依赖NAT10的N4-乙酰胞苷重塑R环并促进癌症干细胞生长
发布时间：
2026-08-16 21:08
依赖NAT10的N4-乙酰胞苷重塑R环并促进癌症干细胞生长
吴旭佳， 王东海， 苏切特·陶里， 吴伟驰， 德奥布拉特·迪克西特， 吕德冠， 史蒂文·J·马利特， 斯泰西·L·盖尔豪斯， 袁法恩， 张波， 黄腾飞， 袁怀瑞， 吴秋莲， 以及杰里米·N·里奇
希尔曼癌症中心，匹兹堡大学医学中心，美国宾夕法尼亚州匹兹堡
莱因伯格综合癌症中心，北卡罗来纳大学，美国北卡罗来纳州教堂山
神经病学系和赫伯特·欧文综合癌症中心，哥伦比亚大学，美国纽约州纽约市
药理学与化学生物学系，匹兹堡大学，美国宾夕法尼亚州匹兹堡
健康科学质谱核心实验室，匹兹堡大学，美国宾夕法尼亚州匹兹堡
神经病学系，匹兹堡大学，美国宾夕法尼亚州匹兹堡
神经病学系，北卡罗来纳大学，美国北卡罗来纳州教堂山
这些作者贡献相同
主要联系人
*通讯作者:wuxujia.sysu@gmail.com (吴旭佳)，drjeremyrich@gmail.com (杰里米·N·里奇)
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2026.117408
摘要
R环重塑动态调节染色质状态和基因表达；然而，癌症如何利用它来维持自我更新和恶性程度仍知之甚少。在这里，我们发现与分化后代和神经干细胞相比，胶质母细胞瘤(GBM)干细胞(GSCs)表现出高度活跃的R环。全基因组图谱显示，R环在GSCs的启动子近端区域有细胞特异性富集和空间积累，这与活跃转录和开放染色质相关。我们确定N-乙酰转移酶10(NAT10)是GSCs中一种高亲和力的R环结合蛋白，它在OLIG1下游过度表达。NAT10催化R环RNA链上广泛的 -乙酰胞苷(ac )沉积，稳定启动子相关的R环，并促进开放染色质通过包括EGR1在内的核心干性调节因子维持自我更新。NAT10敲低抑制了GSC在体外的增殖和维持，并减弱了体内肿瘤生长。使用remodelin对NAT10/ac C修饰的R环进行药理学抑制，模拟了NAT10基因靶向作用，显示了靶向癌症治疗的前景。
引言
胶质母细胞瘤(GBM)是最常见且侵袭性最强的原发性恶性脑肿瘤，总体中位生存期不到2年。 GBM干细胞(GSCs)构成了一群具有强大自我更新和分化能力的肿瘤细胞。GSCs引发肿瘤并促进肿瘤复发和恶性进展。 因此，阐明GSC生物学并设计针对GSC的干预措施对于克服GBM治疗当前的治疗挑战仍然至关重要。
R环是三链核酸杂交体，其中单链RNA取代DNA双链中的一条链，并与其互补链形成碱基对。R环最初被认为是罕见的转录副产物，现在人们认识到，未解决的、“非计划的”R环积累会导致RNA聚合酶II(Pol II)暂停、阻断转录，并促进DNA损伤和基因组不稳定。 随着测序技术的进步，研究人员发现，除了非计划的R环外，细胞中同时还存在大量参与转录调控的“调节性”R环。 CpG岛含有更多的R环，R环的积累会损害新生DNA甲基转移酶DNMT3B1的募集，从而维持启动子的低甲基化以保持转录活性。 高分辨率DRIPc-seq(DNA:RNA免疫沉淀后进行cDNA转换并结合高通量测序)图谱显示，R环占据了大约5%的基因组，并与启动子处高度可及的表观基因组区域相关联。 然而，区分非计划的R环和调节性R环仍然具有挑战性，介导R环驱动的转录激活的因素仍然未知。R环重塑在正常胚胎干细胞分化和重编程过程中控制基因表达， 但其在恶性肿瘤进展中的作用和机制仍在积极研究中。
在这里，我们使用空间转录组学、单细胞转录组学、批量转录组学和全基因组RR-ChIP分析，发现了GSCs中具有细胞类型和空间特异性动态升高的R环。蛋白质组分析确定NAT10是一种关键的R环结合蛋白。NAT10高度表达，它介导了 -乙酰胞苷(ac )对R环RNA的修饰，在启动子区域稳定高水平的R环。使用
图1. GSCs中R环的细胞特异性富集和空间积累
(A和B) GBM空间转录组学中所示基因特征的代表性切片(A)和空间权重相关性热图(B，n = 32个切片)。(C和D) 小提琴图显示GSC与DGC(GSE54791，每组n = 9)以及GSC与NSC(GSE119834， GSCs和9个NSCs)中R环形成(C)和R环分辨率(D)特征的单样本基因集富集分析(ssGSEA)Z分数。
(图例见下页) 对R环RNA进行ac 特异性RNA免疫沉淀测序(ac -RIP-seq)，我们提供了 修饰的R环的全基因组图谱，并确定了R环/ac 信号促进肿瘤干性和恶性进展的关键下游介质。用小分子抑制剂remodelin处理模拟了NAT10敲低，降低了R环RNA水平，抑制了GSC自我更新，并抑制了肿瘤生长，证明了靶向R环的治疗潜力。
结果
GSCs中R环的细胞特异性富集和空间积累
