来自两种进化距离遥远的酵母的肌动蛋白丝的快速老化和解聚
发布时间：
2026-07-02 21:29
来自两种进化距离遥远的酵母的肌动蛋白丝的快速老化和解聚
英格丽德·比洛特 - 肖马丁， 雨果·维奥兰德， 奥黛丽·吉洛坦， 阿尔菲·米肖洛， 安托万·热古， 以及纪尧姆·罗梅 - 勒莫内1,4,*
巴黎西岱大学，法国国家科学研究中心，雅克·莫诺研究所，巴黎75013
艾克斯 - 马赛大学，法国国家科学研究中心，地中海生物学研究所，图灵生命系统中心，马赛，法国
法国国家科学研究中心国际研究实验室“连接力学生物学与医学”(IRL 3639 BMC)，新加坡国立大学力学生物学研究所
新加坡国立大学工程驱动1号5A，新加坡117411
主要联系人
*通讯作者:ingrid.billault@ijm.fr(I.B.-C.)，antoine.jegou@ijm.fr(A.J.)，romet@ijm.fr(G.R.-L.)
https://doi.org/10.1016/j.celrep.2026.117473
摘要
不同物种肌动蛋白丝自组装的异同有助于我们理解其进化。然而，这一基础知识在很大程度上并不完整。在这里，我们系统地表征了来自进化上相隔五亿年的两种酵母物种酿酒酵母和粟酒裂殖酵母的肌动蛋白的组装动力学，并将它们与十亿年前分化的、经过充分研究的兔肌肉肌动蛋白进行比较。我们发现，在ATP状态下，两种酵母肌动蛋白在丝的带刺末端的行为与哺乳动物肌动蛋白惊人地相似。相比之下，处于ADP - Pi和ADP状态的酵母肌动蛋白丝的解聚速度比其哺乳动物对应物快几倍，并且它们释放无机磷酸盐的速度快20倍以上。我们表明，组氨酸73上缺乏甲基化在很大程度上解释了酵母肌动蛋白丝这种更快的老化现象。我们还揭示了两种酵母肌动蛋白之间的生化和机械差异。我们的发现表明，肌动蛋白在物种间比以前认识到的更加多样且具有生化特异性。
引言
在活细胞中，肌动蛋白丝和肌动蛋白结合蛋白(ABP)形成动态网络，支持诸如分裂、运动和极性等基本功能。 丝状肌动蛋白(F - 肌动蛋白)由单体球状蛋白肌动蛋白(G - 肌动蛋白)组装成极性丝形成，具有所谓的带刺末端和尖端末端，前者更具动态性。G - 肌动蛋白含有一个ATP分子，该分子在掺入丝后很快水解成ADP·Pi。 随后无机磷酸盐(Pi)被释放，产生ADP - 肌动蛋白。F - 肌动蛋白的三种不同核苷酸状态在带刺末端和尖端末端都具有不同的组装动力学。
肌动蛋白是最保守的蛋白质之一，在整个真核生物界广泛表达，并且在古细菌中有同源物。 一些生物体，如常见的酵母，只表达一个肌动蛋白基因。其他生物体表达多种肌动蛋白异构体，如哺乳动物通常有六种不同的异构体 或植物可以表达多达21种不同的异构体。 兔子的α - 骨骼肌肌动蛋白异构体(OcACTA1)，或来自鸡的100%氨基酸序列相同的同源物，由于其在肌肉中的高丰度和良好的纯化产量，已成为该领域的标准。 我们对肌动蛋白动力学的大部分了解来自使用来自这个单一基因的肌动蛋白的体外研究。
尽管肌动蛋白高度保守，但将OcACTA1的结果外推到其他肌动蛋白直系同源物时必须谨慎。值得注意的是，异源肌动蛋白并非系统地可互换。 特别是，尽管氨基酸同一性为90%，用粟酒裂殖酵母肌动蛋白基因(SpAct1)替代酿酒酵母肌动蛋白(ScAct1)是不可行的。
肌动蛋白的不可互换性部分原因肯定是一些肌动蛋白结合蛋白(ABP)具有亚型特异性。例如，来自硕大利什曼原虫的丝切蛋白不与OcACTA1细丝结合，尽管利什曼原虫的丝切蛋白 - 肌动蛋白细丝与它们的哺乳动物对应物惊人地相似。 肌动蛋白亚型组装特性的内在差异可能也导致了它们的不可互换性。当研究不同的肌动蛋白亚型时，这种差异就很明显。例如，与哺乳动物在进化上距离较远的顶复门寄生虫的肌动蛋白细丝，由于更快的解聚速率和更高的组装临界浓度，周转速度要快得多。 这些内在的动力学差异对于我们理解肌动蛋白细胞骨架及其进化至关重要，而目前这方面的了解仍然非常不完整。
在这方面，两种远缘酵母，酿酒酵母(S. cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(S. pombe)特别有趣。它们大约在5亿年前彼此分化 ，并且在两倍于此的时间之前与后生动物分化 ，因此探索了真核生物树中的一个中间区域。此外，它们都已被用作模式生物数十年，易于进行快速基因操作，并且具有特征明确的肌动蛋白网络。 虽然已知它们的肌动蛋白组装动力学与标准的OcACTA1不同，但缺乏反应速率的量化和系统比较。例如，据报道ScAct1和SpAct1细丝组装得更快，但这个特征归因于更有效的细丝成核，并且伸长率尚未测量。 同样，据报道SpAct1和ScAct1细丝能快速释放无机磷酸(Pi)，但尚未测量反应速率。
