核苷酸序列特征、HN蛋白的氨基酸变异及NDV VIId基因型3D结构分析
发布时间：
2026-06-29 21:32
核苷酸序列特征、HN蛋白的氨基酸变异及NDV VIId基因型3D结构分析
Amin Tavassoli (C) | Safoura Soleymani (C) | Mohammad Reza Housaindokht (C)
摘要
背景:血凝素-神经氨酸酶(HN)是新城疫病毒(NDV)膜蛋白之一，在宿主病毒感染过程中发挥重要作用。因此，针对HN的抗体对宿主抵抗NDV感染至关重要，因其对病毒感染具有关键功能。结果，HN已成为针对新城疫病毒疫苗开发的候选蛋白。
方法:本报告使用了伊朗分离的NDV HN蛋白全长序列(VIId亚基因型)。我们将其与其他更常见的NDV基因型、VII亚基因型和疫苗株进行比较，进行特征分析和氨基酸取代鉴定。此外，应用生物信息学工具确定三维结构、分子动力学模拟和B细胞抗原表位的预测。
结果:结果表明，我们分离株的抗原区域与其他不同地理地区分离的NDV VII亚基因型相当。此外，通过采用我们HN蛋白的最终3D结构，表位预测服务器将氨基酸残基提议为B细胞表位，从而引入了线性及构象抗原位点。
结论:免疫信息学疫苗设计原则目前展现出巨大潜力，可快速经济地开发新一代候选疫苗以根除包括NDV在内的传染性病毒。为此，重点集中于可能被视为抗原的残基。
关键词
抗原区域，生物信息学，血凝素-神经氨酸酶蛋白，新城疫病毒，取代，VIId亚基因型
1 | 引言
新城疫(ND)是一种高度传染性且对许多禽类物种具有重大经济意义的疾病。ND的病原体是致病性新城疫病毒(NDV)强毒株，给家禽业造成巨大经济损失，包括高比例的发病率和死亡率以及产蛋量下降(Berhanu等人，2010年；Sultan等人，2020年；Yan等人，2020年)。根据其致病性，NDV菌株分为三种主要致病型:急性(高度致病)、中等(中度致病)和缓性(非或轻度致病)(Jin等人，2017年；Samal等人，2013年；Sultan等人，2020年)。NDV是一种包膜病毒，具有非分段的单链RNA基因组，属于副黏病毒科中的阿留申病毒属(Berhanu等人，2010年；Bose等人，2014年；Cho等人，2007年)。病毒RNA基因组编码六种主要结构蛋白:核衣壳(N)、基质(M)、磷酸蛋白(P)、融合(F)、血凝素-神经氨酸酶(HN)和大聚合酶(L)，其中只有F和HN糖蛋白与病毒包膜相互作用，是致病性和抗原性特征的重要贡献者，也是决定NDV菌株宿主范围的关键因素(Cho等人，2007年；Huang等人，2004年；Yan等人，2020年)。此外，研究表明，病毒包膜外表面上的这两种糖蛋白可诱导中和抗体，以保护宿主免受NDV感染(Collins等人，1993年；Liu等人，2015年；Sabouri等人，2018年)。
伊朗马什哈德费尔多西大学科学学院生物分子研究与技术中心
伊朗马什哈德费尔多西大学科学学院化学系
通讯
Mohammad Reza Housaindokht，伊朗马什哈德费尔多西大学科学学院化学系，马什哈德阿扎迪广场，马什哈德，伊朗。
邮箱:housain@um.ac.ir
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© 2024 作者。由约翰威利父子有限公司出版的《兽医医学与科学》。
F蛋白通过将病毒包膜与宿主细胞膜融合促进病毒进入细胞(Berhanu等人，2010年，Bose等人，2014年)。宿主蛋白酶已确定F蛋白切割位点的氨基酸序列是NDV组织嗜性和毒力的主要决定因素(Huang等人，2004年；Jin等人，2017年)。由于不同病毒株在此位点存在不同的氨基酸序列，这些基本残基的数量决定了影响它们的蛋白酶酶的类型。在毒力株中，具有多个基本氨基酸的切割位点在大多数细胞类型中被切割，导致病毒的全身传播。相比之下，在基于分泌蛋白酶类型的非毒力株中，病毒的传播通常限制在呼吸和肠道黏膜表面(OIE，2012年；Sabouri等人，2018年；Samal等人，2013年)。HN是NDV的另一个关键毒力因子。它作为一种多功能表面糖蛋白，介导各种活动，例如与F蛋白相互作用以促进膜融合和病毒穿透(Estevez等人，2011年；Huang等人，2004年；Khattar等人，2009年；Liu等人，2015年)。此外，血凝测定(HA)导致红细胞聚集并附着在细胞表面上的含唾液酸受体上，以及作用于神经氨酸酶(NA)以从子代病毒颗粒中释放唾液酸，防止病毒自聚集。HA和NA活性是HN蛋白的特定位功能(Estevez等人，2011年；Huang等人，2004年；Khattar等人，2009年)。
在NDV株中，HN是一种II型同四聚体糖蛋白，具有多种功能，其氨基酸长度在570到616之间(Jakhesara等人，2016年；Khattar等人，2009年；Liu等人，2019年)。该蛋白结构上由胞质尾部结构域、跨膜结构域、茎结构域和球状头部结构域组成。球状头部包含受体结合、抗原性和神经氨酸酶活性位点。此外，球状头部结构域核心结构的X射线晶体结构，称为螺旋桨，揭示了有助于神经氨酸酶、受体结合和融合活性的残基(Khattar等人，2009年；Liu等人，2019年；Yan等人，2020年；Yuan等人，2011年；Zhu等人，2016年)。
尽管在伊朗NDV中关于该基因的分子特征的研究不多，但众所周知，HN蛋白作为表面糖蛋白在NDV的附着、组装、成熟和毒力中起着关键作用。尽管持续实施疫苗接种计划，但NDV爆发仍然是伊朗家禽业的一个重大问题，并且频繁发生在伊朗和其他亚洲国家(Sabouri等人，2018年；Triosanti等人，2018年；Zhu等人，2016年)。因此，发现这种蛋白的基因组和抗原性特征可能有助于ND控制，并可能成为开发新一代疫苗以根除这种传染病的途径，这是令人印象深刻的。
