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聚合酶θ在类别转换重组过程中修复S期持续存在的G1期诱导的DNA断裂

发布时间：

2026-08-19 15:30

聚合酶θ在类别转换重组过程中修复S期持续存在的G1期诱导的DNA断裂

蒂梅亚·马顿，王景龙，阿毛里·韦塞©1,3，于伟©1,5，皮埃尔 - 亨利·科梅尔，昆汀·霍勒维尔，特里斯坦·埃斯皮 - 考莱特，理查德·弗罗克©2 及卢多维克·德里亚诺6

非同源末端连接(NHEJ)是B淋巴细胞免疫球蛋白重链(Igh)类别转换重组(CSR)过程中修复G1期诱导的DNA双链断裂(DSB)的主要途径。在缺乏NHEJ(XRCC4)或DSB末端保护(SHLD1)的B细胞中，CSR期间的末端连接通过替代末端连接途径进行。聚合酶θ(Pol θ)被广泛认为是该途径的介导者，在有丝分裂期间同源重组不可用时，对于修复复制相关的DSB至关重要。在本研究中，我们检测了缺乏XRCC4、SHLD1和/或Pol θ的原代B细胞中的CSR，揭示了两种修复途径:不依赖Pol θ的有效转换和依赖Pol θ的无效转换，其特征为末端切除、倒位和微同源性。此外，我们表明在NHEJ缺陷情况下，Pol θ介导的修复与G1期到S期的转变同时发生，并且独立于RHINO和PLK1。因此，在缺乏NHEJ的情况下，Pol θ在S期而非有丝分裂期间修复持续存在的G1期DSB。

收到日期:2025年3月26日

接收日期:2025年10月17日

在线发表日期:2025年11月26日

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聚合酶θ(Pol θ)由小鼠中的Polq基因编码，是一种特殊的易出错DNA聚合酶，在微同源性(MH)介导的末端连接(一种替代末端连接(alt - EJ)途径)中起重要作用。Pol 由一个独特的N端解旋酶结构域组成，能够取代复制蛋白A(RPA) ，一个C端聚合酶结构域，能够生成短片段的新生DNA 和模板化插入，以及一个无序的中央区域，部分对于通过磷酸化进行调节是必需的。除真菌外，在物种间显著保守，Pol 通过其对齐包含的3’突出端并修复DNA末端的能力在DNA修复中起关键作用，常常导致小的插入或缺失，这会导致基因组不稳定。在过去几年中，Pol θ已成为同源重组(HR)缺陷的癌症(如具有BRCA1/2突变的癌症)中的一个重要治疗靶点。这些癌细胞表现出“Pol θ成瘾”，在复制应激条件下依赖Pol 介导的末端连接(TMEJ)来生存。认识到其治疗潜力，几家制药公司已开发出Pol θ抑制剂，其中一些目前正在进行临床试验，为治疗HR缺陷癌症提供了一条有前景的途径。

TMEJ主要被认为是一种DNA修复机制，供那些由于HR相关基因中的有害突变而无法通过同源重组(HR)修复DNA损伤的细胞使用。然而，最近的研究结果突出了TMEJ在有丝分裂过程中的关键作用。在修复功能正常的细胞中，HR和非同源末端连接(NHEJ)在细胞周期的M期通常受到抑制，这意味着在此细胞阶段持续存在的DNA断裂仍未得到解决。这种未解决的DNA损伤在细胞分裂过程中对基因组稳定性构成重大威胁。与HR或NHEJ不同，TMEJ在此阶段活跃，使细胞能够在完成细胞分裂之前修复残留的双链断裂(DSB)。这种有丝分裂修复过程由Polo样激酶1(PLK1)的多功能活性协调，其磷酸化事件激活Pol 并将其招募到有丝分裂DSB处。招募依赖于RHINO/TOPBP1复合物。HR缺陷细胞，如BRCA2基因缺失的细胞，面临独特的脆弱性。如果Pol 或RHINO(一种911复合物相互作用蛋白)缺失，这些细胞在有丝分裂期间无法修复S/G2期诱导的DSB 。这种缺陷是BRCA突变与Pol θ之间观察到的合成致死性的基础，但由于HR缺陷细胞在缺乏功能性HR途径时严重依赖TMEJ来解决复制相关应激并维持存活。

巴斯德研究所，巴黎西岱大学，法国国家健康与医学研究院U1223，法国抗癌联盟标记团队，基因组完整性、免疫与癌症研究室，巴黎，法国。美国加利福尼亚州斯坦福大学医学院放射肿瘤学系。巴斯德研究所，巴黎西岱大学，生物信息学与生物统计学中心，巴黎，法国。法国巴黎西岱大学巴斯德研究所流式细胞术平台。现地址:中国西安交通大学第一附属医院生物样本库，西安，中华人民共和国。电子邮件:lderiano@pasteur.fr

与细胞周期阶段无关，持续未修复的DNA断裂具有高度毒性，可能导致基因丢失、染色体易位以及致癌性病变的形成。G1期诱导的断裂由于DNA末端加工有限、缺乏切除以及缺乏HR模板，严重依赖NHEJ。与HR缺陷细胞类似，在NHEJ缺陷细胞中，Pol θ在修复各种性质的DNA损伤中也起着关键的补偿作用。NHEJ(例如，通过敲除KU、XRCC4、LIG4或抑制DNA-PK)和Pol θ的破坏都会导致合成致死性。然而，这种对TMEJ的依赖性的确切时间和机制仍不清楚。

由于B淋巴细胞在V(D)J重组和类别转换重组(CSR)过程中依赖程序性G1诱导的DNA断裂，因此它们是研究非同源末端连接(NHEJ)的模型。V(D)J重组对于抗原受体多样性至关重要，它通过将RAG(RAG1/RAG2)诱导的DNA断裂几乎完全引导至NHEJ，使可变(V)、多样(D)和连接(J)基因片段发生重排。在NHEJ缺陷(Xrcc4 )的前B细胞中，持续到随后S-G2/M细胞周期阶段的RAG或CRISPR/Cas9双链断裂(由于p53缺陷)通过依赖Pol θ的机制进行修复，该机制会产生染色体缺失和易位。CSR使抗体发生类别转换——从IgM转换为IgG、IgE或IgA——同时保持抗原特异性，从而使抗体功能多样化并增强免疫反应。CSR由激活诱导的胞嘧啶脱氨酶(AID)启动，AID使免疫球蛋白重链(Igh)基因座转录活性开关(S)区域中的胞嘧啶脱氨基，将它们转化为尿嘧啶。这些S区域是每个恒定编码片段上游富含G的重复序列，通过碱基切除和错配修复途径，在供体Sμ区域(IgM上游)和受体S区域(例如Sγ、Sε或Sα)之间诱导DNA断裂，对应于新的抗体类别。虽然NHEJ仍然是用于修复AID介导的G1期双链断裂的主要修复机制，但研究表明，在NHEJ成分缺陷(例如Ku70、Ku80、XRCC4或连接酶IV)的B细胞中，类别转换仅部分减少(约60%) ，这表明当NHEJ受损时，替代末端连接(alt-EJ)能够有效修复AID诱导的双链断裂。事实上，与严格限于G0/G1期细胞的V(D)J重组不同{{F}}，CSR发生在循环细胞中，因此在更有利于采用各种双链断裂修复途径的环境中。在CSR过程中起作用的alt-EJ途径的性质仍未完全了解，并且TMEJ是否作为主要修复机制尚不清楚。在CSR过程中，53BP1和RIF1通过招募REV7-SHLD1-SHLD2-SHLD3(Shieldin)和CTC1-STN1-TEN1(CST)复合物，保护AID双链断裂末端免受核酸酶降解，从而促进NHEJ 。当NHEJ或双链断裂末端保护受损时，微同源性介导的末端连接(MH)的使用增加，表明向alt-EJ转变。NHEJ或双链断裂末端保护缺陷还与无效类别转换连接的积累有关，这些连接经历了增强的双链断裂末端切除和/或反向连接，以及免疫球蛋白(Ig)转换位点处染色体断裂的积累。

在本研究中，我们探讨了Pol θ在CSR过程中的作用，特别是在NHEJ缺陷和Shieldin缺陷的原代B细胞中的作用。我们表明，从IgM转换为IgG1/IgG2b/IgG3/IgA时，Pol 是可有可无的。然而，在NHEJ缺陷和SHLD无保护的细胞中，我们发现Pol 通过MH介导的末端连接介导切除和反向AID诱导的DNA末端的连接。此外，我们质疑，是否像在同源重组缺陷中一样，在NHEJ缺陷细胞中，TMEJ在有丝分裂期间以RHINO/PLK1依赖的方式发生。我们表明，在Xrcc4 细胞中，RAG或AID诱导的断裂均通过不依赖RHINO的TMEJ进行修复。此外，我们证明TMEJ在G1/S期活跃，并且不依赖PLK1活性，提出了一个模型，其中G1诱导的断裂在S期由TMEJ修复，而不是在有丝分裂期。

