尼罗罗非鱼粘孢子虫鳃感染相关免疫应激标志物的新见解(分子和免疫组织化学研究)
发布时间：
2026-07-01 20:34
尼罗罗非鱼粘孢子虫鳃感染相关免疫应激标志物的新见解(分子和免疫组织化学研究)
Reem M. Ramadan ，Olfat A. Mahdy ，Mohamed A. El-Saied ，Faten F. Mohammed ，Mai A. Salem
1 开罗大学兽医学院寄生虫学系，吉萨，埃及；2 开罗大学兽医学院病理学系，吉萨，埃及；3 法赫德国王大学兽医学院病理学系，艾哈萨，沙特阿拉伯
* fhanafi@kfu.edu.sa，fatenfathy21@yahoo.com
摘要
尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)因其生长迅速且能在各种环境中茁壮成长而在水产养殖中备受重视。粘孢子虫是影响鱼类生产力的寄生虫之一，因为它们会影响鱼类的生长和繁殖，导致养殖场和孵化场大量鱼类死亡。本研究聚焦于对感染埃及三个省份尼罗罗非鱼的粘孢子虫寄生虫进行形态分子鉴定，并评估不同细胞因子(白细胞介素 - 1β(IL - 1β)、主要组织相容性复合体 II 类(MHC - II)以及分化簇 4(CD - 4)和 8(CD - 8))在组织中的基因表达。此外，这项工作旨在将鳃部出现的组织病理学改变和炎症反应与诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和肿瘤坏死因子 - α(TNF - )的免疫组织化学表达相关联。最后，评估感染鱼的皮质醇水平和血糖。对收集到的原生动物的 18S rRNA 进行 BLAST 序列分析的结果证实了阿戈洛斯粘孢子虫(Myxobolus agolus)、短孢子粘孢子虫(M. brachysporus)、罗非鱼粘孢子虫(M. tilapiae)和赫内古亚属(Henneguya)物种。鳃部免疫状态的分子特征显示，感染鱼的鳃中不同炎症细胞因子显著上调。与未感染的对照鱼相比，感染鱼的血清皮质醇和葡萄糖水平显著升高。在感染鱼的鳃中观察到严重的组织病理学改变，这与 iNOS 和 TNF - 的表达增加以及粘孢子虫感染有关。本研究为感染粘孢子虫的尼罗罗非鱼的氧化应激生物标志物提供了新见解，并阐明了鳃作为原生动物进入门户导致组织损伤时的免疫状态变化。
引言
罗非鱼品种，特别是尼罗罗非鱼(O. niloticus)，通常被称为尼罗罗非鱼，因其生长迅速且能在各种环境下生长而在水产养殖中具有很高价值。当前研究期间生成或分析的数据集可在基因库存储库中获取，登录号:[PP318831、PP319004、PP309819 和 PP317555]。
开放获取
引用:Ramadan RM，Mahdy OA，El - Saied MA，Mohammed FF，Salem MA(2024)尼罗罗非鱼粘孢子虫鳃感染相关免疫应激标志物的新见解(分子和免疫组织化学研究)。PLoS ONE 19(6): e0303702。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0303702
编辑:Ishtiyaq Ahmad，印度克什米尔农业科学技术大学
收到日期:2024 年 2 月 27 日
接收日期:2024 年 4 月 30 日
发表日期:2024 年 6 月 4 日
同行评审历史:PLOS 认识到同行评审过程中透明度的好处；因此，我们允许在最终发表的文章旁边发表同行评审的所有内容和作者回复。本文的编辑历史可在此处获取:https://doi.org/10.1371/journal.pone.0303702
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数据可用性声明:所有作者声明，所有相关数据均在
