兔cathelicidin合成肽衍生物对MDA-MB-231乳腺癌细胞系的细胞毒性作用及作用机制研究
发布时间：
2026-07-04 10:55
兔cathelicidin合成肽衍生物对MDA-MB-231乳腺癌细胞系的细胞毒性作用及作用机制研究
玛齐耶·巴希 ，哈米德·马达尼奇 & 巴赫曼·尤塞菲
抗菌肽(AMPs)作为潜在的抗癌剂引发了极大关注，从而成为寻求新型抗癌策略的焦点。这些肽具有独特性质，凸显了开发更有效且具有选择性靶向作用、针对人类癌细胞具有多种作用机制的版本的重要性。与现有癌症疗法相比，此类进展将带来显著优势。本研究旨在检测nrCap18肽在癌细胞系和正常细胞系中的毒性和选择性。此外，在三个不同孵育时间使用凋亡和吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双重染色评估细胞死亡率。另外，评估了该肽对癌细胞周期和迁移的影响，最终研究了细胞周期蛋白依赖性激酶4/6(CDK4/6)基因的表达。研究结果表明，与正常细胞相比，该肽在癌细胞中具有显著毒性和选择性。而且，随着时间推移观察到细胞死亡呈显著的渐进性增加。此外，该肽能够在细胞周期的G1期阻止癌细胞进展，并通过抑制CDK4/6基因的表达来阻碍其迁移。
关键词 杀菌肽，抗菌肽，抗癌肽，Cap18
癌症治疗，尤其是乳腺癌治疗，无疑已成为全球严峻的公共卫生挑战，因为其发病率和死亡率不断上升 。当前的方法，如手术、放疗、化疗或联合使用，有助于延长预期寿命。然而，一些障碍会影响和限制其疗效3。此外，由于缺乏选择性，几种抗癌药物对正常细胞有严重的副作用 。
如今，致力于肿瘤的专门治疗方法，癌症治疗转向分子靶向以开发替代癌症疗法 。为了找到新型抗癌方法和疗法，抗菌肽(AMPs)已引起广泛关注。作为几乎所有微生物先天免疫系统中的必需成分，预计它将进一步超越传统医学的局限性7。虽然大多数临床研究集中在AMPs抗菌作用的潜在用途上，但许多其他近期研究揭示了它们的抗癌功能 ；因此，这些肽被称为抗癌肽(ACPs) 。近年来，对各种癌细胞系(如乳腺癌、肺癌、黑色素瘤和淋巴瘤)潜在治疗方法的研究阐明了不同来源的各种ACPs的细胞毒性作用 。从另一个角度来看，ACPs具有独特特性，如在体内半衰期短、易于合成和修饰、对正常细胞毒性低以及生物相容性 。
伊朗塞姆南医科大学免疫学系，塞姆南。 伊朗塞姆南医科大学癌症研究中心，塞姆南。 伊朗塞姆南医科大学神经系统干细胞研究中心，塞姆南。 伊朗塞姆南医科大学医学院生物技术系，塞姆南35131 - 38111。 伊朗德黑兰巴斯德研究所生物技术研究中心医学生物技术部药物设计和生物信息学组，德黑兰13198。hamidmadanchi@yahoo.com；yosefi_bahman@yahoo.com
因此，设计更有效且更具选择性的ACPs具有重要意义，这些ACPs对人类癌细胞具有多种作用机制，与当前疗法相比具有显著优势 。尽管AMPs有可能具有临床应用价值，但它们的临床应用存在一些障碍，如对正常哺乳动物细胞的附带毒性和严重的免疫反应 。另一个需要克服的限制是它们的合成成本。为了生成经济的ACPs，使用计算机方法对其进行重新设计和修饰将有助于保留其优势，同时降低其附带毒性 。
然而，考虑到抗菌肽在癌症发展中的两面性，将抗菌肽修饰为抗菌阳离子肽已成为对抗癌细胞的创新策略之一 。借助计算机辅助设计和修饰天然肽(特别是抗菌肽)，现在可以增强所需特性并合成更强的抗癌肽 。许多先前关于修饰的抗菌肽衍生物(特别是人抗菌肽)对癌细胞系的研究 表明，这些肽具有多种潜在的抗癌特性；其中一些也在动物模型上进行了研究 。因此，可以认为修饰后的兔抗菌肽可能具有多种潜在特性，如抗癌作用。
目前正在评估和讨论的nrCap18是一种基于兔CAP18的新型修饰阳离子肽衍生物，具有良好的脂多糖(LPS)结合活性和适当的抗菌特性。根据先前的一项研究 ，nrCap18靶向带负电荷的细胞膜和细胞壁，如细菌。因此，可以得出结论，带负电荷膜的癌细胞似乎是一个很好的选择性攻击目标。在这里，我们首次研究了nrCap18对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系MDA-MB 231细胞的一些抗癌特性，并深入了解了该肽的作用机制和细胞毒性。
