热应激通过m6A修饰促进成纤维细胞衍生的WNT5A分泌以激活黑素生成
发布时间：
2026-08-12 21:08
热应激通过m6A修饰促进成纤维细胞衍生的WNT5A分泌以激活黑素生成
万媛媛 D | 温亚清 D | 张玉山 D | 张兰 | 朱建建 D | 汤震 D 姜玲 D | 傅楚涵 D | 周舒 | 张可依 D | 黄江峰 | 李雷 | 陈静 | 曾庆海 D
中南大学湘雅三医院皮肤科，中国湖南长沙 暨南大学医学教育中心，中国广州 I 中南大学湘雅医学院常德医院(常德市第一人民医院)皮肤科，中国湖南常德
通信作者:陈静 (43700351@qq.com) | 曾庆海 (zengqinghai@csu.edu.cn)
收稿日期:2025年12月15日 | 修回日期:2026年7月8日 | 录用日期:2026年7月17日
关键词:fzd10 |热应激 |黑素生成 | N6-甲基腺苷 |旁分泌功能 | wnt5a
摘要
随着全球变暖的影响持续加剧，热应激对皮肤的影响日益明显。越来越多的临床证据表明，热应激可诱导皮肤色素沉着。然而，其潜在机制仍不完全清楚。在本研究中，我们证明热应激可促进白癜风皮损的色素再沉着，并诱导脱色小鼠皮肤中的黑素生成。机制上，我们发现热应激通过METTL3介导的 -甲基腺苷 修饰上调真皮成纤维细胞(FB)中WNT5A的表达和旁分泌分泌。WNT5A mRNA的稳定性通过YTHDC1依赖性途径调节。用重组WNT5A蛋白处理可显著增加黑素细胞(MC)、MNT1细胞和人皮肤外植体中的黑色素含量。此外，WNT5A诱导MC中 -连环蛋白及其受体FZD10的表达。功能挽救实验证实，敲低FZD10可消除WNT5A和热应激诱导的 -连环蛋白激活，从而减弱黑素生成。总之，我们的研究结果阐明了一种新机制，即热应激通过METTL3/YTHDC1依赖性 甲基化触发成纤维细胞衍生的WNT5A分泌，以促进黑素生成。本研究为热诱导的皮肤色素沉着障碍的发病机制提供了新的见解，并揭示了热疗法作为治疗色素减退性疾病的有前景途径的潜力。
1 | 引言
作为直接暴露于外部环境的最大器官，皮肤极易受到紫外线(UV)辐射、热和 等环境因素的影响[1]。随着全球变暖影响的不断升级，热应激对皮肤的影响日益明显[2]。越来越多的证据表明，热应激可诱导皮肤黑色素生成。长期反复暴露于不足以引起烧伤的亚阈值强度热环境中，可能会导致持续性网状色素沉着，临床上称为火激红斑[3,4]。此外，黄褐斑是一种常见的获得性色素沉着障碍，与热应激密切相关[5]。值得注意的是，火针疗法在治疗白癜风方面已显示出有前景的临床疗效[6]。从黑素细胞自身的角度来看，我们的团队此前证明，热应激通过MYC-WDR5-H3K4me3轴上调CX3CL1，从而激活CX3CL1/CX3CR1-JNK信号通路以促进黑色素生成[7]。此外，我们还证明热应激激活TRPV3/Ca Hedgehog信号通路，增强角质形成细胞中的旁分泌信号，随后促进黑色素生成[8]。然而，关于热应激诱导皮肤色素沉着的潜在机制的研究仍然有限，确切的调控途径尚未完全阐明。研究这些机制可能为色素性疾病提供新的治疗靶点。
万媛媛、文雅清和张玉山对本工作贡献相同。
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© 2026作者。由Wiley-VCH GmbH出版的《先进科学》
皮肤成纤维细胞(FB)是真皮中的主要细胞，在表皮黑色素生成中发挥动态作用。它们有助于细胞外基质(ECM)的产生，并分泌各种黑色素生成调节剂，包括干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肝细胞生长因子(HGF)[9]。最近的研究表明，FB衍生的分泌卷曲相关蛋白2(sFRP2)调节Wnt/ -连环蛋白途径，上调小眼相关转录因子(MITF)和酪氨酸酶(TYR)以刺激人黑素细胞中的黑色素生成[10]。此外，据报道热刺激通过阳离子通道TRPV1调节FB细胞功能，这表明FB细胞在热暴露时表现出与角质形成细胞类似的调节级联反应[11]。然而，FB细胞在热应激诱导的黑色素生成中的作用仍不清楚。
经典的Wnt/ -连环蛋白途径正向调节黑色素生成[12]。当Wnt配体与卷曲受体结合时， -连环蛋白的磷酸化被抑制，阻止其降解并导致细胞质积累和核转位[13]。在细胞核中， -连环蛋白增强MITF的表达，促进黑素细胞的存活、增殖和黑色素生成[12,13]。WNT5A是Wnt蛋白家族的成员，根据受体结合情况，通过经典的Wnt/ -连环蛋白途径或非经典的Wnt信号发挥作用[14]。尽管WNT5A已被证明通过经典的Wnt途径参与黑素细胞的分化和成熟[15]，但其确切机制仍不完全清楚。对黄褐斑受累皮肤的转录组分析显示Wnt途径富集、黑色素生成相关基因的表达改变以及WNT5A上调——特别是在基底层和成纤维细胞周围区域[16]。这些发现表明WNT5A在黑色素生成中可能发挥作用，但其在热应激诱导的色素沉着中的作用尚未得到探索。
-甲基腺苷 是真核生物mRNA中最普遍的表观遗传修饰之一，通过影响RNA成熟、核输出、稳定性和翻译效率，在转录后调控中起关键作用[17-20]。 的动态调控由甲基转移酶(“书写者”)、去甲基化酶(“擦除者”)和 结合蛋白(“阅读者”)精心编排。新出现的证据表明，热暴露会改变 的修饰模式。例如，热休克 诱导YTHDF2表达上调并使其从细胞质转移到细胞核。它还限制了FTO对mRNA 5’UTR的去甲基化，从而提高了热休克诱导的mRNA中5’UTR的甲基化水平，并启动不依赖帽的翻译[21]。此外，YTHDC1在热应激期间以METTL3依赖的方式促进热休克蛋白的共转录诱导，突出了 信号在热诱导基因重编程中的关键作用[22]。此外，热触发的 高甲基化激活NLRP3炎性小体，损害小鼠的精子发生[23]。尽管有这些进展，但 修饰是否有助于热应激诱导的黑色素生成仍不清楚。
本研究从成纤维细胞旁分泌信号的角度研究了热应激对皮肤黑色素生成的影响及其机制。最初，对白癜风患者进行热疗，并对色素脱失小鼠模型施加热应激，我们证明热应激促进黑色素再生。随后对色素脱失小鼠皮肤组织进行空间转录组分析，提示WNT5A、其受体FZD10和 修饰在热应激诱导的黑色素生成中的潜在作用。通过体外实验，我们揭示了一种新机制，即热应激通过METTL3/YTHDC1介导的 甲基化上调FB衍生的WNT5A，随后通过FZD10激活 -连环蛋白途径以驱动黑色素生成。
2 | 结果
2. I | 热应激可促进色素脱失皮肤中的黑色素生成
我们证实， 时的热应激可显著诱导皮肤色素沉着(图S1A)，这与我们之前发表的文章[8]一致。为了研究热应激是否能促进色素脱失皮肤的色素沉着，本研究纳入了6例根据临床和反射式共聚焦显微镜检查结果诊断为白癜风的患者。患者随访期间的临床特征和常规治疗情况总结于表S1。在同一患者中，皮肤病变被分为对照组和热疗组。对照组接受常规治疗，而热疗组除常规治疗外，还接受局部热应激治疗 。对照组基线时的平均面积为 ，随访时降至 ，平均反应率为29.5%。热疗组基线时的平均面积为 ，随访时降至 ，平均改善率为54.2%(图1A)。热疗组皮肤病变的治疗反应显著高于常规治疗组(图1B)。一名右上肢有多个白斑的患者实现了快速色素沉着，热疗区域的色素沉着率达到了100%(图1C)。三名患者的热疗区域观察到色素沉着大于50%。上述临床观察表明，热应激可诱导白癜风色素脱失皮肤的色素沉着。