控制ND最有效的方法之一是适当的疫苗接种以防止病毒传播。最广泛使用的ND疫苗属于I型和II型基因型，这些基因型是在近70年前分离的。然而，家禽中流行的NDV株属于不同大陆的V-VII型基因型，它们在遗传上与当前疫苗不同。许多研究一致证实，传统的ND疫苗不能减少接种鸡的病毒排出(Kapczynski & King，2005年；Kim等人，2017年)。由于传统疫苗和流行株之间的抗原相似性低，研究和开发安全、基因型匹配和高效的ND疫苗是一项重要需求(Hu等人，2022年)。新疫苗开发策略集中在重组蛋白疫苗、抗原性匹配疫苗和基因型减毒活疫苗。
在先前的研究 (Tavassoli 等人，2019) 中，我们已表明，2014-2016 年从伊朗东北部临床标本中收集的三株 NDV 基于 ICPI 和 MDT 值以及 F 基因核苷酸序列的系统发育树均为强毒株。在本研究中，由于分离株序列相似，我们使用一株分离株研究 NDV 的 HN 蛋白全长序列。我们比较了与其他更常见的 NDV 基因型、VII 亚基因型和疫苗株在受体结合、融合促进、唾液酸结合和抗原位点的氨基酸取代，以与其他更常见的 NDV 基因型、VIId 亚基因型和疫苗株进行比较。此外，采用生物信息学工具确定 3D 结构、分子动力学模拟和 B 细胞抗原表位的预测。近期分离株的特性分析可能有助于获取关于亚洲疫情(尤其是在伊朗)与其他全球 NDV 株的致病性和流行病学关系的宝贵信息。
2 | 材料与方法
2.1 | 样本采集、病毒增殖和 HA 检测
本研究报道的分离株于 2016 年从伊朗东北部死鸟的气管和肠道中收集。这些鸟表现出临床症状，包括翅膀下垂、腿麻痹和头颈扭曲。此外，尸检发现确切的鸡冠有出血点，肠道壁有出血性溃疡。显示出血点的气管和肠道等组织材料在 PBS 溶液中匀浆，通过 0.2 μm 孔径滤器过滤，接种到 10 日龄 SPF 胚蛋的绒毛尿囊腔中，并在 条件下孵育。感染后的尿囊液在接种后 2 天收获，并在室温下使用 1% 鸡红细胞进行 HA 检测，直至进一步处理前储存在冷冻器 中。
表 1 本研究使用的引物列表。
| 位置 | 产品 (bp) | 序列 (5’-3’) | 引物名称 |
| 5924-5945 | 754 | ATTCTCAAGTCATCGTGACAGG | NDV-HN-F1 |
| 6657-6677 | CACATCTTGACTTGAACTGAG | NDV-HN-R1 | |
| 6483-6502 | 811 | GAAGCAAAGAACACATGGCG | NDV-HN-F2 |
| 7272-7293 | AGTCCTTCTCATGGTATTGACC | NDV-HN-R2 | |
| 7107-7129 | 1362 | CTGCGCTCCATCAATTTAGATGA | NDV-HN-F3 |
| 8446-8468 | GATAGATGTGACTCTGGTAGGAT | NDV-HN-R3 |
2.2 | 病毒RNA的分离、RT-PCR、测序和系统发育分析
从病毒感染的绒毛尿囊液中提取病毒基因组RNA(总RNA纯化试剂盒，Jena Bioscience)，并 subjected to cDNA synthesis(AccuPower RT PreMix，Bioneer)。按照Thermo Scientific的Phusion High-Fidelity PCR Kit说明书扩增HN的整个编码序列。本研究中使用的PCR引物(表1)是根据NCBI GenBank数据库中HN基因的共识序列设计的。然后，通过Sanger测序(Macrogen公司)对编码HN基因的PCR产物进行双向测序。接下来，通过BioEdit软件组装和分析序列。最后，HN基因的开放阅读框提交至GenBank，本研究分离株的指定登录号为MN327574.1。
采用系统发育树和进化距离分析来确定本研究的分离株的基因型和亚型。为此，我们从核苷酸数据库中检索了全球广泛分布的新城疫病毒(NDV)病毒的HN基因核苷酸序列。表2包含了我们用于系统发育分析的每个核苷酸序列的GenBank登录号和相应的来源国家列表。所有HN基因的开放阅读框均使用Clustal Omega、BioEdit和CLC Main Workbench软件进行序列比对、编辑、预测编码区、确定氨基酸替换和系统发育分析。此外，通过MEGA软件(v. X)的邻接法算法(Kimura 2参数，自举1000次复制)对不同的NDV病毒组之间的系统发育和分子进化距离进行了分析。为此，比较了HN基因全长ORF(1至1716核苷酸)的核苷酸序列。
2.3 | HN蛋白的三维结构预测
I-TASSER(https://zhanggroup.org/I-TASSER/)预测了我们研究中分离的HN蛋白的三维结构。该服务器使用LOMETS(局部元线程服务器)来模拟候选蛋白的三维结构。I-TASSER服务器用于线程查询氨基酸序列的不同三维结构(例如1USR、3T1E、1E8U和5B2C)与PDB中报告的那些不同，用于线程。此外，该服务器使用了来自PDB的10种其他病毒来源的HN蛋白结构，并最终预测了5个独立的模型。在这里，我们选择了具有最高C分数(置信分数)的三维结构来估计预测模型的质量。对于进一步分析，我们考虑了C分数值更高的三维结构，这表明了高度置信度。
2.4 | 分子动力学模拟分析
采用GROMACS软件包(版本2019.4)进行50纳秒(ns)的分子动力学分析，以确定最终HN三维模型的稳定性变化。首先，使用amber03力场生成HN结构的拓扑结构。然后，将结构定位在TIP3P水盒内。在压力和温度范围为1 bar和 ，分别使用100 ps的规范NPT和NVT系综，以2 fs的时间步长平衡所有MD模拟系统。最后，以2 fs的时间步长在50 ns内进行MD模拟。计算了此时均方根偏差(RMSD)。PyMOL软件绘制了最终的分子图形。
2.5 | 线性及构象性B细胞表位的预测
