前列腺癌中TP53、SPOP和PIK3CA基因状态

发布时间：

2026-08-20 20:50

前列腺癌中TP53、SPOP和PIK3CA基因状态

马扎尔·萨利姆·阿尔祖比1*、雷德·奥图姆2、穆罕默德·S·阿洛贾尼、萨米尔·阿尔巴希尔、巴哈·阿尔拉德、马纳尔·伊萨姆·阿布阿尔贾、索海卜·M·哈提卜、哈立德·巴泰奈2

摘要

分子生物学的最新进展使前列腺癌(PC)亚群的鉴定成为更深入了解分子发病机制和治疗选择的优先事项。全球范围内，在PC中已报道了许多基因如TP53、SPOP和PIK3CA基因的遗传改变，频率各不相同。我们旨在通过直接测序研究TP53、SPOP和PIK3CA基因热点病变的遗传改变，以及通过RT-PCR研究前列腺癌中TP53和PIK3CA的表达，并探讨TP53、SPOP和PIK3CA改变与前列腺癌肿瘤发生之间的相关性。从接受根治性前列腺切除术的患者中获取79份FFPE前列腺样本，进行基因组DNA提取，并对TP53基因的第5、6、7和8外显子、SPOP基因的第4和5外显子以及PIK3CA基因的第9和20外显子进行突变测序。对PIK3CA基因进行RT-PCR以评估其表达。我们的结果显示，在选定人群中TP53突变频率较高(11/79，13.9%)。另一方面，SPOP和PIK3CA基因在测序的外显子中未显示任何遗传改变。通过RT-PCR在6%的队列中检测到PIK3CA基因过表达。TP53突变是最常见的遗传改变，可能在约旦人群PC的发病机制中起主要作用。

关键词:TP53 - SPOP - PIK3CA - 前列腺癌 - p53

《亚洲太平洋癌症预防杂志》，21(11)，3365 - 3371

引言

前列腺癌(PC)被认为是男性癌症中第二常见的类型，也是第二大致死原因，在全球范围内是第四常见的癌症类型(费雷等人，2015年；西格尔等人，2017年；西格尔等人，2019年)。在约旦，据估计前列腺癌是男性中第四常见的癌症(8.4%)，也是第三大致死原因，男性死亡率为6.2%(阿卜杜勒-拉齐克等人，2015年)。年龄、家族病史、种族、生活方式、饮食、环境和遗传因素被认为是前列腺癌的风险因素(巴隆-兰达和帕森斯，2018年)。为了全面了解前列腺癌，人们进行了深入的分子研究以生成前列腺癌独特的分子特征，然而，前列腺癌的分子发病机制尚未完全明确(阿贝斯豪斯等人，2015年)。人们提出并研究了大量的基因改变，以了解前列腺癌的病因和分子病理学。例如，在不同人群的前列腺癌中已证实TP53、SPOP、PIK3CA、BRCA2和AR基因存在改变(布克斯坦等人，1993年；卡罗尔等人，1993年；塔普林等人，1995年；李等人，1997年；爱德华兹等人，2003c；托马斯等人，2007年；泰勒等人，2010年；巴比里等人，2012年；贝尔特兰等人，2013年)。尽管这些热点基因存在不同模式的基因改变，但这些研究结果并未确定与前列腺癌发生相关的特定基因改变，因为不同研究显示前列腺癌病例中TP53、SPOP和PIK3CA突变或改变的发生率各不相同(布克斯坦等人，1993年；卡罗尔等人，1993年；米尔钱达尼等人，1995年；爱德华兹等人，2003b；米勒等人，2007年；孙等人，2009年；泰勒等人，2010年；巴比里等人，2012年；阿贝斯豪斯等人，2015年)。前列腺癌细胞系中TP53突变的存在揭示了TP53改变对前列腺癌发生的影响(卡罗尔等人，1993年)。进一步的研究表明前列腺癌病例中TP53突变的频率各不相同(布克斯坦等人，1993年；沃勒等人，1994年；米尔钱达尼等人，1995年；托马斯等人，2007年；巴比里等人，2012年；阿贝斯豪斯等人，2015年)。同样，在前列腺癌病例中也检测到SPOP(斑点型POZ蛋白)基因的突变，其发生率各不相同(巴比里等人，2012年；布拉特纳等人，2014年；阿贝斯豪斯等人，2015年)。此外，PIK3CA基因改变在许多类型的癌症中高度普遍，如子宫内膜癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌和前列腺癌(坎贝尔等人，2004年；塞缪尔斯等人，2004年；小田等人，2005年；泰勒等人，2010年)。因此，识别前列腺癌的分子特异性亚群是更深入了解分子病理学和治疗方案的最终目标。

