人外周血间充质干细胞早期和晚期培养中TCF4、GSK、TERT和TERC表达与增殖潜能的相关性
发布时间：
2026-08-19 21:11
人外周血间充质干细胞早期和晚期培养中TCF4、GSK、TERT和TERC表达与增殖潜能的相关性
扎赫拉·法泽利，博士 ，马苏梅·拉贾比巴兹尔，博士 ，塞皮德·法拉马尔齐，理学硕士 ，米尔·达武德·奥姆拉尼，博士 ，赛义德·穆罕默德·侯赛因·加德里安，医学博士、哲学博士，尼卢法尔·萨法维·奈尼，理学硕士
1. 伊朗德黑兰沙希德·贝赫什提医科大学医学院医学遗传学系 2. 伊朗德黑兰沙希德·贝赫什提医科大学医学院临床生物化学系
*通讯地址:邮政信箱:19839 - 63113，伊朗德黑兰沙希德·贝赫什提医科大学医学院医学遗传学系
电子邮箱:z.fazeli@sbmu.ac.ir
收到日期:2019年4月23日，接受日期:2019年6月22日
摘要
目的:近年来，间充质干细胞(MSCs)被认为是再生医学中移植到受损组织的合适细胞来源。不同器官中这些细胞数量较少，这一特性是将其用于疾病治疗的主要缺点。已证明干细胞的细胞衰老依赖于端粒酶活性。本实验研究的目的是评估人外周血来源的间充质干细胞(PB - MSCs)中端粒酶成分和WNT信号通路表达的相关性。
材料与方法:在本实验研究中，从外周血单个核细胞中分离出MSCs后，在早期培养(第8 - 9天)和晚期培养(第14 - 17天)从这些细胞中提取RNA。然后，基于SYBR Green通过定量逆转录聚合酶链反应(qRT - PCR)测定TERT、TERC、TCF4、GSK和CTNNB1的表达。
结果:我们的数据表明，人外周血来源的MSCs晚期培养中TERT表达显著降低(P < 0.05)。尽管在MSCs早期培养中GSK和TERC表达水平之间观察到负相关，但斯皮尔曼分析表明端粒酶成分(TERC和TERT)与WNT信号通路的表达之间无显著相关性(P > 0.05)。
结论:获得的结果表明WNT信号通路可能在维持MSCs的端粒长度和增殖潜能中起次要作用。
关键词:细胞衰老，间充质干细胞，再生医学，WNT信号通路
《细胞杂志(雅赫特)》，第22卷，第4期，2021年1月 - 3月(冬季)，第431 - 436页_____
引用:法泽利Z，拉贾比巴兹尔M，法拉马尔齐S，奥姆拉尼MD，加德里安SMH，萨法维·奈尼N。人外周血间充质干细胞早期和晚期培养中TCF4、GSK、TERT和TERC表达与增殖潜能相关性。《细胞杂志》。2021；22(4):431 - 436。doi: 10.22074/cellj. 2021.6920。本开放获取文章已根据知识共享署名非商业性3.0(CC BY - NC 3.0)条款发表。
引言
在间充质干细胞(MSCs)自我更新和分化能力被表征之后，这些细胞被认为是组织工程和受损组织修复领域的合适候选者(1)。已证明MSCs可从不同来源分离，包括骨髓、滑膜、脐带、脂肪组织和外周血(2, 3)。为了在细胞治疗中使用MSCs，在这些细胞长期培养后获得足够数量的MSCs是必要的。然而，长时间培养与细胞衰老相关(4)。鉴定调节MSCs衰老的机制可能在防止这些细胞衰老中起关键作用。
端粒长度已被证明在细胞衰老中起重要作用。通过端粒酶维持端粒长度可防止细胞增殖停滞(5, 6)。Izadpanah等人(7)证明间充质干细胞(MSCs)中存在端粒酶活性(TA)。他们的结果表明，MSCs中的TA随着衰老而降低。端粒酶的组成型表达伴随着MSCs增殖能力的增强，且对其分化潜能没有任何副作用(8)。不同研究表明，TA依赖于人端粒酶逆转录酶(TERT)的表达。TERT表达主要在转录水平受到调控(9)。
对MSCs表达谱的分析表明，包括WNT信号通路在内的几种信号通路在不同生物学过程中发挥作用(10, 11)。WNT信号通路已被证明参与包括干细胞更新在内的多个细胞过程(12)。WNT与其受体相互作用后，相应信号被转导至下游分子，即Dsh。这种转导导致APC/Axin/GSK3复合物的破坏。这一事件阻止了 -连环蛋白的降解。 -连环蛋白从细胞质转运到细胞核后，该蛋白与TCF4形成复合物，然后该复合物触发靶基因的转录(12, 13)。Zhang等人(14)报道，WNT信号通路在癌症和体细胞中具有调节TERT表达的能力。他们证明，通过shRNA敲低 -连环蛋白会导致癌细胞中TA降低。