结果

在野生型、XRCC4 缺陷型和 SHLD1 缺陷型 B 细胞中，Pol 对于 Igh CSR 是可有可无的

在野生型(WT)B 细胞中，非同源末端连接(NHEJ)是参与 AID 介导的断裂修复的主要修复途径。尽管如此，NHEJ 缺陷型细胞通过替代末端连接(alt-EJ) 维持强大的 CSR。虽然 NHEJ 功能正常，但 Shieldin 复合物缺陷(Mad2l2/Rev7、Shld1 或 Shld2 的敲除)会导致与加剧的双链断裂末端切除和微同源性使用(MH)相关的严重 CSR 缺陷。因此，我们试图研究 Pol θ 在 CSR 过程中在野生型、NHEJ 缺陷型和 Shieldin 无保护的脾 B 细胞中的作用。使用携带的小鼠，我们通过将 Polq 小鼠与 CD21-Cr 杂交产生了 CD21-Cre 小鼠(补充图 1a)，此后称为 Xrcc4 。XRCC4 在 B 细胞发育过程中的 V(D)J 重组中起着至关重要的作用，V(D)J 重组是 B 细胞祖细胞中发生的第一组重排。因此，CD21 驱动的 NHEJ 缺陷使我们能够获得幼稚成熟的 B 细胞，这些细胞在细胞因子刺激下能够进行 CSR，并避免胚胎致死性。正如预期的那样，无论是否存在 Pol θ，条件性 Xrcc4 小鼠中的 B 细胞和 T 细胞发育均未受到破坏(补充图 1b-i)。此外，我们将 Polq 小鼠与 Shld1 小鼠杂交，产生了 Shld 双缺陷小鼠(补充图 2a)。与小鼠类似，当将个体杂交在一起时，小鼠是有活力的，并且以预期的孟德尔比例出生(补充图 2b)，尽管 Shld 小鼠的数量趋势比其他小鼠少，但不同背景下的总脾细胞没有统计学差异(补充图 2c)。然而，在所有收获的脾脏中均获得了一致的脾细胞总数和均匀的 CD19 IgM 细胞群体比例(补充图 1b、i，补充图 2c-d)，从而能够有效地回收原代脾细胞，并测试它们在同型特异性细胞因子刺激下进行 CSR 的能力。

如先前报道，当促使Polq B细胞从IgM转换为IgG1时，其在第4天的类别转换重组(CSR)效率与野生型(WT)B细胞相当，WT的平均值为，Polq 的平均值为 (图1a、b)。相反，如先前所述，细胞因子刺激后，XRCC4缺陷导致细胞的平均值降低了60%(图1a、b)。有趣的是，通过测量与野生型(Xrcc4 和Xrcc4 )相比的平均CSR率下降，我们观察到在缺乏XRCC4的B细胞中，Pol 对于IgM到IgG1的CSR也是可有可无的(图1a、b)。事实上，细胞因子刺激后第4天，Xrcc4 和Xrcc4 之间的细胞没有统计学差异(曼-惠特尼检验，p = 0.355)。我们还评估了受刺激的和Polq B细胞( 非同源末端连接)中IgM到IgG1的类别转换动力学，同样，在Pol θ功能正常和Pol θ缺陷的细胞之间未检测到显著差异(补充图1j)。此外，Pol θ的可有可无性不仅限于IgM到IgG1的转换，因为在XRCC4功能正常(野生型)的细胞中，细胞能够有效地重排为IgG2b、IgG3和IgA同种型(图1e - g)。

尽管XRCC4缺陷的B细胞向IgG2b、IgG3和IgA的转换效率较低(与野生型相比)，但在这种基因背景下，Pol 也是可有可无的(图1e - g)。已证明Xrcc4 Polq 永生化祖B(pro - B)细胞在循环条件下表现出生长缺陷。与pro - B细胞相反，在AID诱导和未诱导条件下用CellTracer Violet(CTV)染色时，Xrcc4 和Xrcc4 Polq 脾细胞显示出相似的增殖曲线(图1d)。同样，在IgG1 CSR动力学分析的第4天，总细胞计数没有显著差异(补充图1k)，这表明在不同基因背景之间未观察到明显的生长缺陷。尽管成功进行了重排并在其表面表达了新的转换同种型(即有效重排)，但在体外CSR刺激后，约11%的野生型和 CD19 B细胞变为Ig阴性

图1 | 聚合酶θ对有效的类别转换重组(CSR)并非必需。a 细胞因子暴露后第4天(抗IgD葡聚糖/LPS/IL-4)，野生型、Polq 、Xrcc4 、Xrcc4 Polq 、Shld1 和Shld1 原代B细胞(CD19*)中IgM和IgG1表达的代表性流式细胞术图。b、c 表达IgG1 的细胞(b)和Ig阴性(IgM IgG1 )细胞(c)的定量分析。柱形图表示平均值标准误，双尾曼-惠特尼检验，野生型和Shld1 的值在源数据文件中给出。d 第3天在增殖(抗IgD葡聚糖)(上图)和IgG1刺激(下图)条件下的细胞追踪紫罗兰(CTV)图谱。e - g 细胞因子暴露后第4天向(e)IgG2b(抗IgD葡聚糖/LPS)、野生型、和 IgG3(抗IgD葡聚糖/LPS)、野生型和以及 IgA(抗IgD葡聚糖/TGF - /LPS/IL - 5/RA)、野生型和转换的细胞百分比。柱形图表示平均值，双尾曼-惠特尼检验，的值在源数据文件中给出。源数据以源数据文件形式提供。(图1a、c)。表面不再表达IgM或IgG1的CD19 + 细胞通常经历了DNA末端加剧的切除、CSR过程中的倒位重组事件，或存在未修复的Igh断裂。这个Ig阴性群体在细胞中几乎翻倍至，并且在去除聚合酶θ后保持在15.71 ± 2.43%几乎不变(图1a、c)。因此，无论其XRCC4状态如何， B细胞在CSR后的和Ig阴性群体中与Polq 对照相比表现出无显著差异(图1a、c)。

图2 | Pol θ促进NHEJ缺陷和SHLD未保护的B细胞中Igh的稳定性。a用于量化Igh异常中期、断裂和易位事件的DNA-FISH探针示意图，以及代表性图像。b第4天IgG1刺激的B细胞中期铺片中Igh断裂(白色)和易位(红色)的平均(±SEM)定量，来自3-4个独立实验。分析的总中期数:WT 和。使用每种基因型中列出的正常和异常中期总数进行双侧Fisher精确检验，值在补充数据1中给出。

AID介导的断裂通过限制末端切除的53BP1-RIF1-SHLD轴进入NHEJ修复。我们重现了在废除SHLD1时观察到的严重CSR缺陷，刺激的Shld1 B细胞在生产性CSR(IgM到IgG1)中显著降低了85%(图1a，b)，并积累了Ig阴性细胞(图1a，c)，与WT和Polq B细胞相比大约多三倍。与Shld1 B细胞一样，的Shld1 Polq CD19 纯化脾细胞在细胞因子刺激后4天成功地从表面表达IgM转变为IgG1，而33.67±4.62%在4天后变为Ig阴性(图1a-c，补充图2f)。如在XRCC4缺陷细胞中观察到的，在SHLD1缺陷的B细胞中敲除Polq不影响CTV增殖谱(图1d)，也不影响IgG1 CSR动力学测定期间获得的最终细胞计数(补充图2e，f)。总体而言，在SHLD1和SHLD1 Pol θ双缺陷B细胞之间，向IgG1的生产性CSR也没有显著差异(Mann-Whitney， (Mann-Whitney， (Mann-Whitney，和 (Mann-Whitney， )(图1a，b，e-g)。因此，当AID介导的DNA末端未被Shieldin复合物保护时，Pol θ对于生产性CSR也是可有可无的。

在CSR过程中，TMEJ连接了一部分AID诱导的DNA断裂

尽管我们表明在野生型、XRCC4缺陷型和SHLD1缺陷型背景下，Pol 对于有效的类别转换重组(CSR)并非必需，但仍进一步研究了无效的CSR事件。如前所述，使用流式细胞术分析作为无效CSR事件代表的Ig阴性群体，由几种重组结果组成，包括未修复的Igh断裂、高度切除的接头和倒位。先前在XRCC4缺陷型和SHLD未保护的B细胞中已描述了Igh未修复断裂和Igh介导的易位数量增加。因此，我们接下来对野生型、和Shld1 刺激的原代脾B细胞中这两种类型事件进行了定量。使用在小鼠Igh基因座两端杂交的BAC探针，我们对含有Igh特异性断裂和易位事件的异常中期进行了定量(图2a)。为了以最全面的方式进行此分析，我们分析了由独立B细胞刺激产生的数千个中期(补充数据1)。刺激进行IgG1类别转换的野生型和Polq B细胞显示出大致相等的异常中期平均数，和，分别。然而，如先前报道，与野生型相比，Polq B细胞中的易位增加了3.27倍(图2b，补充数据1)。此外，Xrcc4 脾细胞具有 Igh断裂和的Igh易位，分别比野生型和Polq B细胞多约5.49倍和5.95倍的异常中期(图2b，补充数据1)。Shld1 B细胞也积累 /gh染色体畸变，8.2 ± 0.25% 的断裂和1.58 ± 0.48% 的易位(图2b，补充数据1)。值得注意的是，尽管通过流式细胞术分析(图1)，Polq缺失后有效和无效的CSR事件没有变化，但与单缺陷对应物 (8.84 ± 1.66% 异常中期)或Shld1 (9.78 ± 0.43% 异常中期)B细胞相比，我们在Xrcc4 (13.04 ± 0.11% 异常中期)和Shld1 (17.88±1.90% 异常中期)细胞中观察到明显更多的异常中期(图2b，补充数据1)，这意味着Pol 参与修复AID诱导的Igh断裂的一个子集，特别是在XRCC4无活性或SHLD1未保护的情况下。