在这里，我们旨在利用最近用于生产肌动蛋白的技术 以及在单细丝水平监测其组装动力学的技术 ，使用低比例的荧光标记核苷酸来填补这一空白。
结果
来自酿酒酵母和粟酒裂殖酵母的ATP - 肌动蛋白与哺乳动物肌动蛋白聚合速率相同
酿酒酵母和粟酒裂殖酵母分别有单个肌动蛋白基因(分别编码ScAct1和SpAct1)，它们与六个哺乳动物肌动蛋白基因具有密切的氨基酸序列同一性，这总体上反映了肌动蛋白的异常保守性(图S1)。特别是，它们分别与大多数体外肌动蛋白研究中使用的α - 骨骼肌穴兔(兔子)同源物OcACTA1具有87％和89％的氨基酸序列同一性(图1A；表S1)。ScAct1和SpAct1彼此之间的相似性仅比与OcACTA1略高，氨基酸序列同一性为90％。尽管在序列上有这些强烈的相似性，但在体内用一个直系同源物替代另一个是致命的。
为了研究酿酒酵母(S. cerevisiae)和粟酒裂殖酵母(S. pombe)中两种不同的酵母肌动蛋白的肌动蛋白聚合特性，我们在毕赤酵母(Pichia pastoris) 中进行重组表达，使其具有N端乙酰化且无组氨酸73甲基化，这与体内情况一致(表S2)。我们使用低比例的ATP-ATTO488监测肌动蛋白丝 ，当肌动蛋白的直接化学标记具有挑战性且不会改变丝伸长 和释放Pi的速率时，这种方法很有用 。然后，我们通过微流体辅助TIRF显微镜 (图1B)在不同肌动蛋白浓度下研究它们的带刺端聚合动力学 (STAR方法)。使用这种方法，血影蛋白-肌动蛋白种子锚定在表面，从它们生长出的丝通过流动方便地排列(图1C)，便于监测它们的带刺端随时间的伸长(图1D；视频S1)。这使我们能够测量伸长速率作为肌动蛋白单体浓度的函数(图1E)。
在高肌动蛋白浓度下，聚合速度足够快，可以认为带刺端主要处于ATP状态，线性拟合得出带刺端ATP-肌动蛋白的结合和解离速率常数 和 (图1E)。令人惊讶的是，SpAct1和ScAct1的这些反应速率与已发表的OcACTA1的反应速率非常相似 (图1E；表1)，分别为 ，以及 ，以及 ，以及 。据我们所知，这些速率常数以前尚未测量，但我们的结果与早期对酿酒酵母的大量分析一致，在那里观察到更快的聚合，但归因于成核而不是伸长 ，以及对粟酒裂殖酵母肌动蛋白的大量分析，其中伸长速率未量化，但推测与哺乳动物肌动蛋白相似 。
综上所述，这些结果表明，两种不同的酵母酿酒酵母和粟酒裂殖酵母彼此之间以及与经过充分研究的后生动物肌动蛋白具有几乎相同的ATP-肌动蛋白带刺端动力学。这远非预期，因为肌动蛋白异构体上的单个点突变就足以极大地改变其伸长速率 。尽管它们的速率常数几乎相同，但我们发现这些肌动蛋白直系同源物并非完全可互换:将等体积的OcACTA1/SpAct1、OcACTA1/ScAct1或SpAct1/ScAct1溶液混合，导致丝伸长比未混合的直系同源物慢13%-19%(图1G-1I和S2)。然而，由来自两个不同物种的肌动蛋白制成的丝似乎并没有明显更脆弱(图S3)。
酿酒酵母和粟酒裂殖酵母的肌动蛋白丝比哺乳动物的肌动蛋白丝解聚快得多
在低肌动蛋白浓度下，我们发现SpAct1和ScAct1丝迅速解聚，且速率相似(图1E)。在溶液中不存在G-肌动蛋白的情况下，丝达到一种稳态，即它们以ADP-肌动蛋白的形式解聚，速率为 。我们发现本研究中使用的两种酵母肌动蛋白的解聚速度比兔α-骨骼肌肌动蛋白快约4.5倍(图1E和1F；表1):SpAct1和ScAct1的解聚速率分别为 和 ，而在相同条件下OcACTA1的解聚速率为 (类似于 的已发表值)。
通过比较重组肌动蛋白和天然肌动蛋白，我们证实解聚差异并非来自潜在的翻译后修饰(PTM)(图S4)。我们还证实升高温度不会影响不同肌动蛋白在解聚速率方面的排名(图S5)。