在Gry等人(15)进行的研究中，评估了不同基因的RNA水平与蛋白质的相关性。他们的结果表明，在33%的病例中，RNA与蛋白质水平存在显著相关性。本研究的目的是调查外周血来源的MSCs(PB-MSCs)早期和晚期培养中端粒酶逆转录酶(TERT)和端粒酶RNA组分(TERC)的RNA表达是否依赖于WNT信号通路基因的表达。这一发现可能会增加我们对MSCs细胞衰老分子机制的理解。
材料与方法
外周血来源的人间充质干细胞的制备
在本实验研究中，从三名35 - 40岁的女性采集了 外周血。如前所述(16)，采用Ficoll密度梯度法从采集的人外周血中分离单核细胞。将获得的细胞沉淀接种于含有10%胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)、2 mM L-谷氨酰胺(伊朗BioIdea公司)和100 U/ml青霉素/链霉素(德国Gibco公司)的杜氏改良 Eagle培养基:营养混合物F-12培养基(DMEM-F12，伊朗BioIdea公司)中。72小时后，将含有未贴壁细胞的培养基换成新鲜培养基。在倒置显微镜下监测细胞生长。培养的细胞通常在六天后(D6)达到70 - 80%汇合度。通过德国Partec公司的CyFlow Space流式细胞仪确认这些细胞的表型特征为MSCs。本研究在培养8 - 9天和14 - 17天的MSCs培养物上进行；它们分别被称为早期培养和晚期培养。第6天的MSCs培养物用作对照。
定量逆转录聚合酶链反应
使用总RNA纯化试剂盒(德国耶拿生物科学公司)从培养细胞中获取总RNA。下一步，进行DNase I(美国Fermentas公司)处理以去除DNA污染。之后，使用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒(美国赛默飞世尔科技公司)合成cDNA。接下来，使用RealQ Plus Master Mix Green(丹麦Ampliqon公司)进行一式两份的定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)。反应条件如下:在 下孵育10分钟，随后进行40个循环，每个循环包括在 下变性30秒、在 下退火30秒以及在 下延伸30秒。引物序列见表1。通过熔解曲线分析以及用Safe stain(伊朗Yekta Tajhiz Azma公司)染色的1.5%琼脂糖凝胶(伊朗Genfanavaran公司)电泳确认qRT-PCR产物的特异性。
符合伦理标准
本研究中涉及人类参与者的所有程序均符合机构和/或国家研究委员会的伦理标准，符合1964年《赫尔辛基宣言》及其后续修订版本或类似的伦理标准。本研究已获得沙希德贝赫什提医科大学医学院伦理委员会(伊朗德黑兰，伦理代码:IR.SBMU.MSP.REC.1397.550)的批准。所有作者均已阅读并确认了该手稿。
表1:本研究中使用的引物序列
| 基因符号 | 引物序列(5’-3’) | 产物长度(bp) |
| 热休克蛋白90α家族成员1 | 正向: GGAAGTGCACCATGGAGAGGA | 157 |
| 反向: GCGAATCTTGTCCAAGGCATCAG | ||
| 端粒酶逆转录酶 | 正向: GGAGCAAGTTGCAAAGCATTG | 182 |
| 反向: TCCCACGACGTAGTACATGTT | ||
| 端粒酶RNA组分 | 正向: CTGGGAGGGGGTGGTGGCCATTT | 179 |
| 反向: CGAACGGGCCAGCAGCTGACAT | ||
| 糖原合成酶激酶3β | 正向: TCGAGAGCTCCAGATCATGAGAA | 124 |
| 反向: CGGAACATAGTCCAGCACCAGA | ||