在类别转换重组过程中，末端微同源介导的连接产生切除和倒位的无效接头

为了确定在类别转换重排(CSR)中由Pol θ连接的DNA末端类型，我们首先采用长距离PCR(LR-PCR)分析来扩增Igh内含子增强子iEμ(引物EμF)和Igh 恒定外显子6(引物Cγ1R2) 之间的区域(图3a)。该分析可大量扩增样品中所有IgM到IgG1的缺失重组事件，因为所使用的引物在种系基因座上相距太远(>100 kb)(图3a)。严格发生在Sμ和Sy1之间的有效重组事件(S-S接头)大小在4.9 - 17.3 kb范围内，而通过LR-PCR很容易识别出离开两个S区域基因座的广泛切除的CSR接头产生的较短扩增子(切除的接头，≤4.9 kb)(图3a)。与通过FACS获得的CSR分析一致，从IgG1刺激的细胞中扩增的LR-PCR片段长度图谱显示，在所有测试的B细胞遗传学中，大多数重组事件发生在S区域内，产生4.9 - 17.3 kb的S-S接头片段(图3b，补充图3a)。然而，在XRCC4失活后，在S-S接头下方出现了数量增加的较短片段(拖尾)(补充图3a)，这与之前的报道一致，即NHEJ废除后切除的/gh接头数量增加。值得注意的是，样品在琼脂糖凝胶上没有可见的拖尾，这表明在没有Pol θ的情况下不会形成切除的接头(补充图3a)。在DNA末端切除加剧的情况下，如SHLD1缺陷，通过LR-PCR可获得预期较弱的S-S接头条带以及其下方大量切除接头的拖尾(图3b，补充图3a)，这与这些细胞中IgG1 减少和Ig阴性群体百分比增加一致 (图1a，c)。在这种情况下，Pol θ缺失的影响显示出清晰的S-S接头条带，没有拖尾(切除的接头)(图3b，补充图3a)。为了精确量化扩增的S-S和切除的/gh接头，我们使用PacBio长读测序技术对每个基因型的3 - 6个独立B细胞样品的LR-PCR片段进行测序。读长分布概括了LR-PCR迁移图谱(图3c，补充图3b)，因为每个长读代表一个IgM到IgG1的缺失重组事件。使用每个遗传背景数万个读段(补充数据2)，分别从野生型和Pol θ缺陷细胞中计算出中位数读长为8.9和，其中1.76%和0.87%的读段低于有效CSR的阈值(≤4.9 kb)(图3c，补充图3b，补充数据2)。与从琼脂糖凝胶中观察到的加剧的DNA末端切除接头一致，在中，中位数缺失大小进一步显著下降，在Shld1 刺激的B细胞中下降2.5 - 2.8 kb，并且11.5%(Xrcc4 )和26.8%(Shld1 )的总读段是非生产性的(图3c，补充图3b，补充数据2)。引人注目的是，添加Pol 缺陷(Xrcc4 中位数和中位数，0.154% ≤4.9 kb)后恢复到类似野生型的缺失大小(图3c，补充图3b，补充数据2)。从Su和Sy1缺失映射独特的接头位置(补充数据3)显示，在没有Pol θ的NHEJ缺陷和SHLD无保护的情况下，不到1.03%的独特断裂连接事件位于S区域之外(图3d，e)，这在野生型和Polq 背景范围内(0.47 - 2.5%)，并且远低于Xrcc4 (13.04%，野生型的5.2倍)和Shld1 (19.68%，野生型的7.9倍)细胞(图3d，e，补充数据3)。总体而言，通过LR-PCR测序，我们表明切除的缺失Igh接头的修复导致非生产性CSR，这完全由Pol θ介导。

在缺乏非同源末端连接(NHEJ)且未受SHLD保护的细胞中，错误的双链断裂(DSB)末端连接在一起时，会发生更多的倒位重组事件，这可能是广泛的DNA末端处理导致联会不稳定的结果。倒位重组是导致Ig阴性表型的第三种类型的类别转换重排(CSR)事件。由于长片段PCR(LR-PCR)测序仅限于分析缺失事件，我们还使用来自IgG1刺激细胞的基因组DNA(gDNA)，通过全基因组高通量易位测序(HTGTS)来检查Sμ-Sy1接头的模式。在区域的处退火的单个诱饵引物用于线性扩增接头序列，从而识别和表征与供体连接的下游S区域DSB(图4a)。这种高通量CSR接头测序方法允许表征发生在内(在内)和S区域间(例如， -Sy1)的缺失(蓝色箭头)和倒位(红色箭头)CSR事件(图4a) 。在野生型(WT)和Polq 中，未观察到差异，因为我们鉴定出16,942个和18,147个Igh接头，将诱饵断裂与另一个或下游断裂融合(图4b)。在这些接头中，略超过34%来自接头，约60%的Igh接头是融合，而映射到其他区域(即Sy3和Sε)的很少(图4b，补充图4a，b)。对Sμ-Sy1融合分布(WT 10,215个接头和Polq 10,750个接头)的更详细研究表明，绝大多数映射在Sy1内，>95%的接头是缺失型，很少有倒位(<5%)重组事件(图4b)。因此，不到1%的Sμ-Sy1接头被切除(图4c)，WT和Polq IgG1刺激细胞的平均倒位/缺失(INV/DEL)比率为0.04±0.01(图4d)。删除XRCC4或SHLD1可使测序的Igh接头总数显著减少一半(Xrcc4 为9094个接头，Shld1 为8464个接头)(图4b)，并显著降低Sμ-Sy1的比例(<45%)(图4b，补充图4a，b)，如先前所述。在中，我们重现了接头数量的增加，而与WT相比，SHLD1缺失时未观察到显著差异(补充图4a)。放大Sμ-Sy1接头分布(Xrcc4 为3631个接头，Shld1 为2261个接头)证实，尽管大多数接头是缺失事件(Xrcc4 中为88%，Shld1 中为77%)，但与WT相比，CSR接头中经历倒位修复的比例增加( 中为12%，Shld1 中为 )，平均INV/DEL比率显著提高到在中，以及Shld1 B细胞中的 (图4b，d)。与方向无关，映射到Sy1外的Sy1融合数量、切除的CSR接头，在Xrcc4 和Shld1 中分别增加了12.9倍和39.7倍(图4b，c)。在缺乏NHEJ且未受SHLD1保护的细胞中，缺乏Pol 使Igh接头总数降至单敲除时的~25%和WT的<12%(图4b)，证实了在中期铺片中观察到的未修复AID断裂的积累(图2)。尽管回收的接头数量显著下降，但添加Polθ缺陷通过特异性消除S区域侧翼的切除接头，令人惊讶地富集了S区域接头(图4b，c)。关注Sμ-Sy1接头发现，在两个双缺陷模型中，几乎没有猎物序列映射到Sy1区域外( 中平均个接头，中个接头)(图4b，c)，如使用LR-PCR测序方法所观察到的。此外，Pol 缺陷降低了S区域内的倒位比例，导致恢复的INV/DEL比率和，在和Shld1 中(图4d)。因此，由加剧的切除和/或倒位修复导致的异常非生产性CSR接头仅由Polθ依赖性修复途径介导。

图3 | TMEJ负责修复(长)切除的AID诱导的重组事件。使用抗IgD葡聚糖/ LPS / IL-4刺激后第4天的原代B细胞(CD19 +)。a 用于可视化IgG1转换过程中切除片段的示意图远程PCR(LR-PCR)。内含子增强子iEμ和Ighy1外显子6中的引物(酒红色箭头)，扩增缺失重排。有效的Sμ-Sy1连接产生4.9-17.3 kb扩增子(S-S接头)；切除的、无生产性的事件产生小于4.9 kb的片段。b Sμ-Sy1接头的LR-PCR图谱。IL-2作为上样对照。见补充图3。*表示非特异性条带。c 通过对LR-PCR片段进行PacBio测序获得的读长小提琴图，来自独立样本WT 和Shld1 。使用混合模型回归测试，随后进行事后Tukey HSD测试，WT与Xrcc4 ，WT与Shld1 ，Polq 与Xrcc4 (p = 0.05)，Polq 与Shld1 (p = 2.00e-11)，Xrcc4 与Xrcc4 Polq (p = 0.00053)和Shld 与Shld 。对于所有箱线图:最小值是最小值，最大值是最大值，中心是中位数，四分位数由箱线图和须表示。绘制的读数数量见补充数据2。d 通过LR-PCRseq获得的独特断点，按基因型汇总，并绘制WT、Polq 、Xrcc4 、Xrcc4 Polq 、Shld1 和Shld1 Polq 细胞位于Sμ和Sy1区域的AID接头的分布。使用250 bp区间，独特断点的坐标用于生成分布并确定和基因组区域内独特接头的百分比。指示了位于和基因组区域内和周围的独特接头的百分比。每个图右下角括号内指定了绘制的接头总数(n)。用于LR-PCR的引物为深红色。e 通过使用PacBio的LR-PCRseq获得的切除接头的百分比，断裂接头位于S区域之外。切除接头定义为在独特接头中，5’或/和3’坐标之一或两者在Sμ或/和Sy1基因座之外的接头。条表示平均值 SEM，未配对双尾T检验(*p < 0.05，**p<0.01)。另见补充数据3。源数据作为源数据文件提供。