资金:本研究得到沙特阿拉伯费萨尔国王大学研究生研究与科研副校长办公室科研院长的支持，通过年度资助项目GRANT5,913提供资金支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、出版决策或稿件准备过程中没有任何作用。本研究未获得其他外部资金。
利益冲突:作者声明不存在利益冲突。环境因素 [1]。由于对鱼类蛋白质的需求不断增加，人们开始关注影响尼罗罗非鱼生长、健康和生存的寄生虫，因为疾病会严重限制鱼类生产力 [2]。粘孢子虫是影响鱼类生产力的鱼类寄生虫之一。它们影响鱼类生长和繁殖，可引发 epizootics，导致养殖场和孵化场大量鱼类死亡。粘孢子虫会危害食用受感染鱼类的免疫功能低下人群的健康 [3]。
分子分析正成为研究粘孢子虫寄生虫的关键工具，有助于确认鉴定过程，并广泛应用于这些寄生虫的分类学，以及结合孢子形成的精确位置、孢子形态、宿主和组织特异性等传统技术来确定后生动物体内粘孢子虫的系统发育鉴定。此外，这还导致能够准确识别和区分来自Henneguya属和Myxobolus属形态相同的粘孢子虫物种(sp.)[4]。
Myxobolus感染会增强细胞免疫并产生白细胞介素和促炎细胞因子。这些白细胞介素会刺激肥大细胞和嗜酸性粒细胞，从而提高血液中免疫球蛋白E(IgE)和免疫球蛋白G(IgG)的水平 [4]。促炎细胞因子如白细胞介素在感染早期产生，在寄生虫感染的发病机制中起关键作用。根据感染报告，IL-1 基因在限制寄生虫生长和通过形成囊肿产生慢性潜伏感染方面至关重要 [5]。各种病原体(包括细菌、病毒或寄生虫成分)刺激免疫细胞释放细胞因子。当它们与正确的受体结合时，可改变免疫反应以消除病原体，并吸引中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞到先天免疫的受影响区域 [6]。
主要组织相容性复合体(MHC)基因因其在促进寄生虫抗性方面的关键作用而在进化生物学中备受关注，如索默和沙德等人所述 [7,8]。MHC II类(MHC-II)基因的主要作用是编码细胞表面的糖蛋白，这些糖蛋白结合并将外来肽递送至T细胞受体。相互排斥的分化簇4或8(CD-4或CD-8)共受体的表达可区分功能不同的淋巴细胞 [6,9]。
本研究旨在根据检测到的粘孢子虫寄生虫的小亚基rDNA序列数据提供形态学描述和系统发育分析。然而，埃及尚未开展关于感染Myxobolus和Henneguya物种期间鱼类免疫状态及相关细胞因子的研究。本研究使用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)分析尼罗罗非鱼鳃中细胞因子基因的表达，特别是IL1-β、MHC-II、CD-4和CD-8。此外，评估受影响鱼类的皮质醇水平和血糖作为对寄生虫原生动物感染的生理反应。此外，还对鳃中发生的组织病理学改变和炎症反应与iNOS和TNF- 的免疫组化表达之间进行了相关性分析。
材料与方法
伦理批准
本研究已获得开罗大学兽医学院机构动物护理与使用伦理委员会(IACUC-Vet-25122023810)的批准。
鱼类样本采集与寄生虫学调查
2023年2月至12月期间，从淡水栖息地随机采集了总共628份 . niloticus标本，俗称尼罗罗非鱼。采样地点包括吉萨省(348份标本)、卡夫尔谢赫省(172份标本)和贝尼苏韦夫省(108份标本)尼罗河内的不同地点。
鱼被养在配备连续曝气和过滤系统的玻璃水族箱中存活。它们被供应不含氯的自来水[10]。然后所有鱼立即被转移到埃及开罗大学兽医学院寄生虫学实验室。鱼通过浸入含有150mg/L甲磺酸三卡因(MS-222)的麻醉浴中进行麻醉，这有助于通过鳃快速吸收到血液中。随后，鱼在麻醉下实施安乐死以减轻它们的痛苦。安乐死通过斩首进行。鱼样本按照Mahmoud等人的方法进行鉴定[11]。收集鱼样本并进行检查以确定是否存在成熟的粘孢子阶段。进行全面的外部检查以检测全身宏观可见的病变或囊肿。按照标准程序取出鳃，清洗并在显微镜下检查是否有粘孢子虫寄生虫。鳃固定并用吉姆萨染料染色后进行印片。收集粘孢子虫囊肿并破裂以产生用于光学显微镜检查的孢子。使用微米(μm)确定孢子的最小和最大测量值。在孢子的测量、分类和描述中遵循Abdel-Gaber等人的方法[12]。