基础医学系，雅尔穆克大学医学院，伊尔比德211 - 63，约旦。生物科学系，雅尔穆克大学理学院，伊尔比德211 - 63，约旦。病理学和微生物学系，约旦科技大学医学院，伊尔比德，约旦。*通讯作者:mszoubi@yu.edu.jo

因此，本研究旨在调查TP53、SPOP和PIK3CA基因的遗传改变在约旦队列前列腺癌中的作用。我们旨在对TP53基因外显子5、6、7和8、PIK3CA基因外显子9和20以及SPOP基因外显子4和5中的热点突变进行直接测序。此外，通过RT-PCR评估PIK3CA基因的表达水平。

材料与方法

肿瘤样本与患者

在获得约旦科技大学阿卜杜拉国王大学医院(KAUH)机构审查委员会(IRB)批准后进行了样本采集和数据获取(IRB编号:13/1/881，医院政策:GM7601)。

2003年1月至2015年12月期间，考艾大学医院病理科提供了79例接受前列腺切除术的前列腺癌(PC)患者的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样本。组织诊断是根据要求进行检测的医生的病理评估提交的，并由病理科的病理学家进一步核实。我们特意从每个原始标本的原发性肿瘤中选取了癌细胞被识别的样本。仅对原发性肿瘤的一个代表性组织块进行了宏观解剖。大多数样本显示肿瘤成分超过60%。纳入研究的PC患者的平均年龄为72岁(55 - 95岁)。

DNA提取

使用QIAmp DNA提取试剂盒(德国希尔德市Qiagen GmbH公司)按照制造商的方案从(FFPE)中提取基因组DNA。简要地说，在1.5 mL Eppendorf管中收集五片FFPE切片。使用二甲苯(3次)和乙醇孵育(2次)进行脱石蜡和清除过程，离心并干燥。将最后的沉淀物与裂解缓冲液孵育，孵育两小时，然后进行柱洗涤，最后用洗脱缓冲液洗脱。所有洗脱液保存在中直至使用。通过Nano-drop估计DNA的纯度，并通过0.5%琼脂糖凝胶电泳确认，DNA样本保存在中用于长期储存以进行进一步分析。

聚合酶链反应(PCR)

基于NCBI基因序列，使用特定的引物组对TP53基因的外显子5、6、7和8、SPOP基因的外显子4和5以及PIK3CA基因的外显子9和20进行PCR扩增，以检测任何点突变(表1)。

PCR扩增反应在总体积为的反应体系中进行，使用即用型预混液(美国新英格兰生物实验室)。PCR反应在Gene Pro热循环仪

3366《亚太癌症预防杂志》，第21卷，型号TC - E - 96G(中国博日)中按照以下循环条件进行:初始变性在下进行3分钟；40个循环，变性30秒，退火30秒，延伸60秒；随后在下进行最终延伸5分钟。PCR产物通过在1.5%琼脂糖凝胶上运行样品进行分析和分离。

DNA测序

Sanger DNA测序由外部服务机构(美国新泽西州GENEWIZ公司)进行。DNA测序服务的输出结果通过Mutation Surveyor V5.1.1和FinchTV 1.5进行分析。当样本显示突变时，通过进行PCR和Sanger测序在单独的运行中重复两次。