胚胎干细胞分化伴随着调控性R环的重编程。 然而，这种表观遗传重塑在癌症中的作用仍知之甚少，尤其是在癌症干细胞中。胶质母细胞瘤(GBM)的特征是明显的空间异质性， 而R环的空间分布以及GBM中R环重塑与干细胞维持之间的相互作用在很大程度上仍未被探索。为了研究空间分辨的R环重编程，我们首先使用空间转录组测序数据评估了不同转录程序的空间分布(表S1)。 一种GBM干性特征 与泛干性特征 和缺氧信号显示出强烈的空间一致性(图1A和1B)，这与缺氧作为GBM和胶质母细胞瘤干细胞(GSCs)的关键驱动因素一致。 使用由参与R环形成或解决的因子组成的基因集特征 (表S1)，我们观察到两个R环特征在空间上都与干细胞龛相关，表明R环活性与GSC维持之间存在动态相互作用。这种相关性并不局限于特定的肿瘤亚区域，而是可能代表一般关联，因为我们在同一患者的多个组织学上不同的区域都观察到了这种情况(图1A)。两个R环特征都特别富集于恶性肿瘤细胞而非其他微环境成分(包括巨噬细胞、内皮细胞和CD8* T细胞)(图S1A)。将恶性热点(定义为恶性细胞分数>0.8)映射到四种细胞状态(神经祖细胞样[NPC样]、少突胶质细胞祖细胞样[OPC样]、星形胶质细胞样和间充质样) 显示两个特征在OPC样和NPC样状态中都有富集(图S1B和S1C)。
接下来，我们分析了单细胞RNA测序(scRNA-seq) 并在肿瘤块中区分了GSCs和分化的GBM细胞(DGCs)(见STAR方法)。GSCs中的R环形成和R环解决活性更高(图S1D和S1E)，这得到了批量转录组学 的证实，显示与DGCs和正常神经干细胞(NSCs)相比，GSCs中的活性升高(图1C和1D)。在scRNA-seq中，两个特征在祖细胞样细胞状态(特别是OPC样和NPC样)中共同富集(图S1F - S1H)，并且在GSCs和DGCs的G2/M期细胞中上调(图S1I和S1J)。总体而言，这种模式表明R环代谢在增殖性、祖细胞样GSCs中受到动态且强烈的调控。
为了确定R环是维持在高丰度还是低丰度，我们接下来使用催化失活的核糖核酸酶H1 D210N突变探针(dRNH1) 和S9.6单克隆抗体比较了多种细胞类型中的全局R环水平。 这两种正交技术表明，与DGCs和NSCs相比，GSCs表现出更强的核R环(图1E和1F；图S1K和S1L)。核糖核酸酶H处理证实了核R环信号的特异性，该处理选择性地降解R环结构。基因组DNA的斑点印迹分析证实了这些发现(图1G)。因此，R环在GSCs中以高丰度维持动态平衡，表明它们可能发挥受调控的生理功能。
为了在基因组规模上剖析生殖干细胞中的R环生物学，我们使用NLS-RNaseH1-D210N-V5进行RR-ChlP ，以全面绘制全基因组R环图谱(见STAR方法)(图S2A)。我们在不同细胞类型中异位表达NLS-RNaseH1-D210N-V5(图S2B)并进行平行RR-ChIP测序。R环以链特异性模式存在于既定的基因组位点，包括MALAT1和JUN(图S2C)。这一观察结果与已发表的数据一致， 验证了我们RR-ChIP的可靠性和稳健性。基因本体(GO)富集分析表明，生殖干细胞特异性R环相关基因包括mRNA代谢和剪接、组蛋白修饰以及细胞周期调控(图S2D)。鉴定出了包括MYC、OLIG1和LGALS3在内的干性相关因子， 表明生殖干细胞中R环的特定分布与细胞命运相关。双极胶质细胞特异性R环相关基因也在mRNA代谢和组蛋白修饰中富集，但还与蛋白质修饰相关(图S2E)。在双极胶质细胞特异性表达的GFAP上检测到双极胶质细胞特异性R环信号(图S2F)。 在神经干细胞中，R环相关基因包括mRNA代谢、染色质重塑以及轴突发生(图S2G)。在EN2位点观察到神经干细胞特异性R环富集(图S2H)，EN2是中枢神经系统发育的关键基因。 总之，这些结果表明R环分布与染色质重塑和mRNA代谢过程相关
(E和F) 有/无RNaseH处理的dRNH1染色的代表性图像(E)和定量(F， 每组随机选择的细胞)。比例尺， 。
(G) 显示有/无RNaseH或DNase I处理的R环信号点图。亚甲蓝作为上样对照。
(H) 生殖干细胞特异性R环相关基因的轨迹。
(I) R环峰的基因组分布。
(J) 转录起始位点周围R环信号的分布图。CPM，每百万计数。
(K) 生殖干细胞23中有无启动子R环的基因表达。FPKM，每千碱基百万片段数。
在(E)和(G)中，数据代表至少三个具有相似结果的实验。统计学方法:双尾Pearson相关性分析(C)、双尾不成对 检验(D-G和N)以及单因素方差分析(I)。另见图S1和S2。在不同细胞类型中，同时呈现肿瘤和谱系特异性模式。
图2. NAT10依赖性 修饰R环
(A) S9.6免疫沉淀后进行质谱分析以鉴定R环相互作用组的工作流程。
(B和C) 生殖干细胞与双极胶质细胞(B)以及生殖干细胞与神经干细胞(C)中差异R环结合的火山图。截断值:|log FC|>1，校正后的 。
(D和E) 显示生殖干细胞富集的相互作用因子的维恩图(D)以及三个已发表的R环相互作用组的重叠情况(E)。
(图例见下一页)
为了更深入地了解R环动力学，我们将分析范围从单个基因扩展到全基因组，以研究R环的分布。相对于双潜能生殖细胞(DGCs)和神经干细胞(NSCs)，生殖干细胞(GSCs)中正义链和反义链上启动子近端区域(定义为围绕转录起始位点[TSSs]的 )的R环水平升高(图1I和1J)，但转录终止位点(TESs)周围区域没有升高(图S2I)。启动子处的表观遗传景观是染色质可及性的关键决定因素和转录活性的标志。 含有启动子R环的基因在生殖干细胞中表现出更高的表达水平(图1K)。启动子R环与开放染色质的既定标记共定位，包括组蛋白H3赖氨酸27乙酰化(H3K27ac)、组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)以及通过转座酶可及染色质测序鉴定的可及染色质区域(图S2J)。总的来说，这些发现表明，生殖干细胞中与启动子相关的R环积累并促进染色质可及性，有助于细胞特异性转录重编程。