我们随后建立了一种色素脱失小鼠模型，以系统地研究热应激对色素减退皮肤的影响。在对这些小鼠进行热疗时，我们确保皮肤温度在 左右保持稳定，且不引起全身应激，如图S1B、C所示。动物研究的总体实验流程如图1D所示。使用5周龄的C57BL/6J小鼠建立色素脱失模型。进行Masson-Fontana黑色素染色以评估毛囊中的色素脱失水平，结果如图1E、G所示。雌性和雄性小鼠在背部毛囊表型上没有差异，均表现出明显的色素减退。对色素脱失小鼠进行热疗后，我们发现 组毛囊中的黑色素含量与NC组相比显著增加，如图1F、H所示。
图1 | 热应激可促进色素脱失皮肤中的黑色素生成。(A) 白癜风患者的色素沉着特征。(B) 常规治疗与热疗的反应率比较。采用配对学生t检验确定统计学意义(*p <0.05)。(C) 治疗期间3号和6号患者的色素沉着情况。(D) 色素脱失小鼠的建立及后续热疗示意图。(E) 色素脱失小鼠模型皮肤的大体形态变化。(F) 色素脱失小鼠热疗前后皮肤外观比较。(G) 正常组和模型组小鼠皮肤组织的代表性Masson-Fontana染色(标尺 )。采用学生t检验分析统计学意义 。(H)色素脱失小鼠热疗前后皮肤组织的代表性Masson-Fontana染色(标尺 )。采用学生t检验分析统计学意义(***p <0.001)。
图2 | 热应激促进黑素生成相关基因和WNT5A的表达上调。(A) 小鼠皮肤样本制备及RNA测序流程。(B) 组织学类型的空间分布及相应的苏木精-伊红染色图像。(C) 热应激促进关键黑素生成基因(Tyr、Tyrp1、Pmel、Dct)表达上调。(D) GO、KEGG富集结果的前30条通路。(E) 与黑素生成通路相关的差异表达配体-受体对的火山图。(F) NC组和 组中Wnt蛋白表达的热图(* )。(G) NC组和 组中Fzd受体表达的热图 。
2.2 | 热促进关键黑素生成基因的表达
为探究热应激诱导皮肤色素沉着的潜在机制，对NC组和 组的皮肤样本进行了空间转录组分析(图2A)。经过质量控制(图S2A - D)后，我们整合了无监督聚类(图S2E)、经批次校正的t - SNE/UMAP可视化(图S2F)以及苏木精-伊红引导的组织学注释(图2B)，将两组数据分为四个组织学类别:表皮、真皮、脂肪和肌肉(图S2G)。空间定位表达显示，与NC组相比， 组中关键黑素生成相关基因——Tyr、Tyrp1、Pmel和Dct的表达水平显著升高(图2C)。这些发现表明热暴露促进了黑素生成相关基因的上调。通过筛选NC组和 组之间的差异表达基因(DEGs)，随后进行GO和KEGG富集分析，我们发现GO数据库在与表皮发育、毛发周期和细胞间连接组织相关的术语中富集，而KEGG数据库在黑素生成相关通路以及Wnt、PI3K - Akt、MAPK和Hippo信号通路中富集(图2D)。对黑素生成相关通路中编码上游配体和受体的基因进行差异表达分析(表S2)，结果显示与NC组相比， 组中Wnt信号成分显著上调(图2E)。基于这些发现，我们进一步分析了WNT家族成员及其受体的表达变化。结果表明，WNT5A及其受体FZD10在两组之间表现出最显著的差异(图2E - G和图S2H)。此外，WNT5A和FZD10与关键黑素生成相关基因，包括Mlana、Tyr、Tyrp1、Dct、Mitf、Pmel和Myo5a，显示出最强相关性(图S2I)。这些发现表明WNT5A - FZD10轴可能在热应激诱导的黑素生成中起重要调节作用。
2.3 | WNT5A诱导黑素生成
通过上述空间转录组分析，我们发现WNT5A和FZD10与黑素生成相关基因的相关性最强(图3A)。为了进一步研究WNT5A在黑素生成中的具体作用，我们对来自小鼠模型的空间转录组数据进行了分层分析。该分析表明，WNT5A、Fzd10和其他关键黑素生成调节因子在毛囊区域富集，并且在热处理后表达上调(图3B)。随后，我们分析了这些基因在人类黄褐斑数据集(GSE72140)中的表达谱，以验证WNT5A与人类皮肤样本中黑素生成之间的关联。黄褐斑组和正常组之间的差异表达分析，随后进行GO和KEGG富集分析，结果显示Wnt信号通路和黑素生成途径显著富集(图S3A)。WNT5A和黑素生成相关调节基因(MLANA、TYR、TYRP1、DCT、MITF、PMEL和MYO5A)的表达在黄褐斑样本中明显上调(图S3B、C)。此外，WNT5A表达与黑素生成相关基因集呈正相关(R = ；图S3D)。根据TYR的平均表达水平，将黄褐斑样本分为TYR高表达组和TYR低表达组。差异表达和富集分析显示，两组之间Wnt信号通路和黑素生成模块持续富集(图S3E)，WNT5A在TYR高表达组中明显上调(图S3F)。空间转录组分析和整体转录组分析均一致表明WNT5A与黑素生成密切相关。随后，我们进一步验证了WNT5A对黑素生成的影响。分别用不同浓度的重组WNT5A蛋白 连续处理人皮肤组织、MC和MNT1细胞5天、2天和2天。Masson-Fontana染色显示，与对照组相比，WNT5A处理的皮肤组织、MC和MNT1细胞中的黑色素含量显著增加( )(图3C、D)。免疫荧光染色进一步表明，外源性WNT5A增强了MC和MNT1细胞中黑素体特异性标记物PMEL17的表达(图3E、F)。此外，在MNT1细胞中，TYR探针染色表明外源性WNT5A显著提高了TYR活性，黄色荧光增加证明了这一点(图S4A)，并且上调了TYRP1的表达(图S4B)。
图3 | WNT5A与黑素生成相关。(A)Wnt5a/Fzd10与黑素生成相关调节基因之间的相关性(Pearson相关分析， )。(B)NC组和41°C组毛囊区域中Wnt5a、Fzd10和黑素生成相关基因(Mlana、Tyr、Tyrp1、Dct、Miff、Pmel和Myo5a)的彩色点可视化。(C)Masson-Fontana染色显示WNT5A处理5天后人皮肤外植体中的黑色素含量(标尺 )。(D)Masson-Fontana染色显示WNT5A处理2天后MC和MNT1细胞中的黑色素含量(标尺 )。(E)免疫荧光显示WNT5A处理2天后MC细胞中PMEL17的表达(标尺 )。(F)免疫荧光显示WNT5A处理2天后MNT1细胞中PMEL17的表达(标尺 )。
2.4 | WNT5A激活FZD10/ -连环蛋白途径以诱导黑素生成
