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新生RNA标记化合物5-乙炔基尿苷(EU)在某些动物中整合到DNA中

发布时间：

2026-08-18 15:40

新生RNA标记化合物5-乙炔基尿苷(EU)在某些动物中整合到DNA中

马林·A·乔萨维克，凯瑟琳·L·P·唐纳姆，露丝·施蒂法尔斯，莱奥妮·阿德尔曼，马里奥·查齐乔治乌，弗洛里安·莱布尔，帕维尔·伯克哈特，费加尔·奥法雷尔，帕特里克·R·H·施泰因梅茨和凯瑟琳·加尔沙尔

摘要

背景从头合成的mRNA转录本的检测对于理解真核转录调控至关重要。使用核苷或核苷酸类似物标记新生RNA可能会受到普遍存在的核糖核苷酸还原酶(RNR)的影响，这些酶可以将核糖核苷酸转化为DNA的组成部分2’-脱氧核糖核苷酸。尽管存在这一挑战，尿苷类似物5-乙炔基尿苷(EU)已商业化并常规用作新生RNA的特异性标记。在这里，我们采用共聚焦成像、流式细胞术和生物化学方法来研究EU在六种不同动物物种中标记RNA的特异性。

结果我们证明，EU如预期主要整合到人类胚胎肾细胞系(HEK293T)、果蝇翅盘和栉水母Mnemiopsis leidyi的RNA中。相比之下，我们发现EU主要标记海葵Nematostella vectensis和Exaiptasia diaphana以及多毛纲动物Platynereis dumerilii的DNA。在Nematostella中，我们表明用羟基脲抑制RNR可消除细胞增殖以及EU掺入DNA。用于标记新生RNA的替代化合物，如5-乙炔基胞苷(EC)、5-乙炔基尿苷三磷酸(EUTP)或2-乙炔基腺苷(EA)在Nematostella中对RNA的特异性同样较低。

结论我们的发现引发了对包括EU在内的乙炔化核苷和核苷酸在某些动物中标记RNA的特异性的担忧。因此，我们建议制定良好实践指南，以帮助在使用EU标记新生RNA时识别无意的DNA标记。

关键词转录，DNA复制，生物正交标记，5-乙炔基尿苷，新生RNA，海葵，多毛纲动物，果蝇，栉水母

卑尔根大学生物科学系，Thormøhlensgt. 53，卑尔根N-5006，挪威

维也纳大学神经科学与发育生物学系，Dr. Bohr-Gasse 9/4，维也纳A-1030，奥地利

维也纳生物中心博士项目，维也纳大学和维也纳医科大学的博士学院，维也纳，奥地利

*通信作者:

帕特里克·R·H·施泰因梅茨

patrick.steinmetz@uib.no

凯瑟琳·加尔沙尔

Kathrin.garschall@uib.no

卑尔根大学迈克尔·萨斯中心，Thormøhlensgt. 55，

卑尔根N-5006，挪威

背景

真核基因表达的调控对于维持基本细胞功能和适应环境变化至关重要。在多细胞生物(如动物、植物)中，转录调控确保基因在正确的时间、地点和水平表达，以控制胚胎发育和成年期的体内平衡[1-3]。复杂的基因调控网络是动物、植物[6]以及一些单细胞真核生物(如疟原虫属[7])中复杂细胞类型和细胞特化的发育和进化的基础。研究基因调控的一个关键方面是对新生mRNA合成变化的检测、定量和分析。由于标准的RNA提取和检测程序无法区分储存的和活跃转录的mRNA，20世纪60年代引入了修饰核苷(即与核糖结合的核碱基)来标记和分离新生RNA[8-11]。核苷需要被特定的核苷激酶三磷酸化成为核苷三磷酸(NTP)，然后才能被RNA聚合酶用作底物来合成RNA[12]。然而，NTP的中间产物核苷二磷酸(NDP)不仅是NTP和RNA合成的前体。相反，核糖核苷酸还原酶(RNR)将NDP还原为2’-脱氧-NDP(dNDP)，然后dNDP可作为DNA合成的前体[12]。这一功能在几十年前就被发现，是DNA复制中一个至关重要且限速的步骤，在细菌、真核生物和古细菌中高度保守[13-15]。因此，使用修饰核苷酸不仅有标记新生RNA的风险，还有复制DNA的风险。事实上，几十年前开发的用于通过放射自显影定量新生RNA合成的放射性标记核苷(如 -尿苷、 -胞苷或尿嘧啶前体 H-乳清酸)已多次被发现大量整合到DNA中[8,16]。此外，用于化疗的嘧啶类似物5-氟尿嘧啶(5-FU)在癌细胞的RNA(作为5-氟尿嘧啶三磷酸；5-FUTP)和DNA(作为5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸；5-FdUTP)中均被检测到[17-19]。同样，核糖核苷阿糖胞苷(阿糖胞苷或Ara-C)和9-β-D-阿拉伯呋喃糖基-2-氟腺嘌呤(F-ara-A)在DNA合成过程中会整合到DNA和RNA引物中[20]。由此产生的对DNA复制的抑制作用已被用于开发化疗药物[20,21]。

最近开发的核苷5-乙炔基尿苷(EU)可以通过一步铜催化反应，通过“点击化学”与含叠氮基的荧光团共价偶联[22]。这种方法避免了免疫检测所需的苛刻变性步骤，并提供了更高的安全性和检测灵敏度。据报道，EU能特异性标记哺乳动物细胞系(NIH 3T3)中的RNA，并被认为是RNR的不良底物[22]。自2008年引入以来，EU已被广泛用于使用共聚焦显微镜观察和定量真核细胞或组织中的全局新生RNA合成和周转。例子包括植物[23]和各种动物，如小鼠[22] Drosophila[24]、蜗牛[25,26]以及刺胞动物，如水螅虫[27]或海葵[28]。然而，当使用EU进行新生RNA标记时，并不总是明确考虑其同时整合到RNA和DNA中的可能性。

在此，我们旨在通过可视化和量化海葵星状海葵(Nema-tostella vectensis)中新生转录水平，验证使用5-乙炔基尿苷(EU)作为新生RNA标记工具的可行性。与我们的预期相反，除RNA外，EU和其他几种乙炔基化核苷或核苷酸还强烈标记增殖细胞的复制DNA。因此，我们将对EU作为新生RNA标记工具的评估扩展到其他动物系统，包括具有生物医学相关性的模型。我们证实，EU主要掺入人细胞系HEK293T、果蝇(Drosophila melanogaster)的翅盘和栉水母(Mnemiopsis leidyi)的RNA中。然而，令人惊讶的是，EU在海葵透明艾氏海葵(Exaiptasia diaphana)和多毛纲环节动物杜氏阔沙蚕(Platynereis dumerlii)中也主要标记DNA。因此，DNA和RNA的一致双重标记使得EU不适用于可视化和量化星状海葵、艾氏海葵和阔沙蚕中的新生RNA转录本。因此，我们批判性地评估了以往文献中EU作为RNA标记工具的使用情况，并提出了防止将复制DNA误识别为新生RNA的指导原则。

方法

星状海葵的动物培养

成年星状海葵息肉源自原始的CH6雌性和CH2雄性实验室菌株，培养方法如前所述[29, 30]。简而言之，成年海葵保存在，盐浓度为16‰。幼年星状海葵息肉由野生型动物杂交产生，在的黑暗培养箱中，盐浓度为16‰(星状海葵培养基)中饲养。息肉每周喂食5次卤虫无节幼体，生长至第二对肠系膜发育时，定义为“幼年”。每次喂食后当天更换培养基。