多项研究表明，在缺乏非同源末端连接(NHEJ)的情况下，类别转换重组(CSR)断点处短微同源性(MH)的使用增加，因此一般认为支持CSR的替代末端连接(alt-EJ)途径是由MH驱动的。值得注意的是，依赖于Pol θ的修复途径需要在双链断裂(DSB)处切除并暴露短的MH片段，并随后用于连接

一起修复DNA末端。因此，Pol 修复特征与短MH(4-8 bp)的使用以及有限的 bp插入相关。接下来，我们利用我们的HTGTS CSR数据来分析刺激的原代脾B细胞中的断点修复特征，如短插入和MH，并探讨缺乏Pol θ对CSR连接类型的影响。以下分析是在Sμ-Sy1接头、映射到Sy1 ± 10 kb的HTGTS猎物序列上进行的。我们首先专注于量化直接接头，即没有MH或插入的接头。在野生型(WT)和Polq IgG1刺激的B细胞中，大约26%的Sμ-Sy1接头是直接接头，9%的接头具有MH bp，这与NHEJ是CSR过程中AID断裂的主要修复机制一致(图4e-g)。然而，与先前报道的不同，我们观察到WT和Polq 细胞在插入方面没有差异(补充图4c，d)，这可能源于使用了不同的CSR测序技术。正如预期的那样，在缺乏NHEJ(Xrcc4- )的情况下，直接接头显著下降1.84倍，平均降至14.23%；在缺乏SHLD保护(Shld1 )的B细胞中，直接接头下降1.42倍，平均降至18.5%(图4e，g)，而具有短MH的Sμ-Sy1接头的百分比增加(图4f，g)。MH使用情况的绘图显示，在和Shld1 单缺陷B细胞中，含有4-8 bp长MHs的接头增加(图4g)。事实上，在Xrcc4- (22.75%)和Shld1 (20.06%)中，具有 bp长的测序Sμ-Sy1接头的百分比分别显著增加2.52倍和2.22倍(图4f，g)。明显地，在NHEJ缺陷和

图4 | CSR-HTGTS显示TMEJ修复了无效的(长片段)切除和倒位的AID诱导的重组事件。a 用抗IgD葡聚糖/LPS/IL-4刺激正常B细胞时CSR激活的示意图，该刺激诱导AID并激活Jy1的转录。缺失型CSR事件用蓝色箭头表示，倒位重组事件用红色箭头表示。虚线表示开关内重组事件。用于CSR-HTGTS的诱饵引物位于Sμ区域上游 (b) 对用抗IgD葡聚糖/LPS/IL-4刺激的野生型、、、Xrcc4 、Shld1 和Shld1 脾细胞中与下游受体S区域之间的断点进行CSR-HTGTS-seq分析。通过对3-6只小鼠进行CSR-HTGTS-seq获得的接头，按基因型汇总，并将总接头的分布绘制在Igh上的1 kb区间内。每个分布图上标明了位于和内的映射缺失型和倒位接头的百分比。对于每个图，还绘制了在Sy1区域的AID接头分布的放大图，以250 bp区间表示。每个图左上角括号内标明了绘制的接头总数 (n)。每个分布图上标明了Sy1内外映射的缺失型和倒位接头的百分比。c, d 条形图代表平均值标准误，野生型和，未配对双尾T检验，值在源数据文件中给出。c中切除的Sμ-Sy1接头的百分比。d中每个样品的倒位与缺失事件比例。对用抗IgD葡聚糖/LPS/IL-4刺激的脾细胞的Sμ-Sy1接头修复特征进行CSR-HTGTS-seq分析。e-g 条形图代表平均值标准误，野生型、和，未配对双尾T检验，值在源数据文件中给出。直接接头的百分比 (e)。断裂位点含有 bp MH轨迹的接头百分比 (f)。g 每个遗传背景下的MH使用情况图。每个数据点代表平均值和。源数据作为源数据文件提供。SHLD1未保护的情况 Pol θ缺失恢复了野生型表型，导致短MH接头显著减少，直接Sμ-Sy1接头显著增加(图4e-g)。因此，倒位和切除的CSR接头以Pol θ依赖的方式修复，有利于短MH片段的使用。在Xrcc4- Polq B细胞中，捕获的Sμ-Sy1接头仅代表由AID断裂的NHEJ/Pol θ非依赖性修复产生的有效CSR事件，并且不使用或极少使用MH(MH 0-2 bp)(图4g)。因此，在没有依赖于MH使用的NHEJ的情况下，Pol θ非依赖性末端连接负责有效CSR，而TMEJ产生MH介导的无效接头形成。

由AID诱导的双链断裂的末端微同源性介导的末端连接不需要RHINO

接下来，我们询问，与S/G2期诱导的双链断裂一样，G1期诱导的双链断裂是否在有丝分裂中通过末端微同源性介导的末端连接(TMEJ)以依赖RHINO的方式进行修复。为此，我们使用CRISPR/Cas9介导的基因编辑构建了几种单突变和双突变CH12F3 B细胞系(细胞系和用于基因分型的引物的完整列表见补充数据8-9)。首先，我们敲除了非同源末端连接(NHEJ)(XRCC4 外显子3)和/或Pol ( 外显子1)以获得Polq 、Xrcc4 和Xrcc4 Polq B细胞系(补充图5a，补充数据8)。CH12F3 B细胞的行为类似于原代B细胞，实际上，对于有效的IgM到IgA转换水平，NHEJ和Pol θ的缺失都是不必要的(图5a，b)，尽管由于通过长距离PCR(LR-PCR)观察到切除末端缺乏连接(图5d和补充图5c)并通过LR-PCR测序测量(补充图5d，e)，导致IGH相关断裂显著积累(图5c)。我们还证实，在用Pol θ抑制剂(Polθi)ART558处理后，切除的类别转换重组连接缺失，同时IGH断裂相应增加(补充图6)。总体而言，我们发现缺乏NHEJ的原代B细胞和体外细胞系通过TMEJ修复了一部分AID介导的双链断裂。

然后，我们通过靶向第3外显子的缺失构建了几个独立的RHINO缺陷型(±NHEJ)CH12F3 B细胞，导致移码并去除了ATG (补充图7a - b)。在细胞因子刺激下(图5a)，与野生型相比，Pol θ或RHINO的缺失不会影响IgM到IgA的类别转换，这与XRCC4缺失不同，XRCC4缺失会导致显著下降2倍，Ig阴性群体增加3倍(图5b)。在NHEJ缺陷型细胞中，有生产性的类别转换也没有改变，因为或与单突变细胞系相比没有显著差异(图5b)。因此，我们确定在XRCC4 proficient和XRCC4缺陷型细胞中，RHINO对于IgM到IgA的类别转换是可有可无的(图5a，b)。然后，我们提出疑问，当分析Igh稳定性和连接产物时，Rhno1 缺陷型CH12F3 B细胞的行为是否与野生型或NHEJ缺陷型细胞不同。我们观察到，与野生型断裂和易位)以及Polq (2.25 ± 0.72%断裂和0.5 ± 0.19%易位)刺激的CH12F3克隆相比，RHINO缺失的克隆显示出相当水平的Igh不稳定性断裂和易位)(图5c，补充数据6)。在NHEJ缺陷型细胞中，与XRCC4缺失(14.41±1.02%断裂)相比，Xrcc4 CH12F3 B细胞中具有Igh断裂的中期细胞百分比显著增加约两倍(28.86 断裂)(图5c，补充数据6)，而XRCC4和RHINO的联合缺失仅略微增加Igh不稳定性断裂和易位)(图5c，补充数据6)。与Xrcc4 细胞不同，在XRCC4/RHINO双缺陷型细胞中，通过LR - PCR很容易检测到由Pol 修复的AID断裂(即那些在连接前经历切除的断裂)(图5d)。实际上，在所有测试的独立克隆中，Xrcc4 和Xrcc4 Rhno1 的涂片图谱无法区分。总体而言，这些结果表明，在XRCC4缺陷型B细胞中，RHINO对于AID诱导的DSB的TMEJ是可有可无的。