材料与方法
化学试剂
高糖DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基)、胎牛血清(FBS)和乙二胺四乙酸(EDTA)购自美国纽约的Gibco公司。2-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)乙烷磺酸、青霉素和链霉素、台盼蓝染料、胰蛋白酶、MTT染料(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)、戊二醛和二甲基亚砜(DMSO)购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。总RNA纯化试剂盒和cDNA合成试剂盒购自德国耶拿的耶拿生物科学公司。实时定量PCR使用丹麦欧登塞的AMPLIQON公司生产的Real Q Plus 2×Master Mix Green。
培养条件和细胞系
三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB 231(ATCC HTB-26)和正常乳腺细胞系MCF-10A(ATCC CRL-10317)最初购自伊朗国家细胞库(伊朗巴斯德研究所)。MDA-MB 231细胞系在DMEM-High Glu培养基(添加15 mM HEPES(2-(4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基)乙烷磺酸)、24 mM碳酸氢钠、1%青霉素-链霉素、pH 7.4和10%胎牛血清)中生长。
MEBM(乳腺上皮细胞基础培养基)包含在MEGM(乳腺上皮细胞生长培养基)子弹头试剂盒(可从Clonetics公司购买，产品编号CC-3150)中，是用于MCF-10A细胞系的基础培养基。为制备完全生长培养基，向基础培养基中添加以下成分:试剂盒提供的所有MEGM单组分添加剂(GA-1000(牛垂体提取物(BPE)13 mg/ml，2 ml；氢化可的松0.5 mg/ml，0.5 ml；人表皮生长因子(hEGF)10 μg/ml，0.5 ml；胰岛素5 mg/ml，0.5 ml)(霍乱毒素100 mg/ml除外(单独销售 - Sigma Aldrich))。
细胞的培养条件为 ，湿度为 ；此外，使用胰蛋白酶/EDTA和磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液进行传代培养。
肽合成
采用固相合成技术，在澳大利亚穆尔格雷夫的Mimotopes公司的芴-9-甲氧基羰基(Fmoc)-多肽活性酯化学条件下，制备了具有WRKRLRKFRLKKKILQ序列的nrCap18肽和具有PVSKMRMATPLLMQA序列的CLIP肽(II类相关恒定链肽)作为阴性对照。合成的肽通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)方法纯化至95%。使用美国马萨诸塞州的Sciex API100液相色谱/质谱仪(LC/MS)确认肽的分子量和序列准确性。
MTT 测定法
在96孔板中，每孔接种 个MDA-MB 231细胞和每孔接种 个MCF-10A细胞，在不同浓度(1000、500、50、5和0.5 μg/ml)的nrCap18、不同浓度(100、10、1和0.1 μg/ml)的阿霉素以及作为阴性对照的完全培养基中孵育过夜24小时。将“MTT”(1-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-3,5-二苯基甲臜，噻唑蓝甲臜)以5 mg/ml的储备液溶于无菌PBS中，向每孔加入 的细胞培养基，其中含有 的MTT储备液。 后取出含MTT的培养基，加入 的无菌二甲基亚砜(DMSO)溶解甲臜晶体 。在酶标仪(美国BIOTEK公司)中分析溶液，在 处测量吸光度，然后在GraphPad Prism 9.0软件上进行分析以确定 抑制浓度 。根据测试孔和对照孔的吸光度读数，使用以下公式确定细胞活力百分比 。