EU、EdU、EC、EUTP或EA标记以及与BrdU的共标记

为确定EU(5-乙炔基尿苷，Invitrogen)的合适工作浓度，我们在室温下将息肉在和的EU中孵育。然后我们使用流式细胞术测量EU指数，该指数对应于DNA含量在和之间的所有细胞中被EU标记的部分(图1G)。由于和时EU指数相似，但在5mM EU处理中降低(补充图2A，附加文件1)，所有标记实验均在最低浓度0.5mM EU下进行。

将星状海葵幼体在于的星状海葵培养基中松弛，以准备进行孵育。然后将松弛的动物转移到含有2% DMSO、50mM 以及0.5mM EU、0.5mM EdU(5-乙炔基-2’-脱氧尿苷，Invitrogen)、0.5mM EC(5-乙炔基胞苷，耶拿生物科学公司)、0.5mM EUTP(5-乙炔基UTP，耶拿生物科学公司)或(0.5mM EA(2-乙炔基腺苷，耶拿生物科学公司)的标记培养基中。在共标记试验中，将0.1mM BrdU(5-溴-2’-脱氧尿苷，Invitrogen)与 EU/EdU在含有2% DMSO和的星状海葵培养基中混合。

所有孵育均在室温下进行。对于未标记的对照，将动物暴露于2%二甲亚砜和培养基中的。每12孔板的单个孔中最多孵育15只动物，或每6孔板的孔中最多孵育50只动物。掺入后，在固定和解离前，用含有的海葵培养基冲洗动物。

用于整体共聚焦显微镜的固定和样品制备

用EU、EdU、EC、EUTP、EA和/或BrdU标记后，将松弛的息肉轻轻转移到固定溶液(1x PBS、3.7% FA、0.2% TritonX、0.5% DMSO)中，在室温下孵育30分钟，然后在的新鲜固定剂中过夜固定。固定后，用PTx(1x PBS、0.2% TritonX)洗涤息肉3 - 5次以进行通透处理，在PBTx(1x PBS、0.2% TritonX、3% BSA)中短暂封闭，并用1x PBS冲洗。将含有Alexa荧光团叠氮化物(Alexa Fluor 488或555)的Click-iT™反应鸡尾酒添加到所有样品中，包括未标记的对照，并根据制造商方案在室温下黑暗中孵育30分钟(Click-iT"新生RNA捕获试剂盒/细胞增殖试剂盒，Invitrogen)。最后，用PTx(1x PBS、0.2% TritonX)洗涤息肉3 - 5次，用Hoechst33342(1:5000)孵育，并用ProLong Gold™(Invitrogen)固定用于共聚焦显微镜观察。

图1 EU标记增殖细胞的细胞核。(A) EU通过RNA聚合酶整合到RNA中，或者在细胞周期的S期通过DNA聚合酶整合到复制DNA中的示意图。绿色箭头突出显示用于通过点击化学偶联荧光团的乙炔基部分。绿色星号代表荧光团。(B - F") 幼年海葵息肉中EU(B - D")、EdU(E - E")标记的表皮细胞或EU和BrdU共标记的表皮细胞(F - F")的单共聚焦图像。C - C"表示B - B"中标记区域的更高放大倍数。D - D"描绘了来自流式细胞术样品的EU和伴刀豆球蛋白A标记的细胞，以显示细胞核和细胞质形态。注意EU信号的广泛核分布。(G - H) FxCycle Violet DNA染色的流式细胞术直方图(G)或DNA染料(DNA - A)和EU信号强度(Alexa555)的密度图(H)显示EU +细胞的DNA含量在和之间。和突出显示二倍体细胞的或细胞周期阶段中通常发现的DNA含量范围。(H)中的颜色梯度表示事件密度从高(红色)到低(蓝色)。 :表示平均标准误差。流式细胞术: 次重复。核染色(B’ - C”和E’ - F”中的蓝色):Hoechst33342。伴刀豆球蛋白A:Concanavalin A。K:1.(此处原文可能有误，推测应为1.000)；Pol:聚合酶。比例尺:20 µm(B”)、10 µm(C"、D”、E”、F”)或插图中的2 µm

使用ACME进行细胞浸解以及对细胞悬液进行Click-iT™反应

为了对提取的DNA或RNA进行印迹分析，以及通过流式细胞术量化EU+细胞的比例和信号强度，按照之前描述的方法[31, 32]，将“乙酸/甲醇”(ACME)浸渍方案应用于海葵幼体并进行标记后，将息肉解离并固定。简而言之，将5毫升新鲜的ACME溶液(15%甲醇/10%冰醋酸/10%甘油于超纯水)加入到轻柔MACS™ C管(美天旎生物技术公司)中已标记的息肉中，并在室温下于跷跷板式振荡器上孵育。孵育期间，在的ACME孵育后，使用轻柔MACS™组织匀浆器(美天旎生物技术公司)运行程序“B_01”进行初次解离，随后在接下来的内运行四次“Multi_A_01”程序，直到所有组织解离。将得到的细胞悬液用10 冰冷的 PBS/1%BSA洗涤两次，在于{{F?}}离心，重悬于的 PBS/1%BSA中，并通过预先湿润的 CellTrics滤网(Sys-mex)过滤。所得细胞在室温下用PTx(1x PBS，0.2% TritonX)通透15分钟，用1x PBS洗涤，然后在室温下于黑暗中用改良的Click反应混合物(Click-iT AScent RNA试剂盒，赛默飞世尔科技公司)孵育，其中反应缓冲液被 PBS取代。然后将细胞在于离心5分钟沉淀，用PTx洗涤，并转移至含有1% BSA的 PBS中，于4°C短期保存。如需长期保存，将细胞重悬于90%甲醇中，并保存在。

BrdU和RNA聚合酶II-Ser2的检测

免疫荧光

在与BrdU共标记的样本中, 在进行BrdU免疫荧光检测之前，将掺入的EU/EdU通过Click反应连接到Alexa Fluor 555(赛默飞世尔科技公司)。组织首先在室温下于中用孵育30分钟以使DNA可及，随后用PBTx(1x PBS，3% BSA，0.2% TritonX)多次洗涤，并在室温下于封闭溶液(1x PBS中含5% NGS，3% BSA和0.02% TritonX)中封闭。抗BrdU兔源一抗(赛默飞世尔科技公司，PA5 - 32256)在封闭溶液中按1:500稀释，并在于旋转振荡器上孵育过夜，不振荡。用PBTx洗涤3次后，组织在室温下于新制备的封闭溶液中封闭，并在室温下用1:1000山羊抗兔Alexa488抗体(赛默飞世尔科技公司，A - 11034)、1:5000 Hoechst33342(赛默飞世尔科技公司)于封闭溶液中孵育。然后将样本在PTx中洗涤3次以减少非特异性信号。

用于RNA聚合酶II CTD重复序列YSPTSPS磷酸化丝氨酸2(AB5095，Abcam)的免疫荧光标记，以指示活跃转录，对固定的、经点击反应的息肉进行洗涤，并在封闭溶液(1x PBS中含5% NGS、3% BSA和0.02% TritonX)中封闭。一抗(AB5095，Abcam)在封闭溶液中按1:500稀释，并在下于旋转摇床上孵育过夜，期间不颠倒。用PBTx(1x PBS、3% BSA、0.2% TritonX)洗涤5次后，在室温下于封闭溶液中封闭30分钟，然后加入1:1000的山羊抗兔Alexa488二抗(Invitrogen，A - 11034)以及1:5000的Hoechst33342，并在室温下放置。然后将样品在PTx中洗涤3次，并用封片剂封片以进行共聚焦显微镜观察。