粘孢子虫寄生虫的基因分型鉴定
DNA提取。通过在 以 离心，从保存在乙醇中的样本中分离粘孢子。去除上清液后，将孢子沉淀在 孵育三到四个小时。随后，加入 裂解STE缓冲液 (Tris-HCl [pH 8]、100mM NaCl、10mM乙二胺四乙酸[EDTA]、0.2%十二烷基硫酸钠和0.4mg蛋白酶K)。按照制造商的说明[13]，使用QIAamp DNA MiniKit(Qiagen)提取基因组DNA。
PCR扩增。如Khalifa等人所述[14]，使用常规PCR扩增18S rRNA基因(小亚基核糖体RNA)以从鱼样本中鉴定粘孢子虫寄生虫。扩增反应总体积为 ，由每种引物1μL的10pmol、3μL提取的DNA作为模板和12.5μL Cosmo Taq DNA聚合酶预混液(英国Willowfort)组成。表1列出了特异性引物序列和PCR条件。阳性和阴性对照使用相同的方案:来自知名原生动物寄生虫的基因组DNA和无核酸酶水。
表1. PCR扩增中使用的寡核苷酸引物对。
| 寄生虫 | 靶基因 | 引物序列 | 扩增条件 | 参考文献 |
| 黏液孢子虫属 | 18S核糖体RNA | 正向:5’ CTGCGGACGGCTCAGTAAATCAGT 3’ 反向:5’ CCAGGACATCTTAGGGCATCACAG 3’ | 35个循环， 温度下进行 时长， 温度下进行 时长，之后在 温度下进行 时长 | [12] |
| 正向:5’ CCTGAGAAACGGCTACCACATCCA 3’ 反向:5’ GATTAGCCTGACAGATCACTCCACGA 3 | ||||
| 正向:5’ GATGATTAACAGGAGCGGTTGG 3’ 反向:5’ ACCGCTCCTGTTAATCATCACC 3’ | ||||
| 赫氏碘泡虫属 | 正向:5’ TTCTGCCCTATCAACTWGTTG 3’ 反向:5’ GGTTTCNCDGRGGGGMCCAAC3’ | 30个循环， 温度下进行 时长， 温度下进行 时长， 温度下进行 时长，之后在 温度下孵育10分钟 | [15] |
F:正向，R:反向，min:分钟，s:秒，
测序与系统发育研究。在使用BigDye终止子V3.1测序试剂盒(美国应用生物系统公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)对PCR产物进行测序之前，使用QIAquick纯化提取试剂盒(瑞士希姆布雷克顿的Qiagen公司)对其进行纯化[16]。使用ChromasPro程序(澳大利亚特万廷的Technelysium Pty Ltd.公司的ChromasPro 1.7)进行序列的同步构建。在它们与GenBank参考序列进行BLAST比对之后，使用MEGA程序11对其进行检查。使用邻接法和MEGA 11软件，通过1000次自展重复生成系统发育树[17]。
##尼罗罗非鱼细胞因子基因表达的免疫状态:qRT-PCR法
采样。在完全卫生的条件下，对十条感染严重的患黏液孢子虫属和亨内古亚属的鱼进行无菌解剖以获取感染的鳃。选取五条未受影响的鱼作为阴性对照。使用 -肌动蛋白基因作为参考基因来标准化IL-1β、MHC-II、CD-4和CD-8基因的表达。感染鱼的组织最终进行无菌保存以分离RNA，并保存在 [18]。