采用洗涤后MTT法评估nrCap18的选择性
通过一种称为洗涤后MTT法的改良MTT测定法评估nrCap18对癌细胞膜(MDA-MB 231细胞系)细胞的选择性，Madnachi等人之前对此进行过解释。 nrCap18肽由于其高阳离子特性，对带负电荷的细胞膜(癌细胞)具有高亲和力，同时对正常细胞的亲和力较低。首先，将MDA-MB 231和MCF-10A细胞在96孔板中培养过夜。第二天，弃去上清液后，将细胞与不同浓度(1000、500、50、5和0.5 μg/ml)的nrCap18以及作为阴性对照的完全培养基孵育1小时。处理1小时后，吸出孔内液体，用PBS洗涤两次。接下来，向孔中加入完全培养基，并继续孵育 。最后，按照标准MTT法进行其他步骤 。
通过流式细胞术测定细胞凋亡
使用Annexin V-FITC/7-AAD检测试剂盒(BioVision公司)检测细胞凋亡。将MDA-MB 231细胞接种于6孔板中并孵育过夜。之后，用 浓度的nr-Cap18和阿霉素处理细胞24小时和 小时，然后经胰蛋白酶消化和离心收集细胞。使用自动血细胞计数器(Countess II，美国赛默飞世尔科技公司)计数细胞数量，调整细胞密度至约 个细胞/毫升。按照制造商说明(BioVision公司)，样品用PBS洗涤两次后重悬于500微升结合缓冲液中。加入5微升Annexin V-FITC和5微升7-AAD后，细胞混合物在室温下孵育5分钟。使用BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD生物科学公司，加利福尼亚州)分析样品。Annexin 细胞被视为处于凋亡早期，而Annexin 细胞被认为处于凋亡晚期 。最后，使用FlowJo软件(版本10，美国TreeStar公司)分析数据。
活/死双染
为评估nr-Cap18肽对细胞膜的影响，进行了吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染实验。简要来说，将细胞接种于6孔板中并孵育过夜以使其贴壁。在以相关 剂量与肽一起培养 后，样品用PBS洗涤两次。接着，向每孔中加入 胰蛋白酶。细胞脱落后，将 悬浮液置于载玻片上。向每个悬浮液中加入 含有等浓度 毫升溴化乙锭(EB)和吖啶橙(AO)的双荧光染色溶液后，在混合物上盖上盖玻片，并在荧光消退后30分钟内使用紫外荧光显微镜对样品成像。使用荧光显微镜检查形态，至少重复三次 。
使用碘化丙啶(PI)分析细胞周期
已使用细胞周期阻滞试验评估了 nrCap18 对 MDA - MB 231 细胞周期的影响。 剂量的 nrCap18 用于接种处理组细胞，而对照组细胞(未处理细胞)在 的 DMSO 中培养。用 PBS 洗涤两次后，收获的肿瘤细胞以 个细胞 的密度重悬于细胞悬浮缓冲液(PBS + 2%胎牛血清，即 FBS；PBS + 0.1%牛血清白蛋白，即 BSA)中。肿瘤细胞在 条件下离心 ，弃去上清液。使用适度涡旋，将 5 ml 冷的 70%乙醇逐滴加入到已分装在 V 型底聚丙烯管中的 缓冲液细胞悬液中。在进行流式细胞术分析和碘化丙啶(PI)染色之前，细胞在 条件下固定至少一小时。用 PBS 洗涤固定后的细胞两次。将 条件下的 PI 染色溶液加入到细胞沉淀中。随后，将 含终浓度为 的 RNase A 储备溶液加入到样品中，然后在 条件下孵育至少 。使用流式细胞术 检测保存在 条件下的储存样品中的 10⁶ 个事件。
用于细胞迁移分析的划痕试验
将 个细胞/孔的MDA-MB 231细胞接种到6孔板中，使其贴壁生长至70 - 80%汇合度。使用无菌的1000 μL微量移液器吸头在每个孔中刮擦细胞单层。刮擦后，用 的培养基洗涤孔一次以去除细胞碎片，并使刮擦细胞的边缘平滑。接下来，向每个孔中加入 含有浓度为 和 的肽和阿霉素的培养基，并将板孵育 。
借助微米刀片测量距离以进行成像，并在板的外侧底部用近似划痕的尖端标记进行标记。最终，在相差显微镜下检查板时，参考标记留在捕获图像区域之外。使用ImageJ软件在每隔 直至 的固定时间间隔拍摄图像后测量细胞迁移距离。每个划痕闭合的距离通过细胞前沿确定，并通过比较在时间0拍摄的照片与在不同时间点拍摄的照片来测量。