由于WNT5A是Wnt信号通路的一个组成部分，在空间转录组学和黄褐斑转录组学分析中均观察到其表达富集(图2D和图S3A)，我们试图确定WNT5A是否通过经典Wnt信号通路促进黑色素生成。MC和MNT1细胞用不同浓度的重组WNT5A蛋白 处理2天。结果表明，WNT5A促进了MC细胞中 -连环蛋白的核表达(图4A)。此外，在MNT1细胞中，WNT5A显著增强了 -连环蛋白依赖性TCF/LEF转录活性(图4B)，并显著增加了总 -连环蛋白蛋白水平(图4C)。为了阐明WNT5A如何激活 -连环蛋白，我们聚焦于在 上调的WNT通路受体(FZD1、FZD6、FZD7和FZD10；图2G)。细胞实验表明，只有敲低FZD10才能拮抗WNT5A诱导的MNT1细胞中黑色素含量的增加(图4D)，这表明WNT5A主要通过FZD10促进黑色素生成。接下来，我们研究了WNT5A与FZD10之间的关系，发现WNT5A上调了FZD10的表达(图4E)。此外，空间转录组学分析显示WNT5A和FZD10的空间定位有大量重叠，在热应激下相关性显著增强(对照组皮尔逊相关系数:0.5， 组:0.91；图4F)。同样，在培养的人皮肤组织中进行的免疫共沉淀(Co-IP)实验证实了WNT5A与FZD10之间的相互作用，并且这种相互作用在热应激下增强(图4G)。在验证了WNT5A-FZD10相互作用并确定FZD10是介导WNT5A信号的主要受体后，我们接下来试图从功能上表征FZD10在该轴中的作用。我们使用siRNA沉默其表达，通过qPCR、WB和IF证实了有效敲低(图S5A-C)。敲低FZD10显著降低了WNT5A诱导的MNT1细胞(WB)和MC细胞(IF)中 -连环蛋白的上调(图4H，I)。同样，Masson-Fontana染色显示敲低FZD10显著损害了WNT5A驱动的MC细胞中的黑色素生成(图4J)。
图4 | WNT5A激活FZD10/β-连环蛋白信号通路。(A)免疫荧光显示WNT5A处理2天后MC细胞中 -连环蛋白的表达(标尺 )。(B) WNT5A处理2天后MNT1细胞中 -连环蛋白依赖性TCF/LEF转录活性的双荧光素酶报告基因检测。采用单因素方差分析和Tukey事后检验，F (3, 8) = 12.64，***p < 0.001。(C) WNT5A处理2天后MNT1细胞中β-连环蛋白蛋白表达的蛋白质印迹分析。(D) Masson-Fontana染色显示WNT5A与FZD1/6//7/10敲低联合处理2天后MNT1细胞中的黑色素含量(标尺 )。(E)免疫荧光显示WNT5A处理2天后MC细胞中FZD10的表达(标尺 )。(F)空间转录组分析中WNT5A和FZD10表达的空间定位及相关性(皮尔逊相关系数:NC组为0.5， 组为0.91)。(G)热处理后人皮肤组织中WNT5A与FZD10相互作用的免疫共沉淀(Co-IP)分析。(H) WNT5A蛋白与FZD10敲低联合处理2天后MNT1细胞中 -连环蛋白蛋白表达的蛋白质印迹分析。(I) WNT5A蛋白与FZD10敲低联合处理2天后MC细胞中FZD10和 -连环蛋白表达的免疫荧光分析(标尺 )。(J) WNT5A蛋白与FZD10敲低联合处理2天后MC细胞中黑色素含量的Masson-Fontana染色(标尺 )。
2.5 | 热应激诱导成纤维细胞中WNT5A表达
上述实验建立了WNT5A与黑色素生成之间的联系(图3)，空间转录组分析证实热应激诱导WNT5A表达(图2)。然而，WNT5A的细胞来源仍不清楚。为了解决这个问题，我们分析了单细胞转录组数据(GSE15067)，发现WNT5A在成纤维细胞中高表达，而其受体FZD10可在黑素细胞中表达(图5A)，这表明热应激诱导的WNT5A升高可能起源于成纤维细胞。一致地，在 和 下每天暴露于热应激 天，持续3天的FB显示WNT5A mRNA(图5B)和蛋白(图5C)水平显著增加。
2.6 | 热应激诱导成纤维细胞分泌WNT5A激活FZD10/β-连环蛋白/黑色素生成途径
尽管WNT5A被确定为成纤维细胞衍生，但具体机制仍不清楚。由于WNT5A是一种分泌蛋白，我们接下来试图确定热应激是否通过成纤维细胞介导的旁分泌信号促进黑色素生成。首先，将MNT1和FB细胞分别在37、39、41、42和 下每天处理 ，持续3天(图S6A)，然后通过CCK-8评估细胞活力。与之前的报道[8]一致，在37、39或 时，两种细胞类型的活力均未降低(图S6B)。随后，我们设计了一系列细胞热处理方案，包括共培养和上清液处理(图5D)。首先，我们将MC或MNT1细胞与FB细胞共培养，并将共培养系统在37、39或 下每天处理 ，持续3天。Masson-Fontana染色显示热应激下黑色素含量增加(图5E)。免疫荧光进一步显示MC和MNT1细胞中黑素体标记物PMEL17的表达增强(图5F)。此外，TYR探针染色显示MNT1细胞中TYR活性增加，黄色荧光增强(图S6C)。然后，将FB细胞在37、39或 下每天处理 ，持续3天，并在第4天收集上清液，用于处理MC和MNT1细胞2天。Masson-Fontana染色显示，用热应激FB上清液处理后，MC和MNT1细胞中的黑色素含量均增加(图5G)。免疫荧光进一步证明MC和MNT1细胞中黑素体标记物PMEL17上调(图5H)，以及MNT1细胞中TYR、TYRP1和DCT的表达升高(图S6D-F)。此外，蛋白质印迹法证实，用热应激FB上清液处理的MNT1细胞中，关键黑色素生成调节因子(TYR、TYRP1、DCT、MITF和PMEL17)的表达升高(图5I)。上述结果表明，39和 的热应激诱导FB介导的旁分泌信号促进黑色素生成，在 时观察到的效果更明显。鉴于我们早期的研究结果表明WNT5A激活FZD10/ -连环蛋白信号通路(图4)，且热应激上调FB细胞中WNT5A的表达(图5B、C)，我们推测热应激通过刺激成纤维细胞分泌WNT5A来促进黑色素生成，进而激活FZD10/ -连环蛋白信号通路。
为了验证这一假设，我们研究了WNT5A在热应激下通过 -连环蛋白信号通路促进黑色素生成中的作用。双荧光素酶报告基因分析证实，从热处理的FB收集的条件培养基促进了MNT1细胞中 -连环蛋白依赖性TCF/LEF转录活性(图6A)。在用这种条件培养基处理的MNT1细胞中，WNT5A敲低降低了 -连环蛋白蛋白表达并增加了p- -连环蛋白水平(图6B、C)，在人类皮肤切片中也观察到了类似的效果(图S6G、H)。此外，WNT5A敲低显著降低了MNT1细胞和人类皮肤切片中热应激诱导的黑色素含量(图6D、E)。
在确认了热应激下WNT5A- -连环蛋白轴后，我们接下来研究FZD10是否也介导了这种效应。在MNT1细胞中进行的免疫共沉淀实验证实了WNT5A与FZD10之间的相互作用，并且这种相互作用在热应激条件下增强(图6F)。免疫荧光显示，FZD10表达降低减弱了热应激FB上清液诱导的 -连环蛋白上调(图6G)。同样，Masson-Fontana染色显示，FZD10敲低显著抑制了热应激FB上清液在MC(图6H)和MNT1(图S6I)细胞中诱导的黑色素生成。相反，敲低其他WNT5A受体，包括FZD1、FZD6和FZD7，未能抑制热应激FB上清液在MNT1细胞中诱导的黑色素生成(图S6J)。总的来说，这些发现表明热应激通过促进成纤维细胞作为旁分泌因子分泌WNT5A来增强黑色素生成，随后激活FZD10/ -连环蛋白信号通路。
2.7 | 热应激通过METTL3/YHDC1依赖性 修饰促进WNT5A的表达
