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YTHDF3通过促进TBX19表达增强骨质疏松症中骨髓间充质干细胞的成骨分化

发布时间：

2026-08-14 21:47

YTHDF3通过促进TBX19表达增强骨质疏松症中骨髓间充质干细胞的成骨分化

陶千科谯楠杨恒鹏白隆钱伟 D | 肖金刚 D

西南医科大学附属医院整形烧伤外科，中国泸州 2西南医科大学附属口腔医院口腔颌面重建与再生泸州市重点实验室，中国泸州 I 西南医科大学附属医院口腔颌面外科，中国泸州 I 乐山市人民医院口腔科，中国乐山 I 西南医科大学附属口腔医院口腔种植科，中国泸州 | 6西南医科大学附属口腔医院牙周黏膜病科，中国泸州

通信作者:谭丹 (tandan@swmu.edu.cn) | 肖金刚 (xiaojingang@swmu.edu.cn)

收稿日期:2025年12月23日 | 修回日期:2026年4月23日 | 录用日期:2026年5月20日

摘要

-甲基腺苷修饰在调节骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化中起关键作用，然而阅读器蛋白在骨质疏松症中的功能贡献仍不清楚。在本研究中，我们发现大鼠骨质疏松症与严重的骨质流失和BMSCs成骨潜能降低相关，同时伴随着阅读器YTHDF3的下调。功能分析表明，YTHDF3促进BMSCs的成骨分化。RNA测序分析确定转录因子TBX19是YTHDF3的关键下游介质。随后的研究证实，Tbx19基因敲低不仅减弱了BMSCs的成骨能力，还消除了Ythdf3过表达的促成骨作用。此外，体内实验表明，Ythdf3过表达增强了骨质疏松症BMSCs的骨形成能力。总的来说，我们的结果表明，YTHDF3主要通过调节TBX19作为BMSC成骨的正调节因子，其下调导致骨质疏松症的发病机制。这些发现提出YTHDF3作为治疗骨质疏松症的新型潜在治疗靶点。

1 | 引言

骨稳态的维持是一个微妙的动态平衡过程，依赖于骨形成和骨吸收的协同运作[1]。这一过程的失衡是骨质疏松症(OP)等代谢性骨病的主要病理基础，其特征是骨量减少、骨微结构恶化和骨脆性增加[2, 3]。骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为成骨细胞的主要前体细胞，通过其成骨分化在骨形成和修复中起关键作用

这是一篇根据知识共享署名许可协议的开放获取文章

然而，在骨质疏松症条件下，特别是在绝经后骨质疏松症(PMOP)中，BMSCs的成骨分化潜能显著受损。这伴随着分化为脂肪细胞的趋势增强，导致骨量减少和骨髓脂肪组织积累，这已成为OP的核心病理机制之一[7, 8]。

骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分化命运受到多种信号通路和转录因子的精确调控。关键转录因子如RUNX2和osterix(Sp7)在成骨分化过程中起关键作用[9,10]。此外，骨形态发生蛋白(BMPs)，特别是BMP2，与Wnt/ -连环蛋白信号通路一起，已被确认为调节BMSCs成骨分化的经典通路[11-13]。近年来，越来越多的物质，包括单味中药成分、化合物和囊泡，已被证明可促进BMSCs的成骨分化[14-16]。尽管这些物质在促进骨形成方面得到广泛认可，但调节BMSCs成骨分化的机制仍不清楚。阐明这一复杂的调控网络对于开发针对骨质疏松症(OP)等骨疾病的新型治疗策略至关重要。

这是一篇根据知识共享署名许可协议条款发布的开放获取文章，允许在任何媒介中使用、分发和复制，前提是正确引用原始作品。

近年来，RNA表观遗传修饰，特别是N6-甲基腺苷，在基因表达调控中的作用越来越受到关注。作为真核生物mRNA中最普遍的内部化学修饰，由写入器、擦除器和读取器动态调节，它们共同调节RNA的稳定性、剪接体、定位和翻译效率[17,18]。尽管已广泛涉及包括BMSCs的分化和增殖在内的各种生物学过程，但其在BMSCs成骨分化中的精确作用和潜在机制仍有待充分阐明[19-21]。

YTHDF3是一种关键的读取蛋白，已被证明在各种生物学过程和疾病中通过识别修饰来调节靶基因的命运[22-24]。值得注意的是，其在骨代谢中的作用越来越多地被发现。对强直性脊柱炎(AS)的研究表明，AS患者BMSCs中YTHDF3表达显著上调。它通过识别IL32 mRNA上的修饰位点并增强其稳定性，促进BMSCs的成骨分化和病理性骨化[25]。然而，在OP的背景下，YTHDF3在BMSCs中的具体表达谱和功能作用及其下游效应分子仍有待明确阐明。

本研究旨在探讨YTHDF3在OP病理微环境中对BMSCs成骨分化的调控作用及其潜在机制。我们观察到骨质疏松条件下来源的BMSCs中YTHDF3表达下调。随后，通过慢病毒介导过表达和siRNA介导敲低方法，我们证明YTHDF3是促进BMSCs成骨分化的关键调节因子。转录组测序分析表明，TBX19可能是YTHDF3的关键下游效应分子，这一假设通过涉及siRNA介导敲低Tbx19的拯救实验得到进一步验证。此外，在骨质疏松条件下使用大鼠颅骨缺损模型的体内研究证实了YTHDF3在骨质疏松微环境中强大的促骨生成功能。这些发现验证了YTHDF3-TBX19轴在BMSCs成骨中的调控功能，这不仅揭示了修饰在OP中的新作用，也为基于YTHDF3的OP治疗提供了潜在的治疗靶点。