接下来，我们试图研究酿酒酵母和粟酒裂殖酵母ADP-Pi-肌动蛋白的解聚速率。ADP-Pi-肌动蛋白的情况更为复杂，因为已知至少在哺乳动物肌动蛋白中，带刺端亚基会快速结合并释放可溶性Pi。 因此，末端亚基可以以ADP-Pi-肌动蛋白或ADP-肌动蛋白的形式从丝上解离(图S6)。于是，我们在无肌动蛋白的情况下，用不同浓度的磷酸盐监测解聚情况(图2A和2B；视频S2)。所得的滴定曲线(图2C)提供了相应的平衡解离常数 BE(STAR方法)，表明与OcACT1相比， 对酵母肌动蛋白丝带刺端的亲和力较弱(表1)。我们将在最高Pi浓度下测得的解聚速率用作平台值的估计(图2D；表1)， 和ScAct1的解聚速率分别为 和 ，OcACTA1的解聚速率为 (类似于已发表值 )。与ADP-肌动蛋白亚基的解聚不同，ADP-Pi-SpAct1和ScAct1的解聚速率有很大差异。它们也比OcACTA1的解聚速率大得多:SpAct1快约64倍，ScAct1快约27倍。
图1. 酿酒酵母和粟酒裂殖酵母肌动蛋白与兔骨骼肌肌动蛋白的ATP-肌动蛋白动力学无明显差异，但ADP-肌动蛋白解聚速率更快
(A) 本研究中使用的三种肌动蛋白ScAct1(Uniprot P600P10)、SpAct1(Uniprot P10989)和OcACTA1(Uniprot P68135)的系统发育树。AtACT1(Uniprot POCJ46)用作外类群。比例尺:每个氨基酸的平均替换数。
(B) 用于研究肌动蛋白丝动力学的TIRF辅助微流控实验。F缓冲液(黄色)中的ATP-ATT048 G-肌动蛋白(绿色)流入PDMS微流控室，并从吸附在表面的血影蛋白-肌动蛋白种子(灰色)聚合，形成丝，其尖端正锚定在表面，动态带刺端通过TIRF显微镜监测。
(C) 使用 (B) 中概述的方法获得的典型视野(裁剪后)，使用 0.5 M SpAct1 和 0.25 M ATP - ATTO488(视频 S1)。
(D) (C) 中勾勒出的细丝(黄色线)在采集过程中的动态光密度图。伸长率是沿着细丝带刺末端的线(黄色线)的斜率。
(E) 绘制了 SpAct1(蓝色)和 ScAct1(品红色)的带刺末端聚合速率与肌动蛋白浓度的函数关系。每个点是至少四个独立实验的平均值，每个实验有 30 次细丝伸长，如 (D) 中那样进行量化(误差条:标准差)。在 肌动蛋白以上进行线性回归，得到 (斜率)和 ( - 截距)(表 1)。
(F) 解聚速率 对应于 (E) 中 ScAct1 和 SpAct1 在 0 μM 肌动蛋白时的值，以及图 2C 中 OcACTA1 在 0 mM 磷酸盐时的值(表 1)。在细丝聚合后测量。每个点是一个独立重复的平均值。黑色条表示重复的平均值。未配对学生 t 检验； 。
(G - I) OcACTA1(黑色 - [G] 和 [H])、SpAct1(蓝色 - [G] 和 [I])、ScAct1(品红色 - [H] 和 [I])的纯溶液及其各自 50/50 混合物的带刺末端聚合速率。纯溶液和混合溶液同时聚合以确保相同的实验条件(图 S2A)。每个点是 细丝的一个独立重复的平均值。线连接来自同一采集的点。另见 图 S1 - S5 和表 S1。
改变磷酸盐浓度会影响溶液的离子强度及其溶解蛋白质的能力(离子特异性，霍夫迈斯特效应)，这本身可能会潜在地影响解聚速率。为了控制这些可能的影响，我们测量了随着 KCI 浓度增加以及随着 浓度增加时 SpAct1 和 ScAct1 的解聚速率， 与 具有相似的促溶性质 。我们发现它们对 SpAct1 和 ScAct1 都有适度影响(图 S7A 和 S7B)。
表 1. 结果总结
| 常数 | 反应(图S6) | 肌动蛋白类型 | 值 | 来源 |
| 三磷酸腺苷 | (1) | OcACTA1 | 11.6±1.2微摩尔¯1秒 | 波拉德5 |
| SpAct1 | 11.6±0.7微摩尔¯秒 | 本研究 | ||
| ScAct1 | 10.0±0.7微摩尔^I秒^1 | 本研究 | ||
| SpAct1 H73me | 11.7±0.7微摩尔^1秒 | 本研究 | ||
| 三磷酸腺苷 | (2) | OcACTA1 | 1.4±0.8 s^1 | 波拉德5 |
| SpAct1 | 1.51±0.47秒¯ | 本研究 | ||
| ScAct1 | 0.97±0.52秒¯ | 本研究 | ||
| SpAct1H73me | 1.09±0.55秒¯ | 本研究 | ||
| 二磷酸腺苷 - 磷酸 | (3) | OcACTA1 | 0.10±0.01秒¯1 | 本研究 |
| SpAct1 | 6.39±0.93秒¯ | 本研究 | ||