热暴露已被证明可在生物体中诱导表观遗传调控[24]。为了研究WNT5A表达与表观遗传修饰之间的潜在关联，我们在空间转录组学数据中分析了WNT5A表达与各种表观遗传标记之间的相关性。结果显示WNT5A表达与多种表观遗传修饰之间存在显著正相关，其中 修饰显示出最强的关联(图7A)。先前的研究也表明热暴露可诱导 修饰[21]。我们的数据表明， 热应激后FB细胞中总体 修饰水平显著上调(图7B)。 修饰由甲基转移酶(写入器)和去甲基酶(擦除器)动态调节。甲基转移酶复合物核心成分METTL3、METTL14和WTAP介导 沉积，而FTO和ALKBH5作为主要的 擦除器[19]。最初进行实验以检测热应激后FB细胞中 写入器和擦除器的表达模式。 调节剂(写入器和擦除器)与WNT5A之间的空间共定位分析显示，WNT5A高表达的空间域与METTL3水平升高的空间域之间存在明显重叠(图S7A)。此外，RT-qPCR结果显示， 热处理后0和 时METTL3 mRNA水平显著上调(图7C)。随后的蛋白质印迹分析证实，热应激后 时FB细胞中METTL3蛋白表达显著升高(图7D)。在人皮肤切片中，热应激5天后波形蛋白阳性成纤维细胞中METTL3表达也升高(图7E)。
图5 | 热应激诱导成纤维细胞来源的WNT5A，并通过成纤维细胞介导的旁分泌信号促进黑色素生成。(A) 在单细胞数据集(GSE150672)中对不同细胞类型的WNT5A和FZD10表达进行分析。(B) 热应激后FB细胞中WNT5A mRNA表达的RT–qPCR分析(单因素方差分析和Tukey事后检验，F(2, 6)=24.21，**5 )。(C) 热应激后FB细胞中WNT5A蛋白表达的Western blot分析。(D) 细胞热处理程序的示意图。(E) 使用Masson–Fontana染色评估热应激后共培养系统中MC和MNT1细胞的黑色素含量(标尺 )。(F) 免疫荧光定位观察热应激后共培养系统中MC和MNT1细胞中PMEL17的荧光强度(标尺 )。(G) Masson–Fontana黑色素染色检测FB上清液处理后MC和MNT1细胞中的黑色素含量(标尺 )。(H) 免疫荧光定位观察FB上清液处理后MC和MNT1细胞中PMEL17的荧光强度(标尺 )。(I) Western blot分析FB上清液处理后MNT1细胞中黑色素生成相关调控基因的蛋白表达水平。
图6 | 热应激成纤维细胞分泌的WNT5A激活FZD10/β–连环蛋白信号以促进黑色素生成。(A) 用FB条件培养基处理的MNT1细胞中 –连环蛋白依赖性TCF/LEF转录活性的双荧光素酶报告基因检测。使用学生t检验分析统计学显著性(*p )。(B) WNT5A敲低后FB细胞中WNT5A蛋白表达的Western blot分析。(C) FB上清液和WNT5A敲低联合处理2天后MNT1细胞中 –连环蛋白、p– –连环蛋白蛋白表达水平的Western blot分析。(D) Masson–Fontana染色显示FB上清液和WNT5A敲低联合处理2天后MNT1细胞中的黑色素含量(标尺 )。(E) 热应激和WNT5A敲低联合处理5天后人皮肤切片中黑色素含量的Masson–Fontana染色(标尺 )。(F) 用热处理FB细胞的条件培养基处理的MNT1细胞中WNT5A与FZD10相互作用的免疫共沉淀(Co–IP)分析。(G) FB上清液和FZD10敲低联合处理2天后MC细胞中FZD10和 –连环蛋白表达的免疫荧光分析(标尺 )。(H) FB上清液和FZD10敲低联合处理2天后MC细胞中黑色素含量的Masson–Fontana染色(标尺 )。
为了进一步研究METTL3是否通过 修饰参与热应激诱导的FB细胞中WNT5A的表达，我们使用SRAMP数据库预测WNT5A mRNA上潜在的 位点，并设计针对高分位点的引物(图S7B)。MeRIP–qPCR分析证实热应激上调了WNT5A mRNA的 修饰，并且在FB细胞中使用siRNA敲低METTL3后这种上调减弱(图7F和图S7C、D)。总之，这些发现确立了METTL3是热应激介导的WNT5A 修饰的关键调节因子。
我们上述的研究表明，热应激可诱导成纤维细胞(FB细胞)旁分泌WNT5A以促进黑色素生成(图3、图5和图6)，并且热应激通过一种依赖于METTL3的机制增加WNT5A 修饰(图7)。基于这些发现，我们推测热应激诱导的WNT5A上调促进黑色素生成的作用取决于METTL3的激活。STM2457是一种适用于体内研究的新型高选择性METTL3抑制剂[25]。我们首先检测了STM2457对FB细胞活力的影响。结果表明，在37℃或 下用1.25、2.5、5和 μM的STM2457处理 ，对细胞活力没有显著影响(图S8A)。在随后的实验中，用 μM的STM2457处理可有效抑制热应激诱导的FB细胞中WNT5A mRNA和蛋白水平的升高(图8A和图S8B、D)，以及上清液中旁分泌WNT5A的水平(图S8C)。为了进一步验证METTL3在调节WNT5A表达中的作用，我们通过敲低FB细胞中的METTL3进行了功能挽救实验。结果表明，敲低METTL3显著抑制了热应激诱导的WNT5A在mRNA水平(图8B)、蛋白水平(图8C)以及其向上清液中的旁分泌分泌(图8D)的上调。与这些细胞实验结果一致，敲低METTL3也显著抑制了热应激诱导的人皮肤切片中WNT5A表达的上调(图8E)。
图7 | 热应激通过METL3/YTHDC1依赖性 修饰诱导WNT5A表达促进黑色素生成。(A)WNT5A表达与表观遗传修饰之间的相关性分析(Pearson相关性，*p < 0.05)。(B)热应激2小时后FB细胞中 修饰水平的免疫荧光分析(比例尺 )。(C)热应激后0、1和2小时FB细胞中METTL3、METTL14、WTAP、FTO和ALKBH5 mRNA表达的RT-qPCR分析。采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验。METTL3:F(3, 8) = 24.73，** ，***p 。其他基因未发现显著差异。(D)热应激后1、2和4小时FB细胞中METTL3蛋白表达的蛋白质印迹分析。(E)热应激5天后人皮肤切片中波形蛋白阳性成纤维细胞(绿色)中METTL3蛋白表达(红色)的免疫荧光图像(比例尺 )。(F)敲低METTL3的热应激FB细胞中WNT5A相对 A水平的MeRIP-qPCR分析。采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验(F(3,8) = 30.79，*** )。
为了检测METTL3是否参与热应激诱导的黑色素生成，我们收集了用STM2457处理的FB细胞的条件培养基，并用其处理MNT1和MC细胞2天。用STM2457处理的热应激FB细胞的条件培养基显著逆转了热应激诱导的MNT1和MC细胞中黑色素含量升高(图S8E)。此外，敲低METTL3显著降低了热应激诱导的人皮肤切片中黑色素含量(图S8F)。
图8 | METL3介导热应激诱导的WNT5A表达和黑色素生成。(A) 用2.5 μM STM2457预处理后再进行热应激的FB细胞中WNT5A蛋白表达的蛋白质印迹分析。(B) 热应激后METTL3敲低的FB细胞中WNT5A mRNA表达的RT-qPCR分析。采用单因素方差分析和Tukey事后检验 (F (3,8) = 35.08,*** 。(C) METTL3敲低后FB细胞中WNT5A蛋白表达的蛋白质印迹分析。(D) 热应激后METTL3敲低的FB细胞条件上清液中WNT5A水平的ELISA定量分析。采用单因素方差分析和Tukey事后检验 (F (3,8) = 19.45,** )。(E) 在METTL3敲低的热应激5天后的人皮肤切片中，波形蛋白阳性成纤维细胞 (绿色) 中WNT5A蛋白表达 (黄色) 的免疫荧光分析 (标尺 )。(F) 对MNT1和MC细胞进行2天处理后的Masson-Fontana黑色素染色