B细胞表位主要有两种类型:线性表位和构象性表位。线性表位连续出现，而构象性表位由一组长距离氨基酸组成。为了预测HN线性B细胞表位，我们使用了Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0服务器(http://tools.iedb.org/bcell/)。此外，应用Ellipro服务器(http://tools.iedb.org/ellipro/)预测抗体的线性及构象性表位。Ellipro服务器，为了分析，需要PDB格式的HN蛋白三维结构。
TABLE 2 用于系统发育树分析的新城疫病毒(NDV)菌株。
| 基因型/亚基因型 | 国家 | 基因库编号 | 编号 | 基因型/亚基因型 | 国家 | 基因库编号 | 编号 |
| VIIb | 中国 | JQ015295 | 41 | 1 | USA | AY562991 | 1 |
| VIIb | 中国 | KC542899 | 42 | 1 | 澳大利亚 | AY935494 | 2 |
| VIIb | 中国 | JX840450 | 43 | 1 | 日本 | M19478 | 3 |
| VIIb | 中国 | JQ015296 | 44 | 1 | 匈牙利 | DQ097394 | 4 |
| VIIi | 伊朗 | KU201418 | 45 | Il | 中国 | AY845400 | 5 |
| VIIi | 伊朗 | KU201419 | 46 | II | 中国 | JF950510 | 6 |
| VIIi | 中国 | KJ607169 | 47 | II | USA | EU289028 | 7 |
| VIIe | 中国 | DQ659677 | 48 | II | USA | AF309418 | 8 |
| VIIe | 中国 | DQ485265 | 49 | II | USA | AF375823 | 9 |
| VIIe | 中国 | DQ485263 | 50 | II | 德国 | Y18898 | 10 |
| VIIf | 中国 | GQ338310 | 51 | III | 中国 | FJ430160 | 11 |
| VIIf | 中国 | JF343538 | 52 | III | 中国 | FJ430159 | 12 |
| VIIg | 中国 | KC542895 | 53 | III | 中国 | EF201805 | 13 |
| VIIe | 中国 | DQ485265 | 54 | III | 中国 | GU573804 | 14 |
| VIIg | 中国 | GQ994433 | 55 | IV | 中国 | EU293914 | 15 |
| VIIh | 印度尼西亚 | HQ697261 | 56 | IV | 荷兰 | AY741404 | 16 |
| VIIh | 印度尼西亚 | HQ697256 | 57 | IV | 匈牙利 | X71994 | 17 |
| VIII | 中国 | FJ751919 | 58 | V | USA | AY562986 | 18 |
| VIII | 中国 | FJ751918 | 59 | V | USA | AY288993 | 19 |
| IX | 中国 | FJ436302 | 60 | V | USA | GQ288386 | 20 |
| IX | 中国 | FJ436305 | 61 | V | USA | GQ288385 | 21 |
| X | 伊朗 | GQ288392 | 62 | V | USA | GQ288381 | 22 |
| X | 伊朗 | GQ288390 | 63 | V | 墨西哥 | HM117720 | 23 |
| XI | 法国 | HQ266603 | 64 | VI | 匈牙利 | AJ880277 | 24 |
| XI | 法国 | HQ266602 | 65 | VI | USA | AY562988 | 25 |
| XI | 法国 | HQ266604 | 66 | VI | 荷兰 | GQ429293 | 26 |
| XII | 秘鲁 | JN800306 | 67 | VI | 中国 | FJ766529 | 27 |
| XII | 秘鲁 | KR732614 | 68 | VI | USA | FJ410145 | 28 |
| XII | 中国 | JN627511 | 69 | VI | 中国 | FJ766528 | 29 |
| XII | 中国 | JN627513 | 70 | VIa | 中国 | GQ281092 | 30 |
| XIIIa | 印度 | KJ577585 | 71 | Vla | USA | AY288996 | 31 |
| XIIIa | 印度 | KF727980 | 72 | VIId | 中国 | AF431744 | 32 |
| XIIIa | 俄罗斯 | AY865652 | 73 | VIId | 中国 | FJ872531 | 33 |
| XIIIb | 印度 | KF740478 | 74 | VIId | 中国 | AF473851 | 34 |
| XIIIb | 印度 | KP089979 | 75 | VIId | 中国 | GQ245843 | 35 |
| XIIIb | 巴基斯坦 | JN682211 | 76 | VIId | 中国 | GQ245847 | 36 |
| XIIIb | 巴基斯坦 | JN682210 | 77 | VIId | 中国 | GQ245860 | 37 |
| XVI | 多米尼加共和国 | JX119193 | 78 | VIId | 中国 | GQ245870 | 38 |
| I类 | USA | EF520714 | 79 | VIId | 中国 | DQ486859 | 39 |
