外源双链RNA触发序列特异性RNA干扰和真菌应激反应以控制短柄草中的稻瘟病菌
发布时间：
2026-07-02 14:16
外源双链RNA触发序列特异性RNA干扰和真菌应激反应以控制短柄草中的稻瘟病菌
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郑莹®1，本杰明·莫拉赫®2，贝丝丽·雅各布斯 - 舍恩万特®2，阿南特·帕特尔®2，基娅拉·帕斯塔卡尔迪10’，斯特凡·雅各布10 ，安娜·R·塞德D4，曼弗雷德·海因莱茵6，明娜·M·波拉宁6 ，卡尔 - 海因茨·科格尔© & 玛丽亚·拉德era·卡尔莫纳D X
在脊椎动物和植物中，双链RNA作为病原体相关分子模式(PAMP)和RNA干扰的介质发挥着关键作用。高等真菌如何响应双链RNA尚不清楚。我们证明，稻瘟病菌(Mo)，一种全球重要的作物病原体，能够摄取21至约3000 bp的广泛大小范围内的双链RNA。用 双链RNA孵育真菌分生孢子，无论大小或序列如何，都会诱导异常的芽管伸长，揭示了双链RNA在这种真菌中具有强烈的序列非特异性效应。因此，合成双链RNA类似物聚(I:C)以及各种大小和序列的双链RNA引发了典型的真菌应激途径，包括应激标记物丝裂原活化蛋白激酶Hog1p的核积累和活性氧的产生。将双链RNA叶面施用于谷物模式物种短柄草可抑制叶瘟病的进展。值得注意的是，双链RNA的序列非特异性效应取决于较高剂量，而在低浓度双链RNA( )下观察到纯序列特异性效应。通过在施用双链RNA和接种之间保持至少七天的间隔，并通过将双链RNA稳定在藻酸盐 - 壳聚糖纳米颗粒中，双链RNA的保护作用进一步增强。总体而言，我们的研究为农业中双链RNA农药的开发和使用开辟了更多可能性。
双链RNA(dsRNA)已被认为是保护植物免受病毒、昆虫、真菌病原体和卵菌 侵害的有前途的工具。在大多数真核生物中，双链RNA触发RNA干扰(RNAi)，这是一种促进基因组稳定和抵御RNA病毒和类病毒 的基因调控途径。在作物保护中，RNAi机制可用于害虫和疾病控制，使用外源双链RNA(喷雾诱导基因沉默，SIGS)或宿主表达的双链RNA(宿主诱导基因沉默，HIGS)来降低害虫和病原体的必需基因活性，从而降低它们的毒力 。
除了在RNAi中的作用外，双链RNA在脊椎动物和植物中还被认为是一种病原体相关分子模式(PAMP) 。这触发了模式触发免疫(PTI)，例如非特异性防御反应，这可能减轻病毒感染。在脊椎动物中，已经鉴定出一组双链RNA受体，它们在识别双链RNA后诱导多种细胞内和细胞外免疫反应 。然而，真菌如何响应双链RNA在很大程度上尚未得到探索。用双链RNA成功进行植物保护是基于这样的假设，即大多数真菌具有功能性RNAi系统 ，因此对双链RNA介导的真菌靶基因沉默敏感 。然而，双链RNA在真菌中是否也具有诱导先天免疫的成分这一问题仍未解决 。
植物病理学研究所，生物系统、土地利用与营养研究中心，吉森尤斯图斯·李比希大学，海因里希 - 布夫环26号，35392吉森，德国。 生物制品与化学品的发酵与配方，比勒费尔德应用材料研究所，比勒费尔德应用科学大学，Interaktion 1，33619比勒费尔德，德国。 生物技术与药物研究所，汉斯 - 迪特尔 - 许施街17号，55128美因茨，德国。 植物分子生物学研究所，法国国家科学研究中心，斯特拉斯堡大学，将军齐默街12号，67084斯特拉斯堡，法国。 分子与整合生物科学研究计划，赫尔辛基大学生物与环境科学学院，赫尔辛基，芬兰。
& 电子邮件:karl - heinz.kogel@agrar.uni - giessen.de；maria.ladera - carmona@agrar.uni - giessen.de
在本研究中，我们以稻瘟病菌(Mo)为实验模型，探讨真菌如何对外源双链RNA作出反应。这种半活体营养型真菌是稻瘟病的病原体，在世界十大植物病原体中排名第一，具有极高的科学和经济重要性 。Mo可感染多种禾本科植物的地上和根部组织，包括禾本科模式植物短柄草(Bd)。DICER - LIKE(DCL)、ARGONAUTE(AGO)和RNA - 依赖RNA聚合酶(RdRp)家族的RNAi蛋白是真菌致病力所必需的 ，并且在感染组织中积累了多种宿主来源的微小RNA(miRNA)，包括预测可对编码致病力或致病性相关基因的真菌mRNA进行序列特异性靶向的miRNA候选物 。与此一致的是，Mo能够内化并加工来自表达这些RNA的转基因水稻植株 以及经双链RNA处理的水稻叶片中的外源双链RNA，导致相应真菌靶基因的序列特异性沉默 。
在此，我们发现双链RNA除了具有RNAi介导的基因沉默活性外，还具有免疫原性。双链RNA处理以大小和序列非特异性的方式部分抑制了感染进程。与此发现一致的是，双链RNA诱导了真菌的高渗甘油(HOG)途径，这是一种磷酸化中继系统，在真菌物种中保守，依赖于对不同类型环境变化(如渗透胁迫、紫外线、高温、脂多糖和氧化应激)快速作出反应的MAPK级联反应的激活 。我们表明，这些序列非特异性的类PAMP效应是短暂的，而在外源双链RNA浓度较低时，当双链RNA应用与真菌接种之间间隔7或14天且双链RNA通过壳聚糖 - 海藻酸盐纳米颗粒稳定化时，可观察到外源双链RNA的纯序列特异性RNAi活性。总体而言，我们的数据表明双链RNA对真菌及其引起的疾病的影响可能是多样的，为农业中双链RNA农药的开发和应用开辟了更多机会。
结果
稻瘟病菌从液体培养物和叶片中摄取不同长度的外源双链RNA
为了确定Mo对双链RNA的摄取是否依赖大小，我们分析了其摄取长度从21 bp到1775 bp的酶促合成荧光双链RNA(10 ng/μL)的能力(补充数据2)。双链RNA与分生孢子在液体培养物中孵育，并在处理后 小时(hpt)使用共聚焦扫描显微镜(CSLM)成像。在所有处理的样品中均鉴定出荧光芽管(GTs)(图1A)。通过将分生孢子与来自噬菌体phi6的双链RNA孵育扩展了该分析，噬菌体phi6具有由三个双链RNA片段代表的三方基因组，其中最小的片段大小为2948 bp。在用微球菌核酸酶(MNase)对菌丝体进行额外处理以去除