此外，当对METTL3敲低的FB细胞进行热应激处理，并将其条件培养基应用于MNT1和MC细胞时，我们观察到METTL3的缺失显著减弱了热应激诱导的黑色素含量增加 (图8F)，并显著抑制了MC细胞和MNT1细胞中PMEL17的上调 (图S8G，H)。此外，用METTL3敲低的FB细胞上清液处理的MNT1细胞中，TYR、TYRP1、DCT的表达受到抑制 (图8G)。同时，我们还在FB细胞中过表达了METTL3 (图S8I，J)。结果表明，来自热应激、METTL3过表达的FB细胞的条件培养基显著增加了MNT1细胞中WNT5A的表达 (图8H和图S8K)，并同时增强了热应激诱导的MC和MNT1细胞中黑色素的增加 (图8I)。总之，这些发现表明METTL3在促进热应激诱导的WNT5A上调中起关键作用，从而加剧热应激刺激的黑色素生成。
在 修饰的动态调控网络中，阅读蛋白作为关键的执行者，连接上游的书写过程和下游的功能结果。它们特异性地识别并结合到 位点以调控基因表达。为了鉴定参与热应激调控的 修饰的关键阅读蛋白，我们在FB细胞中进行了RT-qPCR。结果显示，热应激后0、1和2小时，YTHDC1 mRNA水平显著上调(图9A)。随后的实验证实了2和4小时时YTHDC1蛋白水平升高(图9B)。在人类皮肤切片中，热应激5天后，波形蛋白阳性成纤维细胞中的YTHDC1表达也升高(图9C)。为了进一步研究YTHDC1在调控WNT5A表达中的作用，我们进行了RIP-qPCR和RNA下拉实验，证实了YTHDC1蛋白与WNT5A mRNA之间存在直接相互作用(图S9A、B)。随后，我们使用siRNA在成纤维细胞中敲低YTHDC1(图9D)。为了验证siRNA介导的敲低的特异性，对成纤维细胞进行YTHDC1敲低，然后进行热应激。蛋白质印迹分析表明，siRNA有效抑制了热应激诱导的YTHDC1蛋白水平升高，而对YTHDC2蛋白表达没有影响，证实了siRNA的特异性(图S9C)。进一步的实验表明，敲低YTHDC1可抑制热应激FB细胞中WNT5A的mRNA和蛋白表达(图9E、F)。鉴于先前的文献强调YTHDC1在调控mRNA稳定性中的作用[26, 27]，我们评估了热应激同时敲低YTHDC1后WNT5A mRNA的稳定性。通过测量放线菌素D处理后的WNT5A mRNA水平，我们发现siYTHDC1敲低细胞中WNT5A mRNA的半衰期较短(图9G)。此外，将热应激FB细胞的条件培养基应用于MNT1细胞表明，敲低YTHDC1显著减弱了热应激诱导的MC和MNT1细胞中的黑色素生成(图9H)。这伴随着MNT1细胞中黑色素生成相关蛋白(DCT、TYR和MITF)表达水平的显著降低(图S9D)，以及MC和MNT1细胞中PMEL17上调的抑制(图S9E、F)。此外，对敲低YTHDC1的人类皮肤切片进行5天的热应激处理。我们同样发现，敲低YTHDC1可拮抗热应激诱导的人类皮肤组织中WNT5A表达上调和黑色素含量增加(图S9G、H)。这些发现证实，YTHDC1是人类皮肤热诱导黑色素生成所必需的。总之，这些发现表明，YTHDC1通过调控WNT5A的mRNA稳定性在热应激诱导的WNT5A上调中起关键作用，从而加剧热应激刺激的黑色素生成。
3 | 讨论
本研究表明，热应激通过METTL3/YTHDC1依赖性的 甲基化修饰促进成纤维细胞分泌WNT5A。WNT5A与黑素细胞表面的FZD10受体结合，从而抑制 -连环蛋白的磷酸化依赖性降解。黑素细胞中积累的 -连环蛋白随后转运到细胞核中，在那里驱动关键的黑色素生成相关基因的表达，最终促进黑色素合成。总的来说这项研究揭示，热应激通过 修饰的WNT5A/FZD10/ -连环蛋白信号通路调控黑色素生成(图10)。
先前的研究表明，热和紫外线B对黑素细胞具有相似的生物学效应，仅热就足以直接调节黑素生成[8]。皮肤色素沉着由复杂的真皮-表皮网络协调，其中成纤维细胞衍生的因子与黑素细胞受体相互作用，以调节细胞内黑素生成途径[28]。我们早期的研究表明，热应激通过激活TRPV3/Ca Hh信号轴增强角质形成细胞旁分泌活性，从而刺激黑素生成[8]。此外，我们发现热应激通过WDR5介导的H3K4me3修饰激活CX3CL1/CX3CR1轴诱导黑素生成[7]。然而，以前没有研究探讨热应激诱导的成纤维细胞旁分泌信号如何影响黑素生成。因此，本研究填补了这一重要的研究空白。我们的研究结果表明，成纤维细胞中 -WNT5A途径依赖性旁分泌效应代表了热应激下调节黑色素生成的另一种独立机制。
热应激后用METTL3敲低的FB细胞的条件培养基处理(比例尺 )。(G)用METTL3敲低的成纤维细胞的条件培养基处理后，对MNT1细胞中DCT、TYRP1、TYR和MITF蛋白表达进行蛋白质免疫印迹分析。(H)热应激后对METTL3过表达的FB细胞中WNT5A mRNA表达进行RT-qPCR分析。采用单因素方差分析，然后进行Tukey事后检验(F (2, 6) = 23.95，*p < 0.05)。(I)热应激后用METTL3过表达的FB细胞的条件培养基处理2天的MNT1和MC细胞的Masson-Fontana黑色素染色(比例尺 )。
图9 | YTHDC1介导热应激诱导的成纤维细胞中WNT5A表达和黑素生成。(A)热应激后0、1和2小时FB细胞中YTHDF1、YTHDF2、YTHDC1、IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3 mRNA表达的RT-qPCR分析。采用单因素方差分析，然后进行Tukey事后检验。YTHDC1:F (3, 8) = 415，****p < 0.0001。其他基因未发现显著差异。(B)热应激后0、1、2和4小时FB细胞中YTHDC1蛋白表达的蛋白质免疫印迹分析。(C)免疫荧光图像显示热应激5天后人皮肤切片中波形蛋白阳性成纤维细胞中YTHDC1蛋白表达(比例尺 )。(D)YTHDC1敲低后FB细胞中YTHDC1 mRNA表达的RT-qPCR分析。采用单因素方差分析，然后进行Tukey事后检验(F (2,6) = 195.3， ， )。(E)热应激后YTHDC1敲低的FB细胞中WNT5A mRNA表达的RT-qPCR分析。采用单因素方差分析，然后进行Tukey事后检验
Wnt信号通路在黑素细胞分化中起关键作用[29, 30]。特别是，WNT3和WNT1作为经典配体激活Wnt/ -连环蛋白途径，驱动黑素生成相关基因的表达[31, 32]。从机制上讲，Wnt蛋白与卷曲蛋白(FZD)家族的G蛋白偶联受体结合，抑制 -连环蛋白磷酸化及随后的降解，从而使 -连环蛋白稳定、在细胞质中积累并向细胞核转运[13]。在细胞核中， -连环蛋白增强MITF转录，最终促进黑素细胞存活、增殖和黑色素合成[12, 13]。
我们的研究结果证实了WNT5A与黑色素生成之间存在紧密联系。WNT5A上调了FZD10的表达，功能挽救实验表明，敲低FZD10可减弱WNT5A诱导的 -连环蛋白激活和黑色素生成，证实FZD10在这种情况下作为WNT5A的受体。总体而言，这些结果表明WNT5A通过FZD10/ -连环蛋白途径促进黑色素生成。