2 | 材料与方法

2.1 | 动物模型

本研究获得西南医科大学伦理委员会批准(伦理编号:20230703 - 016)，并严格按照中国科学技术部颁布的《实验动物管理和使用指南》(2011年)进行。从西南医科大学采购了40只8周龄的雌性斯普拉格 - 道利(SD)大鼠。最初通过吸入异氟醚诱导麻醉，随后通过腹腔注射2%戊巴比妥钠维持麻醉，剂量为。为建立骨质疏松模型，对SD大鼠进行双侧卵巢切除术(OVX)。假手术对照组进行相同的手术操作，但不切除卵巢。卵巢切除术后三个月，从OVX组和假手术对照组采集股骨样本。使用SCANCO Medical系统对这些样本进行微计算机断层扫描(micro - CT)。脱钙后，通过苏木精和伊红(H&E)染色和Masson三色染色对骨标本进行组织学分析[26]。

2.2 | 微计算机断层扫描分析和骨组织切片染色

使用SCANCO μCT 50扫描仪(SCANCO Medical AG)对股骨样本进行扫描，并分析距生长板处范围内的小梁骨数据。此外，具有临界尺寸缺损的颅骨标本也在相同扫描参数下使用相同的系统进行扫描。以缺损部位为中心定义一个圆柱形感兴趣体积(VOI)，用于定量分析新骨形成[27, 28]。股骨和颅骨样本脱钙4周，脱水，然后嵌入石蜡，切成3μm厚的切片。这些切片用于H&E染色和Masson三色染色，以评估组织形态和结构。此外，使用相应抗体对切片进行免疫组织化学分析，以评估不同组大鼠骨组织中特定蛋白质的表达水平。

2.3 | 骨髓间充质干细胞的分离与鉴定

采用全骨髓贴壁法从SD大鼠中分离骨髓间充质干细胞。通过颈椎脱臼法对大鼠实施安乐死，无菌切除双侧股骨/胫骨。用PBS冲洗骨髓腔，通过滤网过滤并离心(1000 rpm，5分钟)。将沉淀重悬于补充有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的 - MEM中，以个细胞/mL接种到T75培养瓶中，并在条件下培养。在时通过更换培养基去除未贴壁细胞，随后每3天更换一次培养基，直至细胞达到80% - 90%汇合度(7 - 10天)。对贴壁细胞进行胰蛋白酶消化(0.25%胰蛋白酶 - EDTA，1分钟)并以1:3的比例传代；使用P3 - P5代细胞进行鉴定。鉴定包括:(1)形态:均一的纺锤形细胞；(2)流式细胞术:CD90/CD29/CD44阳性率> 95%，CD45/CD34/CD31阴性率<5%；(3)三系分化:成骨(茜素红S染色，ARS)、成脂(油红O染色，ORO)和成软骨(阿尔辛蓝染色，AB)[29]。

2.4 | 成骨分化

使用成骨诱导培养基(Pricella)对P3代骨髓间充质干细胞进行成骨分化诱导培养。然后每3天更换一次成骨诱导培养基。诱导5天后，进行碱性磷酸酶染色(ALP)，并提取RNA和蛋白质用于后续实验。诱导21天后，进行茜素红S染色(ARS)。

2.5 | 碱性磷酸酶和茜素红S染色

将第三代骨髓间充质干细胞接种于12孔板中培养，直至细胞汇合度达到。然后，用成骨诱导培养基(Pricella)处理。在成骨诱导的第3天和第5天，使用碱性磷酸酶检测试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司)检测碱性磷酸酶活性。在成骨诱导的第21天，使用茜素红染色液(赛业生物科技集团)对钙结节进行染色。

2.6 | RNA 斑点印迹分析

为研究总体mRNA 水平，进行了斑点印迹分析。使用TRIzol试剂(安必昂)从细胞中提取总RNA，并将每个实验组的RNA浓度调整一致。取的总RNA样品在变性。随后，将变性样品迅速转移至硝酸纤维素膜上，并在紫外灯下交联。用PBS缓冲液洗涤膜后，用脱脂牛奶封闭。然后将膜在与抗体溶液孵育过夜。次日，用PBS洗涤后，将山羊抗兔IgG-HRP抗体在室温下孵育，随后再次用PBS洗涤。使用Pierce ECL蛋白印迹底物(赛默飞世尔科技公司)对膜进行显影，并使用ImageJ软件对斑点样品信号进行定量分析。

2.7 | siRNA干扰和慢病毒转导

siRNA和阴性对照(NC)由欧易生物科技公司合成，相应序列列于表1。转染前，将骨髓间充质干细胞培养于无抗生素培养基中。然后根据制造商的方案，使用riboFECT CP转染试剂盒进行转染，应用 siRNA ，之后更换为新鲜培养基。转染后进行后续实验。Ythdf3过表达(Ythdf3-OE)和对照(Ythdf3-NC)慢病毒由吉凯基因公司构建。首先进行梯度转染实验，在荧光显微镜下观察并记录细胞形态和荧光强度，以确定最佳感染复数(MOI)。随后使用选定的MOI进行转染实验。