| ScAct1 | 2.73±0.13秒¯ | 本研究 | ||
| SpAct1H73me | 2.77±0.08秒¯ | 本研究 | ||
| (4) | OcACTA1 | 6.5±0.2秒¯1 | 本研究 | |
| SpAct1 | 27.4±1.4 s | 本研究 | ||
| ScAct1 | 30.6±0.9 s | 本研究 | ||
| SpAct1H73me | 29.1±0.8 s^1 | 本研究 | ||
| (5) | OcACTA1 | 0.0068±0.0021 s^1 | 热古等人 | |
| SpAct1 | 0.159±0.058 s^1 | 本研究 | ||
| ScAct1 | 0.583±0.127秒¯1 | 本研究 | ||
| SpAct1H73me | 0.0277±0.0022秒¯1 | 本研究 | ||
| (6) | OcACTA1 | 1.8±0.6 s^1 | 热古等人 | |
| SpAct1 | 7.80±4.11秒¯ | 本研究 | ||
| ScAct1 | 4.42±2.87秒¯ | 本研究 | ||
| SpAct1H73me | 8.46±0.73秒¯ | 本研究 | ||
| (7) | OcACTA1 | 0.56±0.21毫摩尔 秒 | 本研究 | |
| SpAct1 | 本研究 | |||
| ScAct1 | 0.46±0.30毫摩尔^i秒^ | 本研究 | ||
| SpAct1H73me | 本研究 | |||
| - | OcACTA1 | 3.2±0.5毫摩尔 | 本研究 | |
| SpAct1 | 14.9±3.6毫摩尔 | 本研究 | ||
| ScAct1 | 9.7±0.5毫摩尔 | 本研究 | ||
| SpAct1H73me | 6.8±0.3毫摩尔 | 本研究 | ||
| - | OcACTA1 | 9.59±0.59微米 | 本研究 | |
| SpAct1 | 8.48±0.81微米 | 本研究 | ||
| ScAct1 | 7.46±0.76微米 | 本研究 | ||
| SpAct1H73me | 8.52±0.76微米 | 本研究 |
对于本研究中测量的所有反应速率，所示值为平均值 标准差(在 次重复实验中)，但(1)和(2)除外，它们是线性拟合的结果，表示95%置信区间。有关不同反应速率的示意图，请参见图S6。
综上所述，这些结果表明，对于 . 酿酒酵母和 . 裂殖酵母而言，ADP - 肌动蛋白丝和 ADP - Pi - 肌动蛋白丝的解聚速度明显快于哺乳动物骨骼肌肌动蛋白。
酿酒酵母和粟酒裂殖酵母的肌动蛋白丝释放无机磷酸的速度比哺乳动物肌动蛋白丝快得多
肌动蛋白动力学的一个重要方面是从ADP-Pi状态到ADP状态的转变，这使得肌动蛋白丝稳定性降低，并在控制调节蛋白的结合中起重要作用。 因此，我们接下来试图研究酵母肌动蛋白释放无机磷酸(Pi)的速度有多快。为此，我们像之前一样在磷酸盐缓冲液中聚合肌动蛋白丝，但随后切换到不含磷酸盐的缓冲液进行解聚(图2E)。由于 低于 ，随着Pi从肌动蛋白丝的亚基中逐渐释放，我们观察到解聚速率随时间增加(图2F)。通过分析这种加速过程(图S8)，我们可以提取Pi释放速率 (STAR方法)。
图2. 酿酒酵母和粟酒裂殖酵母的ADP Pi-肌动蛋白丝比兔α-骨骼肌肌动蛋白丝解聚和释放无机磷酸更快
(A) TIRF辅助微流控实验，用于研究在不含肌动蛋白的磷酸盐缓冲液(橙色)中ADP-Pi-肌动蛋白丝的解聚。
(B) 如(A)中实验所示的肌动蛋白丝的动态记录图，使用 M SpAct1、 M ATP-atto488和 M磷酸盐(视频S2)。
(C) 以磷酸盐浓度为函数绘制的SpAct1(蓝色)、ScAct1(品红色)和OcACTA1(黑色)的带刺端解聚速率。插图:OcACTA1数据的重新缩放图。至少三个独立实验的平均值±标准差，每个实验至少有15根如(B)中所述进行量化的肌动蛋白丝。线为双曲线拟合(STAR方法)。另见图S7。
(D) 解聚速率 对应于(C)中SpAct1和ScAct1在 磷酸盐浓度下以及OcACTA1在150 mM磷酸盐浓度下的测量值(表1)。每个点是独立重复实验的平均值，黑色条是重复实验的平均值。未配对学生 检验； 。