| β-连环蛋白 | 正向: TCTGAGGACAAGCCACAAGATTACA | 122 |
| 反向: TGGGCACCAATATCAAGTCCAA | ||
| 转录因子4 | 正向: GCACTGCCGACTACAATAGG | 150 |
| 反向: CTGCATAGCCAGGCTGATTC |
统计分析
通过pfaff1方法估计所研究基因的相对表达水平。本研究进行了三次独立实验，并使用HSP90AB1作为管家基因对qRT-PCR数据进行标准化。采用学生t检验来确定间充质干细胞早期和晚期培养物之间的差异。通过估计斯皮尔曼相关系数(r)来确定端粒酶成分表达与WNT信号通路基因之间的相关性。P<0.05被认为具有统计学意义。这些分析使用社会科学统计网站(http://www.socscistatistics.com/tests/studentttest/Default2.aspx)进行。
结果
本研究中干细胞的CD标志物分析表明，这些细胞表达CD184、CD105、CD73和CD44。在这些细胞中未检测到CD14和CD45的表达(图1)。这些细胞表面标志物的模式证实了这些细胞为间充质干细胞。在培养的第 天，这些细胞呈现成纤维细胞样形态。随着细胞年龄的增加，其外观发生变化。在培养的第 天，在倒置显微镜下这些细胞呈现扁平且宽大的形态(图2)。
图1:外周血间充质干细胞(PB-MSCs)流式细胞术分析结果。CD标志物表达分析表明，这些细胞CD184、CD105、CD73和CD44呈阳性，而CD14和CD45呈阴性。
所研究基因的相对表达水平分析表明，间充质干细胞晚期培养物中TERT显著下调(t检验:-2.29，P = 0.04，表2)。所得结果表明，培养14 - 17天时TERT和TERC的低表达与间充质干细胞培养8 - 9天时TCF4表达减少和GSK表达增强相关(图3，表2)。此外，我们发现间充质干细胞早期培养物中TERC表达增强与CTNNB1表达增强和GSK表达减少相关(表2)。斯皮尔曼分析表明，TERC与CTNNB1、GSK以及TCF4表达之间存在弱相关性。然而，这种相关性无统计学意义(P>0.05，表3)。
图2:外周血间充质干细胞(PB-MSCs)的形态。A. 在初始培养的第 天，这些细胞呈现成纤维细胞样形态，B. 它们的形态随时间变化，C. 在晚期培养时它们呈现扁平且宽大的形态(比例尺: )。
表2:间充质干细胞早期和晚期培养物中所研究基因表达数据的学生t检验(双侧)分析结果
| 所研究的基因 | 早期培养 | 晚期培养 | ||
| t检验 | P值 | t检验 | P值 | |
| 端粒酶RNA组分 | 1.82 | 0.14 | -1.43 | 0.18 |
| 端粒酶逆转录酶 | 0.17 | 0.87 | -2.29 | |
| E蛋白转录因子4 | 0.21 | 0.85 | -0.64 | 0.54 |
| β-连环蛋白 | 1.19 | 0.30 | 1.44 | 0.18 |
| 糖原合成酶激酶 | -1.22 | 0.29 | 0.92 | 0.38 |
*；具有统计学意义。
表3:使用谢尔曼相关系数分析端粒酶成分表达与WNT信号通路的关系
| WNT信号通路基因 | 早期培养 | 长期培养 | ||||||
| 端粒酶RNA组分 | 端粒酶逆转录酶 | 端粒酶RNA组分 | 端粒酶逆转录酶 | |||||
| P值 | P值 | P值 | P值 | |||||
| 转录因子4 | 0.5 | 1 | -0.5 | 1 | 0.143 | 0.803 | -0.371 | 0.497 |
| β-连环蛋白 | -1 | 0.333 | -0.5 | 1 | 0.486 | 0.355 | -0.143 | 0.803 |
| 糖原合成酶激酶 | -0.5 | 1 | 0.5 | 1 | 0.257 | 0.658 | -0.428 | 0.419 |
；斯皮尔曼相关系数。
图3:与晚期培养相比，早期间充质干细胞(MSC)培养中TERT、TERC、TCF4、CTNNB1和GSK的平均表达水平。进行了三项独立实验，并将表达水平标准化为HSP90AB1基因的表达水平。
