荧光偏振（FP）技术测量的是样品中荧光示踪剂发射的光偏振变化，与测量特定波长发射光强度的荧光强度截然不同。FP 广泛用于监测溶液中的分子相互作用，因为它很容易适用于高通量格式和筛选应用。FP 是一种复杂的技术，需要精心设计，并使用特定的仪器（带有荧光滤光片的平板读取仪，能够进行偏振光激发并捕捉两个平面上的发射光）。本说明探讨了该技术的基本原理和基于 FP 的实验。

荧光偏振（FP）原理
在 FP 技术中，荧光染料被偏振光激发。虽然初始光源会向各个方向发光，但偏振器会过滤光线，将其限制在沿传播方向的单一平面内。当荧光染料被单平面偏振光激发时，它会重新向所有方向发射光（即对激发光去偏振），因为它在激发和发射之间会移动和旋转。分子旋转是由于布朗运动造成的，这种运动在纳秒内发生，光的去极化程度与这种运动成正比。事实上，当温度升高加速布朗运动时，荧光团再次发射的光的偏振会减弱，而当溶剂粘度升高减缓荧光团的运动时，偏振会增强。同样，随着荧光团尺寸的增大，布朗运动也会减弱，从而增加偏振的保持率（FP 的历史和理论基础见 [1]）。

因此，荧光探针的光偏振程度与布朗运动成反比。因此，FP 受改变分子旋转和随机运动的所有参数的影响，如大小、形状（球体旋转更快）、溶剂粘度和温度。当温度和粘度保持不变时，大小成为驱动 FP 的主要因素，FP 与荧光探针的大小成正比。

总而言之，荧光探针的极化程度是一个术语，表示激发光保持极化的程度。当一个小的荧光团被偏振光激发时，它的运动速度很快，会向各个方向重新发光：它会使激发光去极化，偏振程度很低。相反，被偏振光激发的大荧光团的重新定向是有限的：再发射时大部分光仍是偏振的，偏振程度高。

在实验中，FP 技术测量的是荧光团在相对于激发平面平行和垂直的两个光平面上发射的荧光强度。荧光偏振程度 (P) 的定义是：相对于激发平面平行和垂直的荧光强度之差除以总荧光强度：

I_‖ = 平行于激发平面的荧光强度

I_┴ = 垂直于激发平面的荧光强度

大多数仪器以 mP 为单位显示荧光偏振，其中 1 mP = 1000 P

由于 (P) 是光强的比值，因此它是一个没有维度的数字。理论 (P) 值范围为 -0.33 至 0.5（-330 至 500 mP）。实验数据通常从 10 mP 到 300 mP 左右不等。仪器可以实现非常精确的测量（P ± 0.002 或 ± 2 mP）。上式假定光在平行和垂直通道中的传输效果相同。实际情况并非如此，必须进行修正。校正因子称为 "G 因子"。

G 因子与仪器有关，需要由研究人员确定。仪器手册将包含如何确定 G 因子的信息。

荧光偏振(PF)检测
荧光偏振(PF)检测法测量小荧光团与大荧光团相互作用或解离时发生的光偏振变化。任何能与荧光团共价标记并能与较大伙伴形成复合物的小分子都适用于荧光偏振(PF)。

要成功地进行实验，必须进行几种控制：

"空白 "含有缓冲液和溶剂，但不含示踪剂或结合伴侣。它测量的是试剂产生的微量自发荧光，应低于 "参照物"。所有测量结果都要减去它。
"参考 "是一种内部对照，含有示踪剂，但不含结合伴侣。它是实验条件允许的最低 FP，因为所有荧光示踪剂都以游离形式存在。
"高荧光系数 "是实验条件允许的最高荧光系数的内部对照，其中大部分或全部荧光示踪剂都以结合态存在。在许多（但不是所有）类型的检测中，这与 "阳性对照 "相同。
"阳性对照 "是实验对照。例如，如果测试的是抑制剂，那么阳性对照就是没有抑制剂的状态。
 根据实验设置和检测类型，如果 "高 FP "对照与阳性对照相同，则可以省略。

实际测量和计算
在使用同一台仪器进行所有实验时，用户可以忽略 G 因子，因为它与仪器有关。

如果需要，可在测量前设置 G 因子。如果制造商没有明确说明，则需要由研究人员确定。仪器手册中会包含如何设置 G 因子的信息。例如，BPS Bioscience 的科学家使用的 Tecan 荧光平板阅读器的 G 值设置为 22 mP。