NAT10依赖性乙酰化 修饰R环
R环调节多种生物学过程，如基因表达、RNA加工、端粒维持、DNA修复和表观遗传调控，这些过程由R环相互作用蛋白进行微调。 为了阐明生殖干细胞中的R环相互作用蛋白，我们使用S9.6抗体进行了R环免疫沉淀(IP)，随后对生殖干细胞、双潜能生殖细胞和神经干细胞进行了质谱(MS)分析(图2A和S3A；表S2)。比较蛋白质组学分析揭示了相对于双潜能生殖细胞和神经干细胞，在生殖干细胞中与R环结合更强的蛋白质(图2B和2C；表S3)。双潜能生殖细胞没有显示出特异性富集的R环相互作用蛋白(图2B)，这与我们观察到的双潜能生殖细胞中R环水平降低一致。在神经干细胞中独特富集的蛋白质包括R环分辨率的调节因子，如LBR、DDX1和XRN2 (图2C)。在神经干细胞中拉下了更多的R环分辨率蛋白(图S3B)，这与生殖干细胞中R环积累高于神经干细胞一致。生殖干细胞与双潜能生殖细胞以及生殖干细胞与神经干细胞比较的交集产生了五种一致富集的蛋白质:NAT10、DNA-PKcs(由PRKDC编码)、WDR3、Hornerin(由HRNR编码)和桥粒斑蛋白(由DSP编码)(图2D)。我们比较了使用多种方法生成的R环相互作用组，包括RNase H1 TurboID邻近标记、 S9.6抗体IP、 和DNA-RNA杂交IP。 这些独立数据集的交集在22个重叠的高可信度相互作用蛋白中鉴定出NAT10(图2E)，这使其成为进一步分析的优先对象。通过R环IP(包括S9.6 IP和dRNH1 IP)验证了生殖干细胞中NAT10与R环的结合增强(图2F和2G)。与双潜能生殖细胞和神经干细胞相比，生殖干细胞中NAT10的表达升高(图2F和2G)，表明其在这些细胞中可能具有重要的功能作用。总之，这些结果表明，虽然NAT10与R环的关联可能是普遍存在的，但其功能可能被生殖干细胞劫持和利用以驱动致癌表型。
为了研究驱动优先表达的上游转录因子(TFs)，我们使用JASPAR数据库 来预测可能与NAT10启动子结合的TFs。在预测的509个TFs中，有几个在胶质瘤干细胞(GSCs)中表达较高(图S3C)。对这些候选因子进行交集分析，确定了OLIG1、OLIG2和HES6(图S3D)。在中国人脑胶质瘤基因组图谱(CGGA)中，OLIG1与NAT10的相关性最强(图S3E)，这促使我们将OLIG1作为优先研究对象。敲低OLIG1会下调NAT10的表达(图S3F和S3G)。NAT10启动子区域包含两个假定的OLIG1结合位点(图S3H)，染色质免疫沉淀qPCR(ChIP-qPCR)证实了直接结合(图S3I)。这些结果共同表明，GSCs中NAT10的优先表达是由干性相关的TFs驱动的，特别是OLIG1。
NAT10催化 RNA修饰， 这表明GSCs中R环RNA上存在 修饰。R环(通过dRNH1或S9.6检测)、 修饰和NAT10在GSC细胞核内空间共定位(图2H和2I；图S4A和S4B)。为了从生化角度证实基因组R环RNA上的 ，我们进行了R环免疫沉淀，随后进行DNase I处理和R环相关RNA分离(图S4C)。斑点印迹分析以RNase H作为对照检测到 修饰，支持R环上存在 修饰(图S4D和S4E)。
为了减少与基于抗体的方法相关的潜在脱靶结合和假阳性，我们使用质谱法(MS)评估 。由于从R环免疫沉淀或RR-ChIP中富集的R环RNA量有限，不足以进行MS分析，我们采用了另一种沉淀方法(见STAR方法)。通过沉淀富集的R环RNA与RR-ChlP表现出很强的一致性，具有高度正相关(图S4F和S4G)和相似的基因组分布模式(图S4H)，证实了基于沉淀的方法富集R环RNA的可靠性。点图和MS分析显示，NAT10缺失后ac 显著减少(图2J和2K)。与弥漫性胶质瘤细胞(DGCs)相比，GSCs细胞核内的R环 水平富集(图S4I)。NAT10敲低降低了 水平。
(F和G) S9.6免疫沉淀(F)和dRNH1免疫沉淀(G)中NAT10的免疫印迹。组蛋白H3作为阳性对照。
(H和I) 免疫荧光显示R环(dRNH1)与NAT10(H)和ac C(I)在细胞核内共定位。白色箭头表示共定位。标尺， 。
(J) NAT10敲低后R环RNA上a 的免疫印迹和点图分析。
(K) NAT10敲低后R环RNA上a 的质谱分析( 每组生物学独立样本)。
(L和M) NAT10敲低并用野生型NAT10或G614E NAT10拯救后，NAT10的免疫印迹(L)以及R环RNA上ac 的点图分析和定量( 生物学重复)(M)。
在(K)和(M)中，数据以平均值±标准差表示。在(B)-(D)中，蛋白质组学数据来自每组两个生物学独立样本。在(F)-(J)和(L)中，数据代表至少三个具有相似结果的实验。统计学分析:单向方差分析(K和M)。另见附图S3和S4。野生型NAT10可挽救R环RNA，而催化失活的NAT10突变体(G641E)则不能 (图2L和2M)，表明NAT10的乙酰转移酶活性是R环ac 修饰所必需的。
(下一页有图例)
NAT10稳定启动子R环以维持开放染色质
NAT10与GSCs中R环RNA上丰富的 修饰相关，这表明NAT10/ac 可能在调节R环生物学中起关键调节作用。NAT10敲低减少了核R环并增加了细胞质R环，野生型NAT10的过表达可挽救此现象，但G641E突变体则不能(图S5A)，这确定了NAT10的乙酰转移酶活性对维持核R环稳态的必要性。细胞质R环积累与先天免疫反应的激活有关。 NAT10敲低激活了cGAS-STING途径，TBK1和STING的磷酸化增加证明了这一点(图S5B)。这表明NAT10抑制后积累的细胞质R环作为免疫刺激配体，触发先天免疫反应。