共聚焦成像

对于整装标本图像，使用剃须刀片将固定并染色的息肉横向切开，将中段切片用ProLong Gold™(Invitrogen)作为封片剂固定在载玻片上。使用配备标准PMT探测器和60x硅浸透镜的奥林巴斯FLUOVIEW FV3000显微镜进行共聚焦成像。在每组图像的采集过程中，激光功率和传感器灵敏度设置保持一致:(i) 增殖细胞中强烈的核EU标记(图2A、C、E、G、I、K)；(iia) 核仁EU/EdU标记(图4A - D")或(iib) 图4E - H；(iii) EdU标记(图2B、D、F、H、J、L)；(iv) EUTP核标记(图5A - B)；(v) EUTP核仁标记(图5A’ - B’)；(vi) EC核标记(图5C - D)；(vii) EC核仁标记(图5C’ - D’)；(viii) EA标记(图5E - F)；(ix) HEK293T细胞中的EU/BrdU标记(图6F - G")；(x) 黑腹果蝇中的EU/BrdU标记(图6H - I")；(xi) 莱氏裸甲藻中的EU/BrdU标记(图6J - K")；(xii) 杜氏阔沙蚕中的EU标记(图6N - N’、P - P’)和EdU标记(图6M - M’、O - O’、Q - Q’)；(xiii) 透明海鞘中的EU/BrdU标记(图6L - M")。

使用Fiji/ImageJ [34,35]中的QuickFigures插件[33]对每组图像中的所有图像进行亮度和对比度的一致调整，但DNA染色在不同图像之间的调整方式有所不同。

流式细胞术

对于每个实验条件或 )，将两(2% DMSO对照)或三(其他所有)组每组7只幼体的重复样本解离并使用ACME固定，然后按照上述方法与Alexa Fluor 555偶联。细胞悬液用 FxCycle violet DNA染料(Invitrogen)在下过夜染色，并在LSRFortessa™(BD Life Sciences)流式细胞仪上运行。使用FlowJo 10.8版本(BD Life Sciences)分析EU标记的细胞(见门控策略补充图1，附加文件1)。简而言之，在使用FSC和SSC参数进行事件门控后，选择具有介于和之间的FxCycle violet DNA信号的细胞。在该细胞群体中，基于其高于未标记的2% DMSO样品阈值的Alexa555信号对EU阳性细胞进行门控。

图2 增殖细胞中的细胞核EU标记对核糖核酸酶A、核糖核酸酶H和放线菌素D不敏感，但对羟基脲敏感。(A-L) 幼年星状海葵表皮细胞的单共聚焦图像，这些细胞用EU(A、C、E、G、I、K)或EdU(B、D、F、H、J、L)标记，未进行任何处理(A、B)，或用核糖核酸酶A(C、D)、核糖核酸酶H(E、F)、0.2μM(G、H)和8μM(I、J)的转录抑制剂放线菌素D，或核糖核苷酸还原酶(RNR)抑制剂羟基脲(K、L)处理。细胞核染色(蓝色):Hoechst33342。比例尺:

在流式细胞仪检测后的EU标记细胞悬液中加入与Alexa Fluor™ 488偶联的伴刀豆球蛋白A，以观察细胞质和细胞核糖蛋白，勾勒细胞形态。

流式细胞术数据分析

基于DNA信号显示细胞周期分布的所有细胞中EU阳性细胞的比例(EU指数)及其荧光强度，使用单向方差分析在不同浓度的EU(0.5mM/1mM/5mM)之间进行分析。不同EU浓度之间的成对比较在Tukey多重比较检验中计算，并将调整后的p值表示为星号(补充图2，附加文件1)。

羟基脲、放线菌素D和dNTP孵育

对于使用羟基脲(Sigma，H8627)或0.2μM或8μM放线菌素D(Invi - trogen，A7592)进行的介入治疗，幼体在含有1%二甲基亚砜和50mM氯化镁的海葵培养基中与化合物预孵育30分钟。随后，将EU、EdU或二甲基亚砜加入培养基中，使EU或EdU的终浓度达到，二甲基亚砜的终浓度达到，并将息肉孵育。对于使用 dNTPs(New England Biolabs)进行的治疗，将每种核苷酸0.5mM直接加入含有2%二甲基亚砜的EU标记培养基中，孵育2小时。

在核糖核酸酶A或核糖核酸酶H中孵育

选择核糖核酸酶A的浓度超过的标准建议，以实现有效的RNA消化，并补偿固定组织样本中潜在的次优反应条件。

在Click-iT反应之后，将样品在PTx(0.2% TritonX，1x PBS)中用核糖核酸酶A(PureLink ，Invitrogen)在下处理15分钟，或在核糖核酸酶H反应缓冲液中用核糖核酸酶H(Thermo Fisher Scientific)在下处理。

孵育后，在固定和共聚焦显微镜检查之前，用PTx将组织洗涤3-5次。

用于斑点杂交可视化的总RNA提取

每个样本中，将50只带有欧盟标签的动物在的ACME溶液中匀浆，按上述方法洗涤，但不通过CellTrics™滤网过滤。在与Alexa Fluor 488进行Click反应后，所得细胞沉淀的一半用于提取总RNA，另一半用于提取基因组DNA。对于总RNA提取，将细胞与1 ml TRIzol试剂(Invitrogen)混合，在-20°C下保存长达一周，并根据制造商的说明进行轻微调整后进行处理。简而言之，将样品在下恢复至室温，通过反复颠倒与氯仿轻轻混合，并在以全速离心。转移水相并通过颠倒与等体积的100%异丙醇混合，在室温下孵育15分钟。通过在全速下离心15分钟沉淀RNA，用新制备的80%乙醇洗涤并再次离心。小心去除所有乙醇，并在的加热块上干燥。RNA重悬于无DNase和RNase的超纯水中，并在中用2U TurboDNase(Invitrogen)在下消化。用 (来自MEGAscript 试剂盒，Invitrogen)和糖原(Roche)在下沉淀RNA 。通过在全速下离心沉淀RNA，并用冰冷的80%乙醇洗涤。在沉淀空气干燥后，将RNA重悬于无DNase和RNase的超纯水中，并在NanoDrop(Thermo Scientific)上测量浓度。

基因组DNA提取

从ACME解离和Click反应获得的细胞沉淀的一半用于DNA提取，并保存在TE缓冲液(10mM Tris pH 8、1mM EDTA pH 8、25mM NaCl)中，于-20°C保存长达一周。解冻后，加入蛋白酶K，细胞在孵育直至完全消化。每个样品通过颠倒混匀与苯酚混合，并以全速离心。将上清液转移到一个新管中，与苯酚/氯仿(1:1混合)混合，并以全速离心。将上清液与 100%氯仿混合，并以全速离心。再次，转移上清液，并用 -乙酸盐pH 5.2和冰冷的100%乙醇沉淀。通过全速离心沉淀DNA，用冰冷的80%乙醇洗涤并再次离心。去除乙醇后，将沉淀空气干燥并重悬于无RNase和DNase的超纯水中。然后将DNA与 RNase A在孵育，并使用0.1体积 Na-乙酸盐和2.5体积冰冷的100%乙醇再次沉淀。通过全速(16000 g，4°C)离心10分钟沉淀DNA，并用80%冰冷乙醇洗涤。去除乙醇并空气干燥后，将DNA沉淀溶解于无DNase和RNase的超纯水中，并在Nano-Drop(赛默飞世尔科技)上测量其浓度。