(E) TIRF辅助微流控实验，用于研究肌动蛋白丝在磷酸盐缓冲液(橙色)中伸长后，在不含肌动蛋白的F缓冲液(黄色)中解聚时的磷酸盐释放情况。
(F) 如(E)中实验所示的肌动蛋白丝的典型动态记录图，伸长过程中使用0.8 µM SpAct1、0.4 µM ATP-atto488和50 mM磷酸盐。在F缓冲液(无磷酸盐)中的解聚随着肌动蛋白丝中ADP-Pi含量的减少而加速。
(G) 解释本实验中测量的不同速率的示意图。解聚速率 以每秒亚基数为单位。
(图例见下一页)
我们发现，与哺乳动物相比，裂殖酵母中Pi从F-肌动蛋白的释放速度快23倍，而酿酒酵母 中则快86倍: 和 分别对应 Act1和 Act1(图2H；表1)，与OcACTA1的 相比(Jégou等人 的速率，与其他研究 一致)。两种酵母肌动蛋白中的Pi释放有所不同，ScAct1的释放速度比SpAct1快4倍。我们发现SpAct1与OcACTA1相比增加了23倍，这与早期的大量实验结果一致，早期实验估计增加了10到100倍，但由于时间分辨率有限，缺乏精确性。 分析解聚随时间的加速情况(图2F和S8；STAR方法)还可以得出ADP-Pi-肌动蛋白丝的解聚速率， ，对应解聚开始时，以及ADP-肌动蛋白丝的解聚速率， ，对应肌动蛋白亚基都释放出Pi后的较晚时间。根据定义， 与 相同，我们发现的SpAct1的 和ScAct1的 的值(图2I)与我们之前对 的测量结果(图1F)相符。
相比之下， 比 更快，正如之前在兔骨骼肌肌动蛋白中所揭示的那样。 这是因为，如前所述，带刺末端的肌动蛋白亚基以 的速率释放其磷酸根离子，比丝状体的其他部分更快。因此，ADP - Pi - 肌动蛋白的解聚可以通过两条途径发生:(1) ADP - Pi 亚基作为 ADP - Pi - 肌动蛋白从带刺末端解离，或者 (2) 它首先释放其磷酸根离子，然后作为 ADP - 肌动蛋白解离(图 2G)。我们发现，对于 而言， 比 明显更快；图 2J)。知道 和 后，我们可以计算出 ，其确实比 快得多(图 2K；表 1)。我们发现，对于 Act 1 ， 几乎是 Act 1 的两倍快，尽管具有较弱的统计学显著性 ，并且两者都明显快于 。
由于我们已经确定了 在带刺末端的平衡解离常数 (图 2C)，我们可以用它来计算结合速率常数 。我们发现三种肌动蛋白种类的值非常相似(表 1)。
为了验证在切换到解聚条件时，肌动蛋白丝确实完全处于 ADP - Pi 状态，我们用不同浓度的磷酸盐缓冲液重复了实验。我们发现在用 50 或 200 mM 磷酸盐聚合后从解聚中提取的速率没有显著差异(图 2H - 2K)。这个结果表明，在 时，丝状体的大部分已经被磷酸根离子饱和(与带刺末端不同；图 2C)，并验证了我们的测定方法。
总之，这些结果表明，粟酒裂殖酵母和酿酒酵母的肌动蛋白丝从丝状体内部的亚基以及带刺末端释放磷酸根离子的速率都比哺乳动物肌动蛋白丝快。
酵母肌动蛋白更快的磷酸根离子释放速率主要是由于组氨酸 73 甲基化的缺失
接下来，我们试图确定为什么ScAct1和SpAct1的Pi释放速率比OcACTA1快。一个有吸引力的假设是，已知酵母中不存在组氨酸73甲基化，而组氨酸73甲基化是后生动物肌动蛋白中一种重要且普遍存在的翻译后修饰(图3A；表S2)，最近研究表明，从 兔肌动蛋白中去除该修饰会加速Pi释放。 在酿酒酵母中，组氨酸73的突变被证明会影响体外肌动蛋白组装 ，最近的高分辨率冷冻电镜结构表明，组氨酸73附近的氢键可能会影响Pi释放。
为了直接在 粟酒裂殖酵母中验证这一假设，我们在表达SETD3的巴斯德毕赤酵母菌株中表达SpAct1，SETD3是负责哺乳动物肌动蛋白组氨酸73甲基化的酶。 通过质谱分析，结果表明所产生的肌动蛋白在组氨酸73上100%甲基化。 同样，通过质谱分析，我们验证了在SETD3存在的情况下重组表达的绝大多数SpAct1在组氨酸73上甲基化(图S9)。我们将这种肌动蛋白称为SpAct 。
然后，以与SpAct1和ScAct1相同的方式评估SpAct1 产生的肌动蛋白组装动力学。我们在肌动蛋白丝的尖端测量的ATP-肌动蛋白的动力学速率常数 以及 ，与SpAct1和OcACTA1的速率常数没有区别(图3B；表1)。ADP-肌动蛋白在肌动蛋白丝尖端的解离速率常数 ，与SpAct1的也没有显著差异，并且与OcACTA1相比同样加速(图3B；表1)。然而，SpAct1H73me肌动蛋白丝尖端对Pi的亲和力比其未甲基化的对应物高约两倍，这是由于Pi在肌动蛋白丝尖端的结合更快且解离不受影响(图3C和3D；表1)。SpAct1 肌动蛋白丝尖端还显示出较低的ADP-Pi-肌动蛋白解离速率 (与未甲基化的 的 相比)，但仍比OcACTA1快得多(表3)。离子效应和霍夫迈斯特效应与其未甲基化的对应物一样适度(图S7C)。