鉴于NAT10和ac 修饰的R环在GSCs中主要定位于细胞核(图2H和2I；图S4A和S4B)，我们专注于核表观遗传功能。RR-ChIP测序表明，NAT10缺失减少了两条链上的启动子R环(图3A和3B)。NAT10缺失还降低了基因体和TES上的R环水平(图3A和3B)。H3K27ac ChIP测序(ChIP-seq)显示，只有失去启动子R环的基因显示H3K27ac减少(图3C-3E)，这表明虽然NAT10/ac 可能广泛调节R环，但只有启动子R环的稳定在功能上与活性染色质的维持相关联，从而驱动基因座特异性转录激活。NAT10抑制降低了整体新生RNA合成，野生型NAT10的过表达可挽救此现象，但G614E NAT10则不能(图S5C和S5D)。这些结果表明NAT10/ac 介导的启动子R环稳定在调节转录激活中的作用。
为了探究这种修饰对基因表达的影响，我们利用RNA测序技术，并在NAT10敲低后鉴定出444个下调基因(图3F；表S4)。聚焦于这些下调基因揭示了相同的局部效应:NAT10缺失降低了TSS近端启动子区域内的R环信号强度(图3G)。NAT10敲低降低了这些下调基因处的组蛋白H3K27ac信号强度(图3H和3I)。这些发现表明NAT10/ac 维持启动子近端R环的稳定性，将这种修饰直接与染色质开放性和基因转录联系起来。对这些下调基因的GO富集分析揭示了“缺氧反应”以及GBM干性的核心通路，包括“血管生成的正调控”、“整合素介导的细胞粘附”和“发育性细胞生长”(图S5E)。GSC身份和功能的调节因子与NAT10/ac 相关，包括整合素家族成员ITGA1、ITGA5和ITGA6 ；血管生成因子VEGFA ；Wnt信号成分WLS ；以及Hippo通路效应器TAZ (图S5F)。为了区分NAT10/ 在生理调节中的作用与病理功能障碍，我们评估了 在NAT10缺失时的表达。NAT10敲低增加了 水平(图S5F)，表明失调的R环稳定诱导基因组不稳定。这些结果表明NAT10/ac -环轴不是一般的生理调节因子，而是在GBM中被病理利用以维持干细胞群体。
RIP-seq揭示了 在R环上的基因组图谱
为了以单基因分辨率精确绘制 修饰在基因组R环上的图谱，我们对从有或无NAT10敲低的GSC中分离的R环RNA进行了ac RIP-seq。广泛的 修饰峰修饰了R环RNA的两条链，在NAT10缺失时减少(图4A)。42.04%的具有启动子R环的基因显示出可检测的 修饰(图4B)(表S5)。对779个ac 修饰的R环相关基因的GO生物学过程富集涉及翻译调控、mRNA加工、染色质重塑，以及干细胞分化和发育性细胞生长，并且相关的分子功能主要涉及多种蛋白质和RNA物种的结合(图4C)。与DGC和NSC 相比，779基因特征在GSC中高度表达(图4D)，并且与患者来源的GSC中的NAT水平呈正相关(图4E)以及与癌症基因组图谱(TCGA)-GBM队列(图4F)。在空间转录组数据中， NAT10在GSC生态位内与779基因特征表现出空间一致性(图4G和4H)。总体而言，这些结果证明了 修饰在R环上的广泛存在，并建立了 修饰的R环相关基因的表达与NAT10之间的密切关联。
NAT10缺失减弱自我更新和肿瘤生长
为了研究NAT10与R环动态的功能依赖性，我们研究了DepMap中70个弥漫性胶质瘤细胞系的全基因组CRISPR筛选数据。 在R环中
图3. NAT10稳定启动子R环以维持开放染色质状态
(A和B) NAT10敲低后GSC23(A)和GSC387(B)中R环信号的分布图。
(C和D) 在NAT10敲低后，聚焦于具有R环变化的基因，GSC23 (C) 和GSC387 (D) 中H3K27ac信号的剖面图。
(E) RR-ChlP-seq和H3K27ac-ChlP-seq的轨迹。VEGFA代表启动子R环和H3K27ac降低的基因。RNF44代表TES R环降低且H3K27ac未改变的基因。NCL代表基因体R环降低且H3K27ac未改变的基因。
(F) RNA-seq中NAT10敲低后差异表达基因的火山图 (每组 个生物学独立样本)。截断值:Ilog2FC ，校正后 。
(G) 444个下调基因的R环信号剖面图。
(H和I) 444个下调基因的H3K27ac信号的剖面图 (H) 和热图 (I)。另见图S5。通过质谱鉴定的相互作用蛋白，那些在GSCs中富集的蛋白表现出更高的必需性评分 (图5A)。大多数细胞系对NAT10表现出强烈依赖性，Chronos评分小于-1表明了这一点 (图5B)。NAT10缺失损害了GSC增殖，细胞生长速率降低 (图5C) 和EdU掺入减少 (图S5G) 证明了这一点，表明扩增能力受到抑制。自我更新能力受损，表现为肿瘤球较小 (图S5H) 和极限稀释分析中干细胞频率较低 (图S5I)。在原位异种移植模型中，NAT10缺失减弱了体内肿瘤生长并延长了生存期 (图5D和5E)。野生型NAT10可完全恢复NAT10敲低后GSC增殖 (细胞活力和EdU掺入；图5F - 5H) 和自我更新能力 (球形成和极限稀释分析；图5I - 5K) 的损害，但G641E突变体不能，这确立了NAT10的酶活性作为GSC维持和肿瘤增殖中的核心调节因子和脆弱点。
图4. 对R环的基因组景观