2.8 | RNA分离和定量实时PCR(RT-qPCR)

根据制造商的方案，使用TRIzol试剂(赛默飞世尔科技公司)从培养的细胞中提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计(赛默飞世尔科技公司)测定每个样品的总RNA浓度。使用HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将等量的RNA逆转录为cDNA。在CFX Connect实时荧光定量PCR系统(伯乐生命医学产品有限公司)上使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行RT-qPCR。将mRNA表达水平标准化为内参基因Gapdh，并使用方法计算相对mRNA表达水平。引物序列详见表1。RT-qPCR反应程序包括在初始变性，随后进行40个循环的扩增。

2.9 | 蛋白质提取和蛋白质印迹分析

收集样品后，向RIPA裂解液(碧云天)中加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的细胞裂解缓冲液(碧云天)。使用超声破碎仪(30%振幅，5秒，共5次)裂解样品，然后在冰上额外裂解。在条件下离心，收集上清液。使用BCA蛋白定量试剂盒(碧云天)测定蛋白质浓度，并在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)样品缓冲液中于条件下将蛋白质变性。通过SDS-PAGE分离等量蛋白质，并转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用快速封闭缓冲液(碧云天)封闭膜后，在条件下与一抗在温和搅拌下孵育过夜。在室温下与二抗孵育1小时后，使用SuperPico ECL化学发光试剂试剂盒(翌圣生物)显影蛋白条带，并使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)分析信号强度。相关抗体信息列于表2。

2.10 | RNA测序

Ythdf3-NC组和Ythdf3-OE组的骨髓间充质干细胞(BMSCs)在RNA提取前进行5天的成骨诱导。按照制造商的方案，使用TRIzol试剂从BMSCs中分离总RNA。在进行质量控制后，由上海

美吉生物医药科技有限公司(中国上海)进行RNA纯化、逆转录、文库构建和测序。使用Illumina Stranded mRNA Prep、Ligation Kit(加利福尼亚州圣地亚哥)以的总RNA作为输入制备链特异性mRNA测序文库。在NovaSeq X Plus平台(PE150)上使用NovaSeq试剂试剂盒进行测序。使用DESeq2进行差异表达分析。将满足和的基因定义为显著差异表达基因。

表1 | qPCR引物序列和siRNA序列。

基因	引物序列5’-3’
甘油醛-3-磷酸脱氢酶正向引物	GCAAGTTCAACGGCACAG
甘油醛-3-磷酸脱氢酶反向引物	GCCAGTAGACTCCACGACA
Runx2正向引物	GAACCAAGAAGGCACAGAC
Runx2反向引物	AATGCGCCCTAAATCACTG
骨桥蛋白正向引物	ACAGTATCCCGATGCCACAG
骨桥蛋白反向引物	TGACTCATGGCTGGTCTTCC
Ythdf3正向引物	CCTCACCAAGTGCAGTCTCA
Ythdf3反向引物	CAGCACTGGATGCACCTCTA
Tbx19正向引物	GGAGGGAGAAGGGAGATCCTAC
Tbx19反向引物	GACGAAGTCCAACAGAAGGG
Tbx19-465&500正向引物	GGGACTGGACCCTAATGCTA
Tbx19-465&500反向引物	ACCCATTCCCCGTTGACATAC
Tbx19-773正向引物	AGAATGGCAGGCGGATGTT
Tbx19-773反向引物	CAACAGAAGGGAGTACATAGCA
Tbx19-1201正向引物	TTTGCGAGTGTATCTGTCCCC
Tbx19-1201反向引物	AATACCAGGGGGCTATGGGCA
Ythdf3小干扰RNA正义链	GGACGUGUGUUUAUAAUUAAGTT
Ythdf3小干扰RNA反义链	CUUAAUUAUAAACACACGUCCTT
Tbx19小干扰RNA正义链	GAUUCAAGGAAGUCACUAATT
Tbx19小干扰RNA反义链	UUAGUGACUUCCUUGAAUCTT
阴性对照小干扰RNA正义链	UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
阴性对照小干扰RNA反义链	ACGUGACACGUUCGGAGAATT

2.11 | RNA免疫沉淀和qPCR(RIP-qPCR)

使用Magna RIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒(美国密理博公司)按照制造商说明进行RNA免疫沉淀(RIP)分析。简要地说，裂解骨髓间充质干细胞(BMSCs)，将澄清的细胞裂解物与偶联有抗YTHDF3抗体(Abcam；稀释度1:50)或正常兔IgG(作为阴性对照)的磁珠一起孵育。经过大量洗涤后，从免疫沉淀复合物中提取RNA，逆转录成cDNA，并进行定量PCR(qPCR)以检测Tbx19 mRNA。