台风成像

将EU标记动物和对照的ACME固定细胞悬液在与Alexa Fluor™ 488偶联后分开，用于基因组DNA和总RNA提取(见上文)。将总RNA和基因组DNA印迹在Amersham Hybond™-N+膜上，并用Typhoon生物分子成像仪(FLA 9000)使用激光和标准LPB滤光片读取Alexa488荧光。

海葵息肉中的动物培养、EU和BrdU共标记及成像

Exaiptasia diaphana菌株CC7 [36]的共生克隆系在下保存在1.5升塑料盒中，置于黑暗中，使用盐度为的过滤海水。息肉每周喂食5天，每周换水两次，每月刮擦盒子。所有实验均在实验前几天收集的来自克隆繁殖的小息肉上进行，以便恢复。

将息肉在含有2% DMSO、50mM MgCl 、0.5mM EU和0.1mM BrdU的过滤海水中标记两小时。在用含有50mM 的海水短暂冲洗后，将动物固定在 PBS、3.7% FA、0.2% TritonX、0.5% DMSO中，在室温下固定30分钟，然后在新鲜固定液中过夜固定。如上文所述，对BrdU进行洗涤、点击反应和免疫染色，方法与海葵相同。然后将一半动物在 ml RNase A(PureLink™，Invitrogen)中于PTx中在处理15分钟，并在PTx中洗涤5次，然后固定用于共聚焦成像。

将固定的完整动物用ProLong Gold™(Invitrogen)固定，并在配备标准PMT探测器和60x硅浸透镜的Olympus FLUOVIEW FV3000显微镜上成像。表皮区域的图像记录为z-stack，样品之间的激光功率和传感器灵敏度保持相同。除了DNA染色在图像之间进行不同调整外，所有图像在Fiji/ImageJ中均一致调整亮度和对比度。

HEK293T细胞的培养、EU和BrdU共标记及成像

将HEK293T细胞解冻并在含有DMEM(#41965，Gibco)、10% FBS的培养皿中在、、条件下于湿度控制的培养箱中培养代群体倍增。对于实验，将细胞接种到聚-D包被的玻璃底培养皿( No. 0，Mattek)中，培养至80%汇合度。

为了进行标记，将细胞在含有和的DMEM中于 DMSO中在培养箱中于37°C孵育，用DPBS(#14190，Gibco)洗涤，并用4% PFA(#28906，Thermo Scientific)固定30分钟。在用PBTx(1x PBS，3% BSA，0.2% TritonX)通透10分钟后，用1x PBS洗涤细胞，并按照制造商的说明与Alexa Fluor 488叠氮化物点击反应30分钟。

在用PTx(PBS，0.2% TritonX)短暂洗涤后，通过与在室温下孵育水解DNA，并用PBTx冲洗细胞。在PBTx中用5% NGS(封闭缓冲液)封闭，并将1:500的抗BrdU兔单克隆抗体(PA5-32256，Invitrogen)在封闭缓冲液中与细胞在室温下缓慢振荡孵育。在用PBTx洗涤三次后，加入1:1000的山羊抗兔-Alexa568抗体(A-11011，Invitrogen)以及1:5000的Hoechst33342在封闭缓冲液中，细胞在缓慢振荡过夜。通过在PBTx中洗涤三次去除二抗。

将一半样本与核糖核酸酶A(PureLink™，英杰公司)在磷酸盐缓冲盐水中于孵育15分钟，并用PTx洗涤三次。染色后的细胞直接在玻璃底培养皿( 编号0，Mattek)中的PTx中，在配备标准光电倍增管探测器的奥林巴斯FLUOVIEW FV3000显微镜下成像。使用硅浸透镜将图像记录为z轴堆叠，同时保持激光功率和传感器灵敏度恒定。在所有样本中，除了每个图像单独调整的Hoechst33342信号外，Alexa Fluor信号在Fiji/ImageJ中统一调整亮度和对比度。

海月水母栉水母幼虫的动物培养、5-乙炔基尿苷(EU)和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)共标记及成像

如前所述[37]，饲养并繁殖野生型海月水母的叶状成体(3 - 5厘米)。收集受精卵并在充气的1升玻璃烧杯中于孵育直至孵化。对于标记试验，在受精后内的栉水母被转移到12孔板中，并在含有 EU和 BrdU的2%二甲基亚砜的人工海水中孵育两小时。孵育后，将动物在含有0.1%吐温 - 20的3.7%甲醛的人工海水中于室温固定一小时。样本用PTw(1×磷酸盐缓冲盐水，0.1%吐温 - 20)洗涤三次，并在保存长达两天。

使用Click-iT™ Plus EdU细胞增殖成像试剂盒(Alexa Fluor™ 488，英杰公司)进行EU检测，与Click-iT™新生RNA捕获试剂盒相比，该试剂盒产生的EU信号强度更高。样本在含有3%牛血清白蛋白的PTw中封闭，用 TritonX洗涤一次，再用PTw洗涤一次。Click-iT反应按照制造商针对的说明在室温下进行，之后所有样本用PTw冲洗。

按照对星状海葵的描述，使用相同试剂进行BrdU检测(见上文)。样本在含有山羊抗兔 - Alexa568抗体(英杰公司；1:1000)和Hoechst33342(1:2000)的二抗溶液中于在孵育。对一半样本通过与核糖核酸酶A( 在磷酸盐缓冲盐水中)在于孵育进行RNA消化。

所有样本使用间隔物(两层透明胶带)安装在SlowFade Glass Soft-set抗荧光淬灭封片剂(S36917，英杰公司)中，并用CoverGrip盖玻片密封剂(23005，碧迪公司)密封。共聚焦成像和图像处理按照对星状海葵的描述进行。

黑腹果蝇幼虫成虫盘的动物培养、EU和BrdU共标记及成像

如前所述[38]培养w1118品系的黑腹果蝇。简而言之，果蝇在每升含有干马铃薯粉、60克蔗糖、27.3克干酵母、7.3克琼脂、4.55毫升丙酸和2克尼泊金的固体培养基上生长，温度为25°C，湿度为70%，昼夜周期为12小时。从三龄幼虫中在施奈德果蝇培养基(产品编号:L0207 - 500)中解剖出翅成虫盘。

将解剖后的翅成虫盘在含有0.5mM EU、0.1mM BrdU、2% DMSO的施耐德果蝇培养基中于室温下振荡孵育1小时。用培养基冲洗后，将组织在4%甲醛/PBS中固定20分钟。固定后的样品在PTx(1x PBS，0.1% Triton-X)中冲洗三次，然后在PBTx(1x PBS，0.1% Triton-X，0.5% BSA)中封闭15分钟。用PBS冲洗后，按照制造商的方案(Click-iT" 新生RNA捕获试剂盒，Invitrogen)在室温黑暗条件下对Alexa Fluor™ 488叠氮化物进行Click-IT™反应。样品在PTx中冲洗5次，然后在室温下于中孵育。在PBTx中冲洗三次并洗涤四次，每次20分钟后，加入抗BrdU抗体(Invitrogen，PA5-32256，1:(此处原文有误，应为1:500)500，溶于PBTx)并在过夜孵育。在加入驴抗兔-Alexa Fluor 555抗体(A31572，Invitrogen；1:1000溶于PBTx)之前，样品在PBTx中彻底洗涤。在室温下振荡孵育2小时后，将经过Click反应的成虫盘如前在PBTx中洗涤，并用DAPI(D9542，Sigma-Aldrich)染色，然后用PTx冲洗。