(A) NAT10敲低后 RIP-seq信号在R环RNA上的剖面图和热图。(B) R环RNA上有/无 的启动子R环相关基因的百分比。
(图例见下一页)
NAT10介导的R环上的ac 通过EGR1调节GSC自我更新
为了探索下游机制和潜在的介导因子，我们进行了整合分析，将我们在NAT10缺失时的 序列、RNA序列和H3K27ac ChlP序列数据联系起来。基因集富集分析(GSEA)显示，在NAT10敲低后下调的基因(来自RNA序列)中，失去启动子相关 (来自ac -RIP序列)的基因富集(图6A)。H3K27ac ChlP序列支持转录下调，在相同的ac 依赖基因集的启动子区域整体下降(图6B)。从GSEA中，我们提取了199个“前沿”基因的核心集，它代表了NAT10/ac -环轴的主要转录输出。对这个核心基因集的GO富集分析揭示了GSC生物学的基本过程，包括“发育过程”、“细胞分化”、“有丝分裂细胞周期”和“细胞粘附”(图6C)。在这个核心集中下调最显著的基因中有几个关键转录本，包括A2M、EGR1、PTPRG、NDRG1、TNC和GAP43(图6D)。对 中的scRNA序列数据的分析表明，EGR1、PTPRG、TNC和GAP43在恶性细胞中表达最高，反映了NAT10的表达模式(图S6A)。对R环RNA进行ac -RIP qPCR证实，与其他候选基因相比，EGR1上的ac 富集强烈(图6E)。NAT10的缺失减少了EGR1启动子R环RNA上的ac ，降低了其R环水平，并降低了EGR1位点的H3K27ac和H3K4me3(图6F - 6H)。这些效应可以通过重新表达野生型NAT10来挽救，但不能通过G614E突变体来挽救(图6H)，表明其乙酰转移酶活性在调节中的必要性。
为了排除NAT10敲低对EGR1表达的影响是通过mRNA稳定性介导的可能性，我们用放线菌素D处理细胞， 放线菌素D可阻断转录，并监测mRNA降解。NAT10敲低没有改变EGR1 mRNA的半衰期(图S6B)，表明其稳定性不受影响。为了排除对翻译的潜在影响，我们构建了一个EGR1翻译报告基因，其中EGR1编码序列位于荧光素酶下游，随后是一个IRES驱动的海肾荧光素酶(Rluc)作为内部对照(图S6C)。使用Rluc标准化的荧光素酶活性评估翻译效率，并根据转录本丰度进行校正。NAT10敲低不影响EGR1 mRNA的翻译效率(图S6D)，表明NAT10在翻译水平上不调节EGR1。事实上， 对mRNA进行RIP-qPCR未能检测到成熟EGR1 mRNA上的ac 修饰(图6E)。这表明ac 修饰在EGR1转录早期短暂沉积，可能促进启动子近端区域的染色质开放，而不是参与其成熟mRNA转录本 的代谢调节或翻译调控。
EGR1此前已被证明通过转录激活关键的干性相关基因(包括PDGFA、TNF和TGFB1)参与维持GSC干性 。敲低NAT10会在mRNA和蛋白质水平上降低EGR1及其这些靶标的表达(图6I；图S7E和S7F)，重新表达野生型NAT10可挽救这种情况，但G614E突变体则不能(图6J)。敲低NAT10会损害GSC的增殖和球形成能力，而EGR1的基因重组可有效逆转这些功能缺陷(图6K - 6N；图S6G)。这些功能挽救实验支持EGR1是NAT10/ac 信号在R环RNA上的重要下游效应物，调控癌症干性。
对NAT10进行药理学靶向模拟敲低NAT10并抑制胶质母细胞瘤进展
为了探索靶向GBM中依赖NAT10 修饰的R环的治疗潜力，我们评估了NAT10抑制剂remodelin的疗效。 Remodelin处理降低了R环RNA上的 水平，过表达野生型NAT10可挽救这种情况，但G641E - NAT10则不能(图7A)。Remodelin抑制了GSC的增殖和自我更新(图7B)并降低了球形成效率(图7C)。GSCs对remodelin的敏感性高于DGCs和NSCs，较低的IC 值表明了这一点(图7D)，提示存在选择性治疗脆弱性。Remodelin与GBM治疗中的标准化疗药物替莫唑胺(TMZ)联合使用显示出协同杀伤GSC的作用(图7E)，增强了抑制NAT10的转化影响。
(C) 修饰的R环相关基因的GO富集。
(D)小提琴图显示GSC与DGC(GSE54791， 各样本)以及GSC与NSC(GSE119834， 个GSCs和9个NSCs)中779基因特征的单样本基因集富集分析(ssGSEA)Z分数。
(E和F) GSCs(GSE119834， )(E)和TCGA - GBM( 患者)(F)中779基因特征与NAT10表达之间的相关性。
(G和H)空间转录组切片显示NAT10和所示特征(GBM干性也见图1A)。
统计学方法:错误发现率(FDR)校正的过表达检验(C)、双尾非配对t检验(D)以及双尾Pearson相关性分析(E和F)。
图5. NAT10缺失减弱GSC维持和GBM进展
(A)(左)DepMap中70个弥漫性胶质瘤细胞系中GSC富集的R环相互作用蛋白的Chronos依赖性评分(来自图2B中的GSC与DGC或图2C中的GSC与NSC)。红色标签显示共同富集的相互作用蛋白(该数据集中没有PRDKC)。平均Chronos评分小于 -1用作共同必需性的截止值。(右)平均Chronos评分的比较。
(B) 70个胶质瘤细胞系中NAT10的Chronos依赖性评分。
(图例见下页)