| I类 | 日本 | AB524405 | 80 | VIIb | 中国 | JQ015297 | 40 |
3 | 结果
3.1 | HA
本研究报告的NDV分离株于2016年从伊朗东北部出现临床症状的鸟类中采集。该毒株使用HA进行评估。该试验表明样品似乎呈阳性结果。在我们之前的研究(Tavassoli等人，2019年)中，我们表明该样品被归类为强毒株。
3.2 | HN的进化分析
分离的NDV的HN核苷酸序列已注册在GenBank数据库中，登录号为MN327574.1。使用MEGAX软件(版本X)和1000次自举复制，构建了基于83个NDV分离株的完整CDS的HN基因序列的进化树(图1)，这些分离株对应于世界各地的不同基因型，以及商业疫苗株，包括登录号:AF077761(LaSota)，AF309418(B1)，M19478和AY562991(Ulster)。比较分析针对从1到1716 bp的核苷酸序列。HN基因的核苷酸序列的GenBank登录号和来源国家以及我们的序列(如图1中的圆点所示)用于表2中所示的进化分析。此外，在本表中，我们列出了每个分离株的基因型和亚基因型。我们的分离株的聚类模式表明其归类为II类，基因型VII和亚基因型VIId。此外，进化分析表明研究分离株与伊朗先前报道的菌株(KU201818，KU201419)密切相关。这些结果表明基因型VII的NDV在伊朗的主要流行。此外，同源性分析表明，与伊朗不同地区分离的其他NDV株的HN氨基酸序列相比，分离株的相似性得分在95%到99%之间(图S1)。
3.3 | HN编码序列变异研究
为分析不同NDV基因型和NDV VII亚基因型之间的变异，我们使用CLC软件预测了不同分离株的HN基因的编码序列。然后，预测的编码区域进行比对，以确定HN蛋白序列中的氨基酸取代，特别是在受体结合、融合促进、唾液酸结合和抗原性区域等关键位点。
对不同NDV基因型的序列比较表明，NDV的HN蛋白长度在570到616个氨基酸之间变化(Khattar等人，2009年；Liu等人，2019年；Jakhesara等人，2016年)。在这里，我们的HN蛋白分离株含有571个氨基酸，这是强毒NDV的主要特性之一(Maminiaina等人，2010年)。因此，该氨基酸序列用于比较，以发现不同疫苗株和NDV基因型在受体结合、融合促进、唾液酸结合和抗原位点等几个主要区域中的突变和取代(表3)。疫苗株包括Ulster，LaSota和B1。此外，这些比较是为了发现VII型NDV不同基因型和我们分离株之间的变异(表4)。
图1 新城疫病毒(NDV)株基于血凝素-神经氨酸酶(HN)基因核苷酸序列的进化树(完整ORF；1-1716个核苷酸)。右侧显示了基因型或亚基因型的临时命名。使用MEGA X软件和1000次自举复制生成的邻接法生成了系统发育树。登录号MN327574.1，如图1中的圆点所示，是本研究研究的对象(从伊朗东北部分离)。
表3 新城疫病毒(NDV)所有基因型血凝素-神经氨酸酶蛋白序列在受体结合位点、融合促进区域、唾液酸结合和抗原位点的氨基酸变化比较。
| 抗原位点 | 唾液酸结合位点 234-239 | 融合促进区 | 受体结合位点 | 基因型 | 国家 | 基因库编号 | ||||||||||||
| 494,513-521,569 | 345-353 | 193-201 | 145 | 142 | 140 | 127 | 526 | 416 | 401 | |||||||||
| D, RITRVSSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | A | V | L | 1 | Y | R | E | 1 | 爱尔兰 | AY562991 (Ulster) |
| G, RITRVSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | A | V | L | 1 | Y | R | E | II | 中国 | AY845400 (LaSota) |
| G, RITRVSSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | A | V | L | 1 | Y | R | E | II | 美国 | AF309418 (B1) |
| A, RITRVSSSS, G | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | T | V | L | V | Y | R | E | III | 中国 | FJ430160 |
| D, RITRVSSRS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | A | V | L | V | Y | R | E | IV | 荷兰 | AY741404 |
| N, RITRVSSSN, D | PDEQDYQVR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | T | V | L | V | Y | R | E | V | 美国 | GQ288381 |
| D, RVTRVSSSS, G | PDGQEYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | T | V | L | V | Y | R | E | VI | 匈牙利 | AJ880277 |
| D, RVTRVSSSS, D | PDQQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIId | 伊朗 | MN327574 (研究分离株) |