RNA分离。根据制造商的说明，使用德国耶拿生物科学公司的总RNA纯化试剂盒，从保存在 的鳃样本中获得总RNA。含有 的DEPC水用于洗脱RNA。使用美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司生产的ND-1000纳米微量分光光度计来评估洗脱RNA的完整性并确定其数量。为了制备用于第一链cDNA合成的RNA样本，使用以下程序去除残留的基因组DNA:在一个无RNase的管中混合以下成分后，在 孵育30分钟:含有 RNA样本、 DEPC处理水和 DNase I的 反应缓冲液。然后将混合物放回 10分钟，并加入 的 EDTA。随后，使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(美国沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)，以所得RNA为模板通过逆转录产生第二链cDNA。根据马赫迪等人的方法[18]，将cDNA保存在冰上并保存在 。
定量逆转录聚合酶链反应方案。使用基于已知序列生成的参考基因(β-肌动蛋白)，对四种细胞因子(IL-1β、MHC-II、CD-4和CD-8)进行了评估(表2)。使用Applied BiosystemsTM 7500实时荧光定量PCR系统(美国马萨诸塞州贝德福德的Applied Biosystems公司)来定量感染鸽子中细胞因子的表达水平。qPCR系统由以下部分组成:每种正向和反向引物的 、 中 的量直至 、ROX染料 ，以及WizPureTM qPCR Master(SYBR)(韩国Wizbiosolution公司)。对于qPCR反应，遵循以下条件:在 退火1分钟，在 变性 ，每次持续 ，在 预变性10分钟，熔解曲线程序设置为在 持续 ， 持续1分钟， 持续 ， 持续 ，计算产物特异性。根据Mahdy等人[19]的研究，每个实验重复进行三次。
表2. qRT-PCR中使用的引物对。
| 引物 | 序列 | 参考文献 |
| 白细胞介素-1β | 正向引物:TGGCCCTGACTGAACCACTG 反向引物:TCAGACCCACGCCACAGAAC | [20] |
| 主要组织相容性复合体II类 | 正向引物:ATGTCCAAGCTGCTGAAGATT 反向引物:TGCCGTCTGACTTCTTCACC | [21] |
| CD4 | 正向引物:AAGAAACAGATGCGGGAGAGT 反向引物:AGCAGAGGGAACGACAGAGAC | [22] |
| CD8 | 正向引物:ACACCAATGACCACAACCATAGAG 反向引物:GGGTCCACCTTTCCCACTTT | [23] |
| β-肌动蛋白 | 正向引物:GGCTACTCCTTCACCACCACAGG 反向引物:GGGCAACGGAACCTCTCATT |
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皮质醇和葡萄糖水平的测量。从五条受感染鱼和五条未受感染鱼采集血样进行生化分析。用苯佐卡因(50毫克/升)作为麻醉剂处理鱼，无论是否使用抗凝剂(肝素)，均从其尾静脉取血。样本在 凝固后，以1500转/分钟的速度离心15分钟，通过生化分析提取血清。然后将血清样本在 冷冻。使用埃及Spectrum Diagnostics公司的商业试剂盒和日本东京的JASCO V - 730分光光度计测量葡萄糖水平。使用液体闪烁计数器定量放射性，并使用商业皮质醇试剂盒进行放射免疫测定以测量血液皮质醇水平[24]。
组织学和免疫组织化学检查。从重度感染鱼的鳃中采集代表性混合样本，用10%中性缓冲福尔马林妥善保存。随后，将它们切成 厚度的切片，嵌入石蜡块，用二甲苯透明，并常规用苏木精和伊红(H&E)染色[25]。
制备厚度为 的带有组织切片的粘附载玻片用于免疫染色。用磷酸盐缓冲盐水使切片复水并冲洗。将一抗以1:200稀释，并在 在潮湿箱中与抗TNF - (sc - 52746；德国海德堡的Santa Cruz Biotechnology公司)和iNOS(sc - 7271；德国海德堡的Santa Cruz Biotechnology公司)孵育过夜。用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶。然后按照制造商的说明并使用HRP标记的检测试剂盒(美国Bio SB)进行阳性反应显色。消除一抗孵育的过程产生阴性对照。使用奥林巴斯BX43光学显微镜检查组织切片，并通过连接到CellSens Dimension软件的奥林巴斯DP27相机进行拍摄。