实时聚合酶链反应
首先，将 个MDA - MB 231细胞/孔接种于12孔微孔板中培养。接着，以 浓度向孔中加入nrCap18肽，并处理 。处理 后，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。此外，使用cDNA合成试剂盒合成cDNA。然后，将实时荧光定量PCR反应体系与cDNA、CDK4和CDK6引物以及实时荧光定量PCR预混液混合。随后，使用LightCycler 96仪器(罗氏，巴塞尔，瑞士)在 (退火温度)下以 进行40个循环的 ，并在 进行 。使用 技术分析结果。通过GAPDH(甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶)对相对CDK4/6(细胞周期蛋白依赖性激酶4/6)基因表达水平进行标准化。引物序列见表1。
统计分析
本研究的所有数据均以平均值±标准差(均值 SD)表示。使用GraphPad Prism 9.0进行所有统计分析。采用单因素和双因素方差分析来确定均值之间的显著差异。当获得的概率值小于0.05(P<0.05)时，认为差异具有统计学意义。
结果
nrCap18对MDA - MB 231和MCF - 10A细胞系的细胞毒性
通过MTT法评估nrCap18和阿霉素对癌细胞系(MDA - MB 231)的毒性。根据活力/浓度曲线，使用GraphPad Prism 9.0软件得出该肽的 。结果表明，与CLIP(一种无细胞毒性的肽)相比，nrCap18肽对MDA - MB 231表现出高度显著的细胞毒性(图1a)。此外，结果显示nrCap18对正常细胞系MCF - 10A的细胞毒性明显低于其对癌细胞系的潜在细胞毒性(图1b)。而且，结果表明阿霉素对MDA - MB 231和MCF - 10A细胞的细胞毒性百分比无显著差异(图1c)。
nrCap18对MDA - MB 231的 约为0.29μg/ml，而对MCF - 10A的该值为 。上述肽在MCF - 10A中的 显著高于MDA - MB 231(P<0.01)。同样，阿霉素对MDA - MB 231和MCF - 10A的 值分别为1.6和 (图2)。
nrCap18对癌细胞的选择性
通过MTT法比较该肽在乳腺正常细胞系和癌细胞系中经洗涤处理后的细胞毒性，研究nrCap18对癌细胞(MDA - MB 231)的选择性。
在MDA - MB 231细胞系中，该肽对微孔板中的细胞显示出选择性和强效作用，且不会因洗涤而去除。在新的活力/浓度曲线中比较了该肽的细胞毒性。
在MCF - 10A细胞系中，处理1小时后通过洗涤细胞可轻松去除这种阳离子肽。活力/浓度曲线证实了这一解释(图3)。
| 基因 | 序列 | 长度 | 解链温度(°C) |
| 细胞周期蛋白依赖性激酶4 | 正向:5’-CTGGTGTTTGAGCATGTAGACC-3’ | 22 | 55.41 |
| 反向:5’-GATCCTTGSTCGTTTCGGCTG-3’ | 21 | 56.39 | |
| 细胞周期蛋白依赖性激酶6 | 正向:5’-CCAGSTGCTCTAACCTCAGT-3’ | 21 | 54.71 |
| 反向:5’-AACTTCCACGAAAAAGAGGCTT-3’ | 22 | 54.8 | |
| 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 正向:5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’ | 22 | 54.71 |
| 反向5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’ | 19 | 55.28 |
表1. 引物序列。
图1. 活力/浓度图表。结果表明nrCap18对细胞的细胞毒性呈剂量依赖性增加。(a) MDA-MB 231细胞系，(b) MCF-10A细胞系，以及(c) 两种细胞系中阿霉素(DOX)的细胞毒性比较。DOX:阿霉素。
