参数检验之前，评估正态性和方差齐性的假设。使用Shapiro - Wilk检验检查正态性，使用Levene检验评估方差齐性。在认为假设合适的情况下(所有 )使用参数检验分析数据，并且Levene检验表明各组间方差齐性(所有 )。两组之间的比较使用Student’s 检验，多组之间的比较使用单向或双向方差分析(ANOVA)，随后进行Tukey事后检验。使用GraphPad Prism 10(美国加利福尼亚州圣地亚哥市GraphPad软件公司)进行统计分析。所有检验均为双侧检验， 值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
BDE47诱导小鼠睾丸中CYP3A11表达和铁死亡
BDE47是一种CYP3A代谢底物，与生殖毒性有关。给C57BL/6小鼠口服1.5 mg/kg BDE47，持续8周后，组织学检查发现，BDE47处理组小鼠的生精小管紊乱、生精上皮脱落、附睾精子密度降低(图1A)。蛋白质免疫印迹分析表明，BDE47显著降低了铁死亡标志物GPX4和精母细胞标志物SYCP3的表达(图1B)。计算机辅助精子分析进一步表明，BDE47处理组的总精子浓度和进行性精子百分比显著降低(图1C)。这些结果表明，BDE47对生殖细胞造成了损害。免疫染色分析表明，BDE47特异性诱导睾丸中CYP3A11的表达，表明BDE47在该组织中上调了自身的代谢酶(图1D)。进一步分析发现，BDE47显著降低了睾丸中的谷胱甘肽(GSH)水平，提高了丙二醛(MDA)水平(图1E)。此外，BDE47增加了小鼠睾丸中的 水平(图1F)。这些结果共同表明，BDE47暴露诱导了睾丸中铁死亡相关的变化。尽管肝脏中CYP3A的基线表达较高，但BDE47并未诱导明显的肝脏铁死亡或进一步上调CYP3A(补充图1)，这表明，在本研究使用的暴露条件下，在睾丸中观察到了明显的铁死亡相关变化，而在肝脏中未观察到。
图1 BDE47处理的雄性小鼠中的铁死亡。雄性C57BL/6小鼠(每组n = 5)通过口服灌胃给予BDE47(1.5 mg/kg)，持续8周。对照组接受等量二甲基亚砜(DMSO)的生理盐水。A:使用苏木精和伊红染色对生精小管和附睾进行组织学观察。显示了代表性的全貌(上图)和放大图像(下图)。比例尺分别为 和 。B:以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为上样对照，通过蛋白质免疫印迹分析小鼠睾丸中SYCP3和GPX4的表达。C:使用计算机辅助精子分析评估附睾精子质量。参数包括精子浓度、总活力和进行性活力。D:通过免疫荧光染色检测小鼠睾丸中CYP3A11的表达。4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核(蓝色)，Alexa Fluor 594标记CYP3A11(红色)。显示了代表性图像和定量分析。比例尺:20 µm。E:通过比色法测定睾丸中的谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。F:使用比色铁测定试剂盒测量睾丸中的总铁(Fe)、亚铁(Fe2+)和铁离子(Fe3+)水平。使用ImageJ软件对图D中的荧光强度进行定量分析，并分析来自三个独立样本的荧光强度。数据表示为平均值 标准差。使用学生 检验进行统计分析，“ ，以及 ”。缩写:BDE47，2,2,4,4’-四溴二苯醚；CYP3A11，细胞色素P450家族3亚家族A成员11；GPX4，谷胱甘肽过氧化物酶4；SYCP3，联会复合体蛋白3。
BDE47在GC-2细胞中诱导铁死亡