Remodelin下调了NAT10、EGR1以及下游干性相关因子的表达(图7F；图S6H和S6I)。Remodelin处理降低了EGR1启动子R环处的 修饰，并减少了EGR1基因座处的活性组蛋白标记(H3K27ac和H3K4me3)，野生型NAT10的过表达可挽救这种情况，但G641E突变体则不能(图7G)。野生型NAT10可挽救Remodelin处理下的EGR1下调，但G641E - NAT10则不能(图7H)。Remodelin对EGR1 mRNA稳定性(图S6J)及其翻译效率(图S6K)均无影响。这些结果与NAT10敲低的情况相似，建立了一个连贯的模型:NAT10催化启动子近端R环上的 修饰，进而促进开放染色质状态并驱动对GSC维持至关重要的基因转录，包括EGR1。
Remodelin可穿过血脑屏障。 为评估其体内疗效，我们在原位异种移植小鼠中腹腔注射Remodelin，观察到肿瘤生长延迟(图7I - 7K)和生存期延长(图7L)。总体而言，这些结果表明，对NAT10的药理学抑制有效地概括了其基因缺失的功能后果，突出了NAT10作为靶向GSC和GBM的有前景的治疗靶点。
NAT10 - R环轴的临床相关性
接下来，我们评估NAT10 - R环轴在GBM中的临床相关性。对TCGA和GTEx脑皮质数据的综合分析显示，与正常脑组织相比，GBM中R环形成特征和NAT10过表达(图S7A和S7B)。在患者来源的GSC(图S7C)和TCGA - GBM队列(图S7D)中，NAT10的表达与R环形成特征呈正相关。使用内部样本证实了肿瘤中NAT10的过表达(图7M和7N)。为探究所确定的NAT10 - R环轴是否代表特定胶质瘤亚型的决定性特征，我们研究了其在IDH突变状态、Verhaak亚型、 和复发状态中的表达。NAT10在IDH野生型胶质瘤中未富集，但下游R环轴(包括NAT10敲低后444个下调基因的特征强度和EGR1的表达)在IDH野生型胶质瘤中更易表达(图S7E和S7F)。在CGGA中，NAT10表达在间充质亚型中有适度升高趋势，但其下游通路活性在TCGA和CGGA数据集中的间充质胶质瘤中均富集(图S7G和S7H)。对胶质瘤纵向分析(GLASS)队列的分析未发现复发样本中NAT10或其下游R环轴的富集(图S7I)。然而，在复发胶质瘤中，较高的NAT10表达与干性标记物(SOX2和NES)升高呈正相关(图S7J)。NAT10、下游444个基因和EGR1的激活与患者预后不良相关(图S7K和S7L)。总体而言，这些数据表明，NAT10驱动的R环转录程序是IDH野生型和间充质胶质瘤的标志，与复发中的干性相关，并预测预后不良，使其成为GBM中的预后指标和治疗靶点。
讨论
R环曾被视为计划外且对细胞有损害的转录副产物，与基因组不稳定、复制应激和DNA损伤相关。 表皮生长因子受体VIII型(EGFRvlII) 神经胶质瘤表现出复制应激增加和高水平的R环积累，这代表了一个可通过治疗靶向的脆弱点。 与此同时，神经胶质瘤细胞必须同时解决过多的R环，以防止DNA损伤积累并维持基因组稳定性。 然而，最近越来越多的证据表明，调节性或“计划性”R环共存，并在转录激活、染色质组织、端粒维持和DNA修复中发挥生理作用。 癌细胞利用这些调节性R环功能来促进其生长 ；然而，关于胶质母细胞瘤中调节性R环功能的已发表研究有限。我们的全基因组RR-ChlP-seq分析支持了胶质母细胞瘤中的这一范式转变，表明胶质瘤干细胞(GSCs)在高表达的原癌基因的启动子近端区域表现出细胞类型特异性的R环富集，与活性组蛋白标记如H3K27ac和H3K4me3共定位。与神经干细胞(NSCs)和双潜能神经胶质细胞(DGCs)相比，活性组蛋白标记是胶质瘤干细胞的一个显著特征，因此，R环调节可能是胶质瘤干细胞中上调的转录谱的基础。 这种以启动子为中心的分布也反映了多能干细胞中的发现，其中R环保留转录活性染色质并促进转录机制的募集。
我们对R环相互作用组的蛋白质组学分析揭示了NAT10是一种在胶质瘤干细胞中富集的相互作用蛋白，与双潜能神经胶质细胞和神经干细胞相比，它与R环有优先结合。尽管NAT10因其在 mRNA上的沉积作用以及在衰老和癌症中调节RNA稳定性、翻译和代谢方面的作用而闻名 ，但其与R环的关联仍知之甚少，特别是在癌症干细胞的背景下。我们的数据表明，在胶质瘤干细胞中，NAT10被与干性相关的转录因子OLIG1转录激活，将……联系起来
(C) NAT10敲低后的细胞活力( 独立实验，以第0天为对照进行标准化)。
(D) 原位肿瘤的苏木精-伊红(H&E)染色脑切片。当任何一组出现首个神经学症状时，采集大脑。
(E) Kaplan-Meier生存曲线( 每组小鼠数量)。
(F) NAT10敲低并用野生型或G614E NAT10拯救后的细胞活力( 独立实验，以第0天为对照进行标准化)。
(G和H) EdU掺入图像(G)和定量分析(H) ( 每组随机选择的视野)。比例尺， 。
(I和J) 球体形成图像 (I) 和定量分析 (J)(分别在GSC23中为 个球体，在GSC387中分别为 个球体)。比例尺， 。
(K) 极限稀释图与干细胞频率。