空间转录组分析显示热诱导WNT5A上调，而单细胞转录组数据(GSE150672)表明成纤维细胞是WNT5A的主要来源。一致地，分子分析证实热应激在成纤维细胞中诱导了WNT5A在mRNA和蛋白质水平的表达。随后的共培养和条件培养基实验进一步验证了成纤维细胞在介导热诱导的黑色素生成中的旁分泌作用。重要的是，先前的临床研究表明，黄褐斑皮损中WNT5A表达升高，黄褐斑与热触发密切相关[16]，与我们的观察结果一致。最后，功能挽救实验证实FZD10参与热诱导的黑色素生成:沉默FZD10可显著减弱 -连环蛋白激活和黑色素积累。综上所述，这些结果表明热应激刺激成纤维细胞分泌WNT5A，进而激活FZD10/ -连环蛋白信号级联反应以促进黑色素生成。
修饰是真核细胞中最普遍的表观遗传RNA修饰，在转录后水平决定修饰RNA分子的命运方面起着关键作用，影响几乎所有关键的生物学过程[33]。新出现的证据表明 甲基化参与热应激反应的调节[21 - 23, 34]。作为 甲基转移酶复合物的核心催化成分，METTL3已被证明在热应激期间具有重要功能。先前的研究报道，热应激 显著上调了原代肝细胞和湖羊前脂肪细胞中METTL3的水平[35, 36]。同样， 热应激被发现可提高猪支持细胞中METTL3的表达[23]。与这些发现一致，我们的研究表明，受到 热应激的皮肤成纤维细胞中METTL3表达有类似的增加。值得注意的是，METTL3依赖性 甲基化与热诱导的热休克蛋白(HSPs)上调有关，这表明许多其他热反应基因可能通过类似机制被调节[22]。在我们的研究中，我们发现热应激处理增加了WNT5A mRNA的 修饰水平，随后导致其表达显著上调。值得注意的是，这一调节过程主要由METTL3介导。
作为一种关键的核 阅读器，YTHDC1已被证明在热应激期间发挥重要的功能作用。先前的研究报道，YTHDC1在热应激下以METTL3依赖性方式促进热休克蛋白的共转录诱导[22]。此外，对在不同温度下饲养的萨达羊的基因组分析表明，YTHDC1可能与绵羊耐热性间接相关[37]。同样地，另一项研究发现敲低YTHDC1会损害果蝇对热应激的调节能力[38]。与这些发现一致，我们的研究表明，受到 热应激的成纤维细胞中YTHDC1的表达增加。通过调节WNT5A mRNA的稳定性，YTHDC1介导热应激诱导的WNT5A上调，随后促进黑素细胞中的黑色素生成。
我们的研究最初表明，热应激通过 修饰增强成纤维细胞中WNT5A的旁分泌分泌，从而促进黑色素生成。这些发现为热诱导色素沉着障碍(包括黄褐斑、火激红斑和激光后色素沉着)的发病机制提供了新的机制见解。我们的研究提供了几个具有潜在转化价值的见解。首先，它通过 介导的真皮成纤维细胞分泌WNT5A，在热应激和黑色素生成之间建立了直接的机制联系。其次，热刺激的促色素沉着作用增加了热疗作为一种针对白癜风等色素减退性疾病的新型非紫外线干预措施的可能性。与光疗不同，局部热应用可能具有较低的光致癌风险，并且可以与现有治疗方法相结合。第三，将WNT5A和FZD10鉴定为关键介质表明，该轴的药理学激活——例如，使用WNT5A模拟物或小分子FZD10激动剂——可能代表一种刺激色素再生的靶向策略。
然而，类似于紫外线辐射在白癜风治疗中的双刃剑效应——特定波长在光疗中作为主要方式，而光损伤可能潜在地引发同形反应[39, 40]——过度或长时间的热暴露可能在白癜风中诱发同形反应[41]。因此，在应用热疗治疗白癜风等色素减退性病变时，应仔细考虑潜在的治疗风险。治疗持续时间过长或温度过高可能导致局部不良反应，包括红斑、水泡形成、溃疡和继发感染。此外，长时间或过度的热暴露也可能导致色素沉着。因此，为了确保促进白癜风脱色病变中色素再生的疗效以及将潜在副作用降至最低，严格控制热疗的温度和持续时间至关重要。
检测(F(2,6)=17.02，**p<0.01)。(F)YTHDC1敲低后FB细胞中YTHDC1和WNT5A蛋白表达的蛋白质印迹分析。(G)在给予放线菌酮D处理0、2、4和6小时后，YTHDC1敲低的FB细胞中WNT5A mRNA的RT-qPCR分析。采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验(0小时:无显著差异；2小时:F(2,6)=5.859，*p<0.05；4小时:F(2,6)=125.4，***% > 0.0001，6小时:F(2,6)=54.57，**p<0.011，***p<0.0001)。(H)热应激后用YTHDC1敲低的FB细胞的条件培养基处理2天的MC和MNT1细胞的Masson-Fontana染色(比例尺 )。
图10 | 机制图，说明热应激通过m A修饰增强成纤维细胞分泌WNT5A促进黑色素生成。热应激通过成纤维细胞中METTL3/YTHDC1依赖性 修饰调节WNT5A mRNA的稳定性，从而促进WNT5A的旁分泌分泌。在黑素细胞中，WNT5A通过激活FZD10/β-连环蛋白信号通路驱动黑色素生成。
总之，本研究进一步揭示，热应激可能通过METTL3/YTHDC1依赖性 修饰促进成纤维细胞分泌WNT5A，并激活黑素细胞中的FZD10/ -连环蛋白信号通路以驱动黑色素生成。这些发现为色素性皮肤病(包括色素沉着过度性疾病(如黄褐斑和火激红斑)和色素减退性疾病(如白癜风))的临床预防和治疗提供了新的见解和潜在的分子靶点。
4 | 材料和方法
4.1 | 热疗
本研究经中南大学湘雅三医院伦理委员会批准(编号:24385)。白癜风患者的皮损分为两组。对照组接受常规治疗，包括光疗，以及皮质类固醇、钙调神经磷酸酶抑制剂或二氧化碳激光等。在常规治疗的基础上，热疗组额外进行局部加热。由于其广泛的可及性和用户友好性，使用暖垫(wecan，中国)每天对皮损进行一次加热，每次加热 。撕开外部保护袋后，暖垫中的铁粉迅速氧化并与空气接触释放热量，使表面温度升至约 。在治疗前后测量皮损面积。治疗12周后比较两组皮损的色素再生情况。知情同意模板见表S6。
4.2 | 细胞培养
人黑色素瘤细胞系MNT1(Meisen CTCC，中国，#CTCC - 006 - 0301)细胞在补充有20%胎牛血清(FBS)(Meisen CTCC，中国，#CTCC - 002 - 071)、1%青霉素 - 链霉素(G - CLONE，中国，#ABT920)和1%非必需氨基酸(Meisen CTCC，中国，#CTCC - 002 - 142)的DMEM培养基(Gibco，美国，#C11995500BT)中培养。
经中南大学湘雅三医院伦理委员会批准(编号:24910)后，从包皮环切术后捐赠的青少年包皮组织中提取人表皮黑素细胞(MC)和人真皮成纤维细胞(FB)。MC细胞在含有1%HMGS(Gibco，美国，#S0025)和1%青霉素 - 链霉素的254培养基(Gibco，美国，#M254500)中培养。FB细胞在补充有10%FBS(Viva Cell，中国，#C04001 - 500)、1%青霉素 - 链霉素的DMEM培养基中培养。未检测到任何细胞系被支原体污染。细胞在湿度培养箱中于 和 培养。为抑制METTL3，FB细胞用溶解于DMSO(MP Biomedicals，美国，#196055)的STM2457(MedChemExpress，美国，#HY - 134836)连续处理4天。