统计分析。原生动物测量值以平均值 标准差表示。所有统计推断均使用PASW Statistics，方差分析检验(P值≤0.001)，版本27程序(美国伊利诺伊州芝加哥的SPSS公司)[26 - 28]。
结果
在检查的尼罗罗非鱼中检测到的原生动物的患病率
宏观和微观检查显示，在628条采集的尼罗罗非鱼中，有194条(30.9%)自然感染了粘孢子虫属(22.5%)和亨内古亚属(8.4%)(表3)。吉萨省的感染水平最高，其次是卡夫尔 - 谢赫省和贝尼 - 苏韦夫省，在粘孢子虫和亨内古亚属中均如此。未发现混合感染。所有回收的成熟粘孢子虫寄生虫属于3个不同的种，即短孢子粘孢子虫、阿戈洛斯粘孢子虫和罗非鱼粘孢子虫。
表3. 在检查的尼罗罗非鱼中检测到的原生动物的患病率。
| 省 | 检查数量 | 感染数量(%) | 原生动物属 | |
| 粘体虫属(%) | 尾孢虫属(%) | |||
| 吉萨 | 348 | 119 (34.2) | 96 (27.6) | 23 (6.6) |
| 卡夫尔谢赫 | 172 | 51 (29.7) | 32 (18.6) | 19 (11.05) |
| 贝尼苏韦夫 | 108 | 24 (22.2) | 13 (12.04) | 11 (10.2) |
| 总计 | 628 | 194 (30.9) | 141 (22.5) | 53 (8.4) |
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图1. 粘孢子虫新鲜和染色孢子的显微照片。吉姆萨染色。A) 阿氏粘孢子虫新鲜标本。B) 吉姆萨染色的阿氏粘孢子虫。C) 吉姆萨染色的短孢粘孢子虫。D - E) 罗非鱼粘孢子虫新鲜标本。F) 吉姆萨染色的罗非鱼粘孢子虫。比例尺 。
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形态学鉴定
阿氏粘孢子虫。孢子后端圆形且稍宽，呈椭圆形至稍梨形。其长度为 ，宽度为 。孢子前端有两个梨形、细长的极囊，约占其长度的三分之二。沿着囊内壁，极丝盘绕成八九圈。孢子腔的最后三分之一充满了孢子质。在孢子质中观察到一个相当大的球形嗜碘泡(图1A和1B)。
短孢粘孢子虫。椭圆形孢子明显大于长度为6.9 - 8.2 的孢子，宽度为 。极囊主要呈近圆形，大小均匀。极丝盘绕五六圈，囊的纵轴与极丝纵轴稍倾斜或垂直。孢子质充满孢子腔内剩余空间。孢子质中有一个大的球形嗜碘泡(图1C)。
罗非鱼粘孢子虫。孢子呈椭圆形至卵形，前后端均为圆形。后端似乎比前端稍宽。孢子的测量值为长度15.2 - 16 (15.6±0.4) µm，宽度9.7 - 10.9 。孢子前端有两个椭圆形、稍不对称的极囊。它们占孢子长度的四分之一以上。极丝在极囊内倾斜于极囊纵轴定位后牢固地盘绕五六圈。极囊后面的孢子剩余空间被有圆形嗜碘泡的双核孢子质占据(图1D - 1F)。
图2. (A - B) 尼罗罗非鱼的赫氏碘泡虫，显示出两条后鞭毛和两个极囊。比例尺 。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0303702.g002
赫氏碘泡虫。在孢子尾部发现孢子体大呈椭圆形，大小为(10 - 14)×(6.5 - 8) µm，有两条分叉的丝，长度约为(41 - 53) 。大小相等的梨形极囊位于前端，大小约为(2.9 - 4.2×1.6 - 2.4) 。新鲜孢子中极丝盘绕3 - 5圈。孢子腔的75%充满颗粒状孢子质，其中包括两个明显的孢子质核和一个嗜碘泡(图2)。
分子鉴定