RNA提取、cDNA合成和qRT - PCR

使用(德国耶拿生物科学公司)的总RNA纯化试剂盒进行RNA提取。然后，按照制造商的说明使用(立陶宛赛默飞世尔科技公司)的RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒制备cDNA。最后，使用(赛默飞世尔科技公司)的Maxima SYBR Green qPCR Master Mix(2X)试剂盒进行qRT - PCR，同时在(中国博日)LineGene 9600 Plus热循环仪上进行扩增。qRT - PCR分析使用相对于 -肌动蛋白参考基因的计算方法，使用以下引物(PIK3CA:F - 5’- GGCCACTGTGGTTGAATTGGG -3’，R - 5’- AGTGCACCTTTCAAGCCGCC -3’)，(β -肌动蛋白:F - 5’- GAA CGG TGA AGG TGA CAG -3’，R - 5’- TTT AGG ATG GCA AGG GAC T -3’)。

结果

对79份PC样本进行了TP53基因(NG_017013)(HGNC: 11998)外显子5、6、7和8、SPOP(NG_041815)(HGNC:11254)基因外显子4和5以及PIK3CA(NG_012113)(HGNC:8975)基因外显子9和20的突变筛查。患者的临床病理数据见表2。

当前结果显示，如表3所示，TP53基因存在相当高的突变频率(13.9%，11/79)。在9个样本中检测到TP53基因的错义突变，具体如下:在第5外显子检测到4个替换突变(A138T、L145P、2 C176Y)，在第5内含子检测到1个替换突变(C12351T)，在第6外显子检测到1个替换突变(L194R)，在第7外显子检测到2个替换突变(Y234N)，在第8外显子检测到1个替换突变(R273C)。此外，在第6外显子检测到一个终止突变(R196X)。最后，在第6外显子检测到一个沉默突变(R213R)。图1展示了检测到的突变样本。检测到的突变详细描述见表3。

另一方面，我们的研究结果显示SPOP基因外显子4和5以及PIK3CA基因外显子9和20未出现任何突变。此外，RT-PCR分析显示，在所选样本中，6%的PIK3CA基因存在过表达。

表1. 用于检测TP53基因外显子5、6、7和8、SPOP基因外显子4和5以及PIK3CA基因外显子9和20点突变的引物组

目标基因	外显子	正向引物	反向引物	熔解温度(℃)
TP53	5	正向- 5’CAC TTG TGC CCT GAC TTT CAA C-3’	反向- 5’- CAA CCA GCC CTG TCG TCT CTC -3’	56
	6	正向- 5’-TCC CCA GGC CTC TGA TTC CT-3’	反向- 5’- CCT TAA CCC CTC CCA GA -3’	56
	7	正向- 5’- GCC TCA TCTTGG GCC TGTGTTATC-3’	反向- 5’- TCA GAG GCA AGC AGA GGC TG -3’	56
	8	正向- 5’-CTGATTTCCTTACTGCCTCTTGC -3’	反向- 5’- TCTCCTCCACCGCTTCTTGTC -3’	56
SPOP	4	正向-5’-ACCCATAGCTTTGGTTTCTTCCCC-3’	反向-5’-TATCTGTTTTGGACAGGTGTTTGCG-3’	60
SPOP	5	正向-5’-ACTCATCAGATCTGGGAACTGC-3’	反向-5’-AGTTGTGGCTTTGATCTGGTT-3’	60
PIK3CA	9	5’-CTGTGAATCCAGAGGGGGAAA-’3	5’-CCACAAATATCAATTTACAACCATTG-’3	55
	9	5’-AATCCAGAGGGGGAAAAATATGA-’3	5’-TGAGATCAGCCAAATTCAGTTA-’3	55
	20	5’-GCTTTGTCTACGAAAGCCTCTCT-’3	5’-ATACATTCGAAAGACCCTAGCCC-’3	60
	20	5’-ATGATGCTTGGCTCTGGAAT-’3	5’-ACTCTCAGCAGGCAAAGACC-’3	60