| D, RMTRVSSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | V | V | L | V | Y | R | E | VIII | 中国 | FJ751919 |
| D, RITRVSSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHPH | S | C | S | K | R | N | A | V | L | V | Y | R | E | IX | 中国 | FJ436302 |
| D, RITRVSSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | A | V | L | 1 | Y | R | E | X | 伊朗 | GQ288392 |
| D, RITRVSSSS, G | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | T | V | L | V | Y | R | E | XI | 法国 | HQ266603 |
| G, RVTRVSSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | T | V | L | V | Y | R | E | XII | 秘鲁 | JN800306 |
| D, RVTRVSSSS, V | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | T | V | L | V | Y | R | E | XIII | 印度 | KJ577585 |
| D, RITRVSSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | T | V | L | V | Y | R | E | XVI | 多米尼加共和国 | JX119193 |
表4 新城疫病毒(NDV)基因型VII受体结合位点、融合促进区、唾液酸结合位点和抗原位点血凝素-神经氨酸酶蛋白氨基酸变化的比较。序列。
| 抗原位点 | 唾液酸结合位点 234-239 | 融合促进区 | 受体结合位点 | 基因型/亚型 | 国家 | 基因库编号 | ||||||||||||
| 494, 513-521, 569 | 345-353 | 193-201 | 145 | 142 | 140 | 127 | 526 | 416 | 401 | |||||||||
| D, RVTRVSSSS, D | PDQQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIId | 伊朗 | MN327574 |
| D, RVTRVSSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIId | 中国 | FJ872531 |
| D, RVTRVSSSS, N | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIId | 中国 | AF473851 |
| D, RVTRVSSSS, D | PDGQDQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIId | 中国 | GQ245847 |
| D, RVTRVSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIId | 中国 | GQ245860 |
| D, RVTRVSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIId | 中国 | GQ245870 |
| D, RVTRVSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIId | 中国 | DQ486859 |
| D, RVTRVSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIId | 中国 | AF431744 |
| D, RVTRVSSS, D | PDKQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIj | 中国 | JQ015297 |
| D, RVTRVSSS, D | PDKQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIj | 中国 | JQ015295 |
| D, RVTRVSSS, D | PDKQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIb | 中国 | KC542899 |
| D, RVTRVSSS, D | PDKQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIb | 中国 | JX840450 |
| D, RVTRVSSS, D | PDKQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIb | 中国 | JQ015296 |
| D, RVTRVSSS, D | PDQQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIli | 伊朗 | KU201418 |
| D, RVTRVSSS, D | PDQQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIli | 伊朗 | KU201419 |
| D, RVTRVSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIe | 中国 | KJ607169 |