图1 | 稻瘟病菌从液体培养物和叶片表面摄取双链RNA的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)成像。A 将分生孢子 与用荧光素标记的 双链RNA(21 bp双链RNA)或Alexa Fluor 488染料(更长的双链RNA；补充数据2)在0.002%(v/v)吐温20中于室温下孵育 ，然后拍摄图像。比例尺等于 。上排:AF488和荧光素成像[激发波长(nm):501；发射波长(nm):591]；下排:与明场合并。B Phi6-双链RNA摄取的CLSM成像。如A中所述，将稻瘟病菌分生孢子 与用荧光素标记的 Phi-双链RNA(2948、4063和7599 bp)孵育。在拍摄图像之前，用双链RNA降解MNase处理菌丝体。比例尺等于 。左:AF488和荧光素成像[激发波长(nm):501；发射波长(nm):591]；右:与明场合并。C 稻瘟病菌芽管从局部处理的 叶片摄取双链RNA的CLSM成像。三周龄 植株完整的第二片最幼嫩叶片首先用含有 Cy3标记的490 bp SHP-双链RNA的 滴在0.002%(v/v)吐温20中进行点滴处理。 后，将处理过的叶片区域用含有 分生孢子的 滴进行点滴接种，并在接种后 成像。比例尺等于 。左边为Cy3[激发波长(nm):565；发射波长(nm):626]信号，右边与明场合并。所有双链RNA序列见补充数据2和补充数据3。对于未吸收的双链RNA，我们证实荧光Phi6-双链RNA也被真菌摄取。综上所述，这些结果表明，在测试的大小范围内，真菌培养物对双链RNA的摄取与其大小无关(图1B；补充数据2)。
图2 | 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)芽管(GT)长度对外源双链RNA的响应。将稻瘟病菌分生孢子( 中1000个)与 所示RNA在室温下孵育 。随后，分生孢子在盖玻片上萌发额外24小时并测定长度。(A)野生型稻瘟病菌和(B)MIF1基因敲除突变体ΔMomifl-1的GT长度。用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)拍摄图像，并用ImageJ分析GT长度(并转换为微米)。合并了三个独立实验的数据。箱线图表示平均值及标准偏差 。用Kruskal-Wallis检验 ，随后进行Dunn多重比较检验(A)(*: ; **: ; ***: ; ***: )以及用Welch方差分析检验 及Dunnett检验(B)(*: ; **: ; ****: 。星号表示与对照组(CTR)的差异。
接下来，我们监测了稻瘟病菌从经双链RNA处理过的 中摄取外源双链RNA的能力， 是 的一个既定宿主模型。将三周龄 幼苗的第二片最嫩的叶子用置于每个叶鞘中央的Cy3标记的双链RNA(490 bp SHP - dsRNA ；补充数据3)液滴处理。 后，用分生孢子对处理过的叶区域进行点滴接种。接种后48小时(hpi)的共聚焦成像证实，芽管也可以从处理过的叶区域摄取荧光双链RNA(图1C)。
外源双链RNA对真菌发育具有序列非特异性影响
在植物和哺乳动物中, 长双链RNA(> 30 bp)可促进序列非特异性的PTI活性 。在此，我们通过监测双链RNA对芽管形成的影响来分析双链RNA对真菌病原体的作用性质，因为芽管发育是真菌应激反应的一个良好指标 。为此，我们测试了双链RNA类似物聚肌苷酸:聚胞苷酸 [poly(I:C)]，它可在植物和动物中诱导PTI反应 ，以及各种靶向稻瘟病菌和非靶向的21 bp小干扰RNA(带有突出端的21 bp双链体)和源自三个不同基因的长双链RNA(> 400 bp):稻瘟病菌丝裂原活化蛋白激酶MoPkm1、来自麦长管蚜(Sitobion avenae)的鞘蛋白(SHP)(在稻瘟病菌中无预测靶点)和绿色荧光蛋白(GFP)(补充数据3)。与未处理的对照相比，大多数测试的21 bp双链体和双链RNA在 浓度下在体外诱导芽管伸长(图2A)。这种效应与双链RNA序列无关。数据表明，外源施加的不同长度的双链RNA可在真菌培养物中诱导序列非特异性反应。
利用稻瘟病菌(Mo)基因敲除(KO)突变体ΔMomif1 - 1进一步研究了双链RNA(dsRNA)对真菌发育的非序列特异性影响，该突变体中巨噬细胞迁移抑制因子1(MoMIF1)基因的编码序列被删除。由于这种缺失，ΔMomif1 - 1菌株形成的气生菌丝(GTs)比Mo野生型 短。为了确定MoMIF1的dsRNA介导的基因沉默是否导致类似的短GT表型，我们用 源自MoMIF1的短(21 bp MIF1 - siRNA)或长dsRNA(413 bp MIF1 - dsRNA)处理萌发的野生型分生孢子，并将它们的GT长度与ΔMomif1 - 1的GT长度进行比较。与我们的预期 一致， omif1 - 1的GT明显短于未处理的野生型的GT。相反，与ΔMomif1 - 1菌株或未处理的野生型菌株相比，用源自MIF1的siRNA和dsRNA处理诱导的GT更长而不是更短，这表明用这些RNA处理不会模拟KO突变体的表型(图2B；Welch方差分析检验， )。我们对这些结果的解释是，在给定浓度的 下，MIF - siRNA和MIF1 - dsRNA的免疫原性作用超过了预期的RNAi作用，并掩盖了序列特异性基因沉默活性以及对GT发育的相关抑制作用。与MIF1 - dsRNA和MIF1 - siRNA序列相同的单链(ss)RNA对GT伸长没有显著影响(图2B)，证实观察到的免疫原性作用仅由双链分子触发。
外源dsRNA诱导真菌芽管中的活性氧
活性氧(ROS)参与真菌发育和致病的几个重要方面，包括分生孢子和感染结构 的形成。因此，我们推测外源dsRNA会对Mo幼苗细胞间ROS的调节产生诱导作用。为了解决这个问题，使Mo分生孢子萌发，3天后，将菌丝浸入含有siRNA或长dsRNA的溶液中 ，随后用 染色， 与细胞内 反应形成荧光二氯荧光素 。已知应激源多聚肌苷酸:胞苷酸(poly(I:C))和 长dsRNA触发了由于强烈的ROS爆发而产生的荧光信号，无论它们的序列如何，但相同浓度的siRNA没有触发(图3A)。此外，在0.1至 范围内的剂量反应分析表明， 及更高浓度的长dsRNA触发了 的产生，而在 时作用较弱，在 时未观察到作用(图3B)。
外源dsRNA诱导稻瘟病菌中的经典HOG应激途径