讨论

在前列腺癌(PC)组织中发现了大量基因的结构和功能改变，涉及种系、体细胞和线粒体基因改变(Dong，2006年)。然而，由于这些PC突变的发生率各不相同，因此需要更多的基因研究来确定PC的分子特征。因此，我们旨在研究大多数癌症中最主要的基因突变为TP53、SPOP和PIK3CA的基因改变情况。

p53转录因子在响应DNA损伤或肿瘤发生激活时诱导细胞自杀过程中起核心作用(Sherr和McCormick，2002年)。因此，预计TP53基因的改变与包括PC在内的几种癌症的发生有关。我们的结果显示约旦PC中存在独特的基因改变模式，在所研究人群中有13.9%存在TP53突变。检测到的TP53突变存在于外显子5、6、7和8中。作为一种肿瘤抑制癌基因，TP53的基因改变在许多癌症中被报道为主要的突变基因(Bookstein等人，1993年；Carroll等人，1993年；Mirchandani等人，1995年；Sherr和McCormick，2002年；Dong，2006年；Kandoth等人，2013年)。1992年，Effert等人报告了TP53基因密码子172处存在点突变(Effert等人，1992年)。随后，TP53基因研究的进展表明，不同人群中TP53突变的发生率各不相同，从2%到65%不等(Hall等人，1995年；Hughes等人，1995年；Kubota等人，1995年；Gumerlock等人，1997年；Theodorescu等人，1997年；Kluth等人，2014年)。此外，一些研究表明TP53突变与PC的晚期阶段有关(Bookstein等人，1993年；Abate-Shen和Shen，2000年)。而其他研究则证明了频繁表达的转换突变(Chi等人，1994年)。强调p53通路的重要性，p53的上游调节因子CHEK2中的突变在PC发展中也很常见(Dong等人，2003年)。

表2. 患者的临床病理数据

临床病理数据(n = 79)
年龄(岁)	72
前列腺特异性抗原(ug/L)	61.6
Gleason评分	n	%
3+3	10	13%
3+4	20	25%
4+3	3	4%
4+4	10	13%
4+5	21	26%
5+4	3	4%
5+5	12	15%

图1. TP53基因中检测到的突变的代表性色谱图。A:同源突变GCC/ACC(A1358T)(外显子5)，B:CTG/CCG(L145P)(外显子5)，C:TGC/TAC(C176Y)(外显子5)，D:Rs868157297(G/GA)(内含子4)，E:同源突变CGA/TGA(R196*)(外显子6)，F:CTT/CGT(L194R)(外显子6)，G:CGA/CGG(R213R)(外显子6)，H:TAC/AAC(Y234N)(外显子7)，I:CGT/TGT(R273C)(外显子8)。