为进一步验证BDE47诱导的铁死亡，我们用BDE47处理GC - 2细胞。细胞活力测定显示， BDE47诱导约20%的细胞活力丧失，游离铁螯合剂DFP可部分挽救这种情况(图2A)。基于这些结果，我们选择0、15和 BDE47用于后续实验。蛋白质免疫印迹分析显示，用 BDE47处理的GC - 2细胞中GPX4表达降低，CYP3A11表达增加(图2B)。氧化应激分析显示，BDE47处理的细胞中谷胱甘肽(GSH)显著耗竭，丙二醛(MDA)水平升高(图2C)。一致地，BDE47处理诱导GC - 2细胞中铁死亡标志物明显的剂量依赖性积累，包括 升高、活性氧(ROS)增加和脂质过氧化(LPO)水平增强(图2D)。这些发现支持BDE47在GC - 2细胞中诱导类似铁死亡的、铁依赖性脂质过氧化表型。
BDE47在小鼠和GC - 2细胞中诱导铁蛋白自噬
铁蛋白自噬是介导铁死亡的重要调节途径。因此，我们假设BDE47可能通过铁蛋白自噬导致铁死亡。免疫荧光染色显示，暴露于BDE47的小鼠睾丸中FTH1表达降低，NCOA4略有增加(图3A)。自噬标志物微管相关蛋白1轻链3β(LC3 - β)在睾丸中增加，并与FTH1共定位(图3B)。对BDE47处理的GC - 2细胞进行电子显微镜观察，发现形成了自噬小泡，在较高剂量(30 μmol/L)时积累明显(图3D)。这些结果表明，自噬相关结构和蛋白质的积累可能导致FTH1的下调。蛋白质免疫印迹分析进一步验证了FTH1、NCOA4和自噬蛋白的表达变化。除了导致FTH1显著降低和NCOA4略有增加外，BDE47还显著上调了睾丸组织和GC - 2细胞中自噬相关蛋白12(ATG12)的表达(图3C和3E)。
ATG12介导的自噬促成BDE47诱导的铁蛋白自噬
由于Atg12的完全敲除会导致小鼠胚胎致死，我们采用Atg12杂合敲低小鼠模型(Atg12 )来研究ATG12在自噬过程中的作用。如图4A所示，与野生型对照相比，Atg12 小鼠的ATG12表达降低了约50%。利用该模型，我们进一步研究了ATG12在CYP3A底物BDE47诱导的铁蛋白自噬中的作用。对小鼠睾丸和附睾进行苏木精 - 伊红(H&E)染色显示，Atg12单倍体不足减轻了BDE47诱导的睾丸损伤(图4B)。此外，Atg12单倍体不足显著减轻了Atg12 小鼠中BDE47诱导的ATG12上调和FTH1下调(图4C)。我们还测量了组织铁含量，发现BDE47处理的Atg12 +/− 小鼠中的 水平显著低于BDE47处理的野生型小鼠(图4D)。这些结果支持ATG12依赖性自噬在BDE47相关的FTH1丢失和铁积累中的作用，表明ATG12参与铁蛋白自噬。
BDE47通过 修饰途径诱导ATG12上调
为阐明氧化应激如何增强自噬并促进铁蛋白降解，我们首先研究了缺氧诱导因子 (HIF-1α)的作用，HIF-1α是氧化应激下激活的关键转录调节因子。蛋白质免疫印迹分析表明，BDE47显著上调睾丸组织和GC-2细胞中HIF-1α的表达(图5A和5B；补充图2A和2B)。然而，染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应(ChIP-qPCR)显示HIF-1α未直接结合Atg12启动子(图5C)。由于已知HIF-调节Alkbh5[25](一种 去甲基化酶)的转录，我们推测BDE47可能通过 依赖性转录后调节来调节ATG12的表达。ChIP-qPCR进一步证明HIF-1α直接结合Alkbh5启动子(图5D)。斑点杂交分析表明，BDE47处理的睾丸组织和用 BDE47处理的GC-2细胞中 甲基化水平总体降低(图5E和5F)。此外，我们观察到BDE47处理的睾丸组织和30μmol/L BDE47处理的GC-2细胞中ALKBH5蛋白水平均显著增加(图5A和5B)。这些结果表明ALKBH5可能在ATG12的调节中起关键作用。