在子囊菌真菌哈茨木霉中，氧化应激会激活应激标志物 。为了获取更多关于真菌对双链RNA反应的信息，我们研究了双链RNA是否会在稻瘟病菌中诱导高渗甘油(HOG)应激途径这一问题。该途径在真菌对各种环境应激(包括渗透应激和氧化应激)的反应中起着关键作用，并且也有助于调节真菌的发育、毒力和致病性 。该途径的激活涉及HOG1丝裂原活化蛋白激酶从细胞质迁移到细胞核，在细胞核中它触发转录因子，这些转录因子调节参与细胞应激反应的基因的表达 。将表达嵌合绿色荧光蛋白标记的稻瘟病菌HOG蛋白(GFP-MoHog1p) 的稻瘟病菌报告菌株(HOG1::GFP)的分生孢子与各种类型的RNA一起孵育。共聚焦激光扫描显微镜(CSLM)成像显示，无论它们在稻瘟病菌中是否有RNA干扰靶点，聚肌胞苷酸(poly(I:C))、MIF1-双链RNA、SHP-双链RNA或相应的小干扰RNA(MIF-小干扰RNA、SHP-小干扰RNA) 在处理后5分钟内都会诱导GFP-MoHog1p的核积累(图4A、B)。该反应与在用作阳性对照的0.25M氯化钾存在下观察到的反应相似，而氨基糖苷类抗生素遗传霉素(一种蛋白质生物合成抑制剂)用作阴性对照 。相反，单链(ss)RNA，如21个核苷酸和413个核苷酸(正义链)的稻瘟病菌MIF1特异性单链RNA以及具有源自绿色荧光蛋白的序列的50个核苷酸的环状单链RNA(circRNA)(补充数据3)不会诱导GFP-MoHog1p迁移到细胞核(图S1)。值得注意的是，阳性对照氯化钾仅诱导GFP-MoHog1p的短暂核积累，而聚肌胞苷酸、双链RNA和小干扰RNA的作用持续超过60分钟，表明不同的双链RNA对应激途径有强烈的反应和激活作用(图4A、B)。最后，我们确定了诱导稻瘟病菌HOG1途径的双链RNA的最小允许浓度范围为0.016至 。在双链RNA浓度为 及以下时，不再观察到嵌合蛋白的核转位(图4C)。总体而言，这些数据进一步证实，除了已确定的诱导RNA干扰的活性外，双链RNA还可以在真菌中诱导应激反应。
图3 | 通过 染色检测稻瘟病菌菌丝中对双链RNA处理的活性氧(ROS)爆发。将三天龄的稻瘟病菌液体培养物与不同的RNA分子孵育 ，随后进行染色以进行共聚焦激光扫描显微镜(CSLM)分析。A用聚肌胞苷酸 作为阳性应激源或Pmk1-双链RNA和SHP-小干扰RNA 处理萌发的分生孢子。B用SHP-双链RNA处理后萌发分生孢子中ROS产生的剂量反应效应。用AF488进行荧光检测[激发波长(纳米):492；发射波长(纳米):为561]。比例尺等于 。
外源双链RNA对稻瘟病菌在植物上的侵染性产生序列特异性和非特异性影响
接下来，我们测试了外源双链RNA对Bd叶片感染Mo的影响。我们使用了靶向MIF1的短双链RNA和长双链RNA，因为之前的研究表明，MIF1的缺失会显著降低 的毒力。给三周大的 植株喷洒分生孢子悬浮液以及 MIF1 - siRNA或MIF1 - dsRNA。作为对照，给植株喷洒含有SHP - siRNA或SHP - dsRNA的分生孢子悬浮液，这些在Mo中没有靶点。在感染后5天(dpi)通过成像和基于ImageJ测量总坏死叶面积，结果表明所有双链RNA和小干扰RNA都显著减轻了坏死稻瘟病症状(图S2A、B)。一致地，通过相对于植物DNA的真菌DNA量确定的真菌量与稻瘟病症状的发生相关，并且在用双链RNA或小干扰RNA处理的所有叶片中都减少了(图S2C；单样本 检验，p≤0.05)。综上所述，这些结果表明双链RNA和小干扰RNA对植物叶片上真菌的发育都有非序列特异性的影响。
为剖析双链RNA(dsRNA)对真菌发育的序列特异性和非特异性活性，我们用额外的针对稻瘟病菌(Mo)和非靶向RNA进行了实验。我们推测，在较低浓度下，dsRNA的免疫原性活性可能会降低，而RNA干扰(RNAi)活性得以维持 。为此， 植物用含有低10倍浓度( )的针对Mo的(Pmk1 - siRNA或Pmk1 - dsRNA)或对照(GFP - siRNA或GFP - dsRNAs)RNA的溶液进行喷洒。与上述实验一致，我们发现针对Mo和非靶向dsRNAs减少了大麦白粉病菌(Bd)叶片上的坏死病斑面积(图5A)。然而，Pmk1 - dsRNA和Pmk1 - siRNA比在Mo中无靶点的GFP - dsRNA或GFP - siRNA显著更能减少感染症状，这揭示了除序列非特异性效应外的序列特异性RNAi效应(图5B)。此外，感染定量显示仅在用Pmk1 - siRNA和Pmk1 - dsRNA处理的叶片中真菌数量显著减少(单样本 检验，p )(图5C)。与这些数据一致，对接种了稻瘟病菌分生孢子和Pmk1 - dsRNA(10 ng/μL)混合物的离体大麦白粉病菌叶片的显微镜分析显示，与接种水对照相比，在dsRNA处理后2天(dpt)附着胞形成较少(图S3A、B)。此外，Pmk1 - dsRNA处理减少了稻瘟病菌的穿透和侵染菌丝的形成，从而解释了在4 dpt时叶片坏死减少的原因(图S3C)。
图4 | 对稻瘟病菌分生孢子中嵌合GFP-MoHog1p响应不同应激源的核转运进行成像。A 将 吐温20中的分生孢子(2000/100 μL)与指定双链RNA的 一起孵育。氯化钾 用作阳性应激源对照，而遗传霉素用作阴性对照。处理后5分钟和 时用AF488激光拍摄图像。B 将分生孢子与指定小干扰RNA的 一起孵育。C 用不同量的GFP双链RNA(476 bp)处理的稻瘟病菌分生孢子中GFP-MoHog1p核积累的剂量效应分析。比例尺等于 。AF488 [激发波长(nm):492；发射波长(nm):561]。
稻瘟病菌中RNA干扰和高渗甘油胁迫途径在不同双链RNA浓度下被触发
接下来，我们测试了浓度低于激活HOG应激途径和产生ROS阈值的dsRNA是否仍足以触发对感染的Bd叶片中Mo的序列特异性防御(RNAi)。用分生孢子和 的Pmk1-siRNA/Pmk1-dsRNA或GFP-siRNA/GFP-dsRNA处理Bd叶片。在接种后6天，在用Pmk1-siRNA和Pmk1-dsRNA处理的叶片中观察到感染症状减轻，但用GFP-siRNA和GFP-dsRNA处理的叶片中没有(图6A；图S4)。这些数据表明，外源Pmk1-dsRNA和Pmk1-siRNA可以在dsRNA对真菌应激相关ROS和HOG1信号没有可检测影响的浓度下，以序列特异性方式触发对Mo的RNAi。
为了进一步确认Pmk1-siRNA和Pmk1-dsRNAs的序列特异性RNAi触发活性，我们测量了Mo感染叶片中Pmk1转录本水平。用分生孢子和各自的RNA喷洒Bd植物，并在接种后12小时收获。在这个时间点，MoPmk1是附着胞分化所必需的，因此也是 感染性生长所必需的。与我们的预期一致，在用 的Pmk1-siRNA或长Pmk1-dsRNA处理的感染植物中，MoPmk1转录本减少。相比之下，GFP-siRNA或GFP-dsRNA不影响MoPmk1转录本水平(图6B)。
用于dsRNA制剂的藻酸盐-壳聚糖纳米颗粒的开发
在针对真菌感染的预防性处理中使用dsRNA制剂可能会增强dsRNA的RNAi活性。为此，我们制备了带有dsRNA货物的藻酸盐-壳聚糖纳米颗粒(NPs)(图7A)。这些NPs通过壳聚糖、dsRNA和藻酸盐中分别带正电荷的胺基与带负电荷的磷酸基团和羧基之间的静电相互作用形成。通过动态光散射(DLS)分析发现 和 的Pmk1-dsRNA-NPs的粒径范围分别取决于颗粒强度、体积和数量分布(图7B)。此外，Pmk1-dsRNA-NPs的平均流体动力学直径为 ，与空NPs没有显著差异(图S5A)。最后，通过扫描电子显微镜确认了NPs的尺寸和球形形态(图S5B、C)。