2.12 | A MeRIP-qPCR分析

修饰的RNA片段使用EpiQuik CUT&RUN RNA富集试剂盒(Epigentek)按照制造商方案进行富集。简要地说，提取总RNA并进行片段化，然后与抗抗体(Synaptic Systems；稀释度1:100)以及蛋白A/G磁珠一起孵育。正常IgG用作免疫沉淀的阴性对照。经过严格洗涤后，洗脱、纯化结合的RNA，逆转录成cDNA并通过定量PCR(qPCR)进行分析。使用SRAMP在线工具(http://www.cuilab.cn/sramp)预测Tbx19 mRNA内的假定修饰位点，位点特异性引物列于表1。

2.13 | RNA稳定性分析

通过用放线菌素D(ActD，5μg/mL)处理Ythdf3-NC和Ythdf3-OE细胞以阻断从头转录来评估RNA稳定性。在添加ActD后的0、2、4、6和小时分离总RNA。通过定量实时PCR(qPCR)确定Tbx19 mRNA的降解动力学，并使用相对mRNA水平评估YTHDF3过表达对Tbx19转录本稳定性的影响。

2.14 | 将接种骨髓间充质干细胞的双相磷酸钙(BCP)植入骨质疏松大鼠双侧颅骨缺损处

为了研究YTHDF3在骨质疏松条件下骨缺损修复中的调节作用，我们采用了颅骨临界尺寸缺损模型，因为这种方法已经得到了充分验证。

表2 | 本研究中使用的抗体。

抗体	公司	应用	稀释倍数
抗体	突触系统公司	斑点印迹法	1:1000
RUNX2	艾博抗(英国)有限公司	蛋白质免疫印迹法；免疫荧光法	1:1000; 1:200
骨桥蛋白	爱博迈生物科技有限公司	蛋白质免疫印迹法；免疫荧光法	1:1000; 1:200
YTHDF3	艾博抗(英国)有限公司	蛋白质免疫印迹法；免疫组化法；免疫荧光法	1:1000; 1:200; 1:200
TBX19	领潮生物科技有限公司	蛋白质免疫印迹法	1:1000
甘油醛-3-磷酸脱氢酶	Proteintech(武汉三泽生物技术有限公司)	蛋白质免疫印迹法	1:4000

图1 | 骨质疏松症中骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的降低。(A) 股骨小梁骨的代表性显微CT图像。(B) 小梁骨参数的统计分析。(C, D) 股骨的H&E和Masson染色代表性图像。(E, F) 成骨相关基因Runx2和Spp1的mRNA和蛋白表达水平的RT-qPCR和Western blot分析。使用Gapdh进行标准化。(G) ALP染色(第7天)和ARS染色(第21天)的代表性图像。用于比较两组之间成骨分化的早期(ALP活性)和晚期(矿化)阶段。所有数据均表示为来自三个独立实验的平均值。

图2 | 在骨质疏松条件下，股骨和骨髓间充质干细胞中YTHDF3表达下调。(A) CON组和OP组大鼠股骨中YTHDF3表达的代表性免疫组织化学图像。标尺。(B) CON-BMSCs和OP-BMSCs中水平的斑点印迹分析。(C, D) 使用GAPDH进行标准化，通过RT-qPCR和Western blot分析Ythdf3的转录和蛋白表达。(E) CON组和OP组骨髓间充质干细胞中YTHDF3的代表性免疫荧光图像。标尺。所有数据均表示为来自三个独立实验的平均值。

图3 | 下页图例。

图3 | Ythdf3过表达增强骨髓间充质干细胞的成骨潜能。(A) 通过RT-qPCR测量Ythdf3、Runx2和Spp1的mRNA水平，并使用Gapdh进行标准化。(B, C) 使用GAPDH作为内参，通过Western blot评估YTHDF3、RUNX2和OPN的蛋白水平。(D) NC组和Ythdf3-OE组骨髓间充质干细胞中RUNX2和OPN的代表性免疫荧光图像。标尺。(E) ALP染色(第7天)和ARS染色(第21天)的代表性图像。所有数据均表示为来自为评估体内骨再生而建立的三个独立实验的平均值 SD [30, 31]。Ythdf3-OE组和Ythdf3-NC组(每组个细胞)在24孔板中与BCP支架共培养3天，以使细胞粘附和增殖。麻醉后，将OP大鼠固定为俯卧位，然后进行皮肤准备和颅骨区域消毒。在无菌条件下使用环钻创建双侧5毫米临界大小的颅骨缺损。将接种细胞的BCP支架植入缺损处，左侧接受NC组支架，右侧接受Ythdf3-OE组支架。随后，在植入后8周和12周，我们收集颅骨标本进行后续实验，如显微CT扫描和H&E染色[32]。

2.15 | 定量与统计分析

使用GraphPad Prism(版本9.1.1，GraphPad软件)进行统计分析。使用Shapiro-Wilk正态性检验确定数据的分布特征。呈正态分布的数据以均值标准差表示。两组之间的比较采用未配对或配对双尾Student’s 检验，而多组之间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)，随后进行Tukey多重比较检验。非正态分布的数据以中位数和四分位间距表示，并使用Mann-Whitney 检验或Kruskal-Wallis检验进行分析。被认为具有统计学意义。具体的生物学重复次数和统计分析细节在图注中提供。