为确定Atg12 mRNA上的特定 修饰位点，我们进行了生物信息学预测，确定285、5 和1247位点是最有可能具有高 丰度的区域(图5G)。BDE47暴露降低了285和531位点的 修饰(图5H)。此外，在GC-2细胞中敲低Alkbh5导致Atg12 mRNA和ATG12蛋白水平下调，表明ALKBH5在ATG12表达中起调节作用(图5I和5J；补充图2C)。
图2 BDE47处理的GC-2细胞中的铁死亡。对于CCK-8测定，细胞单独用BDE47(0 - 320 μmol/L)或与 去铁胺(DFP)联合处理 。每个实验组每次实验有六个重复；对于其他实验，GC-2细胞接受BDE47(0、15、30 μmol/L)处理 ，通过CCK-8测定进行评估。B:通过蛋白质免疫印迹分析GC-2细胞中GPX4和CYP3A11的表达，并进行定量分析，以GAPDH作为内参。C:通过比色法测定GC-2细胞中谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平。D:分别使用荧光探针DHE、FerrOOrange和Liperfluo测量GC-2细胞中活性氧(ROS)、铁 和脂质过氧化物(LPO)的水平。显示了代表性的荧光图像和定量分析。标尺: 。使用ImageJ软件测量荧光强度。数据表示为平均值 标准差。使用单因素方差分析和Tukey事后检验进行统计分析。* *" ，和*** 。缩写:BDE47，2,2’,4,4’-四溴二苯醚；CYP3A11，细胞色素P450家族3亚家族A成员11；GPX4，谷胱甘肽过氧化物酶4。
NAC和DFP逆转BDE47诱导的铁蛋白自噬
为了进一步研究ROS在调节铁蛋白自噬中的作用，我们采用了药理学干预策略。我们将GC-2细胞单独用30 BDE47处理或与NAC(一种典型的抗氧化剂)或DFP(一种游离铁螯合剂)联合处理。NAC和DFP均降低了BDE47诱导的LPO水平。然而，它们通过不同的机制起作用:NAC作为抗氧化剂清除ROS，而DFP螯合铁并完全阻止了BDE47诱导的 增加(图 )。NAC和DFP还减少了BDE47触发的自噬小泡的形成(图6B)。此外，NAC和DFP均逆转了BDE47诱导的ATG12上调以及FTH1下调(图6C)。NAC有效逆转了BDE47诱导的ALKBH5表达上调和 甲基化水平降低(图6C和6D)。这些结果表明，ROS可能在BDE47诱导的铁蛋白自噬中起重要作用。
图3显示BDE47在小鼠和GC-2细胞中诱导铁蛋白自噬。雄性C57BL/6小鼠(每组 只)通过灌胃给予BDE47(1.5mg/kg)，持续8周。对照组给予等量二甲基亚砜的生理盐水。GC-2细胞接受BDE47(0、15、30μmol/L)处理 。A:进行免疫荧光染色以检测小鼠睾丸中FTH1和NCOA4的表达。DAPI染细胞核(蓝色)，绿色荧光表示FTH1(520nm)，红色荧光表示NCOA4(570nm)。显示代表性图像和定量分析。比例尺:20μm。B:进行免疫荧光染色以检测小鼠睾丸中FTH1和LC3-β的表达。DAPI染细胞核(蓝色)，绿色荧光表示FTH1(520nm)，红色荧光表示LC3-β(570nm)。显示代表性图像和定量分析。比例尺:20μm。C:以GAPDH作为上样对照，对睾丸中FTH1、NCOA4和自噬相关蛋白表达进行蛋白质免疫印迹分析。D:使用电子显微镜观察用BDE47处理的GC-2细胞中自噬体的代表性图像。黑色箭头，自噬体；星号，线粒体；三角形，细胞核。比例尺:500nm。E:以GAPDH作为上样对照，对GC-2细胞中FTH1、NCOA4和自噬相关蛋白表达进行蛋白质免疫印迹分析。显示定量分析。使用ImageJ软件测量荧光强度。数据表示为平均值 标准差。使用学生 检验(A、B和C)或单因素方差分析和Tukey事后检验(E)进行统计分析。* ** ，和*** 。缩写:ATG5，自噬相关5；ATG7，自噬相关7；ATG12，自噬相关12；BDE47，2,2’,4,4’-四溴二苯醚；FTH1，铁蛋白重链1；LC3-β，微管相关蛋白1轻链3β；NCOA4，核受体辅激活因子4。