有趣的是，组氨酸73甲基化使粟酒裂殖酵母肌动蛋白丝的无机磷酸释放速率降低了约6倍: 对应 ，相比之下 对应 (图3D)。 的无机磷酸释放速率仍比OcACTA1快约4倍。 哺乳动物β肌动蛋白在氨基酸序列同一性上比OcACTA1更接近 Act1(图S1)，据报道其从肌动蛋白丝释放无机磷酸的速率与 相同或快2.5倍 ，在这方面它与 相似。
总之，这些结果表明，组氨酸73甲基化的缺失是粟酒裂殖酵母和哺乳动物肌动蛋白在从肌动蛋白丝释放无机磷酸方面存在差异的主要原因，而对我们测量的其他速率几乎没有影响。
(H - K) 磷酸释放速率 (H)、最终解聚速率 (I)、初始解聚速率 (J)以及带刺端磷酸释放速率 的曲线图，分别对应在50和 磷酸盐条件下聚合后的粟酒裂殖酵母肌动蛋白(SpAct1，蓝色)和酿酒酵母肌动蛋白(ScAct1，品红色)。虚线表示在 的OcACTA1所获得的值或本研究中测量的值(I，J)，以供参考。(H，I，J)中的每个点是解聚速率与时间拟合的结果，至少对40条肌动蛋白丝进行了平均(图S8)。(K)中的每个点是使用 、 (图1F)的值以及(G)中的方程计算得出的，该方程考虑了ADP·Pi - 肌动蛋白从肌动蛋白丝带刺端解离的两条途径。黑色条表示重复实验的平均值。未配对学生 检验；ns: ；* ；*** ；*** 。另见图S10。
图3. 粟酒裂殖酵母肌动蛋白的组氨酸73甲基化减缓无机磷酸释放速率
(A) 丝状体内酿酒酵母F - 肌动蛋白亚基(PDB 9go5) 的骨架。未甲基化的H73残基用绿色突出显示。粉红色的M16存在于酿酒酵母、粟酒裂殖酵母以及β/γ哺乳动物肌动蛋白中，但在哺乳动物α - 骨骼肌肌动蛋白中被L16取代。黄色部分是143、L269和S324残基，它们在粟酒裂殖酵母和酿酒酵母中相同，但在哺乳动物的α - 骨骼肌、β和γ细胞质肌动蛋白中分别变为V43、M269和T324。位于W环中的酿酒酵母中的A167、F169和S170残基与穴兔和粟酒裂殖酵母中的对应残基不同，用品红色表示。
(B)以SpAct1 (绿色)的肌动蛋白浓度为函数绘制的带刺末端聚合速率。SpAct1(蓝色)和ScAct1(品红色)的值从图1E复制以供参考。每个有30根细丝的 个独立实验的平均值 标准差。高于 肌动蛋白的线性回归得出 (斜率)和 。 肌动蛋白处的值得出 (表1)。
(C)以SpAct1 (绿色)的磷酸盐浓度为函数绘制的带刺末端解聚速率。SpAct1(蓝色)和ScAct1(品红色)的值从图2C复制以供参考。每个有 根细丝的 个独立实验的平均值 标准差。 磷酸盐处的数据用于 (表1)。线条为双曲线拟合，得出平衡解离常数 (STAR方法)。
(D) SpAct1(蓝色)、ScAct1(品红色)和 SpAct1 (绿色)的磷酸盐释放速率 、解聚速率 和 以及倒刺端磷酸盐释放速率 。SpAct1 和 ScAct1 的数据是图 2H - 2K 的汇总数据，用于比较。由于 SpAct1 和 ScAct1 在 50 或 200 mM 磷酸盐条件下聚合无差异，因此 SpAct1 的实验在 50 mM 下进行。虚线表示在 中获得的 OcACTA1 值或本研究中测量的值 ，以供参考。每个点是解聚速率随时间拟合的结果，对 根细丝取平均值。黑色条为重复实验的均值。非配对学生 检验；ns: ；* ；* ；* ；*** 。另见图 S1、S5 和 S7。
图4. 与兔肌动蛋白相比，酵母肌动蛋白丝的持久长度降低，与组氨酸73甲基化无关
(A)用于研究肌动蛋白丝持久长度的方法。预聚合的ATP - ATT0488 F - 肌动蛋白沉积在聚 - L - 赖氨酸包被的盖玻片上。在溶液干燥前，通过荧光显微镜快速记录表面附着细丝的快照。
(B)使用A中方法对OcACTA1、SpAct1、ScAct1和SpAct1 的典型图像。
(C)不同肌动蛋白的平均余弦角相关性与肌动蛋白丝上两点间曲线距离的函数关系。数据点为来自 次独立实验的平均值，每次实验有 条丝。阴影区域:标准差。线条为指数拟合(STAR方法)。