3 | 结果

3.1 | 骨质疏松症大鼠的骨髓间充质干细胞存在骨丢失和成骨分化能力受损

通过双侧卵巢切除建立骨质疏松症大鼠模型。术后3个月对股骨进行Micro-CT分析显示，与假手术组相比，去卵巢组的骨小梁体积分数(Tb.BV/TV)和骨小梁数量(Tb.N)显著降低，同时骨小梁间距(Tb.Sp)增加，证实骨质疏松症模型建立成功(图1A、B)。随后对股骨进行组织学检查(苏木精-伊红染色和Masson染色)同样验证了骨质疏松症大鼠以骨丢失为特征的骨质疏松表型(图1C、D)。

采用全骨髓贴壁法从股骨骨髓中分离培养原代骨髓间充质干细胞。在显微镜下观察，原代骨髓间充质干细胞呈贴壁生长，形态为纺锤形、饱满且分布均匀(图S1A)。流式细胞术分析证实间充质标志物(CD29、CD44和CD90)呈阳性表达，造血谱系标志物(CD34、CD45)和内皮细胞标志物(CD31)呈阴性表达，表明其来源于间充质(图S1B)。体外茜素红染色、油红O染色和碱性磷酸酶染色分化试验证实了其三系分化潜能(图S1C)。

我们分别在成骨诱导培养基中培养对照组骨髓间充质干细胞(CON-BMSCs)和骨质疏松症组骨髓间充质干细胞(OP-BMSCs)，以评估它们成骨能力的差异。成骨诱导后，提取RNA和蛋白质进行检测。发现OP-BMSCs中成骨相关基因Runx2和Spp1的转录水平和蛋白质水平均降低(图1E、F)。碱性磷酸酶染色显示OP-BMSCs中碱性磷酸酶的活性显著降低。茜素红染色结果表明两组均形成了矿化结节，但OP-BMSCs形成的结节数量明显低于CON-BMSCs(图1G)。这些结果证实OP-BMSCs的成骨分化能力受损，这被认为是骨质疏松症大鼠骨丢失的重要原因之一。

3.2 | 在骨质疏松症条件下YTHDF3表达受到抑制

为了研究YTHDF3在骨髓间充质干细胞成骨分化和骨质疏松症发病机制中的作用，我们通过免疫组织化学评估了股骨中YTHDF3的表达。结果显示骨质疏松症大鼠骨髓中YTHDF3表达显著降低(图2A)。斑点印迹分析显示OP-BMSCs中甲基化水平整体降低(图2B)。此外，发现这些细胞中YTHDF3的转录水平和蛋白质水平均显著降低(图2C、D)。这些发现表明YTHDF3可能与骨质疏松症的发病机制有关。

3.3 | YTHDF3促进骨髓间充质干细胞的成骨分化

为了确定YTHDF3在骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用，我们在骨髓间充质干细胞中进行了功能丧失和功能获得实验。通过用Ythdf3过表达慢病毒感染骨髓间充质干细胞实现Ythdf3的过表达。转染72小时后，将培养基换成成骨诱导培养基培养5天。随后的qRT-PCR和蛋白质印迹分析证实YTHDF3在mRNA和蛋白质水平均上调。同时，成骨的mRNA和蛋白质水平

图4 | 下一页的图例。

图4 | Ythdf3基因敲低削弱了骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨潜能。(A) 通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)进行标准化，测量Ythdf3、Runx2和Spp1的mRNA水平。(B、C) 使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，通过蛋白质免疫印迹法评估YTHDF3、RUNX2和骨桥蛋白(OPN)的蛋白质水平。(D) 来自阴性对照(NC)组和Ythdf3过表达(Ythdf3-OE)组的BMSCs中RUNX2和OPN的代表性免疫荧光图像。标尺。(E) 碱性磷酸酶(ALP)染色(第7天)和茜素红染色(ARS，第21天)的代表性图像。所有数据均表示为来自三个独立实验的平均值标准差。与对照组相比，Runx2和Spp1等成骨标志物基因也显著增加(图3A - C)。免疫荧光染色进一步证实了Ythdf3过表达后RUNX2和OPN的上调(图3D)。分别在成骨诱导7天和21天后对BMSCs进行ALP和ARS染色。Ythdf3过表达组表现出增强的ALP活性和更多的矿化结节(图3E)。总之，这些发现表明Ythdf3过表达显著促进了BMSCs的成骨潜能。

通过用小干扰RNA(Ythdf3 - siRNA)转染细胞来敲低Ythdf3。在成骨诱导5天后，RT-qPCR和蛋白质免疫印迹分析一致表明，沉默Ythdf3显著下调了关键成骨标志物基因Runx2和Spp1的转录和翻译表达水平(图4A - C)。Ythdf3基因敲低后RUNX2和OPN表达的抑制通过免疫荧光染色进一步得到证实(图4D)。与成骨标志物的下调一致，Ythdf3基因敲低在功能上损害了BMSCs的成骨分化，表现为ALP活性降低和基质矿化减少(图4E)。总之，敲低Ythdf3会减弱BMSCs的成骨潜能。