在(C)、(F)、(H)和(J)中，数据以平均值 标准差表示。在(A)和(B)中，数据代表至少三个具有相似结果的实验。在(C)和(F)-(K)中，数据来自三个独立实验。统计分析:单向方差分析(A、H和G)、双向方差分析(C和F)、对数秩检验(E)和双尾似然比检验(K)。ns，无显著性差异。另见附图S5。具有R环表观转录组重塑的干性。NAT10在胶质瘤干细胞中与R环的优先结合促进了 在基因组上的沉积，这涉及R环稳定和表观基因组调控。最近的一项研究还报道了在具有不同亚细胞定位和功能的HeLa细胞 的R环上存在 修饰，据推测它们主要位于细胞质内体中以调节免疫激活。这与我们在胶质瘤干细胞中的观察结果形成对比，在胶质瘤干细胞中，NAT10和 修饰的R环主要位于细胞核中(图2H和2I；图S4A和S4B)。这突出了R环-ac 轴的功能复杂性和细胞背景依赖性。这种差异的一个合理的解释可能在于癌症干细胞的独特特性，其中该轴的主要病理作用似乎是对干性程序的核表观遗传调控。在本研究中，我们使用 -RIP-seq对R环RNA进行全基因组 修饰图谱绘制，揭示了它们在稳定R环和调节基因转录中的作用。这些发现为 和 环之间的功能相互作用提供了一个视角，突出了与胶质瘤干细胞生物学相关的独特机制。
图6. NAT10介导的R环上的 修饰通过EGR1调节生殖干细胞自我更新
(A) 在NAT10敲低的RNA测序中，对ac 修饰的R环相关基因进行基因集富集分析(GSEA)。
(B) 在NAT10敲低后， 修饰的R环相关基因处H3K27ac信号的剖面图。
(图例见下一页)
通过整合RR-ChlP-seq、 RIP-seq和NAT10敲低实验，我们证明R环RNA链上的 标记特异性地在参与促进恶性肿瘤的基因的启动子近端区域稳定这些DNA-RNA杂交结构。NAT10的缺失降低了这些位点的R环丰度和H3K27ac富集，这表明 修饰的R环作为维持开放染色质构型的调节域。与R环相关的RNA具有各种表观转录组修饰，如 和 ，它们主要与调节转录暂停和基因组稳定性有关。例如， 促进R环形成并在TESs周围的基因组位点促进转录终止。 R环在启动子和终止子区域均作为基因组热点富集， 在那里它们可以增强或抑制转录，充当受调控的调节元件或意外的威胁。然而，区分这些上下文依赖性功能的精确机制仍不清楚。我们的研究支持调节性ac 修饰的R环结构域具有积极的转录作用，并提出细胞通过对R环RNA部分的各种化学修饰进行动态调节来精细调整基因组调控。
我们的机制研究确定EGR1是由NAT10介导的ac R环调节的关键下游转录因子。EGR1通过原癌信号通路的转录激活促进胶质母细胞瘤的肿瘤生长、血管生成和干性。 通过证明ac 修饰发生在EGR1 R环的RNA链上，而不是成熟的EGR1 mRNA上，我们提出了一种在新生RNA-DNA杂交阶段起作用的转录控制机制。这表明了基因调控的额外层面，超越了众所周知的转录后和翻译后修饰。 此外，这一发现进一步支持了 修饰的动态性质，并表明除了作为“书写者”的NAT10之外，可能存在以前未被识别的“读取者”或“擦除者”，它们在从R环相关RNA向成熟mRNA转变过程中调节ac 景观的变化。
我们的研究具有直接的治疗意义。NAT10可被小分子抑制剂remodelin靶向，remodelin具有血脑屏障通透性 ，并且在我们的模型中，可在体外和体内降低GSC增殖、自我更新和肿瘤生长。尽管remodelin尚未获得FDA批准，但多项临床前研究已证明其相对安全。例如，在人类加速衰老综合征小鼠模型中用remodelin治疗约3个月耐受性良好，早衰小鼠的生存期延长。 成年小鼠中条件性Nat10缺失不会导致急性死亡或体重减轻，对主要器官组织病理学影响最小。 然而，也有报道称用remodelin靶向NAT10会损害心肌细胞增殖潜力和心脏修复。 因此，确定合适的治疗窗口至关重要。在本研究中，我们观察到R环上的NAT10/ac 在GSC和胶质母细胞瘤组织中高度活跃。GSC相对于DGC和NSC对NAT10抑制的优先敏感性揭示了潜在的治疗脆弱性和窗口。未来的研究有必要评估广谱NAT10抑制在正常组织中的短期和长期安全性，以及remodelin与现有标准治疗方法(包括化疗和放疗)联合使用时的联合益处和潜在毒性。
总之，我们确定了一种表观转录组机制，其中RNA乙酰转移酶NAT10在GSCs的启动子近端R环上沉积ac ，稳定这些结构以维持开放染色质并驱动诸如EGR1等干性调节因子的转录。这种NAT10 - ac - R环轴代表了GSCs的一个可利用的脆弱点，并为GBM提供了一个有前景的治疗靶点(图7O)。我们的发现扩展了
(C) 199个前沿基因的GO富集分析。
(D) 按 倍数变化排序的前沿基因排名图。标记了 倍数变化为 的基因。
(E) 对指定基因进行ac RIP-qPCR检测R环RNA(左)和mRNA(右)( 个独立实验)。ND，未检测到。
(F和G) ac RIP-seq(F)和RR-ChlP-seq(G)中EGR1的轨迹。
(H) 在NAT10敲低和挽救后，对EGR1的R环RNA进行ac RIP-qPCR(左)以及对H3K27ac/H3K4me3进行ChlP-qPCR(右)(n = 3个独立实验)。
(I和J) NAT10敲低和挽救后指定蛋白质的免疫印迹。
(K) 在有/无EGR1过表达的情况下敲低NAT10后EGR1的免疫印迹。EV，空载体；OE，表示过表达。
(L - N) 在有/无EGR1过表达的情况下敲低NAT10后的细胞活力(L)、球体大小定量(M)(GSC23中 个和68个球体，GSC387中 个和55个球体)以及极限稀释和干细胞频率(N)。