| D, RVTRVSSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | F | V | Y | R | E | VIIe | 中国 | DQ659677 |
| D, RVTRVSSSN, D | PDGQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIe | 中国 | DQ485265 |
| D, RVTRVSSSS, D | PDGQDYQTR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIe | 中国 | DQ485263 |
| D, RVTRVSSSS, G | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIf | 中国 | GQ338310 |
| D, RVTRVSSSS, G | PDGQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIf | 中国 | JF343538 |
| D. RVTRVSSSS, D | PDKODYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIg | 中国 | KC542895 | |
| D, RVTRVSSSN, D | PDGQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIe | 中国 | DQ485265 | |
| D. RVTRVSSSS, D | PDKQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIg | 中国 | GO994433 | |
| D, RVTRVSSSS, D | PDEQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | T | V | L | V | Y | R | E | VIIh | 印度尼西亚 | HQ697261 |
| D, RVTRVSSSS, D | PDKQDYQIR | LSGCRDHSH | S | C | S | K | R | N | 1 | V | L | V | Y | R | E | VIIj | 中国 | JQ015295 |
图2 新城疫病毒(NDV)分离株血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白的三维建模(登录号:MN327574.1)，显示了受体结合、融合促进、唾液酸结合和抗原位点处的残基。该图以彩虹色显示整个蛋白，N端为蓝色，C端为红色，中间颜色渐变。
基于先前发表的报道(Yan et al., 2020; Sabouri et al., 2018; Liu et al., 2015; Ke et al., 2010; Zaitsev et al., 2004; Li et al., 2015)，位置401、416和526的残基被确定为受体结合位点，234至239位的残基为唾液酸结合位点。对于这两个区域，不同基因型间未观察到替换(表3)。然而，在构成HN蛋白融合促进和抗原位点的氨基酸中发现了几种特异性替换。HN蛋白的融合促进区域包括氨基酸编号127、140、142和145。融合促进区域的比较分析显示，127位氨基酸替换为(I V)，145位氨基酸替换为(A→T/I/V)。提出的抗原位点(Yan et al., 2020; Jakhe-sara et al., 2016)包括残基193-201、345-353、494、513-521和569。此外，我们在抗原位点中标注了200位(S→P)、347位(E→G/Q)、349位(D→E)、352位(I→V)、494位(D→G/A/N)、514 和 位置的替换。然而，在抗原位点345至353位的氨基酸中，347位存在氨基酸替换，这是HN的主要线性表位(Cho et al., 2007; Cho et al., 2008)。这意味着我们研究菌株的347位残基为谷氨酰胺(Q)，但在其他分离株中，该位置显示为谷氨酸(E)或甘氨酸(G)等可变残基。此外，抗原位点513至521位和569位存在另一种明显的氨基酸替换(表3)。
图3 使用GROMACS软件进行分子动力学模拟分析的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白均方根偏差(RMSD)结果。RMSD结果证实，模拟时间(50 ns)足以确定HN模型的构象稳定性和变化。
表5 Bepipred服务器预测的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白的线性表位。
| NO. | 开始 | 结束 | 肽段 | 长度 |
| 1 | 5 | 18 | VNRVVLENEEREAK | 14 |
| 2 | 54 | 57 | HDLA | 4 |
| 3 | 64 | 83 | SKTEDKVTSLLSSSQDVIDR | 20 |
| 4 | 93 | 102 | PLALLNTESI | 10 |
| 5 | 112 | 140 | YQINGAVNNSGCGAPVHDPDYIGGIGKEL | 29 |
| 6 | 142 | 170 | VDNISDVTSFYPSAYQEHLNFIPAPTTGS | 29 |
| 7 | 196 | 201 | CRDHSH | 6 |
| 8 | 216 | 217 | TG | 2 |
| 9 | 228 | 235 | NLDDTQNR | 8 |
| 10 | 256 | 267 | GTEEEDYKSVAP | 12 |