(D)OcACTA1(黑色)、SpAct1(蓝色)、ScAct1(品红色)和SpAct1 (绿色)的持久长度Lp。每个点来自至少323条丝的余弦相关性拟合。黑色条为重复实验的平均值。未配对学生 检验；ns: ；** ；*** ；*** 。
酵母肌动蛋白丝比哺乳动物肌动蛋白丝略灵活
肌动蛋白丝的带刺端解离速率部分反映了丝内肌动蛋白亚基之间键的强度，这与丝的机械刚度有关。这使我们想知道SpAct1和ScAct1丝是否比OcACTA1丝更灵活。先前的文献表明酿酒酵母肌动蛋白丝可能比其哺乳动物对应物更灵活。 我们试图证实这一点，并询问这种特性在酿酒酵母之外的酵母中是否保守。为此，我们使用了一种简单的测定方法，将肌动蛋白丝粘贴到涂有聚-L-赖氨酸的盖玻片上(图4A)，并通过拟合丝上的平均角余弦相关性来确定它们的持久长度Lp(图4B - D；STAR方法)。有趣的是，在我们的条件下，我们发现 Act 1丝， ，比 Act1丝略灵活但显著更灵活， (图4D)。两种酵母肌动蛋白丝都比OcACTA1丝更灵活，我们测量OcACTA1丝的Lp = 。组氨酸73的甲基化并未挽救持久长度的这种降低，这似乎并未改变SpAct1丝的持久长度(图4D)。
讨论
通过直接比较粟酒裂殖酵母和酿酒酵母的肌动蛋白丝，我们表明尽管它们在进化上有距离，但它们具有惊人相似的组装动力学。这两种肌动蛋白在解聚动力学上略有不同，且不是以系统的方式:例如，在ADP - Pi - 肌动蛋白中粟酒裂殖酵母的解离速率更高，在ADP - 肌动蛋白中酿酒酵母的解离速率更高(表1)。这些反应速率常数对于旨在理解两种酵母中肌动蛋白驱动机制差异(如内吞作用)的研究应该是有价值的。 这两种肌动蛋白在丝的刚度上也有所不同，酿酒酵母肌动蛋白丝的持久长度较低。氨基酸组成的差异可能解释了我们测量到的动力学和力学差异。例如，介导丝中亚基之间纵向接触的W环包含在两种酵母中不同的残基(图3A中以品红色显示)，这可以部分解释为什么酿酒酵母肌动蛋白丝更灵活 (图4)。事实上，在已知的真核生物肌动蛋白中，这种残基差异似乎是酿酒酵母特有的(图S1)，表明增加的灵活性可能是 酿酒酵母的一个特征。
与广泛研究的兔α-骨骼肌肌动蛋白相比，我们发现，在 条件下，来自两种酵母的肌动蛋白在ATP-肌动蛋白的带刺末端以难以区分的反应速率常数组装。由于肌肉ATP-肌动蛋白带刺末端的伸长受扩散限制 ，且肌动蛋白的伸长速率可能受单点突变影响，因此相同的结合速率常数 并不在预期之内。 此外，相同的解离速率常数 表明，尽管介导这种结合的残基存在差异(图3A)，但末端亚基的结合能与肌肉肌动蛋白丝带刺末端的结合能非常接近。然而，在体内，肌动蛋白丝的伸长速率不会相同，特别是由于这些生物体之间温度的差异。这表明，在十亿年的进化过程中使这些速率几乎保持相同的巨大限制并不仅仅反映了肌动蛋白丝在细胞中的生物学作用。未来的研究应有助于确定生理和化学因素在限制这些速率方面的作用。例如，了解来自其他物种的纯化肌动蛋白丝在 条件下是否也以相同的速率伸长将是很有趣的。如已报道的那样， 酵母肌动蛋白和兔肌肉肌动蛋白可以共聚形成杂合丝。在这里，我们发现这些杂合丝伸长较慢(图1G - 1I和S2)，这表明来自不同物种的亚基之间的键较弱。然而，在我们的实验条件下，这些混合物种界面看起来并不特别脆弱(图S3)。
与伸长相反，我们发现，与哺乳动物的肌动蛋白丝相比，酵母肌动蛋白丝在ADP - Pi - 和ADP - 肌动蛋白中解聚明显更快。虽然在本研究中所做的那样，在没有肌动蛋白单体的情况下解聚在细胞中不太可能发生，但这些速率常数揭示了这三种物种的肌动蛋白之间的根本差异。与哺乳动物相比，在两种酵母肌动蛋白中发现的氨基酸差异(图3A中黄色标记的残基)可能导致亚基的结合较弱，特别是位于D环中的异亮氨酸43(哺乳动物中的缬氨酸)。
酵母肌动蛋白丝释放无机磷酸根(Pi)的速度也比哺乳动物肌动蛋白丝快得多，这在很大程度上是因为酵母中组氨酸 73 没有发生甲基化(如图 3A 中绿色所示)。虽然哺乳动物的α - 骨骼肌肌动蛋白和β - 肌动蛋白的组氨酸 73 都会发生甲基化，但观察发现后者释放 Pi 的速度快 2.5 倍 ，这表明其他残基也参与了这一过程。一个可能的候选残基是甲硫氨酸 16(如图 3A 中粉色所示)，它存在于酵母肌动蛋白和哺乳动物β - 肌动蛋白的核苷酸结合口袋中，但不存在于α - 骨骼肌肌动蛋白中(α - 骨骼肌肌动蛋白中是亮氨酸 16)，并且根据结构数据，它可能有利于 Pi 释放。 组氨酸 73 甲基化的重要性凸显了在体外控制关键翻译后修饰(PTMs)的必要性，而且应该注意的是，在昆虫细胞中表达的重组肌动蛋白可能会被人为地进行组氨酸 73 甲基化。在粟酒裂殖酵母肌动蛋白中，组氨酸 73 甲基化通过增加 Pi 进入正端亚基的结合速率常数 ，提高了 Pi 与正端肌动蛋白亚基的亲和力(图 3C；图 3D；表 1)。组氨酸 73 甲基化还会减缓 ADP - Pi - 肌动蛋白的解聚(图 3C；表 1)。