为准确鉴定从尼罗罗非鱼中分离出的粘孢子虫属(Myxobolus)和单极虫属(Henneguya)物种，对形态学鉴定的粘孢子虫寄生虫进行PCR扩增。随后，对获得的产物进行DNA测序。基于BLAST序列分析，18S rRNA基因的阳性PCR结果分为两个属:粘孢子虫属和单极虫属(图3和图4)。成对序列比对显示，粘孢子虫属的序列被确认为阿氏粘孢子虫(M. agolus)、短孢子粘孢子虫(M. brachysporus)和罗非鱼粘孢子虫(M. tilapiae)(图3)。表4列出了保存在GenBank中的粘孢子虫属和单极虫属18S rRNA基因的登录号。
感染尼罗罗非鱼中被研究原生动物的免疫基因表达
感染的罗非鱼比对照罗非鱼具有更高的IL-1β、MHC-II、CD-4和CD-8表达水平(图5)。
应激指标酶与葡萄糖和皮质醇的水平
感染鱼的皮质醇和葡萄糖水平显著高于对照未感染鱼(表5)。感染鱼和未感染鱼之间存在显著差异，P值为 。
组织病理学改变
鳃的显微镜检查显示整个鳃结构出现强烈的炎症反应。鳃丝显示板层静脉窦严重充血并伴有出血(图6A)。此外，观察到鳃丝明显扭曲。而且，检测到次生鳃小片的板层毛细血管窦严重充血并伴有片间出血(图6B)，并且存在广泛的板层水肿，板层上皮脱落并混有白细胞(图6C)。
图3. 使用邻接法基于粘孢子虫属的18S rRNA构建的系统发育树。对于此查询，登录号由蓝点表示。树底部的比例尺表示每个位点发生多少个核苷酸变化。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0303702.g003
鳃弓表现出强烈的白细胞浸润，传入和传出鳃动脉及小动脉明显充血(图6D)。炎症反应主要由淋巴细胞和组织细胞组成，混有嗜酸性粒细胞(图6E)。此外，在鳃动脉中检测到粘孢子虫属的不同孢子形成阶段，与淋巴细胞和组织细胞混合在一起(图6F和6G)，表明原生动物传播的循环途径。鳃弓的粘膜上皮显示粘液细胞增生并伴有淋巴细胞浸润(图6H)。
图4. 使用邻接法基于单极虫属的18S rRNA构建的系统发育树。对于此查询，登录号由蓝点表示。树底部的比例尺表示每个位点发生多少个核苷酸变化。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0303702.g004
鳃中粘孢子虫属的存在与炎症反应的强度之间存在相关性。在鳃弓中观察到粘孢子虫属的各个阶段，伴有明显的炎症反应。鳃弓内的寄生囊肿包含粘孢子虫属的不同发育阶段，其特征是独特的成对极囊(图7A和7B)。
鳃中TNF- 和iNOS的表达
鳃的显微镜检查显示鳃中iNOS和TNF- 的表达增加。iNOS表达在血管壁的血管平滑肌细胞以及包括鳃结构(主要是鳃弓)的炎症反应区域的单核细胞中观察到。而TNF- 表达在鳃弓基质的单核细胞浸润中观察到(图7C和7D)。
表4. 粘孢子虫属和单极虫属的登录号
| 样本 | 扩增产物(碱基对) | 靶基因 | 登录号 | 同一性百分比 |
| 阿氏单殖吸虫 | (1400) | 18S核糖体RNA | PP318831 | KX632948 (100%) |
| 短孢单殖吸虫 | (1339) | PP319004 | KX632949 (100%); OR766327 (100%) | |
| 罗非鱼单殖吸虫 | (1348) | PP309819 | KX632950 (100%) OR766325 (100%) | |
| 赫内古亚属 | (876) | PP317555 | MT231731 (100%); KP990669 (99.64%) |
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0303702.t004
图5. 感染和未感染鱼类鳃中MHC-II、IL-1β、CD-4和CD-8的基因表达。
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讨论