RAG诱导的DSB的TMEJ发生在G1/S期细胞中，与RHINO和PLK1无关

我们之前表明，在缺乏非同源末端连接(p53 Xrcc4 前B细胞)的情况下，G0/G1期诱导的RAG双链断裂在释放到随后的细胞周期阶段S - G2/M 时由Pol θ修复。然而，修复具体在何时进行仍不清楚，是在S期、S/G2期还是M期。因此，我们探究了这些断裂的微同源末端连接(TMEJ)是否在有丝分裂期间发生。我们使用上述相同策略构建了多个 -三重缺陷的阿贝尔逊激酶转化的表达BCL2的前B细胞克隆(补充图7a - c)。然后，我们通过用 -Abl激酶抑制剂(STI571，以下简称ABLki或STI)处理，将 -Abl前B细胞阻滞在G0/G1期。 -Abl前B细胞的G0/G1期细胞周期阻滞迅速导致RAG1/2基因表达的诱导/稳定以及内源性Igk基因座的重排(图6a) 。与之前的工作一致，内源性重排的PCR扩增显示在非同源末端连接功能正常的p53缺失细胞中有强大的重组，而所有非同源末端连接缺陷的前B细胞克隆在ABLki处理条件下完全缺乏编码接头形成(图6b)。在释放/循环的前B细胞中，以大小高度可变的PCR扩增DNA产物的形式获得了重组的显著挽救(图6b)。在缺乏Pol θ的情况下，无法从前B细胞中扩增出重排(图6b)，表明退出G1期的未修复RAG断裂完全依赖于TMEJ。与p53 非同源末端连接功能正常的前B细胞(2.18%异常中期)相比，前B细胞中的Igk基因组不稳定性增加了20倍(中期的44.76 ± 16.28%)(图6c，补充数据7)。前B细胞中大约一半的异常中期含有 /gk易位，即占总中期的 (图6c，补充数据7)。相比之下，细胞几乎没有显示Igk易位(中期的0.44%)，而是积累了高水平的Igk断裂(中期的64.1%)(图6c，补充数据7)。然后，我们通过评估重排和 /gk易位来探究RHINO是否参与RAG介导的双链断裂的修复。与p53 -/- Xrcc4 -/- 一样，所有独立的释放/循环的p53 Xrcc4 Rhno1 前B细胞克隆都强烈重组 /gk基因座，导致与 -双缺陷细胞获得的PCR扩增谱相似(图6b)。这表明Pol -介导的修复在XRCC4缺陷和XRCC4/RHINO缺陷的p53缺失 -Abl前B细胞中均有活性(图6b)。一致地，前B细胞也含有高水平的Igk易位(占总中期的26.42±4.96%)，与p53 细胞占总中期)相似，与 Xrcc4 - Polg 细胞(总中期的0.44%)形成鲜明对比(图6c，补充数据7)，表明RAG诱导的双链断裂的TMEJ也独立于RHINO发生。

图5 | AID诱导的双链断裂通过微同源性介导的末端连接进行修复，与RHINO无关。a CH12F3细胞在抗CD40/ TGF-β/ IL-4体外刺激下发生IgM到IgA的类别转换重排。b每种基因型的两条柱形图分别代表在第4天未处理(条纹柱形图)和细胞因子刺激(实心柱形图)条件下，产生性和非产生性 CH12F3细胞的百分比。使用的细胞系:野生型(CH12F3，n = 6)，Polq (POLQ13，n = 3；POLQ21，n = 3)，Xrcc4 (XR1，n = 6；XR5，n = 6)，Xrcc4 (POLQ21XR2，n = 5；POLQ21XR8，n = 6)，Rhno1 (RO13，n = 3；RO15，n = 3；RO15，n = 3；RO18，n = 3)和Xrcc4 Rhno1 (XR1RO3，n = 3；XR1RO4，n = 3；XR1RO5，n = 3；XR5RO13， )。柱形图代表平均值标准误，双侧曼-惠特尼检验，值在源数据文件中给出。c未刺激或IgM到IgA刺激的CH12F3细胞中异常/gh中期的定量分析。在第4天从1-3个独立实验中收获细胞，每种基因型至少有2个独立的CRISPR克隆。直方图代表具有易位(红色)和染色体断裂(白色)的中期细胞的平均百分比标准误。柱形图内显示了具有断裂和易位的中期细胞的平均百分比。在未刺激和刺激条件下分别分析的中期细胞总数:野生型和， )。使用每种基因型中列出的正常和异常中期细胞的总数进行双侧费舍尔精确检验，值在补充数据6中给出。另见补充数据6。d IgM到IgA重排的长片段PCR，使用位于内含子增强子iEμ和Igh 恒定外显子4序列内的引物。严格发生在和之间的产生性类别转换重排修复事件导致扩增子跨度为5.1 kb - 13.5 kb(S-S接头)，而在DNA末端连接之前对两个S区域都进行了切除的非产生性类别转换重组事件导致<5.1 kb的片段(切除接头)。CH12F3细胞含有一个非产生性重排等位基因，导致8.1 kb的扩增子。Sμ-Sα接头的长片段PCR图谱。IL-2基因用作上样对照。源数据作为源数据文件提供。

PLK1通过磷酸化Pol θ来调节末端微同源性介导的末端连接(TMEJ)，这对于将其招募到有丝分裂双链断裂处至关重要。因此，PLK1抑制在有丝分裂期间阻断TMEJ。为了测试在G1期诱导的双链断裂处TMEJ是否需要PLK1，我们用或PLK1抑制剂(补充图9b)处理ABL激酶抑制的前B细胞(p53 和 )，并监测修复和不稳定性。Polθ抑制剂处理模拟了上述Pol θ敲除细胞的表型(补充图9，图6h)。相比之下，在非同源末端连接(NHEJ)缺陷的细胞中，PLK1抑制剂(50 nM)仍然允许强大的重排(补充图9c)和高Igk不稳定性(49.9±9.5%)，频繁发生易位(占总中期的21.9±5.2%)，类似于用二甲基亚砜(DMSO)处理的对照(57.9±0.6%异常中期，32.1±0.9%有易位)(图6h，补充数据7)。这表明G1期诱导的双链断裂的TMEJ修复不依赖于PLK1，支持了这些事件发生在有丝分裂之外的观点。

我们之前表明，在G0/G1期停滞的前B细胞中由重组激活基因(RAG)诱导产生的双链断裂在细胞周期进入时导致X射线修复交叉互补蛋白4(XRCC4)和Pol θ之间的合成致死性。因此，我们通过5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)/碘化丙啶(PI)染色和细胞计数分析了前B细胞与和相比的细胞周期动态。在循环条件下(正常培养) 前B细胞系增殖较慢，与和 Xrcc4 Rhno1 相比，进入S期的细胞更少(图6d)。在G0/G1期诱导RAG产生的双链断裂并释放到细胞周期后，p53/XRCC4/Pol θ缺陷的前B细胞很难进入S/G2期，无法增殖，因此很快死亡(图6d - f)。相比之下，p53/XRCC4/RHINO缺陷的前B细胞进入S/G2期并积极增殖/分裂，显示出与细胞无法区分的细胞周期进入动力学(图6d - f)。我们还发现，用处理的G0/G1期停滞的p53/XRCC4缺陷细胞释放到期的能力降低，在G1期释放后第2天，S期细胞占20%，而DMSO处理组为33%(补充图9d，e)。此外，与DMSO处理的对照相比，该处理显著损害了增殖，特别是在细胞中(补充图9f)。我们的

图6 | RAG诱导的G1期双链断裂在G1/S期通过微同源性介导的末端连接进行修复，与RHINO和PLK1无关。a在经ABL激酶抑制剂(ABLki)处理和释放的G1期阻滞的v-Alb原B细胞中RAG表达的示意图。来自独立细胞系的分析:p53 (15307)，p53 Xrcc4 (XR15307 - 3, XR15307 - 11)，p53 Xrcc4 - Polq (XR15307 - 3 - POLQ35)和p53 Xrcc4 Rhno1 (XR15307 - 3RO2, XR15307 - 3RO3, XR15307 - 3RO4, XR15307 - 11RO5)。b未处理(NT)、G1期阻滞(STI)和释放/循环(Re)原B细胞中连接的巢式PCR。IL - 2作为上样对照。c NT和Re3细胞中/gk异常中期频率。来自1 - 5个独立克隆的具有易位(红色)和染色体断裂(白色) SEM的中期平均百分比(柱状图)。NT和Re3中分别分析的总中期数: 和。对每种基因型进行双侧Fisher精确检验，比较正常与异常中期、断裂与其他以及易位与其他(虚线)。值在补充数据7中给出。d原B细胞阻滞/释放实验的代表性细胞周期FACS图谱。e整个阻滞/释放实验中S期细胞的定量分析。来自两个独立实验的平均值 SEM，，以及p 。对AUC进行双尾Mann - Whitney检验。f ABL激酶抑制剂洗脱后释放动力学的细胞计数。点表示来自两个独立实验的平均值 SEM，，以及 Rhno1 。对AUC进行双尾Mann - Whitney检验。g使用RT - qPCR在阻滞/释放期间Polq和Ccne1相对表达的热图。数据使用2 - (ΔΔCT)方法归一化为ACT1和HPRT。h Re3细胞暴露于PLK1抑制剂(50 nM)或Polθ抑制剂(1μM)时异常中期频率。来自2 - 3个独立克隆的具有易位(红色)和染色体断裂(白色) SEM的中期平均百分比(柱状图)。对每种基因型进行双侧Fisher精确检验，比较断裂与其他，值在补充数据7中给出。分析的总中期数:DMSO ，DMSO Xrcc4 ，PLK1i ，PLK1i Xrcc4 ，Polθi ，Polθi 。i通过微同源性介导的末端连接修复G1期诱导的双链断裂的工作模型。源数据作为源数据文件提供。数据表明，与之前关于HR和Pol 的合成致死性的工作不同，NHEJ和Pol θ之间的合成致死性不依赖于RHINO依赖的途径。值得注意的是，v - Abl原B细胞在循环和阻滞/释放环境中对PLK1抑制剂处理都高度敏感(补充图9a，f)，这与其在有丝分裂期间的作用一致，但也与其在调节细胞周期进程和应对S期复制应激中的作用一致。