4.3 | 原代细胞提取
收集中南大学湘雅三医院接受包皮环切术的青少年患者捐赠的包皮组织(经捐赠者和中南大学湘雅三医院伦理委员会批准)，并浸入含有10%青霉素 - 链霉素 - 两性霉素B溶液的杜氏磷酸盐缓冲盐水(D - PBS)缓冲液中，在 冰箱中保存4小时。然后，用D - PBS溶液将包皮组织洗涤3 - 5次。将包皮组织表皮面朝下置于无菌培养皿中，用手术剪刀去除皮下组织。用手术剪刀将包皮组织剪成约硬币大小的圆形片，表皮面朝上、真皮面朝下浸泡在含有中性蛋白酶II( )(Solarbio，中国，#D6430)的培养皿中。然后将培养皿在 下冷藏过夜。然后，用D - PBS溶液将皮肤片轻轻冲洗2 - 3次。用左手持镊子向下按压皮肤片的真皮层，同时用右手持镊子轻轻提起表皮层，将表皮与真皮分离。
黑素细胞:将分离的表皮组织置于培养皿中，用D-PBS溶液冲洗1-2次。将清洗后的皮肤碎片转移至无菌培养皿中，用眼科剪刀切碎。随后，加入 的0.25%胰蛋白酶溶液(碧云天，中国，#C0201)，转移至离心管中，在 培养箱中消化 。最后，细胞悬液通过细胞筛过滤以获得过滤后的细胞悬液。过滤后的细胞用D-PBS溶液洗涤两次。最终，将细胞重悬于MC培养基中。
成纤维细胞:将分离的真皮组织置于培养皿中，用D-PBS溶液冲洗1-2次。将清洗后的皮肤碎片转移至无菌培养皿中，用眼科剪刀切碎。将切碎的真皮组织均匀铺在无菌培养皿中，在 培养箱中干燥4小时。 后，向培养皿中加入FB培养基，并继续在细胞培养箱中培养。
4.4 | 细胞热处理
将细胞以适当密度接种到培养皿中。根据我们之前的研究[8]，细胞贴壁后，将培养皿置于37、39或 恒温的高温培养箱中进行热处理 ，然后将培养皿放回 恒温培养箱中进一步培养，上述步骤连续重复3天。同时，在细胞热处理期间，在0、15、30、45和 时测量恒温培养箱中的 和 浓度。
4.5 | 细胞转染
使用CALNP RNAi体外转染试剂(D-Nano Therapeutics，中国，#DN001-01)按照制造商说明进行细胞转染。简要地说，消化、离心并重悬细胞，然后均匀接种到6孔或12孔板中，并在培养箱中培养。当细胞汇合度达到 时，按照制造商方案进行转染。siRNA序列见表S3。
4.6 | 人皮肤培养与干预
经捐赠者和中南大学湘雅三医院伦理委员会批准后，从健康青少年包皮环切术后的包皮中获取人皮肤样本。简要地说，从包皮样本中去除皮下组织和脂肪，将后者切成2 片。对于WNT5A处理，将皮肤片表皮面朝上置于含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素-两性霉素B和WNT5A(0、62.5、125、250ng )的DMEM上。将培养板在 下用 孵育5天。此外，对于热干预和siRNA敲低:将皮肤组织连续培养5天，每天暴露于 。并且在培养期的第1天和第3天，将靶向WNT5A、YTHDC1或METTL3的siRNA溶液 局部注射到真皮和表皮之间的深部。
4.7 | 构建色素脱失小鼠模型
5周龄的C57BL/6J小鼠(雌雄各半)由湖南赛莱克景达实验动物有限公司提供。所有动物实验方案均经动物福利委员会批准(伦理批准号:CSU - 2022 - 0525)。适应性喂养1周后，剃去小鼠背部毛发。将小鼠分为两组:正常组和色素脱失模型组。色素脱失模型组小鼠每天用40%单苯醚乳膏(印度Briton)处理两次，而正常组小鼠每天用凡士林作为对照处理两次。处理持续6周。
4.8 | 小鼠的热处理
在成功诱导小鼠色素脱失模型后，将动物系统地分为两个不同的组，每组五只小鼠:阴性对照(NC)组和热处理 组。NC组不进行处理作为基线参考。对于 组，将一个 加热垫(中国Warm U)牢固地固定在小鼠背部，每天进行 次温暖处理。该方案共维持5周，在此期间仔细监测和记录治疗结果。
此外，将六只健康的未建模C57BL/6J小鼠随机且平均分配到阴性对照(NC)组和热处理 组，每组3只小鼠。在每天30分钟的热暴露期间，在热处理组小鼠的0、10、20和30分钟时测量加热区域的背部皮肤表面温度和直肠核心温度。使用实验室动物专用数字温度计(中国北京山水新科检测技术有限公司TH212)检测直肠温度，同时通过红外热成像仪(德国Testo SE & Co. KgaA testo 871)记录背部皮肤温度。同时，在初次热暴露后的第1天、第3天和第7天从两组小鼠中采集外周血样本，以检测血清皮质酮水平。
4.9 | 马松 - 丰塔纳黑色素染色
马松 - 丰塔纳黑色素染色利用氨银溶液检测黑色素颗粒，是最常用的黑色素染色方法[42]。
细胞:当孔板中的细胞汇合度达到70% - 80%时，弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞三次。用4%多聚甲醛固定液固定细胞15 - 20分钟，然后弃去多聚甲醛溶液，用双蒸水洗涤细胞三次，每次 。向孔板的每个孔中加入 氨银溶液，在 水浴中避光孵育 。随后，加入 硫代硫酸钠溶液并反应3 - 5分钟。弃去硫代硫酸钠溶液，用双蒸水洗涤细胞三次，最后，向每个孔中加入1 mL PBS缓冲液。
组织切片:将组织切片在烘箱中于 干燥30分钟，然后进行脱石蜡、二甲苯透明和乙醇水化处理，最后用自来水冲洗。随后，将切片平放在黑暗容器中，用 氨银溶液处理，并在 于避光水浴中孵育 。用双蒸水冲洗三次后，加入 硫代硫酸钠溶液处理 ，然后再冲洗三次。然后用 中性红染色溶液处理切片 ，再冲洗三次，空气干燥并封片。
使用蔡司倒置荧光显微镜(LSM800)采集细胞和组织切片的图像。对于每一批样品，在图像采集过程中保持一致的曝光时间和白平衡。使用ImageJ软件(版本1.54，美国)在毛囊区域内测量Masson-Fontana阳性信号的积分光密度(IOD)，采用固定阈值并将其归一化到总表皮面积，以反映每单位表皮面积的黑色素含量。
4.×甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)
使用所述方法提取总RNA，并使用EpiQuik CUT&RUN A RNA富集(MeRIP)试剂盒(EpigenTek，美国，#P-9018-24)[43,44]富集 RNA组分。对于每个样品，将 富集的RNA进行逆转录和扩增。引物见表S4。
4.×酶联免疫吸附测定(ELISA)
使用商业ELISA试剂盒(中国Cloud-Clone Corp；产品编号CEA540Ge)测量血清皮质酮水平，使用另一种ELISA试剂盒(中国Mlbio；产品编号ml1005067)测量细胞培养上清液中的WNT5A水平，均按照制造商的方案进行。使用提供的标准品进行两倍系列稀释生成标准曲线，范围从0.16到 ，空白孔仅含有标准稀释剂 。根据制造商的说法，批内精密度(变异系数，CV)为 (在单个板上对三个已知样品进行20次测定)，批间精密度(CV)为 (在三个独立板上对三个已知样品进行40次测定)。上清液未经稀释进行测定，所有样品均进行双份测定。
4.×用于WNT/ -连环蛋白信号通路的双荧光素酶报告基因测定