在BMSCs中进行的功能丧失和功能获得研究均表明，YTHDF3在促进BMSCs的成骨分化中起关键作用。

3.4 | RNA测序表明Tbx19可能是Ythdf3的关键下游效应因子

虽然先前的研究已经确立了YTHDF3在BMSCs中的促骨生成作用，但其精确的分子机制仍未完全了解。为了阐明这些机制，我们对Ythdf3过表达(Ythdf3-OE)组和阴性对照(Ythdf3-NC)组进行了RNA测序。生物信息学分析鉴定出469个显著上调和205个显著下调的基因，Circos热图直观地证实了Ythdf3过表达诱导的明显转录组差异(图5A、B)。对这些差异表达基因(DEGs)的基因本体(GO)注释分析表明，Ythdf3过表达广泛调节多种细胞过程，包括代谢、免疫反应和转录因子活性(图5C)。在这些差异表达基因中，Tbx19是变化最显著的基因之一。为了确定Tbx19在BMSCs成骨分化中的作用，我们使用靶向Tbx19的小干扰RNA(Tbx19 - siRNA)抑制Tbx19的表达。功能验证表明，敲低Tbx19显著抑制了关键成骨标志物Runx2和Spp1的转录和翻译表达(图5D - F)。总之，这些发现表明Tbx19可能在Ythdf3介导的成骨分化途径中作为关键的下游效应因子发挥作用。基于上述结果，我们推测Tbx19可能在BMSCs的YTHDF3介导的成骨分化途径中作为关键的下游效应因子发挥作用。

3.5 | 敲低Tbx19抑制BMSCs的成骨分化潜能并逆转YTHDF3的促骨生成作用

为验证YTHDF3的促成骨功能是否通过增强Tbx19表达来介导，我们在过表达Ythdf3的骨髓间充质干细胞(BMSCs)中敲低Tbx19(Ythdf3 - OE + Tbx19 - siRNA)。与我们之前的研究结果一致，qPCR和蛋白质免疫印迹分析表明，Ythdf3的过表达显著提高了Runx2和Spp1的转录和翻译水平。并且可以观察到，Ythdf3的过表达显著促进了Tbx19的表达，这与我们的RNA测序分析结果一致。有趣的是，在敲低Tbx19后，这些促成骨作用明显减弱(图6A - C)。同样，通过碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色(ARS)评估，Ythdf3过表达对ALP活性和基质矿化的促进作用在敲低Tbx19后被有效逆转(图6D)。综上所述，这些数据表明YTHDF3通过调节其下游效应因子TBX19促进BMSCs的成骨分化。

3.6 | YTHDF3识别Tbx19 mRNA编码序列(CDS)中的 A修饰以调节其稳定性和表达

为阐明YTHDF3与Tbx19之间相互作用的分子机制，我们首先使用RNA免疫沉淀结合定量PCR(RIP - qPCR)验证了它们的物理结合。在YTHDF3免疫沉淀复合物中检测到Tbx19 mRNA显著富集(图7A)，证实了直接的分子相互作用。我们进一步研究YTHDF3是否影响Tbx19 mRNA的稳定性。在用放线菌素D( )进行转录抑制后，qPCR分析显示，YTHDF3的过表达在多个时间点显著抑制了Tbx19 mRNA的降解(图7B)，表明YTHDF3通过抑制Tbx19转录本的衰变来稳定它们。

为确定Tbx19 mRNA内潜在的调控位点，我们使用SRAMP网络服务器(http://www.cuilab.cn/sramp)进行了计算机预测。该分析在核苷酸位置465、500、773和1201处揭示了四个高可信度的修饰位点(图7C，D)。随后通过甲基化RNA免疫沉淀结合定量PCR(MeRIP - qPCR)验证发现，与对照组相比，Ythdf3过表达(Ythdf3 - OE)显著

图5 | RNA测序确定TBX19是YTHDF3的关键下游效应因子。(A)比较Ythdf3 - OE和Ythdf3 - NC之间RNA表达的MA图。(B)显示Ythdf3 - OE和Ythdf3 - NC中差异表达基因层次聚类的圆形热图。(C)差异表达基因的基因本体(GO)富集分析，分为生物过程、细胞成分和分子功能。(D)通过RT - qPCR测量Tbx19、Runx2和Spp1的mRNA水平，并以Gapdh进行标准化。(E，F)使用GAPDH作为内参，通过蛋白质免疫印迹评估TBX19、RUNX2和骨桥蛋白(OPN)的蛋白质水平。所有数据均表示为来自三个独立实验的均值标准差。

增加了Tbx19 mRNA的甲基化水平，特别是在包含位置465 - 500和1201的核苷酸区域内(图7E)。这些发现表明YTHDF3可能通过以修饰依赖的方式调节其转录本的稳定性来增强Tbx19的表达。

3.7 | Ythdf3的过表达增强了体内OP - BMSCs的成骨能力

为验证YTHDF3在体内骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨过程中的调控作用，我们在骨质疏松(OP)大鼠中建立了双侧颅骨缺损模型(图S2A)。最初，通过荧光显微镜的后续观察证实OP - BMSCs在BCP支架内广泛定植(图S2B)。扫描电子显微镜(SEM)进一步显示OP - BMSCs大量附着于BCP表面(图S2C)。这些结果表明OP - BMSCs能够成功地在BCP表面定植并生长。在此之后，分别将负载对照OP - BMSCs或过表达Ythdf3的OP - BMSCs的BCP陶瓷植入左右颅骨缺损处。在植入后8周和12周收集样本并进行分析。