在酵母中，磷酸根离子(Pi)从肌动蛋白丝的带刺末端释放的速度也比在哺乳动物中快，但程度小于从丝状体核心释放Pi的速度，并且这种效应似乎与酵母中组氨酸73甲基化的缺失无关(图3D；表1)。相反，这可能是由于酵母中末端亚基的较大波动，这可能会使Pi逃逸途径(所谓的“后门”31,48)的打开更容易，或者允许Pi通过另一条途径逃逸。据报道，两种酵母肌动蛋白的单体形式比哺乳动物肌动蛋白更快地交换其核苷酸， 并且我们使用ATP-ATTO488的观察结果与此一致(图S10)。
从进化的角度研究细胞骨架特别有趣，因为它在生命之树中的各种生物体中发挥着重要作用。例如，从顶复门生物和利什曼原虫中纯化的肌动蛋白丝，它们在进化上与后生动物相距甚远，但在体外似乎会迅速解聚。 这通常被解释为这些生物体拥有快速周转的肌动蛋白细胞骨架的一种方式，尽管它们加速肌动蛋白丝解体的调节蛋白有限。更接近后生动物的粟酒裂殖酵母和酿酒酵母提供了一种中间情况，使我们能够测试和扩展这种解释。它们也有非常动态的肌动蛋白细胞骨架，但它们拥有后生动物中发现的关键肌动蛋白结合蛋白(ABP)的直系同源物。 与哺乳动物肌动蛋白丝相比，我们在此报告的快速解聚速率可能是酵母在较低温度下有效运作的一种方式。我们报告的从丝状体核心和带刺末端快速释放Pi的速率，以及Pi对带刺末端的较低亲和力，对于酵母在高细胞质Pi浓度下运作可能很重要。 此外，由于酵母的肌动蛋白网络种类比动物细胞少，它们可能不需要如此广泛的周转率范围，因此可能受益于具有不太稳定肌动蛋白丝。
酵母，特别是粟酒裂殖酵母和酿酒酵母，是研究肌动蛋白细胞骨架的强大模式生物。方便的是，它们拥有一些定义明确且特征良好的肌动蛋白网络， 可以通过研究这些网络来推导肌动蛋白细胞骨架的普遍特性。正如多年前已经强调的， 充分利用这些系统需要了解潜在的反应速率。在这里，我们提供了一些缺失的关键速率(图S6；表1)，应该有助于提高我们对酵母中肌动蛋白网络动态的理解。
##研究的局限性
本研究聚焦于肌动蛋白丝的带刺末端，使用纯化蛋白进行，未涉及调节细胞中肌动蛋白动力学的肌动蛋白结合蛋白。我们在此报告的速率表明，在 酿酒酵母的胞质溶胶中，估计有 个肌动蛋白单体，仅 条肌动蛋白丝在 时会以大约 的速度伸长，例如，这似乎与在内吞位点观察到的快速内化现象相符。 尽管如此，肌动蛋白丝的伸长在酵母细胞中可受到多种因素的调节 ，并且关于酵母中肌动蛋白丝和单体与肌动蛋白结合蛋白的相互作用，仍有几个重要的反应速率未知。由于肌动蛋白 - 肌动蛋白结合蛋白的相互作用可能具有很强的物种特异性， 未来的体外研究将必须仔细匹配蛋白质的来源，以便可靠地解读肌动蛋白动力学的调节机制。
##资源可用性
##主要联系人
如需进一步信息和资源，请联系主要联系人纪尧姆·罗梅 - 勒莫内(romet@ijm.fr)，他将予以提供。
##材料可用性
本研究中产生的所有菌株和质粒可根据要求从主要联系人处获得。
##数据和代码可用性
- 本文报告的所有数据将根据要求由主要联系人共享。
- 所有原始代码已存放在github上，可在https://github.com/AntoineJegou/filament - persitence - length公开获取。
- 如需重新分析本文报告数据所需的任何其他信息，可应要求向主要联系人索取。
致谢
我们感谢莫汉·巴拉苏布拉马尼亚姆提供巴斯德毕赤酵母菌株和质粒，感谢蛋白质组学设施进行质谱分析，感谢索菲·马丁对手稿提出的意见。我们感谢医学研究基金会(授予G.R.L.的EQU202203014630资助)、贝当古 - 舒埃勒基金会(授予A.J.的Impulscience资助)、新加坡国家研究基金会(NRF)的中型资助
酵母,肌动蛋白
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