尼罗罗非鱼是世界上产量最高且交易最广泛的食用鱼类之一[29]。在所有养殖的罗非鱼中，尼罗罗非鱼是养殖最多的淡水物种，约占全球罗非鱼产量的71%[30]。在本研究中，628条尼罗罗非鱼样本中有194条感染了粘孢子虫寄生虫孢子。尼罗罗非鱼自然感染了粘体虫属(22.5%)，目前的结果与Eissa等人[31]、Mohammed等人[32]以及Abdel-Ghaffar等人[33]的结果一致。另一方面，脑粘体虫属的患病率为8.4%，这与Rabie等人[34]、El-Seify等人[35]以及Matter等人[36]的结果一致。在本次调查中，鉴定出了脑粘体虫属和三种粘体虫属。先前的研究[12,31,33,37]将这些物种与一些报道的形态最相似的物种进行了比较。
表5. 对照鱼和感染鱼的血清皮质醇和葡萄糖水平。
| 应激源指标 | 受感染鱼类物种 | 未受感染鱼类物种 | 值 |
| 皮质醇(纳克/毫升) | 41-62 (51.5±2.3) | 21-30 (25.5±1.8) | 0.000 |
| 葡萄糖(毫克/分升) | 95-114 (104.5±3.1) | 38-50 (44±3.1) | 0.001 |
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0303702.t005
图6。(A) 感染鱼鳃的组织学切片，经苏木精-伊红染色，显示鳃丝明显变形，板层静脉窦充血。(B) 毛细血管窦严重充血，板层间出血。(C) 次生鳃小片广泛融合、水肿，板层上皮脱落，伴有淋巴细胞浸润。(D) 鳃弓显示强烈的白细胞浸润，鳃动脉和小动脉明显充血。(E) 上图的高倍放大显示淋巴细胞与巨噬细胞和嗜酸性粒细胞混合浸润，伴有明显的间质水肿。(F) 强烈的淋巴浆细胞浸润，鳃动脉和小动脉明显充血。(G) 高倍放大显示淋巴细胞与巨噬细胞混合浸润，伴有黏液孢子虫属的孢子形成阶段。原生动物传播的循环路径在鳃动脉管腔中显示。(H) 鳃弓显示构成鳃弓黏膜的黏液细胞增生，基底层淋巴细胞数量增加，黏膜下层有淋巴细胞浸润。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0303702.g006
新的分子技术，如针对黏液孢子虫寄生虫特征基因的PCR，有助于形态学鉴定，从而准确确定寄生原生动物[12]。使用18S rRNA基因的BLAST分析验证了黏液孢子虫寄生虫的鉴定，这些寄生虫被分为两个属，黏液孢子虫属和亨内古亚属，结果与GenBank数据库中的结果一致。通过成对序列比对，黏液孢子虫属的身份被确认为罗非鱼黏液孢子虫、阿戈卢斯黏液孢子虫和短孢子黏液孢子虫。亨内古亚属18S rRNA基因座的核苷酸序列与埃及的莫尔西等人[38]、埃梅什等人[15]以及匈牙利的塞凯利等人[39]和巴西的维埃拉等人[40]报道的序列相似。阿戈卢斯黏液孢子虫、罗非鱼黏液孢子虫和短孢子黏液孢子虫18S rRNA基因的BLAST分析与阿卜杜勒-加伯等人[12]的研究结果一致。
图7。(A - B) 鳃腔的组织学切片，经苏木精-伊红染色，显示寄生囊肿被炎症反应包围，主要是淋巴细胞、巨噬细胞与嗜酸性粒细胞混合。(A) 高倍放大显示早期孢子形成阶段的强烈聚集，黏液孢子虫属的成对极囊与淋巴细胞和组织细胞混合。(B) 诱导型一氧化氮合酶在鳃血管壁平滑肌细胞、单核细胞和间质基质中的免疫组化表达。(C) 肿瘤坏死因子 在浸润间质基质的单核细胞中的免疫组化表达 (D)。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0303702.g007
先前的研究表明，诱导宿主细胞和体液免疫反应有助于建立宿主针对寄生虫的防御机制[41]。当包括细菌、病毒和寄生虫入侵者在内的感染性病原体刺激鱼类免疫细胞时，它们会释放炎症细胞因子。几种可溶性和膜结合蛋白与补体系统协同作用，协助先天免疫系统消除感染。约根森等人[42]报道，细菌和抗体-抗原 (Ag-Ig) 复合物都可以直接引发补体介导的死亡。