随后，我们试图精确剖析TMEJ作用于未修复的G1期诱导断裂的具体细胞周期阶段。在G0/G1期阻滞的前B细胞中几乎检测不到Pol θmRNA，而Pol θ在细胞周期进入时表达 (图6g)。我们观察到，大约30%的同步化G0/G1期阻滞的前B细胞在释放后第2天(Re2)开始缓慢退出G1期进入S期(图6d、e)。这与 Xrcc4 和p53 细胞中重组产物的扩增相吻合(图6b)，以及Pol θ和Ccne1表达的增加(图6g)，Ccne1是参与G1-S期转换调控的转录调控的细胞周期蛋白E。我们使用两个独立的克隆和一个前B细胞系作为对照进行了阻滞/释放实验。由于释放的细胞在ABL激酶洗脱后第3天数量仅增加了一倍(图6f)，我们在G0/G1释放后第2天(Re2)或第3天(Re3)将细胞分选到G1、S和G2/M群体中(补充图10a)。从未处理过的循环细胞(NT)、G0/G1期阻滞的细胞(STI)、大量(未分选)释放的细胞以及每个分选群体中提取基因组DNA。然后，我们对Igk 重排进行巢式PCR，以确定连接何时首次可检测到，这表明TMEJ介导修复的时间。正如预期的那样，在存在NHEJ的情况下，RAG诱导的断裂在G0/G1期迅速修复，STI样本中的强扩增信号表明了这一点。释放后所有细胞周期阶段该信号均持续存在(补充图10b)。相反，NHEJ缺陷细胞在STI中未显示Igk重排的证据，而是在释放后Re2和Re3时信号积累。在分析分选的细胞周期部分时，我们观察到早在G1期就出现了少量依赖TMEJ的Igk连接。然而，大多数重排在S期部分被检测到(补充图10b)。在G2/M群体中扩增的少数连接，可能反映了在进入G2/M期的细胞中在G1期或S期发生修复事件(补充图10b)。对Igk 扩增子进行TOPO克隆和测序以分析修复连接。与先前的研究一致，来自p53/XRCC4双缺陷前B细胞的连接呈现切除和微同源性，与细胞周期部分(G1期、S期、G2/M期)无关(补充图10c、d)。因此，我们的数据表明，G1期诱导的断裂通过微同源性快速处理和修复，表明TMEJ在G1/S期是活跃的。总体而言，这些数据表明，在没有NHEJ的情况下，生理性G1期诱导的断裂在进入有丝分裂之前的G1/S期通过TMEJ以独立于RHINO和PLK1的方式进行修复。

讨论

依赖ATM的DNA损伤反应(DDR)由AID诱导的双链断裂激活，通过非同源末端连接(NHEJ) 确保高效的类别转换重组(CSR)。通过破坏DSB感知、染色质构象、末端联会或保护中的NHEJ或其调控，会降低转换效率，同时增加微同源性(MH)的使用、切除和倒位重组。这些损伤会损害有效的CSR，增强对替代末端连接(alt-EJ)途径的依赖，并增加无效的CSR，即IgM丢失而不产生功能性同种型。我们证明，在NHEJ缺陷和SHLD无保护的幼稚成熟B细胞中，无效的类别转换完全依赖于Pol θ，它修复切除和倒位的接头，而不影响有效的类别转换水平。此外，我们表明，由替代微同源介导的末端连接(TMEJ)修复的B细胞程序性双链断裂(AID/RAG)发生在G1/S期，不依赖于RHINO或PLK1，这表明G1期诱导的双链断裂不会在多个细胞周期阶段持续到有丝分裂。我们强调存在两种不同类型的TMEJ，即不依赖于RHINO/PLK1(发生在G1/S期)和依赖于RHINO/PLK1(发生在M期)，它们都负责在双链断裂进入下一个细胞阶段的情况下进行修复(图6i)。

AID诱导的双链断裂以及支持CSR的分子机制对于适应性免疫至关重要，使B细胞能够改变抗体效应功能。虽然幼稚成熟B细胞主要使用NHEJ来修复AID诱导的双链断裂，但它们也可以利用alt-EJ。在缺乏NHEJ的情况下，受刺激的B细胞会强烈重排/gh基因座，常常留下alt-EJ修复特征，例如 bp的MH延伸。我们发现，在XRCC4和SHLD1缺陷的细胞中，Pol θ对于有效的CSR是可有可无的。连接酶1(LIG1) 、连接酶3(LIG3) 、X射线修复交叉互补蛋白1(XRCC1) 和CtIP 在NHEJ缺陷的B细胞的CSR中也不是必需的。然而，我们确定，在NHEJ缺陷和SHLD无保护的转换B细胞中，Pol θ产生了大多数无效的修复事件，和Shld1 B细胞缺乏高度切除和/或倒位的接头。有趣的是，在XRCC4和CtIP 都缺陷的B细胞中也是如此，这表明CtIP参与了AID诱导的双链断裂的TMEJ。我们的研究结果表明，和Shld B细胞表现出与野生型相同的接头修复特征，这表明在NHEJ缺陷或SHLD无保护的情况下，≥4 bp的MH接头来自TMEJ。虽然我们不能排除在XRCC4和SHLD1缺陷的细胞中，一些有效的Sμ-Sy1接头可能通过TMEJ进行处理的可能性，但Pol θ缺失时CSR水平不变表明它在有效的同种型转换中不发挥主要作用，因此存在另一种修复机制。我们的高通量接头特征分析进一步揭示，不依赖于Pol θ的修复主要依赖于0 - 2bp的MH，类似于NHEJ样修复。有趣的是，在LIG4缺陷的B细胞中，XPF-ERCC1的缺失显著降低了有效的CSR，而没有显著影响MH驱动的切除和/或倒位接头，这表明该复合物参与了不依赖于Pol 的修复分支。此外，RAD52的缺失显著降低了KU80缺陷的B细胞中的CSR效率，而HMCES的缺失显著降低了LIG4缺陷的B细胞中的CSR效率，尽管这些细胞中的类别转换接头仍有待分析。

虽然AID诱导的DNA断裂主要在G1期产生，但类别转换重组(CSR)发生在活跃增殖的B细胞中，AID断裂在G1期之后持续存在，因此在S期和G2期会遇到额外的DNA末端处理因子。这拓宽了可用修复途径的范围，增加了切除/同源定向修复的可能性。在S期，RPA出现在AID诱导的单链DNA区域，这进一步表明这些断裂并非仅由非同源末端连接(NHEJ)修复，而是仍可通过其他修复机制进行修复。我们的研究结果支持了这一点，因为我们观察到经历切除的AID断裂子集被引导至微同源末端连接(TMEJ)。一个关键的观察结果是，在G0/G1期停滞的细胞中不存在Pol θ，但在进入S期时其表达迅速增加( 和本研究)，这表明TMEJ不是一种直接的G1期修复机制。已证明Pol 可从单链DNA上取代RPA ，这强化了TMEJ主要发生在存在RPA包被中间体的S期或更晚阶段的观点。此外，Pol 与几种同源重组(HR)和复制应激因子相互作用，表明它在S期具有活性。我们之前表明，RAG诱导的在G1期之后持续存在的断裂变得高度依赖Pol θ进行修复，经常导致易位。使用相同的前B细胞模型，我们研究了通过TMEJ进行G1期断裂修复的时间，并表明在G1期到S期的转变过程中，通过Pol θ对RAG断裂进行修复。这强调了进入S期时TMEJ的快速参与，并进一步突出了其在未解决的G1期断裂进入细胞周期时维持基因组稳定性中的作用。

为了更深入地了解G1/S期TMEJ的调控机制，我们研究了它是否依赖于RHINO或PLK1，这两个在有丝分裂修复过程中对Pol θ招募至关重要的因子。RHINO和PLK1的表达在整个细胞周期中都受到严格调控，在M期观察到它们的最高水平，尽管它们从S/G2期开始逐渐积累。鉴于它们在有丝分裂修复中已确定的作用，我们试图确定RHINO或PLK1是否也促进持续到S期的AID和RAG诱导的G1期断裂的修复。通过基因分析，我们证明RHINO对于这些断裂的修复是可有可无的，这强化了AID和RAG诱导的损伤不会持续到有丝分裂，而是在细胞周期的早期(G1/S期)得到解决的观点。此外，使用PLK1抑制，我们还证明这种修复不依赖于PLK1。因此，我们的研究结果表明，G1/S期的Pol 招募通过一种独特的、不依赖于RHINO和PLK1的机制进行，突出了G1/S期和有丝分裂TMEJ之间的根本差异。我们的研究结果还意味着，G1期断裂的G1/S期TMEJ在机制上与有丝分裂TMEJ不同。与BRCA缺陷细胞中S/G2期复制断裂的情况不同，NHEJ缺陷细胞中G1期诱导断裂的TMEJ似乎不会被RAD52阻断，也不会延迟到有丝分裂开始。此外，在有丝分裂期间，细胞周期蛋白F对EXO1的降解对于允许TMEJ至关重要。在S期，存在长距离切除外切核酸酶EXO1，TMEJ似乎没有受到抑制。这些结果强调了G1/S期Pol θ介导的修复的独特调控框架，将其与有丝分裂DNA修复中其功能的调控机制区分开来。