移植后12周，显微CT分析显示Ythdf3过表达组的骨体积分数(BV/TV)和骨小梁数量(Tb.N)显著增加，同时骨小梁间距(Tb.Sp)明显减小。虽然8周时的样本差异无统计学意义，但BV/TV和Tb.N也呈现上升趋势(图8A，B)。同样，苏木精 - 伊红(H&E)和Masson染色显示，与对照组相比，Ythdf3过表达组的新骨基质形成明显增加(图8C)。这些发现表明Ythdf3过表达增强了OP大鼠来源的BMSCs的成骨潜能，表明YTHDF3能够促进体内BMSCs的成骨分化。

4 | 讨论

骨质疏松症(OP)是一种全身性骨骼疾病，其特征是骨量减少和骨组织微结构恶化，导致骨脆性增加和骨折风险升高[33]。OP的病理生理基础主要涉及骨形成与吸收之间的失衡，根源在于BMSCs的成骨分化减少和脂肪生成倾向增强[34 - 36]。在此，我们揭示了YTHDF3在协调BMSCs成骨分化中的关键作用，并确定转录因子TBX19为YTHDF3潜在的下游效应因子。我们的发现不仅阐明了调控BMSCs命运决定的新型YTHDF3 - TBX19轴，还突出了基于干细胞干预OP的潜在治疗靶点。

是真核生物mRNA中最普遍的转录后修饰，在调节BMSCs分化中起关键作用[37 - 39]。斑点杂交分析显示，OP后BMSCs中的整体修饰呈下降趋势:与对照组相比，OP - BMSCs中的甲基化水平显著降低。这使我们推测提高水平可能增强OP - BMSCs成骨能力——这一观点得到先前研究[26, 40]的支持。现有研究主要集中在由甲基转移酶(如METTL3/METTL14复合物)和去甲基酶(如FTO和ALKBH5)介导的动态沉积和去除[41 - 至44]。然而，修饰最终由识别位点并决定靶mRNA命运、影响其剪接、核输出、稳定性、翻译效率和降解的特定阅读蛋白解码。例如，核阅读蛋白YTHDC1促进修饰转录本的输出；在细胞质中，YTHDF2和YTHDC2通常促进标记mRNA的降解，而YTHDF广泛报道在多种生物学背景下促进翻译[18, 45 - 47]。YTHDF3具有多方面功能:它不仅与YTHDF1和YTHDF2协同调节mRNA翻译和降解，还能独立发挥作用，其作用表现出显著的环境和疾病特异性。

近期研究表明，YTHDF3参与了从肿瘤发生、炎症到干细胞分化等一系列过程[23]。例如，它通过促进FOXO3 mRNA的翻译来调节自噬过程[48]，或者在动脉粥样硬化中，以依赖的方式稳定IL32 mRNA，从而促进异常骨生成[25]。然而，其在骨质疏松症中的精确作用和下游靶点仍不清楚。我们的研究表明，YTHDF3在骨质疏松症骨髓间充质干细胞(OP-BMSCs)中显著下调。功能实验证实，敲低Ythdf3会抑制成骨作用，而其过表达则增强分化，表明它是骨髓间充质干细胞成骨的关键正向调节因子。通过RNA测序分析，我们进一步确定转录因子TBX19是YTHDF3的下游效应因子。

已发现T-box转录因子家族的多个成员与肢体发育和骨形成有关[49-52]。TBX19是T-box转录因子家族的成员之一，因其在垂体发育和细胞命运决定中的关键作用而闻名[53, 54]。我们观察到，Ythdf3过表达后TBX19显著上调，而敲低Tbx19则明显损害成骨分化。值得注意的是，敲低Tbx19消除了Ythdf3过表达的促骨生成作用，表明TBX19是YTHDF3下游的重要效应因子。此外，我们通过RIP-qPCR、RNA稳定性测定和MeRIP-qPCR证明，YTHDF3以依赖的方式增强Tbx19 mRNA的稳定性，从而上调Tbx19的表达。

图 6 | YTHDF3 介导的骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化依赖于 TBX19 的表达。(A) 通过逆转录定量聚合酶链反应(RT - qPCR)检测 Ythdf3、Tbx19、Runx2 和 Spp1 的 mRNA 水平，以 Gapdh 作为内参进行归一化。(B, C) 通过蛋白质印迹法(Western blot)评估 YTHDF3、TBX19、RUNX2 和骨桥蛋白(OPN)的蛋白水平，以 GAPDH 作为上样对照。(D) 碱性磷酸酶(ALP)染色(第 7 天)和茜素红染色(ARS，第 21 天)的代表性图像。所有数据均以均值表示，来自三个独立实验；与 thdf3 - NC 样本相比；# ，与 Ythdf3 - OE + Tbx19 - NC 相比；ns，无显著性差异。

图7 | YTHDF3以 A依赖的方式结合并稳定Tbx19 mRNA。(A) RIP-qPCR分析显示，与IgG对照相比，YTHDF3免疫沉淀中Tbx19 mRNA显著富集。(B) 在Ythdf3-NC和Ythdf3-OE细胞中用放线菌素D处理后Tbx19 mRNA的衰减动力学；相对mRNA水平在8小时内相对于时间0进行标准化。(C) 通过SRAMP分析确定的Tbx19 mRNA上预测的修饰位点的示意图。(D) Tbx19 mRNA结构的示意图，表明在核苷酸位置处预测的m A修饰基序465、500、773和1201。(E) MeRIP-qPCR分析显示，与对照骨髓间充质干细胞(CON-BMSCs)相比，骨质疏松症骨髓间充质干细胞(OP-BMSCs)中Tbx19基因特定位点的m 修饰水平显著降低。所有数据均表示为来自三个独立实验的平均值标准差，ns，无显著性差异。