每种处理的一半样品在室温下于用 RNase A(PureLink ，Invitrogen溶于PTx)孵育。然后将翅成虫盘安装在载玻片上的NPG水性封片剂(NPG/甘油/磷酸盐缓冲液)中，并用配备60x硅树脂浸没物镜的奥林巴斯FLUOVIEW FV3000共聚焦显微镜进行成像。图像之间的成像设置保持恒定。在Fiji/ImageJ中对图像进行分析，在其中对信号的亮度和对比度进行一致调整。

多毛类动物杜氏阔沙蚕再生体的动物培养、EU和EdU标记、RNase处理及成像

杜氏阔沙蚕再生体如先前所述 [39] 制备。简要地说，从在至温度下以光暗(LD)周期培养的实验室培养物(维也纳PIN品系)中取样标本。将长度为40 - 50节的非生殖成虫固定在1:1稀释于人工海水(ASW)中的7.5% 中。使用手术刀片(Swann-Morton，Type10，0101)在立体显微镜下于第20节进行后横向截肢。将动物转移到装有ASW的培养盒中再生至第2阶段(约48小时)。

将再生动物置于溶解于人工海水(ASW)的、0.01mM EU或0.5mM EU中，在玻璃烧杯中于室温孵育。在 /ASW中固定后，动物在含有0.1%吐温-20(PTw)的中的4%多聚甲醛(PFA)中固定，在室温下振荡。固定后的动物在 (1x PBS + 0.2% TritonX)中洗涤，并使用手术刀刀片采集包括5个前段的再生组织。样品在组织透明溶液[40]中于透明，在PTx中洗涤3次，每次5分钟，然后按照制造商的指南进行EU(Invitrogen，C10329)或EdU(Invitrogen，C10337)的Click-IT反应。样品在PTx中洗涤3次，每次5分钟，然后在室温下于PTx中用1:1000的Hoechst33342孵育，随后在PBS中洗涤3次。可选地，在下，用 RNaseA(EN0531，Thermo Scientific)在PTx中处理样品。在用PTx洗涤3次，每次5分钟后，样品在Vectashield抗褪色封片剂(Vector Laboratories，H-100-10)中于过夜保存，并盖上盖玻片安装在载玻片上。使用蔡司Zen软件，在配备LD LCI Plan-Apochromat 40x/1.2 Multi-Immersion、WD 0.41 mm镜头的蔡司LSM900共聚焦显微镜上拍摄共聚焦图像。使用Fiji/ImageJ处理图像以调整对比度、颜色并创建叠加图像。

结果

EU强烈标记海葵星状海葵增殖细胞的细胞核

为了研究海葵星状海葵中的从头RNA转录，我们采用了基于Click化学的EU方案[22]来可视化和定量喂食的幼年水螅体中的RNA转录本(图1A)。使用流式细胞术(补充图1，补充文件1及方法)，我们首先对不同浓度(0.5mM、1mM和5mM)的EU进行了基准测试，以确定最佳工作浓度(补充图2，补充文件1)。我们发现，在中用和 EU孵育导致所有细胞中EU标记细胞的比例很小(即EU指数)，而在5mM EU时，EU指数显著降低(补充图2A，补充文件1)。我们还看到，EU+细胞的荧光强度随着EU浓度的增加而降低(补充图2B，补充文件1)。这一结果表明，较高的EU浓度可能会抑制摄取或整合，因此我们选择作为EU孵育的标准工作浓度。

使用共聚焦成像，我们发现，用2小时的 EU脉冲标记幼年海葵，结果显示，显示高EU信号的细胞亚群出乎意料地小(图1B - C")。在这些EU+细胞中，荧光信号广泛分布于整个细胞核(图1C、D - D")，这与其他系统中EU标记所描述的核仁中的强烈信号不同[23, 41]。为了测试活跃的mRNA转录是否意外地局限于幼年海葵中的一小部分细胞，我们使用免疫荧光检测RNA聚合酶II C末端重复序列上的磷酸化丝氨酸-2(pSer2)，该序列标记活跃的转录延伸。与EU信号相反，在所有细胞中都检测到了pSer2(补充图3，附加文件1)。

EU+细胞的空间分布和相对比例让人联想到用5-乙炔基2’-脱氧尿苷(EdU)标记的喂食幼体中的增殖细胞，EdU是一种2’-脱氧核苷类似物，在S期整合到DNA中[32, 42]。直接比较表明，确实，在孵育2小时后，EU信号在外观和丰度上都与EdU信号非常相似(比较图1C - C"与1E - E")。由于EU和EdU都含有乙炔基部分，它们不能用两种不同的炔基化荧光团独立进行点击标记。因此，我们将EU与BrdU共同孵育作为EdU的替代物，发现两种标记在整个表皮中广泛共染相同的细胞核(图1F - F")。为了测试EU+细胞是否确实在S期进行DNA复制，我们使用流式细胞术对它们的DNA含量进行了定量(图1G、H；见补充图1，附加文件1，以及门控策略的方法)。我们证实，EU+细胞仅占所有细胞的一小部分( )(图1G)，并且它们的DNA含量在和之间，这是S期细胞的典型特征(图1H)。总之，我们的结果表明，EU始终标记海葵中S期细胞的细胞核。

增殖细胞中的EU信号对核糖核酸酶A、核糖核酸酶H和转录抑制剂放线菌素D不敏感

在许多生物体中，DNA复制在S期伴随着mRNA转录[43]。此外，DNA引发酶产生滞后链和前导链DNA复制起始所需的RNA引物[44]。因此，我们测试了EU的强核标记是否对降解单链RNA的核糖核酸酶A[45]或降解RNA/DNA杂交体的核糖核酸酶H敏感。我们发现，核糖核酸酶A和核糖核酸酶H处理对EU或EdU信号的强度都没有任何影响(图2A - F)，这支持了EU和EdU都整合到了海葵的DNA中。

此外，我们推断，如果EU标记DNA，该信号应该对RNA转录抑制剂如放线菌素D(ActD)不敏感，放线菌素D通过插入转录活跃的DNA来抑制RNA合成[47, 48]。ActD以前曾被用作RNA转录抑制剂，以验证EU在培养细胞中整合到RNA中是转录依赖性的[22]。在海葵中，我们观察到，低或高浓度(8μM)的ActD对细胞核EU或EdU染色没有影响(图2G - J)。因此，海葵幼体表皮增殖细胞中的细胞核EU标记对ActD的转录抑制以及核糖核酸酶A和H处理不敏感，这使我们得出结论，EU在S期整合到DNA中。

欧盟(EU)整合到DNA中可以通过EU向EdU的多步转化来解释，这一过程涉及核糖核苷酸还原酶(RNR)将核糖还原为2’-脱氧核糖，该酶在生命的所有领域中都高度保守。我们通过使用羟基脲(HU)来测试这种可能性，羟基脲是一种RNR的选择性抑制剂，它能广泛地使细胞周期停滞在S期，例如在刺胞动物水螅中[49, 50]，可能是通过耗尽dNTP库[51, 52]。在先前的研究中，HU处理被用于小鼠和人类细胞系，以确认EU在转录过程中特异性地整合到RNA中，这是一个典型的不依赖RNR的过程[22,53]。正如预期的那样，我们发现20μM HU孵育消除了EdU标记(图2L)，这与海葵中细胞增殖的阻滞一致。相应地，HU处理也消除了增殖细胞中细胞核的EU标记(图2K)。这进一步证实了EU整合到增殖细胞的DNA中，可能是在被RNR转化为EdU之后。