过氧化氢重现了铁蛋白自噬相关的分子变化
为了直接测试活性氧(ROS)的作用，我们用 (一种典型的活性氧)处理GC-2细胞。我们的结果表明， 和 不仅引发了与铁相关的铁蛋白自噬，还上调了ATG12的表达(图7A)。 暴露也降低了FTH1的表达(图7A)。此外， 诱导的氧化应激导致显著的 积累并提高了丙二醛水平(图 和 )。由于ROS是CYP3A介导的BDE47代谢的重要副产物，这些发现进一步表明ROS在下游铁蛋白自噬中起调节作用。
CYP3A4过表达增强了BDE47诱导的铁死亡
小鼠Cyp3a11与人CYP3A4具有高度同源性，显示出显著的序列保守性，尽管不能排除底物代谢存在物种特异性差异(总体一致性 = 72.6%，覆盖率 = 99.9%)(图8A)。慢病毒介导的CYP3A4过表达(CYP3A4 - OE)加剧了铁死亡易感性:在用 BDE47处理后，CYP3A4 - OE细胞比对照细胞表现出更高的ROS、 和LPO水平(图 和 )。值得注意的是，CYP3A4过表达还显著加剧了BDE47诱导的FTH1水平降低(图8D)，进一步突出了CYP3A介导的代谢在异源物诱导的铁死亡中的关键作用。
图4 ATG12介导的自噬促成了BDE47诱导的小鼠铁蛋白自噬。A:使用蛋白质免疫印迹法检测野生型(WT)和 小鼠中的ATG12表达(每组 只)。GAPDH用作上样对照。条带强度通过ImageJ软件定量。B:对用BDE47(1.5mg/kg)或等量DMSO的生理盐水(对照)处理8周的WT和AtI2 小鼠的生精小管进行组织病理学观察(每组 只)。显示了具有管腔结构放大视图的代表性图像。标尺:分别为 和 。C:使用蛋白质免疫印迹法检测WT和Atg12++ - 小鼠睾丸中自噬相关蛋白和FTH1的表达。GAPDH用作上样对照。D:用比色测定试剂盒测量BDE47处理的WT和AtgI2 小鼠睾丸中的铁积累(亚铁、铁和总铁)。数据表示为平均值 标准差。使用学生 检验(A)或带有Tukey事后检验的双向方差分析(C和D)进行统计分析。* ， 和 。缩写:ATG5，自噬相关5；ATG7，自噬相关7；ATG12，自噬相关12；BDE47，2,2’，4,4’-四溴二苯醚；FTH1，铁蛋白重链。
Cyp3a11基因敲低减轻了BDE47诱导的GC - 2细胞氧化应激和铁蛋白自噬
为了进一步验证CYP3A11在介导氧化应激和铁蛋白自噬中的作用，我们使用特异性siRNA(siCyp3a11)在GC - 2细胞中敲低Cyp3411，这使CYP3A11表达降低了约50%(图9A和9B)。siCyp3a11还显著抑制了BDE47诱导的CYP3A11上调。此外，siCyp3a11敲低显著降低了BDE47引起的ROS、 和LPO水平升高(图9A)。进一步分析表明，Cyp3a11基因敲低逆转了BDE47诱导的GSH消耗和MDA增加(图9C)。此外，Cyp3a11基因敲低减轻了BDE47诱导的ATG12上调和FTH1下调，并逆转了BDE47介导的HIF - 1α和ALKBH5诱导(图9D)。