图5 | RNA喷雾介导的二穗短柄草植株对稻瘟病菌感染的保护作用。(A) 用稻瘟病菌分生孢子与dsRNA或siRNA的混合物喷洒二穗短柄草叶片后的感染症状。将完整的三周龄二穗短柄草植株接种含0.002%(v/v)吐温20的稻瘟病菌分生孢子 和 的siRNA或长dsRNA。对照植株喷洒 吐温(缓冲液)或吐温溶液中的分生孢子(未处理)。为进行成像，在接种后6天取下第二片最嫩的叶子，置于1%琼脂平板上。比例尺 。B用ImageJ计算坏死面积相对于整个叶片面积的相对大小。三个独立实验的结果以箱线图表示，代表平均值及标准差。采用Kruskal-Wallis检验 评估统计学显著性，根据Dunn多重比较检验，星号表示与对照组(CTR-未处理)的差异(*: ，而GFP和Pmk1特异性RNA之间的差异采用双尾Welch 检验(**: )。C通过RT-qPCR比较稻瘟病菌管家基因MoGPD与 管家基因BdUbi10来确定相对真菌生长。合并三个独立实验中真菌生长减少的百分比，并表示为平均值及标准差。采用双尾 检验(**: )和与对照组(CTR)的单样本 检验评估统计学显著性(*: ; **: )。
制剂延长了dsRNA在二穗短柄草中的保护作用
我们比较了裸露的Pmk1-dsRNA与制剂化的Pmk1-dsRNA-NP的抗真菌活性。将三周龄的二穗短柄草植株首先喷洒分生孢子与 的dsRNA、dsRNA-NP或空纳米颗粒的混合物。接种后5天对坏死叶面积的分析表明，未制剂化和制剂化的Pmk1-dsRNA对二穗短柄草植株的保护程度相同，而空纳米颗粒没有提供任何保护(图8A)。因此，dsRNA从纳米颗粒中释放出来，并且能够与裸露的dsRNA一样程度地激活RNA干扰。
接下来，我们设计了一个实验，该实验能更好地反映预防性处理的农艺实践，即dsRNA施用与接种之间较长的时间间隔可以更精确地证明dsRNA制剂的益处。在接种后1天或7天，给植株喷洒dsRNA并接种稻瘟病菌分生孢子。当处理与感染之间间隔一天(1天间隔)时，未观察到用裸露或制剂化的Pmk1-dsRNA处理的植株之间有差异。然而，当间隔7天时，Pmk1-dsRNA-NP对稻瘟病菌感染的保护作用明显强于裸露的Pmk1-dsRNA(Mann-Whitney检验， )(图8B、C；表1)。
与PTI相比，dsRNA介导的RNA干扰对稻瘟病菌的控制作用更强
为了确定Pmk1-dsRNA对Mo感染的保护作用(图8)是由RNAi途径还是PTI介导的，我们进行了一项实验，用Mo特异性和非特异性dsRNA处理植物，并在7天或 天后用Mo接种dsRNA处理过的植物。作为非靶向dsRNA，我们使用了噬菌体Phi6特异性dsRNA，它可以使用我们之前开发的基于细胞的生产系统大量生产 。当在处理和Mo接种之间使用 间隔时，用 Pmk1-dsRNA-NPs处理的 叶片中的稻瘟病症状和坏死区域减少(图9A、B)，当使用 间隔时观察到更强的效果(图9D、E)。然而，非特异性dsRNA如Phi6-dsRNA无论其制剂如何都没有发挥任何作用(图9B、E)。因此，在接种后7天或14天观察到的保护作用是由RNAi介导的，而dsRNAs的非特异性作用在这些时间点不足以提供保护。与此一致的是，通过定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)进行的真菌定量分析表明，当在接种后7天接种植物时，只有Pmk1-dsRNA和Pmk1-dsRNA-NP处理的植物中的Mo含量显著降低(图9C)。此外，配制的Pmk1-dsRNA-NP在接种后14天也具有保护作用(图9F)。因此，未配制的Mo特异性dsRNA可以在一定程度上保护 植物免受感染，但当dsRNA用藻酸盐-壳聚糖制剂保护时，保护作用得到改善。此外，结果表明，如果在dsRNA处理和真菌接种之间有更长的间隔，即使dsRNA被配制在纳米颗粒中，序列非特异性dsRNA的作用也不能提供对Mo感染的保护。
图6 | 喷雾诱导的短柄草保护和稻瘟病菌中的基因沉默。A 用含有指定siRNA和dsRNA的分生孢子 和 的溶液喷洒完整的三周龄 幼苗。在接种后6天确定感染症状，并使用ImageJ对坏死区域的相对大小进行量化。合并三个独立重复的结果，箱线图表示平均值和标准差。使用Kruskal-Wallis检验 评估统计学显著性，星号表示根据Dunn多重比较检验与对照组的差异(* Pmk1-dsRNA: ; * Pmk1-siRNA: )。B 短柄草叶片经dsRNA处理后真菌MoPmk1基因的沉默。用真菌靶标特异性Pmk1-dsRNA、Pmk1-siRNA或GFP-dsRNA或-siRNA的分生孢子 和 的混合物喷洒三周龄 幼苗。在接种后12小时收获叶片，并用MoGPD标准化的RT-qPCR进行分析。条形图表示三个实验的平均值与标准差。使用单向ANOVA检验 评估统计学显著性，星号表示根据Dunnett检验与对照组的差异。(** Pmk1-dsRNA: p = 0.0033; ** Pmk1-siRNA: 。Mo表示未处理的对照。
图7 | 双链RNA在藻酸盐-壳聚糖纳米颗粒(NPs)中的配制。A双链RNA-藻酸盐-壳聚糖纳米颗粒的配制过程示意图。双链RNA和藻酸盐按等比例混合形成阴离子溶液。向该溶液中加入壳聚糖，混合物涡旋并在室温下孵育 。纳米颗粒通过壳聚糖、双链RNA和藻酸盐中带正电的胺基分别与带负电的磷酸基团和羧基的静电相互作用形成。B Pmk1-双链RNA-纳米颗粒的粒径分布。通过动态光散射(DLS)对Pmk1-双链RNA-藻酸盐-壳聚糖纳米颗粒样品进行表征。每个分布的峰值是分布的中位数。数值通过对图中所示三个图表的结果进行平均计算得出。 样品 的归一化强度 、体积 和数量分布 ，▲，分别在对数直径尺度上。
双链RNA半系统地保护植物免受稻瘟病菌侵害
最后，我们测试了未配制和配制后的Pmk1-双链RNA对稻瘟病菌感染的半系统效应。在喷洒双链RNA时，完整的短柄草叶片的上部或下部被覆盖，以使叶片的一半不会直接通过表面接收RNA。间隔4天后，对整株植物接种分生孢子，在接种后6天，分析直接用双链RNA处理的叶片一半(局部处理的“LT”)或间接处理的(系统处理的，“ST”)中的坏死情况，后者可能通过植物体内可能的系统运输接收双链RNA。正如预期的那样，我们发现与未用双链RNA处理的叶片相比，LT叶片一半中的坏死病变面积明显更小。此外，在ST叶片一半中也发现了较小的面积，但仅当它们与直接处理的LT叶片一半呈向顶方向时(图10)。然而，值得注意的是，来自LT叶片的配制后的双链RNA在向基方向上也保护了ST叶片一半(图10)。这些结果证实并扩展了先前的数据，表明双链RNA可以在谷物叶片中半系统地移动 。大多数双链RNA向顶方向移动，而只有少量向基方向移动，这与外源双链RNA通过质外体途径移动的观点一致 。