最后，我们使用斑点印迹法来测试在孵育的海葵幼体的RNA或基因组DNA中是否能检测到EU(图3A)。将来自EU标记动物和对照的细胞悬液与Alexa488荧光团进行点击反应，并分成两部分以提取无RNA的基因组DNA以及无DNA的总RNA(见方法)。将DNA和RNA提取物印迹在膜上，以基于Alexa488荧光比较它们的EU信号强度。我们在经RNase A处理的DNA中记录到了对DNase I敏感的(图3G)EU信号(图3D - G)，以及在经DNase I处理的RNA组分中记录到了EU信号(图3B)，这表明在海葵中，EU不仅整合到了DNA中，还整合到了RNA中。

图3在提取的基因组DNA和总RNA中检测到EU。(A)实验设置的示意图总结。详情见方法。(B - G)来自用(B、D、F、G)或不用EU(C、E)孵育的动物的无DNA总RNA(B、C)或无RNA基因组DNA(D - G)的斑点印迹，以及未处理(F)或用DNase I处理(G)的情况。通过Alexa488荧光记录EU信号。印迹上所加样品体积对应于2至10微升之间

EU也在小的、核仁样结构中微弱标记RNA

发现EU不仅整合到海葵的DNA中，还整合到RNA中，这使我们重新审视使用增加的激光强度和探测器灵敏度对EU标记的幼体表皮进行共聚焦成像。我们推断，EU整合到RNA中应该主要标记核仁，因为核仁是转录活性高的位点，就像在先前明确的RNA标记的案例中看到的那样[22]。确实，我们在大多数细胞核的小的点状结构中发现了微弱的EU信号，这可能表明核仁RNA转录(图4A - A")。

然而，由于增殖细胞复制DNA时荧光信号过度饱和，我们无法确定这些细胞是否还含有额外的EU +核仁点状结构。核仁信号对核糖核酸酶A处理敏感，而增殖细胞中的强标记不受影响(图4B - B")。与EU不同，用EdU孵育未标记任何核仁样结构，表明低EU信号确实由标记的RNA组成(图4C - D")。为了进一步验证这一假设，我们研究了用放线菌素D抑制转录活性是否会影响核仁样标记(图4E，F)。我们观察到0.2μM放线菌素D对核仁EU标记没有可检测到的影响(图4E)。相反，8μM放线菌素D [28]消除了任何可检测到的EU +点状结构(图4F)，表明它们的标记依赖于转录活性。使用羟基脲抑制核糖核苷酸还原酶导致先前在增殖细胞中观察到的强核染色消失(图4G)，而只有核仁EU染色持续存在。我们的结果支持这样的结论，即微弱的点状EU信号对应于新生核糖体RNA，是海葵表皮细胞中转录活性最高的位点。EU潜在地双重整合到RNA和DNA中，这就提出了一个问题，即在DNA合成而非RNA合成过程中，补充脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)是否会胜过EU。然而，提供过量的外源性dNTPs并没有导致核仁或增殖细胞的EU标记有任何重大变化(图4H)。总之，我们的结果表明，EU被整合到海葵增殖细胞的DNA和转录活性细胞的RNA中。

图4 EU而非EdU标记后的小核仁样点对核糖核酸酶A和放线菌素D敏感，但对羟基脲或过量的dNTPs不敏感。用EU(A - B"，E - H)或EdU(C - D")标记的海葵表皮细胞的单共聚焦图像，在相对较高的激光强度和探测器灵敏度下采集。(A - B")EU标记小的核仁样点(箭头)，核糖核酸酶A处理后消失。A"中的插图显示了框选区域的更高放大倍数，并描绘了三个细胞核中标记的核仁样点状结构。(C - D")使用与A - B"相同的检测参数，EdU标记特异性针对增殖细胞的细胞核(C - D")。(E - F)小核仁样点(箭头)中的EU标记对低浓度(E)不敏感，但被高浓度(F)的转录抑制剂放线菌素D消除。(G)羟基脲抑制核糖核苷酸还原酶导致强核染色减少，但小核仁样标记(箭头)不受影响。(H)添加过量的dNTPs似乎对EU标记没有影响。核染色(蓝色):Hoechst33342。比例尺: (插图中为2μm)

5 - 乙炔基尿苷三磷酸、5 - 乙炔基胞苷和5 - 乙炔基腺苷也不能特异性标记RNA

DNA和RNA的双重标记极大地限制了使用EU来可视化和量化星状海葵中从头RNA转录水平。为了寻找替代方法，我们探索了5-乙炔基-UTP(EUTP)在星状海葵中特异性标记新生RNA的潜力，推测它可能不会作为RNR的直接底物，并且可以直接整合到RNA中[54]。此外，我们测试了5-乙炔基胞苷(EC)和5-乙炔基腺苷(EA)作为潜在替代物的标记特性。对于EUTP和EC，我们始终在一小部分细胞核中发现强烈的、对RNase A不敏感的信号，在小核斑点中发现微弱的、对RNase A敏感的信号(图5A-D’)。这强烈表明EUTP、EC和EU之间的标记特性没有明显差异。相比之下，EA孵育导致整个表皮细胞质广泛的、对RNase A不敏感的标记(图5E、F)，特别是在纵肌和环肌细胞中，这表明EA被代谢并标记ADP/ATP池(图

图5 EU的潜在替代物5-乙炔基尿苷三磷酸(EUTP)、5-乙炔基胞苷(EC)和2-乙炔基腺苷(EA)也整合到DNA中或标记其他非RNA结构。使用EUTP(黄色)、EC(红色)或EA(青色)标记的星状海葵表皮(A-F)或胃皮(G)细胞的单共聚焦图像(A-F)或共聚焦成像堆栈(G)。(A-D’)在假定增殖细胞的分散细胞核中检测到EUTP(A-B’)和EC(C-D’)，并且它们的信号对RNase A不敏感(A-D)。在高激光强度和探测器灵敏度下，这两种化合物还标记对RNase A敏感的小核仁样点(箭头)( )。(E-G)EA标记广泛存在于表皮(E)中，并且对RNase A降解不敏感(F)。EA信号也显著存在于肌肉细胞的收缩丝中(G)。核染色(蓝色):Hoechst33342。circ. mus.:环肌；fil.:细丝；par. mus.:壁肌。比例尺:插入图中为

图6(见下一页图例。)

(见上一页的图。)

图6 不同模型系统中的乙炔基尿苷(EU)标记揭示了可变的RNA和DNA掺入模式。(A-E)人胚肾细胞系HEK293T、黑腹果蝇、海月水母、强壮艾氏海葵和杜氏阔沙蚕中检测区域的示意图，红色框表示成像组织以及下方总结的EU信号的亚细胞定位。(F-M")HEK293T细胞(F-G")、黑腹果蝇的翅芽(H-I")、海月水母的表皮梳状区域(J-K")和强壮艾氏海葵的表皮体柱(L-M")中EU(绿色)和BrdU(品红色)的共标记。(N-Q’)杜氏阔沙蚕再生体中的EU(绿色)和EdU标记(品红色)。样品要么未处理(F-F"、H-H"、J-J"、L-L"、N-O’)，要么用200μg/ml核糖核酸酶A处理(G-G"、I-I"、K-K"、M-M"、P-Q")。注意，在强壮艾氏海葵中，对核糖核酸酶A不敏感的核EU标记与BrdU重叠(L-M")，这与EU整合到DNA中一致。还要注意用EU(N-N’、P-P’)或EdU(O-O’、Q-Q’)标记的杜氏阔沙蚕尾部再生体的核定位和对核糖核酸酶A不敏感。样品未处理(N-O’)或用核糖核酸酶A处理(P-Q’)。图像显示单共聚焦图像(HEK293T、杜氏阔沙蚕)或共聚焦堆栈(强壮艾氏海葵、海月水母、黑腹果蝇)。核染色(蓝色):Hoechst33342。比例尺:10μm(插图中为2μm)5G)[55]。总之，我们得出结论，EUTP、EC或EA不是在星状海葵中特异性标记新生RNA转录本的EU的合适替代品。