图 BDE47处理的睾丸和GC-2细胞中的修饰及相关调控途径。每组 只雄性C57BL/6小鼠通过口服灌胃给予BDE47(1.5mg/kg)，持续8周；对照组给予等量二甲基亚砜的生理盐水。GC-2细胞给予BDE47(0、15、30 μmol/L)处理 周。使用蛋白质免疫印迹分析检测小鼠睾丸组织(A)和GC-2细胞(B)中METTL3、WTAP、FTO、ALKBH5的表达。以GAPDH作为内参。定量分析见补充图2。C和D:进行染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应(ChIP-qPCR)分析，以检测GC-2细胞中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)与自噬相关蛋白12(Atg12)(C)和Alkbh5(D)启动子区域的结合。免疫球蛋白G(IgG)和RNA聚合酶II(Pol II)分别作为阴性对照和一般ChIP程序对照。数据以输入DNA进行标准化。E和F:通过斑点印迹分析检测小鼠睾丸RNA和GC-2细胞中的总m 水平。亚甲基蓝染色作为RNA上样的参照。G:使用SRAMP(http://www.cuilab.cn/sramp)预测Atg12 mRNA中的N6-甲基腺苷(m6A)甲基化位点。高可信度的m6A峰出现在核苷酸位置285、531和1247处。H:使用甲基化RNA免疫沉淀-定量聚合酶链反应(MeRIP-qPCR)检测BDE47处理的GC-2细胞中Atg12位点(285、531和1247)的m6A富集情况。结果以输入RNA进行标准化。I和J:分别通过逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹分析检测Alkbh5小干扰RNA(siRNA)干扰后GC-2细胞中Alkbh5 mRNA(I)和自噬相关蛋白12(ATG12)蛋白(J)的表达。以GAPDH作为内参。定量分析见补充图2。数据以平均值 标准差表示。使用学生t检验(A、C、D、H、I和J)或单因素方差分析(one-way ANOVA)及Tukey事后检验(B)进行统计分析。 ，** ，*** 。缩写:ALKBH5，AlkB同源物5；BDE47，2,2′,4,4′-四溴二苯醚；FTO，脂肪量和肥胖相关蛋白；HIF-1α，缺氧诱导因子1α；m6A，N6-甲基腺苷；METTL3，甲基转移酶样3；METTL14，甲基转移酶样14；WTAP，威尔姆斯瘤1相关蛋白。
讨论
BDE47是细胞色素P450 3A(CYP3A)已知的代谢底物，它可诱导CYP3A表达并经代谢激活生成羟基化代谢产物[8]。以往研究主要关注生成的羟基化代谢产物的毒性。然而，在本研究中，我们关注的是CYP3A自身在BDE47诱导的生殖损伤中的作用。BDE47引起的CYP3A高表达不仅会增加活性氧(ROS)水平，还可能间接导致 过载 。在GC - 2细胞中，CYP3A的敲低和过表达均改变了BDE47诱导的铁死亡，这支持CYP3A上调会驱动ROS和 积累。作为最重要的I相代谢酶，CYP3A主要在肝脏中表达，以介导外源性物质的代谢 。虽然长期高剂量暴露时BDE47可导致肝脏损伤 ，但在我们的研究中，在所给予的剂量和时间点未观察到明显的肝脏损伤。相反，通过CYP3A11上调以及ROS和 升高发生了睾丸损伤，这表明，在所检测的暴露条件下，睾丸比肝脏对BDE47相关的CYP3A诱导和铁死亡相关变化表现出更高的易感性。这可能归因于两个因素:(1)肝脏具有高水平的II相代谢酶，可有效消除CYP3A代谢产生的有毒产物，而睾丸则不然[29]；(2)睾丸精子发生过程的复杂性使其对ROS更敏感[17]。
图6 N - 乙酰半胱氨酸(NAC)和去铁酮(DFP)减轻了BDE47处理的GC - 2细胞的铁自噬。GC - 2细胞单独用BDE47(30 μmol/L)处理，或与NAC(5 mmol/L)或DFP(1 μmol/L)联合处理 ，并使用荧光探针测定法检测GC - 2细胞中的铁死亡。显示了代表性荧光图像和定量分析。标尺: 。B:通过透射电子显微镜检测GC - 2细胞中的自噬体形成。黑色箭头，自噬体；星号，线粒体；三角形，细胞核。标尺:500 nm。