| 11 | 281 | 292 | YHEEDLDTTVLF | 12 |
| 12 | 321 | 364 | KPNSPSDTAQEGKYVIYKRHNNTCPDQQDYQIRMAKSSYKPKRF | 44 |
| 13 | 380 | 385 | TSLGKD | 6 |
| 14 | 433 | 458 | NKTATLYSPYKFNAFTRPGSVPCQAS | 26 |
| 15 | 460 | 460 | R | 1 |
| 16 | 479 | 482 | HRNH | 4 |
| 17 | 495 | 499 | EQARL | 5 |
| 18 | 517 | 523 | VSSSSIK | 7 |
| 19 | 552 | 554 | LFG | 3 |
不同VII NDVs和我们的分离株在HN蛋白关键区域的比较结果见表4。这些分析代表了140、347、521和569位的主要变异。因此，除了位于融合促进区的140位残基外，其他三个残基(347、521和569)位于HN蛋白的抗原位点(表4)。
3.4 | 3D结构预测与分子动力学模拟分析
在这项工作中，我们使用I-TASSER服务器根据我们分离的HN蛋白序列生成3D结构(图2)。所选模型的C得分为-0.93。该得分通常在 ，2]范围内，其中更高的值表示置信度更高的模型，反之亦然。该模型代表了我们分离的HN蛋白在受体结合、融合促进、唾液酸结合和抗原位点处所需残基的位置。每个位点处这些残基的位置在图2中表示。
HN 3D模型经GROMACS软件进行分子动力学模拟分析，以确定HN蛋白PDB结构的稳定性及变化。通过测量RMSD指数进行计算。此处分子动力学模拟运行时长为50 ns。该刺激时间内的RMSD分析结果如图3所示。我们对RMSD的发现证实，模拟时间(50 ns)足以确定HN模型的稳定性及变化(图3)。
3.5 | HN 蛋白抗原性评价
利用BepiPred和Ellipro服务器研究HN蛋白对B淋巴细胞的潜在线性及构象表位。我们提交了氨基酸序列和3D结构至BepiPred和ElliPro服务器。首先，BepiPred服务器预测了HN氨基酸序列(571 aa)的线性表位。表5列出了序列、指定起始和终止残基的数量及每个预测表位的长度。阈值被认为小于0.5。然后，Ellipro服务器预测的所有B细胞线性表位的位点和序列信息如图4A, B所示。接下来，计算了HN的抗原性分数范围，从0.786至0.515(图4B)。最后，我们使用Ellipro服务器确定了构象表位。图5A, B描绘了所有预测为构象B细胞表位的残基。此处，大量HN残基具有作为非连续表位的潜力，抗原性分数范围为0.692至0.626。
4 | 讨论
已证实先前研究，HN蛋白序列中存在保守残基，可确保受体识别、抗原性、NA和融合促进作用(Yan et al., 2020; Khattar et al., 2009; Yuan et al., 2011)。例如，HN蛋白存在七个重叠抗原位点，而345-353残基形成HN结构中唯一的线性表位，易受免疫压力影响。这些残基在产生和增强抗原变异中起重要作用(Cho et al., 2007, 2008; Zhu et al., 2016; Li et al., 2015)。通过转染表达HN蛋白的质粒，已突出显示HN蛋白序列关键位置的其它保守残基，这些残基驱动不同生物学功能(Khattar et al., 2009)。多项研究发现NDV病毒的嗜性和毒力因HN基因序列类型而异。通过交换不同NDV株间的HN基因并改变其贡献的保守残基，证实了这一点，这些残基参与多种生物学活动。然而，这些研究结果中存在部分冲突(Jin et al., 2017; Huang et al., 2004; Khattar et al., 2009)。宿主对ND免疫反应的主要靶点是HN和F蛋白，因此这两个蛋白被视为开发ND疫苗的主要目标(Yan et al., 2020; Tavassoli et al., 2019; Izquierdo-Lara et al., 2019)。
| 编号 | 开始 | 结束 | 肽段 | 长度 | 得分 |
| 1 | 319 | 335 | GLKPNSPSDTAQEGKYV | 17 | 0.786 |
| 2 | 1 | 51 | MDRMVNRVVLENEEREAKNTWRLVFRITVLLLMVMTLAISAAALAYSMGAS | 51 | 0.771 |
| 3 | 54 | 131 | HDLAGISTAISKTEDKVTSLLSSSQDVIDRIYKQVALESPLALLNTESIMMNAITSLSY OINGAVNNSGCGAPVHDPD | 78 | 0.77 |
| 4 | 337 | 357 | YKRHNNTCPDOQDYOIRMAKS | 21 | 0.766 |
| 5 | 164 | 171 | PAPTTGSG | 8 | 0.732 |
| 6 | 192 | 203 | ILSGCRDHSHSH | 12 | 0.713 |
| 7 | 276 | 296 | GFDGQYHEEDLDTTVLFKDWV | 21 | 0.703 |
| 8 | 550 | 555 | NTLFGE | 6 | 0.676 |
| 9 | 258 | 269 | EEEDYKSVAPTS | 12 | 0.671 |
| 10 | 360 | 368 | KPKRFGGKR | 9 | 0.666 |
| 11 | 224 | 235 | LRSINLDDTQNR | 12 | 0.657 |
| 12 | 377 | 387 | KVSTSLGKDPV | 11 | 0.641 |
| 13 | 459 | 465 | ARCPNSC | 7 | 0.627 |
| 14 | 567 | 571 | KDDRV | 5 | 0.591 |