讨论
近年来，MSC被认为是治疗不同疾病的良好细胞模型。这些细胞的安全性和有效性已在许多MSC给药的临床试验中得到证实。然而，了解MSC的生物学特性有助于这些细胞在临床上的应用。Zhao等人(17)表明，来自Sprague Dawley大鼠骨髓的MSC长期培养中端粒酶活性降低。他们还证明，TERT的过表达与增殖率提高和MSC衰老降低有关。
在本研究中，我们发现随着人PB - MSC的老化，TERT和TERC的表达降低，这与从人骨髓和脂肪组织来源的MSC获得的结果一致(18)。TA已被证明在干细胞的不同特性中很重要，包括增殖和分化能力。Kang等人(19)表明，将端粒酶逆转录酶基因转染到MSC中可以延长寿命和提高分化能力。
一些研究表明，TERC表达可以参与其他基因的上调或下调，包括参与糖酵解途径、血管生成和转移的基因以及NF - κB靶基因(20 - 22)。尽管斯皮尔曼相关性分析的结果表明TERT表达与PB - MSC中WNT信号通路基因的表达没有显著相关性，但我们观察到在研究的细胞中GSK与TERT表达呈负相关。这些结果表明TERT可能在WNT信号通路基因的调节中发挥作用。
不同的研究表明，β - 连环蛋白通过GSK磷酸化导致其降解，从而抑制WNT信号通路(23)。MSC早期培养中TERC表达增强与GSK表达降低的关联得到了MSC早期培养中 - 连环蛋白的稳定和激活的支持。此外，TERC与GSK表达的负相关(数据未显示)表明，在MSC早期培养中，TERC通过GSK间接调节 - 连环蛋白基因的活性。
关于端粒酶如何影响其他基因的表达有几种假设，其中一种假设提出端粒酶通过改变染色质结构影响基因表达。另一种假设表明端粒酶与不同转录因子的相互作用在基因转录调控中协同作用(23 - 25)。TCF4和TERT的表达支持了TERT与TCF4相互作用对下游WNT信号通路基因表达的影响。
结论
包括WNT信号通路在内的几种途径已被揭示参与干细胞的端粒酶调节和自我更新能力。然而，但关于WNT信号通路对人PB - MSC来源的MSC中端粒酶成分表达的影响尚无报道。我们的数据表明，MSC早期培养中WNT信号的激活可能有助于TERC和TERT表达的增强，而该信号通路似乎在端粒酶成分的表达以及可能的端粒酶活性中起次要作用。综上所述，这些发现表明研究其他信号通路可以提高我们对TERT和TERC调节的认识。
致谢
本研究得到了“沙希德·贝赫什提医科大学医学院研究部”(资助编号:12420)的资助。本研究不存在利益冲突。
作者贡献
Z.F.；进行研究设计、撰写手稿并负责全面监督。M.R.；进行数据分析及其解释。M.D.O.，S.M.H.G.；参与结果解释和讨论准备。S.F.，N.S.N.；进行实验，包括细胞制备和细胞的分子分析。所有作者阅读并批准了手稿。
References
1. Mahla RS. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. Int J Cell Biol. 2016; 2016: 6940283.
2. Nancarrow-Lei R, Mafi P, Mafi R, Khan W. A systemic review of adult mesenchymal stem cell sources and their multilineage differentiation potential relevant to musculoskeletal tissue repair and regeneration. Curr Stem Cell Res Ther. 2017; 12(8): 601-610.
3. Rohban R, Pieber TR. Mesenchymal Stem and progenitor cells in
人外周血,间充质干细胞,WNT,端粒酶,TERT,衰老,干细胞端粒
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