C:通过蛋白质免疫印迹分析GC - 2细胞中自噬相关蛋白12(ATG12)、AlkB同源物5(ALKBH5)和铁蛋白重链1(FTH1)的表达，并进行定量分析。甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶(GAPDH)用作上样对照。D:使用斑点印迹分析检测GC - 2细胞中的总RNA N6 - 甲基腺苷(m^6A)水平。亚甲蓝染色用作内参。使用ImageJ软件测量A图中的荧光强度。数据表示为平均值 标准差。使用单因素方差分析和Tukey事后检验进行统计分析。*** 。缩写:ALKBH5，AlkB同源物5；ATG12，自噬相关蛋白12；BDE47，2,2’,4,4’-四溴二苯醚；FTH1，铁蛋白重链1； ，N6 - 甲基腺苷。
图7 在GC-2细胞中诱导铁自噬。用 处理GC-2细胞 。A:通过蛋白质免疫印迹法分析用 处理的GC-2细胞中HIF-1α、ATG12、ALKBH5和FTH1的表达，并进行定量分析。使用GAPDH作为内参。B:通过比色法测定用 处理的GC-2细胞中的氧化应激标志物(GSH、SOD和MDA)。C:使用荧光探针法检测用 处理的GC-2细胞中的ROS(DHE)、铁 (FerroOrange)和LPO(Liperfluo)水平。显示代表性荧光图像和定量分析。标尺: 。使用ImageJ软件测量荧光强度。数据表示为平均值 标准差。使用单因素方差分析和Tukey事后检验进行统计分析。* ，以及 。缩写:ALKBH5，AlkB同源物5；ATG12，自噬相关蛋白12；FTH1，铁蛋白重链1；GSH，谷胱甘肽；HIF-1α，缺氧诱导因子1α；MDA，丙二醛；SOD，超氧化物歧化酶。
在所检测的细胞色素P450同工酶中，CYP3A在催化NADPH氧化、产生超氧阴离子自由基、产生NADPH依赖性化学发光、氧化二氯荧光素二乙酸酯以及还原铁-EDTA和铁-柠檬酸盐方面表现出最高活性[30]。CYP3A催化循环涉及底物氧化所必需的动态铁氧化还原转变。NADPH-细胞色素P450还原酶将电子传递给血红素铁 ，使氧活化并形成高价铁-氧中间体 。这个循环不仅产生大量的超氧 和 通量，破坏氧化还原稳态和蛋白质翻译，还可能通过与ROS相关的调节途径增加 水平。产生的 和ROS协同促进芬顿反应，引发脂质过氧化和铁死亡 。我们的数据表明，BDE47诱导的铁死亡取决于过量的ROS和 过载，因为抗氧化剂(如NAC)和铁螯合剂(如DFP)可挽救细胞死亡。即使在用 处理的细胞中，我们也检测到亚铁离子积累，这表明ROS可能通过有待进一步研究的机制间接影响铁稳态。CYP3A代谢产生的过量ROS可修饰关键信号转导蛋白 。因此，CYP3A介导的代谢过程中产生的ROS对于铁死亡的完全发生至关重要。
图8 CYP3A4过表达对BDE47处理的GC-2细胞中铁自噬的影响。A:对人CYP3A4和小鼠Cyp3a11进行氨基酸序列比对。X轴代表氨基酸位置，Y轴表示序列同一性百分比。蓝线，滑动同一性；红色虚线，全局同一性。B:通过蛋白质免疫印迹法分析过表达CYP3A4(CYP3A4-OE)的GC-2细胞中CYP3A4和FTH1的表达，并进行定量分析。带有空载质粒的GC-2细胞用作阴性对照(NC)。GAPDH用作上样对照。C:用荧光探针法检测BDE47处理( )后NC和CYP3A4-OE GC-2细胞中的氧化应激水平。用于检测ROS的DHE、用于 的FerroOrange和用于检测LPO的Liperfluo。显示代表性荧光图像和定量分析。标尺:20 µm。D:用免疫荧光法检测BDE47(15 μmol/L，48 h)处理后NC和CYP3A4-OE GC-2细胞中FTH1的表达。用DAPI对细胞核进行染色。获得代表性图像和定量分析。标尺:20 µm。使用ImageJ软件测量荧光强度。数据表示为平均值 标准差。使用双向方差分析和Tukey事后检验进行统计分析。* ，以及 。缩写:BDE47，2,2,4,4-四溴二苯醚；CYP3A4，细胞色素P450 3A4；FTH1，铁蛋白重链1。