通过一项靶向基因筛选确定了RHINO在微同源介导的末端连接中的作用，该筛选旨在利用非同源末端连接(Lig4 )、同源重组(Brca2 )和p53 缺陷的细胞来剖析微同源介导的修复。该筛选确定RHINO是有丝分裂期微同源介导的末端连接的必需因子，因为在BRCA2缺失的细胞中其缺失重现了在BRCA2/Pol θ缺陷环境中观察到的合成致死性。然而，与同源重组缺陷的细胞不同，非同源末端连接缺陷的细胞对RHINO缺失不敏感；Xrcc4 Rhno1 B细胞仍然存活，没有严重细胞应激的迹象，尽管它们在基线遗传不稳定性上确实略有增加(如在中期染色体铺展中观察到的)。此外，前B细胞在受到RAG诱导的G1期断裂后，像细胞一样恢复细胞周期，而不像细胞，后者在进入细胞周期时会崩溃。这表明在筛选中鉴定出RHINO主要是由于其与同源重组的合成致死性而非非同源末端连接。

总体而言，我们发现，在缺乏非同源末端连接(NHEJ)的情况下，有效的同种型类别转换独立于Pol θ发生，而无效的重组事件则依赖于Pol θ，这两者对于维持/gh基因座完整性都很重要。此外，我们的研究表明，G1期诱导的双链断裂(DSB)在S期由Pol θ独立于RHINO和PLK1进行修复，这使其有别于有丝分裂中复制性断裂的模板介导的末端连接(TMEJ)。这些发现揭示了Pol 与NHEJ相比与同源重组(HR)合成致死性背后的机制差异，对开发利用癌症中DNA修复弱点的治疗策略具有潜在意义。

方法

小鼠

CD21-Cre 、Xrcc4fłow、Polq (B6.Cg-Polqtm1Jcs/J；RRID:IMSR_JAX: 006194)和Shld 小鼠先前已有描述。将这些小鼠进行杂交以获得双缺陷和Shld1 个体。小鼠在无特定病原体(SPF)条件下饲养，并处于光照黑暗循环中。在所有实验中，使用6至12周龄、性别和年龄匹配的小鼠。在没有CD21-Cre 的情况下，Xrcc4flox/flox或Xrcc4 与野生型无明显差异，因此，Xrcc4flox/flow小鼠也用作对照。通过二氧化碳暴露对小鼠实施安乐死。所有实验均按照巴斯德研究所/动物伦理委员会(dha210006)的机构动物护理和伦理委员会的指导方针进行。

淋巴细胞发育

对6至12周龄、性别和年龄匹配的小鼠的胸腺、骨髓和脾脏中的淋巴细胞发育进行了分析。在进行细胞表面染色之前，用Fc阻断抗体(CD16/CD32(Fcg III/II受体)，BD Biosciences 553142，克隆2.4G2，1:200稀释)对所有组织的单细胞悬液进行预处理。所有抗体染色均在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中进行。在FACS Fortessa(BD Bioscience)上进行流式细胞术检测，并根据补充图1中的门控使用FlowJo™ v10.8.0(TreeStar)分析数据。

基于骨髓样本中以下标志物的表达鉴定B淋巴细胞亚群:未成熟B细胞(B220 IgM )、再循环B细胞(B220 IgM )、前B细胞(B220 )和pre - B细胞(B220 )。基于以下表达谱鉴定来自胸腺的T淋巴细胞亚群:双阴性(DN)细胞(CD4_ )、DN1 、DN2(CD4 )、DN3 、DN4(CD4 )、双阳性(DP)细胞(CD4 CD8 )和单阳性细胞(CD4 CD8 和CD4 CD8 )。基于以下标志物的表达鉴定来自脾脏的淋巴细胞:总B细胞(CD19’IgM’)和T细胞(CD3 TCR )。使用以下抗体进行细胞表面染色:抗B220 - AF488(BD Pharmingen 557669，克隆号RA3 - 6B2，1:200稀释)、抗CD43 - PE(BD Pharmingen™ 553271，克隆号S7，1:200稀释)、抗CD19 - V450(BD Horizon™ 560375，克隆号1D3，1:200稀释)、抗IgM - PECy7(BD Pharmingen™ 552867，克隆号R6 - 60.2，1:200稀释)、抗CD4 - PE(BD Pharmingen™ 553048，克隆号RM4 - 5，1:200稀释)、抗CD8a - AF488(BD Pharmingen™ 557668，克隆号53 - 6.7，1:200稀释)、抗CD3e - APC(BD Pharmingen™ 553066，克隆号145 - 2C11，1:200稀释)、抗CD44 - V450(BD Horizon™ 560451，克隆号IM7，1:200稀释)、抗CD25 - PECy7(BD Pharmingen™ 552880，克隆号PC61，1:200稀释)和抗TCRβ - APC - eF780(eBiosciences 47 - 5961 - 82，克隆号H57 - 597，1:200稀释)。完整的设门策略请参考。

体外类别转换重组(CSR)分析

根据制造商的说明(Miltenyi Biotec 130 - 121 - 301)，使用磁性抗CD19珠子从小鼠中纯化脾B细胞。细胞在培养，培养基为补充有12%胎牛血清、青霉素链霉素和 2 - 巯基乙醇的RPMI 1640完全培养基。在4 - 5天内，使用以下细胞因子组合在细胞/ mL的条件下进行类别转换重组(CSR)分析；IgG1与抗IgD葡聚糖(3 ng/ml，Fina Biosolutions)、IL - 4(10 ng/ml，Miltenyi)和LPS(25 μg/ml；Sigma - Aldrich)，IgG2b和IgG3与抗IgD葡聚糖(3 ng/ml)和LPS(25 μg/ml)，以及IgA与抗IgD葡聚糖(3 ng/ml)、IL - 5(5 ng/ml；R&D Systems)、TGF - β(3 ng/ml；R&D Systems)和视黄酸(RA；0.3 ng/ml；Sigma - Aldrich)。使用抗CD19 - V450(BD Horizon™ 560375，克隆1D3，1:200稀释)、抗CD19 - APC(BD Pharmingen™ 550992，克隆1D3，1:200稀释)、抗IgG1 - APC(BD Pharmingen™ 550874，克隆X56，1:200稀释)、抗IgG2bPE(Biolegend 406708，克隆RMG2b - 1，1:200稀释)、抗IgG3 - FITC(BD Pharmingen™ 553403，克隆R40 - 82，1:200稀释)、抗IgM - PE - Cy7(BD Pharmingen™ 552867，克隆R6 - 60.2，1:200稀释)和抗IgA - PE(eBioscience ，克隆mA - 6E1，稀释)抗体通过流式细胞术评估类别转换。在FACS Fortessa(BD Bioscience)上采集流式细胞术数据，并使用FlowJo™ v10.8.0(TreeStar)分析数据。

细胞增殖(CTV)

通过体外细胞标记进行增殖分析，对纯化的脾细胞进行操作，这些细胞在细胞于含有 Cell Trace 紫罗兰(CTV)的PBS中在室温下染色 (Thermo Scientific 10220455)，按照制造商的方案进行。在将CTV染色的B细胞在孵育之前，先用完全培养基额外洗涤两次。然后如上述用LPS、IL - 4和抗IgD葡聚糖刺激它们。在Fortessa分析仪(BD Biosciences)上采集FACS数据，并通过Flowjo软件v10.4.2(TreeStar)进行分析和可视化。

DNA - FISH探针

用于Igh基因座的BAC探针，即BAC RP24-134G24(IghC)和BAC RP24-386J17(IghV)，以及用于Igk基因座的BAC探针，即BAC RP23-341D5(IgkC)和BAC RP24-243E11(IgkV)，通过用ChromaTide Alexa Fluor 488-5-dUTP或ChromaTide Alexa Fluor 594-5-dUTP(Molecular Probes)进行缺口平移直接标记。标记后的BAC探针使用Illustra MicroSpin G-50 Columns(GE Healthcare)进行纯化。将每种BAC探针共800 ng汇集在一起，并用小鼠Cot1 DNA和鲑鱼精DNA(Life Technologies)沉淀。然后将探针重悬于杂交缓冲液(10%葡聚糖硫酸酯、5x Denharts溶液、甲酰胺)中，在下变性，并在下预退火。来自MetaSystems的XCyting小鼠12号染色体(橙色)或XCyting小鼠6号染色体(橙色)涂染剂在下变性，并在中期铺片杂交前与BAC探针混合。