表3. 前列腺样本中TP53基因的突变频率

基因	外显子编号	点突变	碱基对替换	基因组突变ID	突变(编码序列)	常见于
TP53	5	A138T	GCC/ACC (12400)	COSV52839281	c.	乳腺癌(迈特拉等人，1999年)，口腔鳞状细胞癌(坂田，1996年)
		L145P	CTG/CCG (12422)	COSV52676080	c.	结直肠癌(袁等人，1997年)，乳腺癌(梅木田等人，1994年)，卵巢癌(法洛斯等人，2001年)
		2 C176Y	TGC/TAC (12515)	COSV52660760	c.	结直肠癌(昂达等人，1997年；袁等人，1997年)，肺癌(胡斯加夫韦尔 - 普尔西阿宁等人，2000年)，乳腺癌(法莱特等人，1998年)
		C/CT	C/CT	rs868137297	C/CT	间变性横纹肌肉瘤，(赫特默等人，2014年)李 - 弗劳梅尼综合征
			-12351	NM 000546.5(TP53):c.376 - 1G>A 以及卵巢肿瘤	NG_017013.2:g.17314G>A	(维拉尼等人，2016年)和(李等人，2019年)，乳腺癌(李等人，2019年)。
	6	L194R	CTT/CGT (12650)	COSV...52679257	c.581T>G	乳腺癌(安德森等人，1993年)和肺癌(铃木等人, 1992年)
		R196*	CGA 同 TGA (12655)	COSV52663748	c.586C>T (同源)	胃癌(波伦巴等人，1995年)，乳腺癌(沙皮伊等人，1999年)，食管癌(奥德雷泽等人，1993年)，皮肤癌(莫尔斯等人，19．93年)
		R213R	CGA/CGG (12708)		c.639A>G	中枢神经系统(大垣等人，1993年)，胆道(沃德尔等人，2018年)，结直肠癌(阿什托拉布等人，2017年)
	7	2 Y234N	TAC/AAC (13337)	COSV52730114	c.700T>A	前列腺癌(小西等人，1995年)，B细胞淋巴瘤(张等人，2013年)，以及乳腺癌(范·恩伯格等人，2008年)
	8	R273C	CGT/TGT (13797)	COSV52662066	c.817C>T	结直肠癌(石冈等人，1991年)，肝细胞癌(克雷斯等人，1992年)，食管癌(今関等人，1992年)

TP53基因的致癌突变已在不同癌细胞系中得到证实，这些突变可能涉及侵袭、迁移、细胞周期进展、耐药性、非锚定依赖性生长、集落形成增加、多倍体和血管生成(Effert等人，1992年；Muller和Vousden，2014年)。PC中TP53突变模式的存在可能是一种有价值的诊断工具，用于识别可能接受治疗方案的一部分患者，因为一些研究表明突变型TP53在诸如RTK等信号通路中发挥作用(Adorno等人，2009年；Sauer等人，2010年；Wang等人，2013年)。

在此，我们鉴定出TP53基因DNA结合域中的11个点突变，这些突变在先前的研究中已有报道。具体而言，肺癌和胃癌中报道了A138T突变(Bumroongkit等人，2008年；Shimizu等人，2014年)，乳腺癌中报道了L145P突变(Greenblatt等人，2001年)，卵巢癌中报道了C176Y突变，肺癌中报道了L194R突变(Ko等人，2002年)，R196*被描述为一种截短突变，可产生促肿瘤异构体，并在结肠癌中报道(Shirole等人，2016年)，Y234N与前列腺癌(Konishi等人，1995年)和乳腺癌(Van Emburgh等人，2008年)相关，R273C与胃癌(Renault等人，1993年)和肝细胞癌(Kress等人，1992年)相关。

据信，TP53突变与PC的转移和进展相关(Eastham等人，1995年；Dong，2006年；Ecke等人，2010年)。作为我们研究的一个局限性，由于大多数患者被转诊至中央癌症中心(安曼国王侯赛因癌症中心)，因此无法获得患者的临床数据进行随访。然而，强烈建议通过外显子测序研究同一人群中TP53基因的其他基因改变，以生成约旦PC患者中TP53基因的清晰分子图谱。

另一方面，SPOP和PIK3CA基因在mRNA水平上未显示任何突变或基因表达变化。SPOP基因突变已被报道为PC中最常见的改变之一(Barbieri等人，2012年；Abeshouse等人，2015年)。Abeshouse等人在一项分子分类学研究中报道，11%的原发性PC样本中存在SPOP基因突变(Abeshouse等人, 2015年)。不同人群队列显示PC中SPOP突变的患病率各不相同(4.6% - 14.4%)(Blattner等人，2014年)。多个队列的全外显子测序显示，6 - 15%的原发性和转移性PC中存在SPOP突变(Barbieri等人，2012年)。另一项研究证实了突变型SPOP基因在PC治疗耐药性中的作用(Dai等人，2017年)。此外，Gunther等人证明了SPOP突变在PC基因组不稳定性中的作用(Boysen等人，2015年)。我们的研究结果与先前报道不一致的原因可能是所研究的外显子不同。因此，建议在同一人群中筛查其余外显子。我们的研究结果并未排除SPOP在PC发生发展中的可能作用，因为我们仅对SPOP基因的两个外显子(4和5)进行了测序。因此，需要通过外显子测序进行进一步的遗传学研究，以调查约旦人群PC中SPOP突变的患病率。