图9敲低GC-2细胞中的Cyp3a11可挽救BDE47诱导的铁蛋白吞噬。用靶向Cyp3a11的siRNA(siCyp3a11)或阴性对照siRNA(siNC)转染GC-2细胞，并用BDE47(30 μmol/L，48小时)处理。A:通过免疫荧光染色检测细胞中CYP3A11的表达，并使用荧光探针测定法测量ROS、Fe2+和LPO的水平。荧光探针:用于活性氧(ROS)的DHE，用于Fe 的FerroOrange，以及用于脂质过氧化物(LPO)的Liperfluo。显示代表性荧光图像和定量分析。比例尺:20 µm。B:通过蛋白质免疫印迹法验证GC-2细胞中CYP3A11的敲低效率。GAPDH用作内部上样对照。C:测定siNC或siCyp3a11细胞中谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的水平。D:使用蛋白质免疫印迹法检测siNC和siCyp3a11细胞中自噬和铁蛋白自噬相关蛋白(HIF-1a、ALKBH5、ATG12和FTH11)。GAPDH用作上样对照。使用ImageJ软件测量荧光强度。数据表示为平均值 标准差。使用双向方差分析和Tukey事后检验进行统计分析。“ ** ，以及 *** 。缩写:ALKBH5，AlkB同源物5；ATG12，自噬相关12；BDE47，2,2’，4,4’-四溴二苯醚；FTH1，铁蛋白重链1；HIF-1α，缺氧诱导因子 -甲基腺苷。
铁蛋白自噬是近期关于外源性化学物质毒性作用研究的一个焦点。因此，我们进一步阐明了细胞色素P450 3A(CYP3A)产生的活性氧(ROS)如何触发铁蛋白自噬。CYP3A底物促进自噬体形成，同时抑制铁蛋白表达。这一过程关键依赖于自噬相关(ATG)蛋白[35]。我们的数据显示，ATG12显著上调，ATG12是一种类泛素蛋白，通过ATG7(E1)和ATG10(E2)酶的顺序激活与ATG5形成关键共轭物[36]。尽管ATG5/ATG7已被证明与铁死亡有关[20]，但我们的研究首次提供证据表明，使用Atg12单倍体不足小鼠模型，ATG12参与铁蛋白自噬。然而，敲除Atg12在小鼠中是胚胎致死的，因此本研究需要使用Atg12 杂合小鼠。这种方法的一个局限性是，杂合小鼠仅表现出ATG12表达约50%的降低，这可能无法完全重现ATG12功能完全丧失时所观察到的表型。在ATG12完全缺陷的情况下，可能会出现更严重或不同的表型，但由于胚胎致死性无法进行评估。未来使用条件性或组织特异性Atg12敲除模型的研究将有助于进一步阐明ATG12在BDE47诱导的自噬和生殖细胞损伤中的全部作用。
鉴于抗氧化剂有效减弱了BDE47诱导的ATG12上调，我们发现了ROS与ATG12诱导之间的新机制联系。我们的数据显示，ROS促进缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的过表达，HIF-1α是一种与线粒体代谢和ROS产生密切相关的转录因子[37]。先前的研究报道，线粒体ROS增强HIF-1α的稳定性[38]，并且HIF-1α已被鉴定为 去甲基化酶ALKBH5的转录调节因子， 是一种关键的 擦除器 。作为RNA修饰的主要形式， 受到甲基转移酶和去甲基化酶的严格调控，并通过改变二级结构、稳定性和蛋白质结合深刻影响RNA命运 。m 修饰在调节mRNA稳定性和蛋白质翻译中起重要作用，这与各种人类疾病有关[40]。为了评估ALKBH5的诱导是否影响 动态，我们证明Atg12 mRNA上的总 修饰显著减少，特定位点的 修饰降低，这与其mRNA表达增加相关，同时ALKBH5表达升高。据报道，去甲基化酶FTO以 依赖的方式促进自噬蛋白ATG5和ATG7的表达，从而影响脂肪生成，并且 修饰与自噬之间存在相互作用[41]。我们的研究结果表明， 修饰减少与ATG12表达增加有关；然而，这种效应是否由Atg12 mRNA稳定性改变介导需要进一步研究。未来使用 位点定向诱变或全转录组 图谱分析的研究需要验证Atg12是否是ALKBH5介导的 去甲基化的直接靶点，并剖析精确的分子机制。