中期铺片上的DNA-FISH

使用标准程序制备中期铺片。简要地说，细胞用秋水仙酰胺 (Life technologies，Kar-yoMAX秋水仙酰胺溶液)在下孵育。然后，收集细胞并在中在下孵育，用固定液(75%甲醇/25%乙酸)固定，并在固定液中洗涤三次。将细胞悬液滴在冰冷潮湿的载玻片上，空气干燥以进行进一步处理。

在中期铺片上进行DNA-FISH，方法是用RNase A 处理载玻片，在70%、90%和100%乙醇中脱水(每次3分钟)，在70%甲酰胺/2x SSC中变性(3分钟，77°C)，在冰冷乙醇浴系列(70%、90%、100%乙醇 - 每次3分钟)中脱水，并与探针杂交(过夜，湿盒)。载玻片在下用50%甲酰胺/0.5x SSC洗涤，在下用0.5x SSC洗涤，。随后，将干燥的载玻片用含DAPI的ProLong Gold抗褪色试剂封片(Invitrogen P36931)。使用ZEISS Axiolmager.Z2显微镜和Metafer自动捕获系统(MetaSystems)对中期铺片进行成像。在Metafer上手动进行中期铺片分析。

LR-PCR和PacBio测序

使用Platinum SuperFi II聚合酶预混液(Invitrogen 16445389)进行长程PCR。使用EμF和Cγ1R2或CαR引物扩增总共100 ng的基因组DNA。循环条件如下:1个循环(98 30秒)；30个循环(98 10秒，57 10秒，68 8分钟)；1个循环(68 5分钟)。以内参IL-2基因为上样对照，使用IMR42和IMR43引物进行扩增，循环条件如下: 30秒)；。引物序列请参考补充数据9。

对于每个样本，在使用Novogene的长读长PacBio Revio技术进行测序之前，对大量PCR扩增产物进行纯化，并制备测序文库。使用PacBio的SMRTLINK软件(v9)(smrtlink: https://www.pacb.com/support/software-downloads/)对序列进行解复用并构建一致环状读段(CCS)。将CCS读段转换为FastQ文件后，使用包含PacBio和剪接选项的minimap2 v2.26-r1175将其映射到小家鼠基因组(参考GRCm38)上。未与感兴趣区域(IgM到IgG1:染色体12，113330523 - 11333884；IgM到IgA:染色体12，范围113255485 - 113431785)的5’和3’部分均比对上的读段被过滤掉。使用SAMtools和R对比对后的读段进行后续的生物信息学分析，以获取覆盖度和读长，同时使用Python和R脚本进行连接分析。简要地说，对于每个读段，确定从5’(Sα/Sy1区域 )到端( 区域 )的断点，提取它们的基因组位置和CIGAR信息。为了抵消长程PCR引入的潜在PCR偏差，仅使用具有测序深度的唯一断点进行修复位置和特征的下游分析。位于或区域之外(5’和/或3’端)的断点被定义为切除连接。此外，CH12F3细胞系中重排的非生产性等位基因被从分析中去除。我们使用Ime包中的lmer函数在线性混合模型中对读长进行建模，并使用emmeans包(https://cran.r-project.org/web/packages/emmeans/index.html)通过Tukey HSD检验估计每个对比的统计显著性。

类别转换 - 高通量基因组靶向测序(CSR-HTGTS)

按照生成HTGTS文库(补充数据9)，使用150 bp双端Nova-seq(Illumina)进行测序，并如前所述使用mm9基因组参考进行处理。

CH12F3和v-Abl原B细胞系的培养

CH12F3和v-Abl原B细胞在补充有12%胎牛血清(Sigma F7524)、青霉素(100 U/ml)/链霉素(100 μg/ml)、50 μM 2-巯基乙醇、1x MEM非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠和10 mM HEPES的RPMI 1640培养基中培养。

我们使用Polθi和PLKi对 -Abl原B细胞进行了敏感性分析，以确定维持细胞活力的合适治疗剂量(补充图9a)，如正文和图中所示，我们使用了5μM/10μM的Polθi(ART558，MedChemExpress，HY-141520)和50 nM的PLK1i(Volasertib，Euromedex S2235-10mM/1 mL，Bi6727)。

培养和CRISPR-Cas9工程改造的CH12F3和v-Abl原B细胞系

如前所述生成基因敲除细胞克隆。使用含有两个编码sgRNA的pCas9-EGFP质粒(针对每个靶向基因特异)对CH12F3和/或原B细胞进行核转染。电穿孔后的细胞静置恢复，然后将表达GFP的单细胞分选到96孔板中。然后通过PCR筛选克隆，并对PCR产物进行Sanger测序，以鉴定CRISPR/Cas9在切割位点诱导的编辑。生成了几个独立的基因敲除克隆(补充数据8)。所用sgRNA序列和基因分型引物见补充数据9。由于缺乏针对小鼠XRCC4和Pol θ的良好抗体，我们使用依托泊苷和MMS敏感性分析验证了我们的Xrcc4 和Polq CH12 B细胞系(补充图5b)。在期间，将CH12 B细胞暴露于不同浓度的依托泊苷或MMS，然后使用MACSQuant分析仪(Miltenyi Biotec，德国贝吉施格拉德巴赫)通过流式细胞术回收活细胞计数，并使用FlowJo软件v10.4.2(TreeStar)分析FACS图谱。

CH12F3细胞系中的类别转换重排(CSR)分析

为了诱导IgM到IgA的类别转换，将50,000个CH12F3细胞/ml接种在补充有抗CD40抗体(1μg/ml，Miltenyi)、IL-4(20 ng/ml，Miltenyi)和TGF-β(1 ng/ml，R&D Biotech)的完全RPMI培养基中。细胞因子刺激后第4天，使用IgA-PE(mA-6E1，1:200)和IgM-PE-Cy7(R6-60.2，1:200稀释)抗体以及Fortessa分析仪(BD Biosciences)通过流式细胞术测定类别转换能力。数据通过FlowJo软件v10.4.2(TreeStar)进行分析。评估了所用CH12F3细胞系中的GLTs和AID表达水平(补充图8)。

RAG双链断裂(DSB)的诱导

的激酶抑制剂STI-571(诺华公司)处理v-Abl原B细胞，以诱导G0/G1期停滞和RAG的表达/稳定。用PBS洗涤细胞3次以去除ABLKi，导致细胞从G0/G1期释放并进入S-G2/M期。

Igk巢式PCR分析，V(D)J重组产物

如前所述，通过巢式PCR 扩增内源性编码接头。使用Jk4-pa和V10-95-pa引物以及以下循环扩增总共250ng的基因组DNA: 。使用Jk4-pb和V10-95-pb引物，将2.5 μl的第一次PCR反应产物使用以下循环进行再扩增: ，。作为上样对照，使用IMR42和IMR43引物以及以下循环扩增IL2基因:1× 。引物序列见补充数据9。

Igk 巢式PCR的产物在琼脂糖凝胶上纯化，并按照生产方案克隆到TA pCR 4-TOPO (Invitrogen ，450030)中。分离单菌落，并使用SANGER测序对克隆片段进行测序。使用内部R/bash脚本分析序列，以检测插入、微同源性和切除的存在。

细胞周期

将V-Abl原B细胞与 Edu(耶拿生物科学公司CLK-N001-25)在下孵育，用1x PBS洗涤，并用多聚甲醛在下固定至少。细胞用硫酸铜(西格玛C1297-100G)、2 μM iFluor™ 647叠氮化物(AAT生物quest 1091)和 L-抗坏血酸(西格玛A5960-25G)在室温下染色，然后用PBS洗涤。然后，细胞用PI染色混合液(1.9 mM柠檬酸三钠二水合物(西格玛S4641-500G)、碘化丙啶(赛默飞世尔科技440300250)、250 μg/ml核糖核酸酶A(英杰公司8003089)、0.5 mM Tris-Hcl、0.75 mM NaCl)在下孵育过夜。在Fortessa分析仪(BD生物科学公司)上采集FACS数据，并通过Flowjo软件v10.4.2(TreeStar)进行分析和可视化。使用MoFlo Astrios EQ(贝克曼库尔特公司)对每个细胞周期阶段的细胞进行分选，每个门分离400万至2000万个细胞用于基因组DNA分离。

RT-qPCR、AID和GLTs表达

使用标准技术进行RNA和cDNA制备。使用SYBR™ Green PCR Master Mix(应用生物系统公司4309155)进行定量PCR，技术重复两次或三次，并在QuantStudio 3实时PCR系统上收集数据。使用QuantStudio Design & Analysis Software v2.6.0分析数据，确定阈值循环(CT)值。分别使用ACT1和HPRT基因作为校准物和对照。通过将标准化值与野生型样品或HPRT进行比较，确定感兴趣转录本的相对表达。引物列表见补充数据9。

报告总结

有关研究设计的更多信息，请参阅与本文相关的《自然》系列报告总结。

数据可用性

本研究中生成的HTGTS和PacBio数据分别已存入NCBI的基因表达综合数据库和序列读取存档库(SRA)，登录号分别为GSE306291(HTGTS)和PRJNA1304899(PacBio)。源数据包括所有未裁剪的凝胶，以及所有图和补充图中图表所示的数据。本文提供源数据。

代码可用性

用于分析PacBio数据的自定义脚本可在Zenodo上获取(https:// doi.org/10.5281/zenodo.17266277) 。

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