图2. 比较nrCap18和DOX在MDA-MB 231和MCF-10A细胞系中的 值。DOX:阿霉素。ns 和** 。DOX:阿霉素。
图3. 洗涤后MTT活力/浓度图表。(a) MDA-MB 231和(b) MCF-10A细胞系在标准MTT法和洗涤后MTT法中的活力比较。(c) 显示洗涤nrCAp18肽后MDA-MB-231和MCF-10A的活力百分比。ns 和 。
使用流式细胞术测量细胞凋亡
利用流式细胞术数据和点图绘制的图表表明nrCap18如何影响MDA-MB 231的凋亡状态。可以看出，与未处理组 相比，nrCap18在时间上显著提高了早期凋亡率(图4)。
AO/EB双重染色
在进行 处理后，用AO/EB对MDA-MB 231细胞进行标记。在荧光显微镜下检查双重染色 - 早期凋亡细胞以黄绿色吖啶橙核染色为标记。晚期凋亡细胞通过浓缩的红橙色核溴化乙锭染色识别。同时，正常活细胞显示绿色荧光(图5)。
细胞周期阻滞分析
用 的 nrCap18 处理 MDA - MD 231 细胞。处理 后，与阴性对照相比， 期细胞显著增加(约 30%)，S 期细胞减少(P < 0.0001)，这表明细胞凋亡增加、细胞周期停滞于 G0/G1 期，且 DNA 复制细胞减少(图 6)。
细胞迁移的伤口愈合试验
结果表明，在 和 处理下显著降低了MDA-MB231的细胞迁移能力(图7)。如图8所示，肽处理后划痕仍未填充；相反，72小时后，未处理的对照细胞完全迁移并填充了间隙。每隔24小时定期拍摄图像，并使用ImageJ对每个细胞之间的区域进行量化，如图8所示。
nrCap18对CDK4和CDK6表达的影响
与GAPDH表达相比，CDK4和CDK6相对表达的定量分析表明，当将所述肽添加到MDA-MB 231细胞中时，靶基因(CDK4和CDK6)的表达显著降低。具体而言，与对照组相比，表达水平显著下降，分别达到0.9(P<0.05)和 (图9)。
图4. (a) 显示点图，说明在两个不同时间点通过流式细胞术分析凋亡/坏死的结果。(b) 未处理的MDA-MB 231细胞以及在两个不同时间用nrCap18和DOX处理的细胞中早期凋亡细胞的百分比。DOX:阿霉素。***P<0.001，***P<0.0001。
讨论
在过去十年中，癌症治疗取得了令人瞩目的进展，改善了许多以往预后不佳的恶性肿瘤的临床管理 。三阴性乳腺癌(TNBC)是一种特别具有侵袭性和高转移性的肿瘤，对化疗反应有限，预后最差。手术和化疗是目前针对 最突出的两种治疗选择。
最近的研究表明，关注先天免疫系统与癌症之间的相互作用可能为治疗肿瘤带来巨大希望 。在这一概念下，治疗性肽已成为一类独特的药物，并在药物研究中受到了广泛关注。肽化学技术的最新进展，特别是在蛋白质纯化、合成、结构解析和测序方面，对推动该领域的进展起到了关键作用 。因此，肽药物的开发势头强劲，约有40种肽药物获得了全球批准。值得一提的是，合成肽也已得到开发 。
自治疗性肽被首次发现以来，它们在各个领域都显示出了巨大的潜力，如激素、生长因子、神经递质、离子通道配体和抗感染剂。这些肽与细胞表面的受体结合，引发特定且高效的细胞内反应。有趣的是，它们与其他生物制剂，如治疗性蛋白质和抗体，具有相似的作用模式。然而，治疗性肽的免疫原性较低，且比生物制剂更具成本效益 。此外，多项研究已鉴定出能够诱导乳腺癌细胞死亡的肽 。
图5. AO/EB双重染色分析。本图展示了 的nrCap18处理后MDA - MB 231细胞的荧光图像 。图像(a和b)由倒置显微镜拍摄，而直接显微镜拍摄了图像(c至 )。未处理的细胞(a和d)为阴性对照(未用肽处理)，而 和 是nrCap18处理的细胞。部分(c和 )展示了凋亡的不同阶段。0:活细胞，1:早期凋亡，2:晚期凋亡。(a和b)图像用20倍物镜拍摄，(c至e)图像用 物镜拍摄。图像(f)用 物镜拍摄。这些图像是选取了最佳视野的。
基于累积的证据，可以推断出像Cathelicidin衍生物及其片段这样的肽具有有利特性，并表现出强大的生物相互作用。因此，它们有望成为癌症治疗的潜在化合物。这些肽可能是开发抗肿瘤药物的新平台，特别是对于那些抵抗现有治疗方法的肿瘤 。