| 15 | 479 | 482 | HRNH | 4 | 0.582 |
| 16 | 142 | 147 | VDNISD | 6 | 0.563 |
| 17 | 452 | 455 | SVPC | 4 | 0.555 |
| 18 | 211 | 217 | LRTSATG | 7 | 0.545 |
| 19 | 253 | 256 | KVTG | 4 | 0.515 |
图4 Ellipro服务器预测的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白的线性表位。3D结构上的表位位置和每个表位的指定信息分别显示在(A)和(B)中。
(b)
图5 Ellipro服务器预测的血凝素-神经氨酸酶(HN)蛋白的构象表位。3D结构上的残基位置和每个残基的指定信息分别显示在(A)和(B)中。
在本研究中，我们展示了伊朗分离的ND病毒HN蛋白的全面分析。在测序并找到HN的全长序列后，用于系统发育分析。结果表明我们的分离株属于VIId亚型(图1，表2)。然后，我们比较了NDV所有基因型在HN蛋白的受体结合、融合促进、唾液酸结合和抗原位点处的氨基酸变异(表3)以及其他更普遍的VII亚型和疫苗株(表4)。我们不同基因型和疫苗株的比较结果表明，受体和唾液酸结合位点的残基是相同的。然而，在融合促进区域，残基127(IV)和145(AT/I/V)存在差异。先前研究表明，NDV HN蛋白似乎至少有五个与表位相关的抗原位点，包括残基193-201、345-355和一个包含残基494、513-521和569的C端区域(Cho等人，2007，2008；Sabouri等人，2018)。此外，HN糖蛋白的氨基酸残基341-355也被鉴定(Ke等人，2010)。在这里，在抗原位点，作为HN蛋白最关键的残基，存在多个替换，但主要残基是347和569，这些残基表现出变异(表3)。我们发现不同VII型NDV和我们的分离株在残基140、347、521和569处存在显著差异。最显著的变异位于抗原位点，残基为347、521和569。残基140位于HN蛋白的融合促进域(表4)。这些结果表明，ND病毒HN蛋白中最可能受到突变压力的关键位点是与抗原性残基相关的(Cho等人，2007，2008；Sabouri等人，2018)。然而，我们分离株的抗原区域与其他从不同地理地区分离的NDV的VIId亚型非常相似。
此外，为确定HN蛋白的RMSD而进行的3D结构和分子动力学模拟结果，引入了一个具有抗原表面显示潜力的稳定结构(图2和图3)。线性表位和构象表位的预测是基于先前研究的抗原残基(Cho等人，2007，2008；Li等人，2015)。在这里，针对我们的分离株，通过使用HN蛋白的氨基酸序列和最终3D结构，我们提供了线性表位和构象抗原区域的列表及其位置和分数(表5；图4和图5)。在这项工作中，我们根据先前相关的科学报告，在表3和表4中列出了HN蛋白的抗原位点。我们发现HN的几乎所有抗原位点(表3和表4)都存在于从在线服务器检索的潜在线性表位和构象抗原表位的列表中(表5；图4和图5)。
通过考虑这些潜在的抗原区域，将有可能设计和开发新一代候选疫苗以在全球范围内消除ND病毒。特别是，HN蛋白位于NDV表面，在宿主受体结合和病毒感染过程中发挥关键作用。因此，针对HN蛋白产生抗体对于宿主保护至关重要。
在数十年的研究和开发之后，仍需改进以创建完美的疫苗。另一方面，通过使用计算机模拟技术，可以更快、更经济地创建更有效的疫苗。
本研究采用免疫信息学方法评估抗原性HN蛋白的特性以激发有效的免疫应答。当前研究是计算机计算方法的唯一结果；为激发疫苗的安全性和有效性，需要对免疫原性蛋白进行实验验证，这可能包括全面的体内和体外评估。因此，探索和鉴定HN蛋白的关键位点将为设计和开发针对流行NDV株的新一代减毒疫苗提供有价值的信息(Yan et al., 2020; Triosanti et al., 2018; Li et al., 2015; Habib et al., 2018)。
5 | 结论
生物信息学已发展出多种工具用于识别和预测病毒和细菌感染蛋白内的表位和潜在的抗原区域(Soleymani et al., 2020)。兽医病毒免疫信息学研究发现免疫原性区域可开发新型疫苗，可能替代基于胚蛋的传统平台。对抗原性的评估预测线性和不连续表位显示出显著潜力以经济快速地产生疫苗。由于HN蛋白是ND病毒的主要免疫原性因素之一，靶向抗原区域可能适合利用合理疫苗设计、蛋白质和基因工程原理开发新一代疫苗。
总之，生物信息学是识别潜在中和表位和指导疫苗候选物选择的宝贵工具。然而，实验验证仍然是疫苗开发过程中的关键步骤。
作者贡献
概念化；方法学；执行分析并撰写手稿:Amin Tavassoli和Safoura Soleymani。监督项目并修改手稿:Mohammad Reza Housaindokht。所有作者阅读并批准手稿最终版本。
利益冲突声明
作者声明他们没有利益冲突。
资金信息
马什哈德费尔多西大学
数据可用性声明
作者确认当前研究使用和/或分析的数据集可在合理请求下从通讯作者处获得。
伦理声明
无。
ORCID
Amin Tavassoli D https://orcid.org/0000-0001-7300-4369 Safoura Soleymani D https://orcid.org/0000-0002-3474-1785 Mohammad Reza Housaindokht D https://orcid.org/0000-0002-5428-2512
同行评审
该论文的同行评审历史可在 https://www.webofscience.com/api/gateway/wos/peer-review/10.1002/vms3.1491 查询。
参考文献
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