仪器提供毫偏振 = mP 的测量值（如上所述，这是两个光偏振面上两次测量值的比值，由仪器直接计算）。

结果计算如下

从所有其他值中减去空白值
计算所有样品的 ΔmP：
ΔmP = (样品的 mP 值) - (参照对照的 mP)

其中，mP 是指仪器提供的毫极化值，参考对照是指在仅含有荧光探针的条件下（探针处于自由状态）获得的 mP 值。

荧光偏振(PF)应用
只要较小的实体能被荧光标记，FP 就适用于涉及两个实体的分子结合的任何实验，其中一个实体比另一个小得多[2]。建立竞争或抑制测定法相当简单；蛋白水解和其他酶测定法也已开发出来。开发 FP 检测的一般程序见 [3]。

抗体与小抗原或表位的结合
受体-配体和蛋白质-蛋白质相互作用
蛋白质-DNA 和蛋白质-RNA 相互作用
酶促反应：底物与酶结合或形成新产物
蛋白质分解
形成新产物，使用特定荧光珠进行区分。例如，使用针对磷酸化产物的特异性荧光抗体测量磷酸化程度
检测特定的 PCR 产物 [4].
示踪剂被置换的竞争研究，EC50 的测定
高通量筛选小分子抑制剂
筛选α-突触核蛋白寡聚化抑制剂 [5]
肌肉功能研究 [6］

荧光偏振(PF)优势与局限
尽管 FP 检测方法的开发很复杂，但设计精良的检测方法使用简单，而且非常适合高通量格式。以下是使 FP 检测法特别具有吸引力的几个特点。

荧光偏振(PF)优点

溶液内
耐受极小体积
均匀，无需清洗步骤
无放射性
实时
与荧光强度检测法相比，对染料的依赖性较低，不易受 pH 值干扰
荧光偏振(PF)局限性

无动力学常数
如果荧光标签设计不当，可能会改变示踪剂的结合特性
对温度变化敏感

考虑因素
干扰不大的因素

缓冲液 pH 值
染料浓度
颜色添加剂

荧光偏振(PF)关键因素：

尺寸变化是最关键的因素，最好是系数≥5 倍的变化。差异越大，测量结果越可靠。
荧光分子具有激发态，分子保持激发态的时间越长，旋转的幅度就越大。这不会影响测量，因为这是荧光团的固有特性，在整个实验过程中保持不变。不过，这也会影响荧光团的选择，因为稳定的荧光团可以实现更稳健的测量。
检测的性能取决于标记对小示踪剂生物活性的破坏程度。荧光团的选择是一个关键因素。验证对于确保标记不改变示踪剂与相关分子的相互作用或不影响所研究的酶反应至关重要。
示踪剂的标记率应大于 90%，游离染料应去除。如果仍有很高比例的示踪剂未被标记，它将与标记的示踪剂竞争结合，从而改变表观 IC50。如果不去除游离染料，就会产生高背景信号，从而降低检测灵敏度。
成分的纯度会影响检测质量。大分子（如细胞或膜碎片）可能会对光散射造成潜在干扰，因此伴侣蛋白必须纯净。因此，粗细胞裂解液或细胞培养上清液必须是纯净的。

结论
我们提供经过验证的基于FP技术的系列检测试剂盒，省去了许多优化步骤，如实验设计、荧光示踪剂的标记和验证或缓冲液成分，从而为科学家节省了时间和金钱。我们的试剂盒含有高质量的纯化蛋白，并附有经过验证的实验方案。

参考文献：

(1) Jameson DM, Croney JC. 2003 Comb Chem High Throughput Screen. 6(3): 167-173. PMID: 12678695.

(2) Hendrickson OD, et al. 2020 Sensors 20(24): 7132. PMID: 33322750.

(3) Moerke NJ. 2009 Curr Protoc Chem Biol. 1(1): 1-15. PMID: 23839960.

(4) Kido C, et al. 2000 Gene 259(1-2): 123-127. PMID: 11163969.

(5) Luk KC, et al. 2007 Biochemistry 46(44): 12522-12529. PMID: 17927212.

(6) Nihel T, et al. 1974 Proc Natl Acad Sci U S A. 71(2): 274-277. PMID: 4521799.