我们的研究突出了细胞色素P450 3A(CYP3A)代谢过程中产生的活性氧(ROS)在2,2’,4,4’-四溴联苯醚(BDE47)诱导的毒性中的作用，并阐明该代谢过程可能是外源性物质引起生殖损伤的一个重要病因，为解释外源性化学物质的生殖毒性提供了新的视角(图10)。此外，体内使用了小鼠Cyp3a11，体外使用了人CYP3A4，这两种酶之间的氨基酸同源性为72.6%。人CYP3A4过表达时观察到的序列同源性和功能效应表明，CYP3A介导的机制可能也与人类相关。然而，CYP3A表达、底物代谢和睾丸生理学的种属特异性差异使得这些发现无法直接外推至人类生殖毒性。此外，鉴于谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)和Cyp3a11在多种睾丸细胞类型中表达，BDE47诱导损伤的确切细胞类型特异性仍有待确定。因此，我们的结论仅限于表明BDE47会对生殖细胞造成损伤，基于组织病理学观察和以往文献，其对精母细胞的影响占主导但并非唯一。此外，机制干预实验主要局限于GC-2细胞，未对睾丸中的CYP3A进行直接的体内干预。因此，需要进一步研究以在体内验证CYP3A介导的铁蛋白自噬途径。未来利用细胞类型特异性敲除或谱系追踪方法的研究将有助于加强本研究的结论。
资金支持
本研究得到了中国国家自然科学基金(S.W.获得82173562和91743205号资助，C.W.获得82273584和81903353号资助)、南京医科大学常州医学中心重点项目(S.W.获得CMCM202315号资助)以及江苏省基础研究计划(C.W.获得BK20251854号资助)的支持。
图10 BDE47诱导睾丸生精损伤的机制图。BDE47触发CYP3A表达，导致过量ROS产生。ROS降低 的 甲基化并增加ATG12表达，这与HIF-1a HIF-1a和ALKBH5表达增加相关。升高的ATG12驱动FTH1的自噬降解，进一步加剧 过载，而Fe 与ROS之间的协同相互作用放大了脂质过氧化。缩写:ALKBH5，AlkB同源物5；ATG12，自噬相关12；BDE47，2,2’,4,4’-四溴二苯醚；CYP3A，细胞色素P450 3A；FTH1，铁蛋白重链1；HIF-1a，缺氧诱导因子 -甲基腺苷；ROS，活性氧。
致谢
无。
作者贡献
徐舒雨:概念化、调查、形式分析、撰写初稿。范文霞:验证、形式分析、数据整理。钱江雪:调查、形式分析。何跃文:形式分析。李春锦:调查。陈超:方法学、软件、形式分析。王莉:方法学、形式分析。于永泉:方法学、撰写 - 审阅与编辑。王超:概念化、方法学、撰写—审阅与编辑、资源、资金获取。王守林:概念化、撰写 - 审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取。
其他信息
网络版包含可在http://www.jbr-pub.org.cn/ article/doi/10.7555/JBR.40.20260159获取的补充材料。
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2026-09-20
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