图8 | 双链RNA配制对喷雾介导的短柄草叶片上稻瘟病菌防治的影响。用稻瘟病菌分生孢子和裸露的Pmk1-双链RNA(1 ng/μL)、基于壳聚糖的Pmk1-双链RNA纳米颗粒(NPs)或空纳米颗粒喷洒短柄草叶片上坏死区域的相对大小。对照植物仅喷洒分生孢子溶液(CTR)。在接种后5天用ImageJ计算坏死区域相对于整个叶片的相对大小。(A)同时用稻瘟病菌分生孢子和裸露或配制后的双链RNA或空纳米颗粒处理。B双链RNA/纳米颗粒处理与随后的稻瘟病菌接种之间间隔一天的顺序处理。C双链RNA/纳米颗粒处理与随后的稻瘟病菌接种之间间隔7天的顺序处理。将三次独立重复的结果合并，箱线图表示平均值和标准差。使用Kruskal-Wallis检验 评估统计学显著性，星号表示根据Dunn多重比较检验与对照组的差异。(C)中的成对比较使用Mann-Whitney检验。(A，****:
讨论
在本研究中，我们调查了植物病原子囊菌稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)对外源双链RNA的反应。我们使用稻瘟病菌作为侵袭性微生物病原体的代表，我们的结果为真菌双链RNA反应提供了重要的机制见解。考虑到基于RNA的抗真菌策略在农业和医学中的未来应用，了解这些反应至关重要。重要的是，我们的结果表明，双链RNA除了诱导RNA干扰外，还能诱导典型的真菌应激途径。引人注目的是，这种应激反应现象与双链RNA序列无关，在高双链RNA浓度下发生，并且与RNA干扰活性相比相当短暂(图S2；图5)。从农艺学角度来看，一种具有多种作用模式的农药可以提高作物保护策略的弹性，提高防治效率，降低对活性成分产生抗性的风险，从而有助于可持续农业实践。
表1 | 用裸露和配制的双链RNA处理后，感染稻瘟病菌的二穗短柄草叶片中的病害严重程度
| 无间隙 | 疾病严重程度 | 平均坏死面积 | 标准差 |
| 对照 | 100% | 0.0985 | 0.0507 |
| NP | 91% | 0.0895 | 0.0374 |
| Pmk1 - dsRNA | 44% | 0.0433 *** | 0.0290 |
| Pmk1 - dsRNA - NP | 34% | 0.0332 **** | 0.0193 |
| 1天间隔 | 疾病严重程度 | 平均坏死面积 | 标准差 |
| 对照 | 100% | 0.0848 | 0.0300 |
| NP | 81% | 0.0688 | 0.0215 |
| Pmk1 - dsRNA | 60% | 0.0508 *** | 0.0299 |
| Pmk1 - dsRNA - NP | 56% | 0.0472 **** | 0.0276 |
| 7天间隔 | 疾病严重程度 | 平均坏死面积 | 标准差 |
| 对照 | 100% | 0.0578 | 0.0244 |
| NP | 126% | 0.0726 | 0.0269 |
| Pmk1 - dsRNA | 72% | 0.0414 ** | 0.0176 |
| Pmk1 - dsRNA - NP | 30% | 0.0172 **** | 0.0179 |
通过使用宽尺寸范围的双链RNA，我们证实了稻瘟病菌摄取外源双链RNA的能力(图1)，此前已有报道称几种真菌具有这种能力，如禾谷镰刀菌 、长孢轮枝菌 、核盘菌 、灰葡萄孢、大丽轮枝菌、黑曲霉和绿色木霉 。与关于昆虫的报道 不同，我们的数据表明，外源双链RNA的长度对真菌摄取并不关键。相反，双链RNA在21 bp至2948 bp的尺寸范围内有效(图1A)，后者代表phi6噬菌体最小基因组片段的长度(图1B)，而在一些昆虫中，双链RNA摄取的最小长度约为 。然而，最小RNA长度可能因昆虫种类而异，在某些情况下，约20 bp的小干扰RNA已被证明是有效的；这尤其适用于蚜虫 。
成功的SIGS策略，即将双链RNA施用于叶片表面可减少真菌感染，也已在一些真菌中得到描述，如灰葡萄孢 、禾谷镰刀菌 和稻瘟病菌 。然而，鉴于这些通过喷洒双链RNA来控制植物病害的成功方法，我们有兴趣更详细地研究双链RNA对真菌的活性。SIGS实验起作用是因为双链RNA的RNA干扰效应，还是因为双链RNA对植物和/或真菌的先天免疫系统有影响，尚未得到令人满意的研究。此外，喷洒的裸RNA是否能被完整的、未分离的叶片有效摄取这一问题仍存在争议 。为了解决后一个问题，我们设计了一个实验，测试真菌从喷洒表面摄取RNA的情况(局部摄取)。这些实验的设计遵循了应用于镰刀菌 和稻瘟病菌 的实验，重要的修改是我们在实验中使用了完整的植物(而不是分离的叶片)。稻瘟病菌GTs从这些处理过的叶片中积累荧光，表明从处理过的叶片表面摄取了双链RNA(图1C)。生长的菌丝细胞壁较薄，可能通过网格蛋白介导的内吞作用摄取外源双链RNA，如在核盘菌中所示 。分生孢子的细胞壁较厚，几乎不能摄取双链RNA。与这一发现一致，我们在萌发的芽管中发现了荧光信号，而在分生孢子中没有(图1)。我们还测试了裸双链RNA或配制的双链RNA是否能赋予植物系统保护。一些报告显示裸双链RNA与木质部运输有关 ，这将遵循向顶方向。事实上，我们在用裸双链RNA处理的植物中发现了向顶保护，而只有当双链RNA用NP配制时，向基保护才变得可检测到(图10)。我们得出结论，双链RNA可以
在谷类叶片中进行半系统移动。大多数双链RNA向顶移动，而只有少量向基移动，这与施用的双链RNA分布在质外体中的观点一致 。
包括与绿色荧光蛋白和SHP同源的非靶向双链RNA在内的小RNA双链体和双链RNA对GT长度的影响与RNA序列无关，因此是非特异性的(图2)。这些结果让人想起
图9 | 喷雾介导的对短柄草叶片上稻瘟病菌的控制。完整的 植株用dsRNA或纳米颗粒(1 ng/μL)喷雾处理，并在 或接种后14天(dpt) 用稻瘟病菌分生孢子感染。植株用空纳米颗粒、裸Phi6-dsRNA或Pmk1-dsRNA，或配制的Phi6-dsRNA(Phi6-dsRNA NP)或Pmk1-dsRNA(Pmk1-dsRNA NP)处理。对照植株仅用分生孢子悬浮液喷雾(CTR)。合并了三个独立重复实验的结果。(A和D) 叶片上的感染症状。展示了来自三个独立实验的一张代表性图片。标尺 以及E 对稻瘟病菌感染的短柄草植株上坏死面积的定量。在接种后6天(dpi)用ImageJ对坏死面积相对于整个叶片的相对大小进行定量。箱线图表示平均值及标准差。用Kruskal-Wallis检验 评估统计学显著性，星号表示根据Dunn多重比较检验与对照组的差异(**: p = 0.0026；***: p = 0.0001；***: p ≤ 0.0001)。