在(E)、(H)、(L)和(M)中，数据表示为平均值 标准差。在(E)、(H)以及(L) - (N)中，数据来自三个独立实验。在(I) - (K)中，数据代表至少三个具有相似结果的实验。统计方法:加权Kolmogorov - Smirnov检验(A)、FDR校正的过表达检验(C)、双尾不成对 检验(H)、双向方差分析(L)、单向方差分析(M)以及双尾似然比检验(N)。另见图S6。对癌症生物学中RNA修饰的功能理解以及GBM和其他脑肿瘤的精准表观遗传衍生疗法的开放途径。
(图例见下一页)
研究的局限性
本研究建立了NAT10、 修饰的R环与GSC维持之间的功能联系，但仍有几个问题存在。在方法上，我们使用RR-ChlP-seq分析基因组R环图谱，该方法依赖于细胞中NLS-RNaseH1-D210N-V5蛋白的预过表达。尽管这种基于dRNH1的方法提供了高分辨率并能够在体内捕获，但与其他方法相比，它可能会扰乱天然细胞生理并引入偏差。用于ac - seq的R环RNA是通过基于沉淀的富集获得的；虽然这种方法与RR-ChlP显示出高度一致性，但它在修饰位点识别中仍可能引入偏差。此外， - RIP-seq缺乏单核苷酸分辨率，需要未来应用化学测序方法进行精确映射。在机制上，尽管转录本如EGR1上的 修饰主要富集在R环RNA而不是成熟mRNA上，但 从R环相关RNA到完全加工的mRNA的动态转变以及控制这一过程的调节机制仍不清楚。在转化方面，鉴于 修饰广泛且具有重要的生理功能，系统靶向NAT10/ac 轴的潜在靶向或脱靶毒性需要在未来的临床前和临床研究中进行全面验证。
资源可用性
主要联系人
如需进一步信息、资源或试剂，请联系主要联系人杰里米·N·里奇(drjeremyrich@gmail.com)，他将负责提供。
材料可用性
本研究未产生新的独特试剂。
数据和代码可用性
RR-ChlP-seq、RNA-seq、H3K27ac-ChlP-seq和 -RIP-seq的原始测序数据已存入GEO，登录号为GSE307601，可公开获取。R-loop IP的原始蛋白质组学数据已通过PRIDE合作伙伴库存入蛋白质组交换联盟，标识符为PXD077002，可公开获取。本文未报告原始代码。如需重新分析本文报告的数据所需的任何其他信息，可向主要联系人索取。
致谢
我们感谢梁开伟博士(中国武汉大学)慷慨提供dRNH1探针。我们感谢中国中山大学附属第一医院的张玉超博士、罗峰博士和张弩博士对本研究的贡献。我们感谢匹兹堡大学健康科学质谱核心实验室进行质谱分析。本研究得到了美国国立卫生研究院的资助(J.N.R.获得R35CA197718、R01CA238662、R01CA268634和R01NS103434；S.L.G.获得NIHS10OD023402和NIH-S10OD032141)、国防卫生局(J.N.R.获得HT9425-23-1-0689)、美国癌症协会丽莎·迪恩·莫斯利癌症干细胞联盟(J.N.R.获得CSCC-LEAD-22-186-01-CSCC)以及匹兹堡大学的启动资金(给J.N.R.)。
作者贡献
X.W.和J.N.R.构思了该项目，设计了整体实验，分析了数据并撰写了论文。X.W.、D.W.、S.T.、W.W.、Q.W.、F.Y.、P.Z.、T.H.和H.Y.进行了实验。S.J.M.和S.L.G.进行了质谱分析。D.D.和D.L.提供了科学建议并协助编辑论文。
利益声明
作者声明无利益冲突。
明星方法
本文在线版本提供了详细方法，包括以下内容:
- 关键资源表
- 实验模型和研究参与者详情
- 人类胶质母细胞瘤组织
GSC的衍生与细胞培养
- 异种移植模型
- 方法细节
- R环RNA染色质免疫沉淀测序(RR-ChIP seq)及数据分析
- 免疫荧光和免疫组织化学染色
图7. NAT10的药物靶向模拟NAT10敲低并抑制胶质母细胞瘤进展
(A) 重塑素处理(100 µM，48小时)及挽救后R环RNA上ac 的点图和定量分析( 个生物学重复)。
(B和C) 重塑素处理后的细胞活力(B)( 个独立实验，以第0天为对照进行标准化)以及极限稀释和干细胞频率(C)。
(D) 重塑素 的抑制曲线和 (至少3个独立实验)。
(E) 重塑素与替莫唑胺联合的协同评分。
(F) 重塑素处理后所示蛋白的免疫印迹。
(G) 重塑素处理及挽救后R环RNA上ac C RIP-qPCR(左)以及EGR1的H3K27ac/H3K4me3 ChlP-qPCR(右)(n = 3个独立实验)。
(H) 重塑素处理及挽救后EGR1的免疫印迹。
(I和J) 重塑素处理后携带GSC23小鼠的示意图及体内生物发光成像(I)和定量分析(J，n = 5只小鼠/组)。(K和L) H&E染色的脑切片(K)和Kaplan-Meier生存曲线(L，n = 5只小鼠/组)。当DMSO组出现首个神经学症状时收获脑组织。
(M和N) 胶质母细胞瘤配对肿瘤(T)与周边组织(P)中NAT10的免疫印迹(M， 例患者)和免疫组化(N)。
(O) 核心机制的示意图模型。
在(A)、(B)、(D)、(G)和(J)中，数据以平均值 标准差表示。在(A)、(C)、(F)和(H)中，数据代表至少三个具有相似结果的实验。统计方法:单向方差分析(A)、双向方差分析(B和J)、双尾似然比检验(C)、零相互作用效力(ZIP)模型(E)、双尾不成对 检验(G)和对数秩检验(L)。ns，无显著性差异。另见图S7。
胶质母细胞瘤干细胞,启动子区R‑环,染色质,干性转录因子OLIG1,NAT10,乙酰转移酶,ac⁴C
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