本研究旨在评估感染和未感染鱼鳃中的几种免疫基因。尽管鱼鳃经常被寄生虫污染，但这些区域释放的黏液是抵御其他寄生虫的屏障，可减少总寄生虫负荷。根据迪克森和芬德利[43]的研究，当发生寄生原生动物感染时，尼罗罗非鱼可以产生免疫反应，导致许多基因的表达上调。
黏液是身体抵御感染的第一道免疫屏障，通过分泌不同的凝集素、免疫球蛋白、补体C反应蛋白和溶菌酶来实现。根据朱等人[44]的研究，这些发现表明鳃中存在黏液和巨噬细胞，且上调水平明显更高。然而，这是由肥大细胞、巨噬细胞和淋巴细胞分泌的各种细胞因子导致的。
白细胞介素-1β、主要组织相容性复合体-II类分子、CD4和CD8细胞因子可诱导鱼类免疫反应。这些基因备受关注，因为它们在免疫防御和疾病管理中至关重要。从细胞外病原体编译外来肽并将其传递给辅助性T细胞是这些基因的一项关键功能。本研究揭示，感染鱼类组织中白细胞介素-1β、主要组织相容性复合体-II类分子、CD4和CD8水平大幅上升，这与先前研究[9,7,45 - 49]一致。然而，这可能是一种减少寄生虫感染的免疫反应。在本研究中，受寄生虫感染(如体外原生动物)的鱼类，其皮质醇和葡萄糖水平显著高于未感染的对照鱼。这些结果与马伦戈尼等人[50]、埃里森等人[51]以及桑多瓦尔 - 希奥等人[52]的研究结果一致。
罗非鱼鳃的组织病理学检查结果显示，鳃耙、鳃弓和鳃丝出现明显的组织病理学改变。这些改变与鳃结构中不同阶段的黏液孢子虫存在所导致的直接损伤相关。仅在鳃弓中检测到黏液孢子虫囊肿。相比之下，鳃丝出现水肿、片状充血和出血，这与鳃动脉和小动脉中的黏液孢子虫直接相关，并伴有严重的炎症反应，随后引发氧化应激和组织损伤。哈迪诺和亚努哈尔[53]也描述了类似的发现，他们观察到黏液孢子虫直接刺激鳃上皮导致鳃损伤。在鳃结构中检测到的明显炎症反应主要存在于巨噬细胞和淋巴细胞中，嗜酸性粒细胞浸润较少。这些明显的炎症反应与鳃结构中 和肿瘤坏死因子 - 的表达增加相关；然而，在易感鳟鱼菌株感染黏液孢子虫后，巨噬细胞会产生由诱导型一氧化氮合酶释放所诱导的一氧化氮[54]。此外，诱导型一氧化氮合酶表达上调，在暴露后1至8天可检测到。此外，阿克拉姆等人[55]指出，尼罗罗非鱼感染黏液孢子虫后组织中 表达升高与炎症反应和组织损伤相关。
结论
黏液孢子虫是影响鱼类生产力的鱼类寄生虫之一，因为它们影响鱼类生长和繁殖，导致养殖场和孵化场大量鱼类死亡。本研究专注于对感染埃及三个省份尼罗罗非鱼的黏液孢子虫寄生虫进行形态 - 分子鉴定，并评估不同细胞因子(白细胞介素1 - β、主要组织相容性复合体-II类分子、CD4和CD8)在组织中的基因表达。此外，还对鳃中出现的组织病理学改变和炎症反应与诱导型一氧化氮合酶和肿瘤坏死因子 - 的免疫组化表达之间进行了相关性分析。本研究为感染黏液孢子虫的尼罗罗非鱼的氧化应激生物标志物提供了新见解，并阐明了鳃作为原生动物进入门户导致组织损伤时的免疫状态变化。
作者贡献
数据管理:Reem M. Ramadan、Olfat A. Mahdy、Mai A. Salem。
形式分析:Reem M. Ramadan、Mai A. Salem。
资金获取:Faten F. Mohammed。
调查:Reem M. Ramadan、Mohamed A. El - Saied、Faten F. Mohammed、Mai A. Salem。
方法:Reem M. Ramadan、Mohamed A. El - Saied。
监督:Olfat A. Mahdy。
撰写 - 初稿:Reem M. Ramadan、Mai A. Salem。
撰写 - 审阅与编辑:Olfat A. Mahdy、Mohamed A. El - Saied、Faten F. Mohammed。
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