C和F 通过基于RT-qPCR分析稻瘟病菌管家基因MoGPD表达，从收获的叶片中测定相对真菌生长。短柄草管家基因BdUbi10用于标准化。柱形图表示合并的三个独立重复实验的平均值及标准差。用单向方差分析(p ≤ 0.05)评估统计学显著性，星号表示根据Dunnett多重比较检验与对照组的差异。(*:p = 0.0187；***: p = 0.0006；****: p ≤ 0.0001)。基于真核生物已经进化出基于双链RNA的识别和降解来对抗病毒的防御系统这一认识。与这一观点一致，双链RNA在植物中表现得像一种病原体相关分子模式(PAMP) 。此外，在脊椎动物中，除了其触发RNA干扰(RNAi)的活性外，双链RNA还被多种先天免疫受体感知，并在被识别后引发多种细胞内和细胞外免疫反应 。这些RNA传感器包括视黄酸诱导基因I样受体(RLRs)、蛋白激酶R(PKR)、寡腺苷酸合成酶(OASes)、Toll样受体(TLRs)和含核苷酸结合寡聚化结构域、富含亮氨酸重复序列和吡啉结构域1(NLRP1) 。因此，除了植物和脊椎动物外，真菌也对双链RNA表现出不同于经典RNAi机制的差异反应，这是合理的。
与我们发现双链RNA可以非特异性作用于稻瘟病菌一致，最初设计用于监测体内渗透胁迫和杀菌剂效果的真菌稻瘟病菌MoHOG1p::GFP报告株系 ，对双链RNA呈剂量依赖性反应，但对具有相应序列的单链RNA无反应(图4；图S1)。HOG途径和HOG1磷酸化在真菌物种间是保守的，并且依赖于快速克服渗透胁迫的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联激活。该途径在不同真菌中也与其他类型的胁迫相关，包括紫外线、高温、脂多糖和氧化胁迫 。值得注意的是，除了线性单链RNA外，环状单链RNA(circRNA)也未能在稻瘟病菌中诱导HOG途径。这一发现与最近的一份报告一致，该报告表明这种类型的RNA在哺乳动物细胞中不会诱导先天免疫激活或抗病毒反应 。值得注意的是， 双链RNA或小RNA(sRNA)的量分别相当于 和 ，比用作HOG1途径诱导阳性对照的氯化钾(0.25 M)的摩尔浓度低得多，这清楚地表明双链RNA对HOG1途径的诱导不是由渗透压引起的(图4)。
为了寻找双链RNA对稻瘟病菌非特异性作用的更具机械性的解释，我们还测试了活性氧(ROS)可能在真菌对双链RNA和小干扰RNA双链体的反应中发挥作用的可能性。真菌可以产生活性氧并在细胞内积累 ，作为对压力的第一反应。用 对绿色木霉中受损的菌丝进行染色，表明机械应激 后活性氧爆发。活性氧的形成依赖于NADPH依赖性氧化酶(NOX)，并且这些酶也被发现参与真菌分化 。活性氧激活哈茨木霉、酿酒酵母属和白色念珠菌中的HOG1途径 ，而条锈菌中适当的糖基转移酶(GT)延伸需要活性氧 ，其中 染色显示萌发菌丝中活性氧积累。值得注意的是，高浓度的活性氧对稻瘟病菌有害 。为此，我们基于染料 进行了 的染色试验。与先前的实验一致，包括聚肌胞苷酸(poly(I:C))在内的长双链RNA在稻瘟病菌中引起了非常早期的活性氧爆发(图3)。此外，与较短的双链RNA相比，较长的双链RNA产生的效果更强，但这可能是由于体外产生的长双链RNA的5’磷酸化状态。酶促产生的双链RNA含有5’三磷酸基团，而本研究中使用的化学合成双链RNA(如小干扰RNA)中不存在该基团。在植物中，较长的双链RNA，如聚肌胞苷酸(poly(I:C))，但不是小干扰RNA，触发了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的激活，这是植物免疫(PTI)的一个标志 。总之，我们的数据表明，在稻瘟病菌中，较长的双链RNA分子也比较短的序列更有效地激活应激信号通路(图2、图3)。需要进一步研究以确定这是否是真菌对双链RNA的普遍反应。然而，信号反应发生得非常快且短暂地，这与之前在其他真菌中的试验一致，在其他真菌中，受伤后几分钟内就检测到了活性氧 。我们假设双链RNA触发的活性氧爆发(图3)影响了芽管发育(图2)和Hog1p向细胞核的迁移(图4)。对植物体内双链RNA处理和稻瘟病菌感染的显微镜分析表明，经双链RNA处理的分生孢子产生了更多的气生菌丝并减少了对植物的穿透(图S3)。外源双链RNA的感知可能通过稻瘟病菌Hoglp信号级联上游的任何组分发生，具有双重作用，既对渗透胁迫作出反应，也对双链RNA作出反应。这并不奇怪，因为真菌细胞可能将双链RNA分子识别为假定的入侵者，即一种真菌病毒，从而重新编程一组基因以应对感染。在被真菌病毒感染的马拉色菌中，参与应激反应、翻译甚至磷酸化过程的基因被上调，而参与细胞分裂和代谢的基因被下调 。
图10 | 半系统RNA喷雾介导的对稻瘟病菌叶片的保护。完整植株在叶片的上半部分或下半部分喷施 双链RNA或双链RNA纳米颗粒，而另一部分则进行覆盖。4天后，对整株植株进行分生孢子喷雾接种。在接种后6天进行坏死面积分析。合并了三次独立重复的结果。使用ImageJ计算坏死面积相对于整个叶片面积的大小。箱线图表示平均值和标准差。使用Kruskal-Wallis检验 评估统计学显著性，星号表示根据Dunn多重比较检验与对照组的差异。CTR仅喷施稻瘟病菌分生孢子的对照叶片，LT在叶片上半部分或下半部分进行局部处理的叶片，ST在向顶或向基方向进行系统处理的叶片。(***下半部分LT: ；***向顶ST: )
通过配制双链RNA进行害虫管理已成为作物生产中广泛讨论且有前景的新工具 。制剂可以延长双链RNA的稳定性，还能增强其细胞摄取，从而提高功效 。壳聚糖已广泛用于临床目的和农业中作为抗菌剂，也用于缓解植物胁迫 。美国食品药品监督管理局(FDA)赋予壳聚糖“一般认为安全”(GRAS)地位(GRAS公告编号GRN 000997；相当于欧盟的基本物质)。我们能够证明用藻酸盐-壳聚糖纳米颗粒(NPs)配制的双链RNA效率更高(图8、9)。使用这种制剂，我们能够在双链RNA施用和接种之间有较长时间间隔的实验设置中表明，双链RNA的序列非特异性效应会随时间消失，因此与持续的RNA干扰活性相比，它被证明是短暂的。
众所周知，外源双链RNA在植物中诱导典型的PTI反应，从而增强对病毒感染的保护 ，而我们的工作重点是双链RNA在真菌中引发的非特异性效应，这方面的研究较少。不管怎样，这两种机制都将有助于双链RNA介导的对植物病原真菌的保护。总而言之，我们的数据为双链RNA在植物保护中的应用提出了进一步的问题。双链RNA的生物学效应比其作为天然农药的首次报道中所假设的更加多样，因此迫切需要对其作用模式和实际应用策略进行进一步研究，包括田间条件下活性成分用量的信息。
方法
植物和真菌生长条件及接种方案