不同系统中的EU标记揭示了RNA和DNA掺入的多样性

星状海葵中EU意外掺入DNA促使我们探究这种现象是星状海葵特有的，还是在其他动物物种中更广泛地发生。因此，我们研究了另外五个物种的增殖组织和细胞培养中的EU掺入情况(图6A-E)，推断对脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)的需求增加可能有利于EU代谢重利用或错误掺入DNA。

为了验证EU用于研究转录活性的用途，我们在两个用于细胞增殖的特征明确的模型系统中检测了EU掺入情况:永生化的人胚肾细胞系HEK293T [56]和黑腹果蝇正在生长的翅成虫盘 [57]。在这两个系统中，EU标记在大多数细胞中突出了核仁，与BrdU不同且对核糖核酸酶A敏感(图6F-G"，图6H-I")。因此，我们证实了之前的报道，即EU在HEK293T细胞 [58]和果蝇 [59]中特异性标记RNA。

然后我们评估了强壮艾氏海葵中的EU掺入情况，强壮艾氏海葵是一种兼性共生海葵，用于研究海葵和珊瑚中的宿主 - 共生体关系 [60 - 62]。研究强壮艾氏海葵的表皮(图6D)，我们发现EU与BrdU在增殖细胞核中共定位。这种EU信号对核糖核酸酶A处理有抗性(图6L-M")，与我们在星状海葵中的观察结果相似。尽管我们在强壮艾氏海葵中未检测到EU标记的RNA，但我们不能排除在为RNA信号恢复优化的条件下EU也掺入RNA的可能性。然而，星状海葵和强壮艾氏海葵都具有将EU掺入DNA的能力，并且由于它们的最后一个共同祖先可追溯到所有海葵的起源，这可能代表了这个刺胞动物群体中的一个祖先特征。

我们还研究了5-乙炔基尿苷(EU)在栉水母海毛虫和多毛纲动物杜氏阔沙蚕中的掺入情况，这两种海洋物种被用于研究神经系统的进化和再生等其他研究问题[39, 63 - 65]。在杜氏阔沙蚕中，我们比较了尾部再生过程中EU和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)的标记情况，尾部是富含增殖干细胞和祖细胞的组织[66]。与星状海葵和艾氏海葵相似，在一部分细胞中，EU信号在整个细胞核中被发现，而不是在点状的、几乎普遍存在的核仁中(图6N - N’)，因此与增殖细胞的EdU标记非常相似(图6O - O’)。EU和EdU标记的强烈核信号对核糖核酸酶A不敏感(图6P - Q’)。此外，我们在一些杜氏阔沙蚕细胞中发现了对核糖核酸酶A敏感的核仁EU信号(图6N’，P’)。总之，这些结果表明在杜氏阔沙蚕中，EU主要标记DNA，但也标记RNA。

在栉水母海毛虫中，我们研究了发育中的栉带周围的表皮细胞(图6C)，发现尽管EU和5-溴脱氧尿苷(BrdU)共同标记了一些细胞，但EU信号明显定位于核仁(图6J)，在那里没有观察到BrdU信号，并且对核糖核酸酶A消化敏感(图6K")。这些观察结果表明在海毛虫表皮中，EU主要标记RNA。

总之，我们的结果表明，不能普遍依赖EU作为新生RNA的特异性标记。相反，其对RNA的特异性在不同物种和组织中差异显著，这突出了在使用EU时考虑并控制潜在DNA整合的必要性。

讨论

将EU孵育与基于点击化学的荧光团标记相结合，有望提供一种快速、简便且可商购的方法来可视化新生RNA和转录活性。在本研究中，与我们的预期相反，我们发现EU在海葵星状海葵和艾氏海葵以及环节动物杜氏阔沙蚕中显著标记了增殖细胞的核DNA。我们的结论基于EU和BrdU之间的共定位、EU和EdU之间的相似染色以及在增殖细胞中发现的强烈核EU信号对核糖核酸酶A不敏感。我们发现抑制核糖核苷酸还原酶(为DNA合成挽救核糖核苷酸的酶[13 - 15])，显著降低了星状海葵中的EU信号，这进一步巩固了EU整合到复制DNA中的观点。

从用EU标记的星状海葵幼体息肉中生化分离出单独的RNA和基因组DNA组分后，我们不仅在DNA中检测到了EU，还在RNA中检测到了。通过共聚焦显微镜提高灵敏度，我们确实也能在星状海葵大多数表皮细胞以及杜氏阔沙蚕再生组织中的小的、核仁样斑点中观察到对核糖核酸酶A敏感的EU信号。此外，在星状海葵中，高浓度的转录抑制剂放线菌素D抑制了微弱的核仁EU信号。

总之，我们的数据表明，在星状海葵中，EU以及替代物5-乙炔基三磷酸尿苷(EUTP)和5-乙炔基胞苷(EC)主要整合到DNA中，在较小程度上整合到RNA中。在星状海葵、艾氏海葵和杜氏阔沙蚕中发现的强烈核EU标记对应于复制的DNA。这一结果与核糖核苷酸还原酶是将EU挽救为5-乙炔基-2’-脱氧尿苷三磷酸(EdUTP)的代谢网络一部分的情况相符。相反，在人类胚胎肾293T细胞、果蝇翅盘和栉水母海毛虫的表皮中，发现EU主要整合到新生RNA中。

我们通过共聚焦成像、流式细胞术或荧光辅助细胞分选(FACS)证明了使用EU-点击标记在星状海葵、艾氏海葵和杜氏阔沙蚕中可视化和定量新生RNA的局限性。很可能，EU和其他标记的核苷对于RNA测序方法，如4-硫尿苷测序(4sU-Seq)[67, 68]或全局运行测序(GRO-Seq)[69]仍然有用，因为在样品和文库制备过程中EU标记的DNA会被去除。然而，应该注意的是，EU对DNA的高整合率可能会导致EU对新生RNA的标记产量较低。

据我们所知，我们首次报告了欧盟在任何动物物种或组织中同时标记RNA和DNA的情况。鉴于其他标记核苷或核苷酸也观察到了双重标记(另见引言)[17 - 19]，我们的研究进一步加深了对它们不加区分地用于特异性标记RNA的怀疑，而这种怀疑很少通过直接和系统的方式得到验证。强烈增殖的组织可能特别容易出现双重标记，因为它们对dNTPs的高需求可能有利于通过转化为EdUTP将欧盟导向DNA复制。在全面筛选近期文献时，我们发现反复有报道称，在高度增殖组织的一部分细胞中，欧盟强烈标记整个细胞核——而不是点状的核仁。我们发现了欧盟标记模式的例子，让人联想到海葵再生过程中EdU或BrdU对DNA的标记[28]，斑马鱼幼体大脑[70]、小鼠肠道隐窝细胞[22, 53]、精巢[71]、颗粒细胞[72]、胚胎皮层[73]和小脑[74]中的情况。我们的报告表明，欧盟在不同动物和组织中的标记行为难以预测，并强调了进行可靠对照的必要性。通常，RNA标记的特异性通过使用转录抑制剂如放线菌素D [22, 75]或α - 鹅膏蕈碱[76, 77]来验证。然而，先前的报告表明，由此产生的转录应激可能会诱导DNA损伤并导致细胞周期抑制[78 - 80]。因此，仅用转录抑制剂作为RNA特异性的唯一验证可能是不够的，因为使用放线菌素D或 - 鹅膏蕈碱后欧盟信号的任何损失也可能是由于抑制DNA复制导致的。虽然放线菌素D在海葵中有效地区分了欧盟标记的DNA和RNA，但在其他系统中使用可能会有更多问题。