将MNT1细胞与TOPFlash(中国碧云天，D2503)和pRL-TK(中国碧云天，#D2760)报告质粒以15:1的比例共转染。转染后，用指定药物处理细胞。使用双荧光素酶报告基因测定试剂盒按照制造商的说明(中国碧云天，RG027)测量荧光素酶活性。简要地说，将细胞裂解，裂解物离心。使用微孔板读数器依次测定上清液中的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。计算萤火虫荧光与海肾荧光的比值以标准化转染效率和细胞数量，并用于比较各组中WNT/ -连环蛋白途径的相对激活水平。
4.×RNA免疫沉淀(RIP)-qPCR
为了探究YTHDC1蛋白与WNT5A mRNA之间的相互作用，我们按照制造商的说明(中国PureBinding RNA免疫沉淀试剂盒，#P0101)进行了RIP实验。对于每个RIP反应，收集 细胞并用PBS洗涤。然后将沉淀重悬于含有蛋白酶抑制剂和核糖核酸酶(RNase)抑制剂的缓冲液中。所得细胞裂解物分为三组(输入组、免疫沉淀组和免疫球蛋白G(IgG)对照组)。磁珠蛋白A/G分别与 的YTHDC1抗体和IgG抗体在 孵育 。随后，将YTHDC1抗体和IgG抗体偶联物分别与免疫沉淀组和IgG组的细胞裂解物在 孵育 。最后，根据制造商的方案提取与蛋白质结合的RNA。通过RT-qPCR分析确定与蛋白质结合的RNA的相对丰度。
4.14 | RNA下拉实验
按照制造商的说明，使用商业试剂盒(中国擎科，DLI201)进行RNA下拉实验。生物素标记的RNA探针(WNT5A mRNA或阴性对照)折叠成二级结构。链霉亲和素磁珠洗涤后，与折叠后的探针混合，在室温下孵育，并重悬于结合缓冲液中。细胞在含有蛋白酶和RNase抑制剂的下拉缓冲液中裂解，在冰上超声处理，然后离心。一部分上清液留作输入。其余上清液与探针偶联磁珠、增强剂和额外的下拉缓冲液混合，然后旋转孵育。捕获磁珠并洗涤三次。在 用洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质用于蛋白质印迹分析。
4.15 | 放线菌素D处理
放线菌素D(美国MedChemExpress，#HY-17559)溶解于DMSO中，在 制备储备溶液。然后用工作浓度为 (从储备液1:1000稀释)的放线菌素D处理FB细胞以抑制mRNA转录。在处理后0、4和6小时收获细胞。提取总RNA并进行RT-qPCR分析。
4.16 | 空间转录组学制备与测序
4.16.1 | 样本制备
空间转录组学数据由上海生物科技有限公司(中国上海SHBIO)提供。使用10x Genomics Visium CytAssist平台进行空间转录组分析。我们从阴性对照(NC)组和热处理 组的小鼠中收集皮肤组织样本，然后进行福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)。
将组织小心地安装到Visium CytAssist基因表达载玻片上，并进行一系列程序，包括脱蜡、染色、成像、交联和探针杂交，目的是捕获空间分辨的mRNA转录本。随后，将Visium CytAssist基因表达芯片插入Visium CytAssist仪器中进行明场成像。在仪器内进行分析物转移，从而精确捕获来自FFPE组织的转录组信息。使用Space Ranger管道(v.2.1.1)处理原始测序数据。
4.16.2 | 数据质量控制与处理
对于空间测序数据，原始UMI计数斑点矩阵、图像和斑点-图像坐标被导入到R(版本4.3.0)中。通过R包Seurat(版本4.9.9)将表达谱、样本信息(元数据)和H&E染色图像(仅空间数据)整合到一个Seurat对象中。过滤掉斑点矩阵，只保留覆盖组织切片的斑点。使用正则化负二项回归(SC变换)对原始UMI计数进行归一化。在识别出2000个最具变异性的基因(FindVariableFeatures)后，使用主成分分析(PCA)和t分布随机邻域嵌入(t-SNE)进行降维。基于 值 和log2倍变化(绝对值在前5%)筛选出显著差异表达基因(DEG)。使用火山图对DEG进行可视化，并使用GO和KEGG富集分析对其功能注释和解释。
4.17 | RNA与单细胞转录组测序
4.17.1 | 数据集收集
本研究中使用的公共数据集是从GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下载的。选择了黄褐斑RNA高通量测序(GSE72140)和人类皮肤高通量单细胞数据(GSE150672)各一个数据集作为验证集(表S5)。数据在Linux系统(Ubuntu，版本20.04)上通过R(版本4.3.0)进行处理。
4.17.2 | 数据集处理与富集分析
使用limma包(3.46.0)分析GSE72140数据集中黄褐斑组和正常组之间的差异表达基因(DEG)，并根据 值 和logFC选择具有统计学意义的DEG。使用火山图展示DEG，并使用小提琴图展示两组之间WNT5A和黑素生成相关调控基因的表达。根据logFC的绝对值对差异表达基因进行排序，选择 值 时前300个显著上调的基因进行GO和KEGG富集分析。随后，根据每个样本中TYR的平均表达水平，将黄褐斑样本分为TYR高表达组和低表达组。分析两组之间的DEG，并对上调的DEG进行GO和KEGG富集分析。使用高通量单细胞表达谱数据(GSE150672)分析人皮肤中不同细胞类型之间WNT5A和FZD10的表达。使用ggplot2包对结果进行可视化。
4.18 | 统计分析
每个实验均进行了三次或更多次独立生物学重复。在进行统计分析之前，对所有数据进行了正态分布检验。对于仅涉及两组的比较，使用双侧不成对学生t检验确定统计学显著性。对于涉及三组或更多组的比较，进行单向方差分析(ANOVA)，随后进行Tukey事后检验以进行多个成对比较。在所有情况下， 值 被认为具有统计学显著性。具体的p值和F值在图中或其各自的图例中注明(例如， ，*p < 0.001)。图表使用GraphPad Prism 10.1.2(美国GraphPad软件公司)生成。
作者贡献
文雅清:概念化、方法学、撰写原始草案、形式分析、可视化、调查。朱建建:调查。黄江峰:软件。李雷:监督。张兰:调查、方法学。周舒:数据管理。唐震:调查。付楚涵:项目管理。曾青海:资金获取、撰写评审与编辑、概念化。万媛媛:概念化、方法学、可视化、撰写原始草案、形式分析、调查。张可一:验证。姜玲:项目管理。陈静:撰写评审与编辑、资源。张玉山:方法学、形式分析、可视化、概念化、撰写评审与编辑、调查。
致谢
本研究得到湖南省高层次卫生人才(20240304082)、湖南省卫生健康委科研项目(20256824)、湖南省自然科学基金(2024JJ7010)、中南大学中央高校基本科研业务费(编号:2026ZZTS0102)的支持。
资金资助
湖南省高层次卫生人才(20240304082)；湖南省卫生健康委科研项目(20256824)；湖南省自然科学基金(2024JJ7010)；中南大学中央高校基本科研业务费(编号:2026ZZTS0102)。
利益冲突
作者声明无利益冲突。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可在合理要求下从通讯作者处获取。
参考文献
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