我们的研究首次确定了传统上与垂体发育相关的转录因子TBX19，它是YTHDF3在成骨分化过程中的关键下游效应因子。我们证明YTHDF3通过上调TBX19促进骨髓间充质干细胞(BMSC)成骨，从而揭示了TBX19在内分泌系统之外以前未被认识的作用。至关重要的是，过表达YTHDF3的骨质疏松症BMSC(OP-BMSC)在体内接种到BCP支架上时表现出强大的骨再生能力，突出了靶向YTHDF3-TBX19轴的治疗潜力。虽然慢病毒介导的过表达提供了一个强大的概念验证平台，但其临床转化受到安全性和监管问题的限制。因此，未来的努力应该

图8 | 下一页有图例说明。

图8 | YTHDF3在体内促进BMSC的成骨分化。(A)代表性的显微CT图像，显示BCP植入后8周和12周大鼠颅骨双侧颅骨缺损情况。(B)BCP植入双侧颅骨缺损后骨参数的统计分析。(C)H&E和Masson染色的代表性图像，显示BCP植入后的颅骨缺损情况。所有数据均表示为来自六个独立实验的平均值标准差，并使用配对双尾学生检验进行分析，ns表示无显著性差异。

专注于开发可临床转化的方法，如小分子激动剂、肽模拟物或先进的基于核酸的递送系统，以选择性增强BMSC中YTHDF3的活性[55, 56]。

尽管有这些进展，但TBX19调控BMSC命运的分子机制仍知之甚少，值得进一步研究。鉴于YTHDF3和TBX19在小鼠和人类之间具有高度的序列和结构保守性，我们推测这个调控轴可能也与人类骨质疏松症的发病机制有关。因此，在人类骨组织和来自骨质疏松症患者的hBMSC中进行直接验证是迈向临床相关性的关键下一步。

总之，我们的研究发现了一个以前未被认识的YTHDF3-TBX19调控轴，该轴对BMSC的成骨分化起关键调控作用。我们证明YTHDF3以依赖的方式增强Tbx19 mRNA的稳定性，从而上调TBX19的表达。升高的TBX19反过来驱动关键成骨主调节因子如RUNX2和OPN的转录激活，最终促进BMSC向成骨细胞谱系的分化。使用卵巢切除诱导的骨质疏松大鼠模型，我们进一步验证Ythdf3在病理性骨微环境中增强BMSC的成骨能力。总的来说，这些发现确立了YTHDF3-TBX19轴作为BMSC命运决定的关键因素，并揭示了一个阅读器-转录因子级联如何精确地协调细胞分化程序。重要的是，这项工作不仅扩展了我们对骨骼生物学中转录后调控的理解，还突出了YTHDF3-TBX19途径作为骨质疏松相关骨丢失和再生的一个有前景的治疗靶点。

作者贡献

陶千科进行了实验，开展了基于动物和细胞的检测，并起草和修订了手稿。叶巧楠协助进行动物和细胞实验并进行了手稿校对。杨成鹏、龙雪梅和谢玉平负责模型构建并协助进行动物实验。白龙、张志远和李钱伟进行了数据采集和分析，并参与了手稿的审阅和修订。谭丹和肖金刚为该研究提供了总体研究方向、资金支持和关键指导。所有作者都审阅并批准了最终手稿版本。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金(82370938)、四川省科学技术厅(2024NSFSC2087)、口腔疾病国家重点实验室开放课题(SKLOD2025OF05)、四川省卫生健康委员会科研项目(24WXXT11)、泸州市科技计划项目(2025MYF002, 2025MYF024)、西南医科大学口腔医学项目(2025KQZX02, 2025KQZX09)、西南医科大学附属口腔医院2025年度博士研究生科研启动基金(2025BS04)、西南医科大学附属口腔医院青年科学家科研提升计划(2023KQ04)、西南医科大学科研项目(2025JC113)以及四川省医学会青年创新项目(Q20250047)的资助。

资助

本研究得到了中国国家自然科学基金(82370938)、四川省科学技术厅(2024NSFSC2087)、口腔疾病国家重点实验室开放课题(SKLOD2025OF05)、四川省卫生健康委员会科研项目(24WXXT11)、泸州市科技计划项目(2025MYF002, 2025MYF024)、西南医科大学口腔医学项目(2025KQZX02, 2025KQZX09)、西南医科大学附属口腔医院博士研究生科研启动基金(2025BS04)、西南医科大学附属口腔医院青年科学家科研提升计划(2023KQ04)、西南医科大学科研项目(2025JC113)以及四川省医学会青年创新项目(Q20250047)的资助。

伦理声明

所进行的动物实验已获得西南医科大学实验动物中心的批准(20230703 - 016)。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可在合理请求下从通讯作者处获取。

参考文献

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m⁶A,YTHDF3,骨质疏松,TBX19,BMSCs,大鼠颅骨

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