在RNA不是DNA酶底物的前提下，另一种有问题的验证试验通常涉及证明欧盟标记对DNA酶I消化不敏感[81]。该试验没有直接解决是否掺入RNA的问题，并且也容易出现固定假象，因为基于甲醛的固定会导致DNA和蛋白质之间形成稳定的共价键，从而抵抗DNA酶I处理[82]。这种现象在BrdU检测试验中很明显，在该试验中，对含标记DNA进行DNA酶I消化以增强抗体可及性，而不会显著损害BrdU信号[83]。

到目前为止，欧盟的RNA特异性在体外系统(如NIH 3T3或HeLa细胞)中得到了最广泛的验证，假设结果可转移到更复杂的动物系统，如小鼠[22, 53]。虽然我们不能最终评估这一假设的有效性，但我们的发现强调了标准化对照在所有实验相关背景下验证欧盟或其他基于核苷酸的RNA标记方法特异性的重要性。根据我们的经验和观察，我们发现以下欧盟标记特征表明存在DNA整合:

细胞核广泛标记，无明显核仁信号。
有丝分裂细胞中染色体浓缩或中期平面标记。
增殖组织中较小部分细胞的细胞核标记。
对RNase A处理不敏感。
对转录抑制剂(如放线菌素D)不敏感。

出现这些特征中的一个或几个应促使进行进一步的验证实验。我们提出以下良好实践指南，以在使用欧盟可视化新生RNA时排除潜在的DNA整合:

通过以下方法验证欧盟标记的RNA特异性

RNase A处理。源自掺入RNA的欧盟信号应对RNase A或其他广泛作用的核糖核酸酶(如RNase T1)敏感。相比之下，欧盟标记的DNA不会被RNase A去除，并且在固定组织中也可能对DNA酶I处理不敏感(见上文)。

通过与EdU或BrdU标记直接比较，研究增殖组织或细胞培养中欧盟标记的高变异性。对欧盟和EdU或BrdU标记的细胞进行直接比较将有助于揭示标记频率、强度和位置的差异或相似性。我们建议在同一组织上共同标记欧盟和BrdU作为金标准，以测试欧盟是否整合到增殖细胞的复制DNA中。
在使用转录抑制剂控制RNA特异性时，考虑潜在的细胞周期脱靶效应。转录抑制通常会导致细胞应激，从而改变细胞周期、影响DNA合成速率或导致细胞死亡。因此，由此产生的欧盟信号损失可能是由于转录减少或增殖受阻导致的。

欧盟(EU)及其他基于核苷的新生RNA标记方法存在显著局限性，因为它们有可能在代谢过程中被转化并掺入DNA。我们的研究表明，不同生物的EU掺入模式存在显著差异，在某些生物中特异性标记RNA，而在另一些生物中则主要整合到DNA中。核苷酸类似物命运的变异性可能源于核苷转运的物种特异性差异、补救途径活性的差异或聚合酶特异性的差异。除了给转录研究带来技术障碍外，EU在RNA/DNA掺入方面的差异还凸显了生物在核苷酸利用和处理方式上的有趣多样性。因此，了解生命之树上核苷酸代谢的细微差别对于开发更具特异性的RNA标记工具至关重要，特别是对于像EU这样的传统核苷类似物主要标记DNA的物种和环境。

结论

我们的研究表明，在海葵N. vec-tensis、E. diaphana和多毛纲动物P. dumerilii中，新生RNA标记化合物5-乙炔基尿苷(EU)主要整合到DNA而非RNA中。相比之下，EU在HEK293T细胞、果蝇D. melanogaster的翅盘以及栉水母 . leidyi的表皮细胞中特异性标记RNA。这些截然不同的发现揭示了在某些动物模型中使用EU研究转录时的关键局限性，并强调了在未经验证的生物学背景下，特别是在高增殖组织中，通过实验解决DNA掺入问题的必要性。更广泛地说，观察到的EU掺入模式的变化也指向了核苷酸代谢中潜在的物种特异性差异。了解这些差异对于开发针对不同模式生物的更可靠的RNA标记工具至关重要。

缩写
2N / 4N	二倍体细胞复制前(2N)和复制后(4N)的DNA含量
4sU-Seq	4-硫尿嘧啶测序
方差分析	方差分析
人工海水	人工海水
放线菌素D	放线菌素D
ACME	乙酸/甲醇(浸渍方案)
Alexa488	Alexa Fluor™ 488荧光团
Alexa555	Alexa Fluor™ 555荧光团
Alexa568	Alexa Fluor™ 568荧光团
阿糖胞苷	阿糖胞苷
牛血清白蛋白	牛血清白蛋白
溴脱氧尿苷	5-溴-2’-脱氧尿苷
CAT	目录编号
CC7	透明海葵的克隆菌株名称
刀豆球蛋白A	刀豆球蛋白A
环肌	环肌
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DNA染色剂)	4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DNA染色剂)
双蒸水	双蒸水
2’-脱氧核苷二磷酸	2’-脱氧核苷二磷酸
脱氧核苷三磷酸	脱氧核苷三磷酸
杜氏改良Eagle培养基	杜氏改良Eagle培养基
二甲基亚砜	二甲基亚砜
脱氧核糖核酸	脱氧核糖核酸
DNA信号面积/高度(流式细胞术)	DNA信号面积/高度(流式细胞术)
脱氧核糖核酸酶I	脱氧核糖核酸酶I
杜氏磷酸盐缓冲盐水	杜氏磷酸盐缓冲盐水
2-乙炔基腺苷	2-乙炔基腺苷
5-乙炔基胞苷	5-乙炔基胞苷
乙二胺四乙酸	乙二胺四乙酸
5-乙炔基尿苷	5-乙炔基尿苷
用5-乙炔基尿苷标记的细胞	用5-乙炔基尿苷标记的细胞
EUTP	5-乙炔基尿苷三磷酸
EdU	5-乙炔基-2’-脱氧尿苷
EdUTP	5-乙炔基-2’-脱氧尿苷三磷酸
EdU+	用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷标记的细胞
氟达拉滨	9-β-D-阿拉伯呋喃糖基-2-氟腺嘌呤
FA	甲醛
FACS	荧光激活细胞分选
FBS	胎牛血清
Fil.	细丝
FSC-A/H	前向散射面积/高度
5-氟尿嘧啶	5-氟尿嘧啶
5-FUTP	5-氟尿嘧啶三磷酸
5-FdUTP	5-氟-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸
g	相对离心力(离心)
	细胞周期的G1期
	细胞周期的G2期和有丝分裂期
GRO-Seq	全局运行测序
3H	氚(氢同位素)
HEK293T	人胚肾293T(细胞系)
HSD	真实显著差异(Tukey事后检验)
HU	羟基脲
K	千(1000)
Milli-Q	超纯水
mRNA	信使核糖核酸
NDP	核苷二磷酸
NGS	正常山羊血清