本研究中使用的真菌菌株是稻瘟病菌(Mo)70 - 15(美国堪萨斯州立大学曼哈顿分校真菌遗传种质中心)。该菌株在 燕麦粉琼脂(OMA； 燕麦粉，10 mg/L琼脂)上生长。用0.002%(v/v)吐温20从在OMA平板上生长14天的Mo培养物中收获分生孢子，并通过两层Miracloth(德国默克公司)过滤。使用血细胞计数板中孢子溶液体积的 计算分生孢子浓度，并用 吐温20调整最终浓度。
短柄草(Brachypodium distachyon)品种Bd21-3种植于装有(德国韦希塔的弗鲁施托费尔土类T型土壤)的花盆中，置于生长室，温度为 (16小时光照/8小时黑暗周期)，相对湿度60%，光周期为 光子通量密度。每个花盆种6株植物，两盆作为一次实验重复。对于SIGS分析，三周龄的完整植株通过叶喷接种法接种含有 分生孢子的悬浮液，该悬浮液用 吐温20配制，将 的分生孢子溶液喷于两盆植物(一次实验重复)直至径流。缓冲液对照植株用0.002%(v/v)吐温20模拟接种，或对照植株仅接种稻瘟病菌分生孢子。或者，将dsRNA与稻瘟病菌分生孢子混合后同时喷洒。对于间隙实验，先给植株喷洒含0.002%(v/v)吐温20的dsRNA，然后接种稻瘟病菌。对于半系统保护实验，喷洒dsRNA时，用铝箔覆盖叶片的下半部分或上半部分。每个实验的详细描述见附图说明。为了量化病害症状，在接种后5或6天，剪下第二片最嫩的叶片，置于1%琼脂平板上，借助塑料棒展开以获得更好的图像。然后使用ImageJ免费软件(https://imagej.net/ij/)量化坏死区域相对于整个叶片面积的相对大小。合并三个独立实验的结果。表1中的病害严重程度通过将对照(未处理)植株的坏死面积设为病害严重程度的100%，并计算每次处理后坏死面积减少的百分比来计算。
核酸分离与RT-qPCR分析
使用DNA提取试剂盒(德国希尔德的Qiagen公司)从叶片中提取真菌DNA，通过qPCR定量真菌延伸因子1- (MoEF1- )或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(MoGPD)的水平，并用短柄草泛素-10(BdUbiquitin10)进行标准化(补充数据4)。按照制造商说明，使用Direct-zol RNA纯化试剂盒(Zymo Research公司)提取RNA。随后，按照制造商说明，用RevertAid逆转录酶cDNA合成试剂盒(赛默飞世尔科技公司)将 的RNA逆转录。在QuantStudio 5实时PCR系统(应用生物系统公司)中，使用 的cDNA进行定量RT-qPCR。使用QuantStudio软件确定Ct值，并通过 方法计算转录本数量。用于PCR和表达分析的引物对列于补充数据4中。
dsRNA的制备
针对绿色荧光蛋白(GFP)、小脯氨酸丰富蛋白(SHP)、巨噬细胞迁移抑制因子1(MIF1)和丝裂原活化蛋白激酶1(Pmk1)基因的双链RNA序列，使用MEGAscript(赛默飞世尔科技公司)按照制造商的说明进行合成。用于体外转录的MIF1和Pmk1聚合酶链式反应(PCR)模板，是从无菌培养的真菌的互补DNA(cDNA)中制备的，使用含有T7 RNA聚合酶启动子序列的引物(补充数据4)，而GFP - 双链RNA和SHP - 双链RNA的模板是从含有GFP和SHP基因的pGEM - T - easy质粒中扩增得到的，使用含有T7启动子序列 的引物。对于MIF1 - 单链RNA，PCR仅使用含有T7启动子序列 的正向引物进行。短的21个碱基对的小干扰RNA(21个碱基对的双链且带有突出端)购自欧陆芬公司(非甲基化的)，并在超纯水(Milli - Q水)中复溶。链的退火是通过在 将正义链和反义链 在 反应缓冲液(赛默飞世尔科技公司)中加热至最终浓度为 持续 ，然后将反应冷却至 持续 来进行的。研究中使用的序列列表可在补充数据3中找到，以红色字体显示用于双链RNA生产的序列。体外转录的引物显示在补充数据4中。双链RNA构建体使用SiFi软件 进行脱靶效应的设计和测试。
长的源自β - 葡萄糖苷酸酶(GUS)的双链RNA序列(488、790、981、1451和1775碱基对；补充数据2)按照制造商的说明，使用高产T7 AF488 RNA标记试剂盒(耶拿生物科学公司)进行制备和标记。使用带有荧光素染料的沉默小干扰RNA标记试剂盒(赛默飞世尔科技公司)对试剂盒提供的Phi6 - 双链RNA和21个碱基对的甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶(GAPDH)小干扰RNA进行标记。对于叶片滴落实验，490碱基对的双链RNA使用相同的试剂盒，以Cy3作为荧光团进行标记。
Phi6双链RNA在丁香假单胞菌LM2691中产生， 稳定复制噬菌体基因组 。产生的三段式phi6双链RNA基因组在最大片段中插入了卡那霉素抗性基因，由长度分别为2948、4063和7599碱基对的双链RNA分子组成。细菌在液体培养物中过夜培养后，收集细胞，并通过NucleoZol - 氯仿提取、逐步LiCl沉淀和醋酸铵沉淀纯化双链RNA。环状RNA分子由吉林大学吉森生物化学研究所的Bindereif教授提供。DNA寡核苷酸模板(Sigma - Aldrich；补充数据4)进行退火，通过体外转录(HighScribe T7高产RNA合成试剂盒，NEB)产生单链RNA，在主混合物中包括30 mM鸟苷5’-单磷酸(GMP，默克)和RNaseOut(赛默飞世尔)，在 下将反应孵育 。之后，在 下用RQ1DNase(Promega)消化DNA模板 。转录本用Monarch RNA纯化试剂盒(NEB)纯化，并用Qubit™ RNA宽范围检测试剂盒(赛默飞世尔)定量。使用 的T4 RNA连接酶(赛默飞世尔)在含有 的BSA和RNaseOut(赛默飞世尔)的 缓冲液中使RNA环化。之后，用苯酚/氯仿(Roth)进一步纯化环状RNA，然后进行乙醇沉淀。最后，从变性聚丙烯酰胺凝胶中纯化环状RNA。通过在 下用RNase R处理(Biozym) 并通过用溴化乙锭染色的变性聚丙烯酰胺凝胶可视化 来确认环化。
真菌对荧光双链RNA的摄取
如上所述，在 吐温20中分离分生孢子 ，并将 真菌悬浮液与 用荧光素标记的双链RNA(21碱基对小干扰RNA和Phi6双链RNA)或Alexa Fluor 488染料(其余双链RNA)在包裹铝箔的微量滴定板中于室温(RT)孵育 。随后，使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)分析GTs中的荧光积累。
用微球菌核酸酶(MNase，赛默飞世尔)处理双链RNA，方法是将萌发的菌丝体沉淀下来，并用 MNase最佳缓冲液(50 mM Tris - HCl pH 8，5 mM CaCl )替换 上清液。之后，用381单位的MNase处理菌丝体，并在 下孵育 。