许多癌症中存在的PIK3CA致癌性改变引发了其在前列腺癌(PC)发展中作用的假设。PI3K - AKT信号通路的基因组改变已在多种实体瘤中被报道，包括子宫内膜癌、结直肠癌、宫颈癌、唾液腺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌和前列腺癌(巴赫曼等人，2004年；塞缪尔斯等人，2004年；莱文等人，2005年；孙等人，2009年；阿塞纳克等人，2014年；米利斯等人，2016年)。三项研究报告了PC中PIK3CA的改变(爱德华兹等人，2003a；米勒等人，2007年；孙等人，2009年)。其中两项描述了PIK3CA扩增，只有孙等人(2009年)的最新研究首次在一个样本中发现了外显子9中的PIK3CA突变，该样本占前列腺肿瘤的3%。一致地，我们的研究结果支持与之前报道约13%病例的研究相比，PIK3CA突变和过表达在一部分PC病例(6%)中的罕见发生率(孙等人，2009年)。致癌影响可通过基因扩增、点突变和易位来刺激(纳桑森等人，2001年)。在本研究中，点突变可能不是激活PC中PIK3CA基因的主要途径。PI3K信号通路除PIK3CA基因外还有许多其他成分，最终导致PI3K - AKT信号通路的激活。目前的数据以及其他研究并未证明PIK3CA突变参与PC，然而，这些肿瘤中PI3K通路的其他成分可能参与PC肿瘤发生，并表明PI3K通路可能是开发此类癌症新疗法的有价值靶点。

肿瘤生长和发展是一种多因素紊乱，需要一个多步骤过程，涉及许多细胞过程，包括信号转导、细胞代谢和细胞周期。基因畸变是激活癌基因或使肿瘤抑制基因失活的最重要机制之一。约旦人在基因构成、吸烟量、饮食习惯和其他未确定的文化因素方面的差异也可能是造成这种差异的原因。不同地理位置的PC的多种病理和病因因素可能与肿瘤发展的分子途径差异并行。

当前PC队列中PIK3CA缺乏突变表明该基因的突变不是约旦人群中PC发病机制的关键因素。这表明PIK3CA基因突变不是激活PC中PIK3/AKT驱动的肿瘤发生途径的主要分子机制。这些结果与之前发表的研究相当一致，其中大多数基于较少病例或未精确界定样本的临床病理特征，但在我们的研究中，我们选择了一个更大、定义明确的患者群体。

由于当前研究仅局限于来自不同Gleason评分的根治性前列腺切除术样本，进一步涉及不同患者PC活检的研究可能能够解决PC中的TP53、SPOP和PIK3CA突变问题。由于病理科活检样本量少，我们的研究仅偏向根治性前列腺切除术样本，这可能限制了我们的研究。最近的综合基因组分析已确定RB、PI3K和RAS/RAF是原发性和转移性PC中最常改变的心路(泰勒等人，2010年)。

总之，在本研究中，我们专门分析了79名主要处于晚期的约旦裔前列腺癌患者，我们报告11.9%的患者存在TP53突变，且研究人群中未发现SPOP和PIK3CA突变。有可能从样本量更大的研究中获得更精确的结果。因此，有必要进行更大样本量的进一步研究，以比较位点特异性频率并确定这些突变在前列腺癌发展中的任何潜在作用。因此，根据我们的研究结果，在约旦人群中，SPOP和PIK3CA热点突变不太可能导致前列腺癌，或者它们确实导致了，但比例要低得多。PIK3CA激活的其他机制或其他分子途径的突变可能参与了该疾病的发病机制。