通过用含有Cy3标记的dsRNA(490 bp；补充数据3)的 滴液 处理三周龄 植株的完整第二片最幼嫩叶片，来测定处理叶片的摄取量。处理区域在dsRNA干燥后3小时接种(hpt)，用含有100个稻瘟病菌分生孢子的 滴液进行接种。在dsRNA施加点上下约 处再设置两个接种点。在接种后48小时(hpi)进行共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)检测。
芽管伸长试验
通过监测分生孢子在疏水盖玻片(Sigma - Aldrich，美国圣路易斯)上的萌发来评估芽管(GT)伸长。将 分生孢子悬浮液与不同的dsRNA 在Eppendorf管中于振荡器中孵育 。随后，将该分生孢子悬浮液的 滴液置于盖玻片上，并在室温下再孵育 。之后，通过共聚焦激光扫描显微镜(CSLM)观察萌发的分生孢子，并用ImageJ分析芽管长度。
接种稻瘟病菌的甘蓝型油菜叶片显微镜观察
将3周龄的 植株的第二片最幼嫩叶片剪下，放置在1.5%的琼脂平板上。将20微升浓度为10,000分生孢子/毫升、含0.002%(体积/体积)吐温20的溶液，随机滴加在 叶片上作为对照，或与Pmk1-dsRNA(448碱基对)的 一起滴加。接种后2天和4天，收获叶片并进行染色。简要步骤如下:将叶片在乙醇-氯仿(4:1体积/体积)溶液中的0.15%(重量/体积)三氯乙酸中进行脱色。之后，将叶片在室温黑暗条件下用 处理 。然后，去除氢氧化钾，并用磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.4)冲洗叶片。将叶片切块置于含有0.02% Silwet L-77的PBS(pH 7.4)中的 Alexa Fluor 488染料-WGA和 荧光增白剂中，并进行三次真空渗透。样品在室温黑暗条件下在染色溶液中放置过夜。使用Axiovision荧光显微镜AXIO Imager A2(蔡司)拍摄图像。使用青色滤光片监测AF488-WGA(小麦胚芽凝集素)染色[激发波长(纳米):485±20；发射波长(纳米):515]，而对于荧光增白剂则使用紫外线设置[激发波长(纳米):365；发射波长(纳米):420]。
高渗甘油(HOG)途径分析
我们使用在EF1 - 启动子 控制下表达嵌合MoHOG1::GFP融合蛋白的稻瘟病菌报告菌株来测试HOG途径的激活。将0.002%(v/v)吐温20中的分生孢子(20/μL)与相应RNA的 一起孵育。随着时间的推移，在稻瘟病菌的分生孢子中监测MoHOG1::GFP从细胞质向细胞核的转位。与之前的研究类似，使用激活HOG途径的盐胁迫KCl(0.25 M)作为阳性胁迫对照，而抗生素遗传霉素用作阴性对照 。
共聚焦激光扫描显微镜
使用配备75毫瓦氩/氪激光器(Omnichrome，奇诺，加利福尼亚州)和水浸物镜(HCX APO L40x0.80 W U-V-l物镜)的徕卡TCS SP8共聚焦激光扫描显微镜(德国韦茨拉尔)拍摄图像。使用徕卡LAS X软件处理图像。AF488和GFP [λ激发(纳米):501；λ发射(纳米):591]。Cy3 [λ激发(纳米):565；λ发射(纳米):626]。
活性氧检测
将稻瘟病菌在燕麦琼脂(50毫克/升燕麦，10毫克/升琼脂)上培养，两周后在 吐温20中收获分生孢子，并用两层Miracloth(德国默克集团)过滤。将分生孢子浓度调整为3500个分生孢子/毫升。然后将稻瘟病菌分生孢子溶液在 艾本德管中于室温下在振荡器上孵育 。首先将稻瘟病菌丝体浸入含有不同双链RNA以及低分子量( 碱基对)聚(I:C)的管中，聚(I:C)购自德国默克集团的钾盐。在双链RNA溶液中放置2分钟后，将菌丝体浸入2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯( DCFDA)染色溶液中再放置1分钟，然后进行显微镜分析。 染色(西格玛奥德里奇)溶液的制备方法是将 重悬于 乙醇中，制成最终浓度为 的溶液。在将样品放在载玻片上之前，将它们在超纯水(Milli-Q水)中再浸泡1分钟。使用上述GFP检测方法进行共聚焦激光扫描显微镜检查。该实验重复2次，结果相似。展示了每种处理的代表性图片。
纳米颗粒中的双链RNA制剂
双链RNA被封装在双链RNA-海藻酸盐-壳聚糖纳米颗粒(NPs) 中。将溶解在0.005%(v/v)乙酸中的 壳聚糖溶液(30 kDa，90%脱乙酰度；英国格兰瑟姆生命科学有限公司)和由等浓度的双链RNA和海藻酸钠(Algogel 3001，美国嘉吉公司)组成的50纳克/微升阴离子聚合物溶液加热至 ，保持 。随后，将壳聚糖溶液以1:1.17的体积比(壳聚糖溶液:阴离子溶液)移液到阴离子溶液中，确保正电荷与负电荷的比例为1.25:1，即壳聚糖带正电荷的胺基与双链RNA和海藻酸钠带负电荷的磷酸基和羧基的比例。将所得混合物短暂涡旋并在室温下孵育 。取样品进行颗粒表征，其余纳米颗粒储存在 。此外，以相同的正电荷与负电荷比例制备海藻酸盐-壳聚糖对照纳米颗粒，因此，将体积比调整为1:0.94(壳聚糖溶液:海藻酸盐溶液)。通过在 散射角下的动态光散射测定纳米颗粒的平均流体动力学直径和尺寸分布，并通过电泳光散射(美国贝克曼库尔特公司的Delsa Nano C)测定表面电荷。还通过扫描电子显微镜研究了纳米颗粒的尺寸和形态。
统计学与可重复性
在分析不同组的样本分布和同方差性后，选择了具有Bonferroni校正的成对比较的方差分析、具有事后Tukey HSD检验和Dunnett检验的方差分析、Welch方差分析或具有Bonferroni校正的Dunn检验的Kruskal Wallis检验、双尾Student’s 检验或Mann-Whitney检验。用单样本 检验评估真菌生物量减少的百分比。每个统计分析的描述可在图注中找到。重复样本定义为生物学重复样本，通过分析 或将3个独立实验合并在一起进行统计分析得到。每个图注中描述了样本量。
报告总结
有关研究设计的更多信息，请参阅与本文相关的《自然》系列期刊报告总结。
数据可用性
本研究期间生成或分析的所有数据均包含在这篇已发表的文章[及其补充信息文件]中。图表的源数据可在补充数据1中找到。本研究中使用的所有序列和引物均包含在补充数据2 - 4中。
收到日期:2024年6月19日；接受日期:2025年1月15日；
在线发表日期:2025年1月25日
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稻瘟病菌,真菌,dsRNA,RNAi
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