Madanchi等人在他们的研究 中提出了一组源自Cathelicidin的修饰化合物，包括nrCap18，作为具有抗菌特性的肽。鉴于这种肽的特定特性，我们目前的研究旨在探究其作为抗癌剂的潜力。因此，假设nrCap18可能具有抗癌作用，并考虑到化疗的局限性以及三阴性乳腺癌(TNBC)的相对高发病率，我们在被称为三阴性细胞系的MDA - MB 231细胞系上使用nrCap18，以阐明其一些抗癌方面。
基于本研究，已确定nrCap18具有抗癌作用。在用nrCap18处理MDA - MB 231细胞系时，细胞活力呈剂量依赖性下降。nrCap18和阿霉素的I 值分别约为 和 。还利用了nrCap18对正常人乳腺细胞MCF - 10A细胞系的细胞毒性。计算得出nrCap18对MCF - 10A细胞的 值为 。Madanchi及其同事报告Hu02细胞的I 值约为335μg/ml 。与Hu02细胞相比，nrCap18对MCF - 10A细胞的IC 值较低，这可归因于其更高的敏感性。总体而言，这些发现具有连贯性和稳定性。
癌细胞中凋亡失调使其存活时间更长。这种延长的存活时间会导致突变积累，从而增强肿瘤进展、刺激新血管生成(血管生成)、破坏细胞生长的正常控制并阻碍细胞分化过程。一般来说，癌细胞采用各种策略逃避凋亡，这使它们对许多促凋亡剂产生抗性，包括某些抗癌药物 。在比较nrCap18与阿霉素的作用时，发现nrCap18在孵育24小时和 期间导致早期凋亡率较低。然而，在48小时时观察到一个显著现象，即nrCap18诱导的早期凋亡率显著增加，并接近在 时阿霉素观察到的速率。这种增加效应表明nrCap18的有效性可能随时间提高，其最大效应可能在24 - 48小时后出现，如在 孵育的AO/EB试验中所示。一些特定肽，如BMAP - 28 ，已被证明通过破坏膜极性诱导细胞死亡，最终导致坏死。
相比之下，我们的观察表明，nrCap18在其 剂量下主要诱导早期凋亡，而在高剂量下，尤其是1mg/ml诱导坏死而非早期凋亡。这些发现表明nrCap18与BMAP - 28和阿霉素相比可能具有不同的作用机制。因此，需要进一步研究阐明nrCap18不同凋亡效应背后的分子机制，并探索其作为抗癌疗法的潜力。
图6. 细胞周期阻滞结果。(a) 未处理的MDA - MB - 231细胞和经nrCap18处理的细胞的细胞周期状态。(b) 不同细胞周期阶段的细胞群体百分比。* ，** ，****P<0.0001。
图7. (a) 和(b) 浓度下nrCap18和DOX对MDA - MB 231细胞迁移和侵袭潜力的影响。DOX:阿霉素。* ，** ，*** 。
细胞的不受控制生长是癌症的一个突出特征，而端粒长度的维持主要促进了这一过程。因此，将负责端粒维持的机制作为一种治疗方法引起了相当大的兴趣 。在最近一项关于一种新提出的名为W12K 的肽的研究中，发现用该肽处理的细胞与对照处理的细胞之间存在差异。
图8. 在三个不同时间点拍摄的代表性图像，描绘了单个化合物(a) 和(b) 浓度对癌细胞迁移的抑制作用。DOX:阿霉素。图像用 镜头拍摄。
图9. 实时PCR结果。上述处理后CDK4/6基因的相对表达。如图所示，与未处理组相比，nrCap18处理导致的CDK4/6基因量显著下降。 。
分析显示，W12K处理的细胞中G1期和S期增加，导致G2M期相应减少。此外，已证明在细胞处理中使用nrCap18肽会改变MDA-MB 231癌细胞系中的细胞周期模式。这种改变的特征是G1期和SubG1期的细胞群体增加，表明诱导了细胞凋亡，而G2/M期的细胞减少，表明对细胞增殖有抑制作用。细胞分裂G1期的停滞，无论ER、HER2和p53状态如何，都会通过抑制端粒触发细胞凋亡 。这种抑制还有效地防止了癌症扩散到身体其他部位(转移)。此外，多项研究已经认识到，G1期和Sub G1期的停滞与促进细胞死亡的基因转录增加(p73、p21、Bax、Bad)有关 。
成功治疗转移性癌症需要解决癌细胞在转移过程中的动态可塑性，以及休眠和生长中的转移灶操纵其周围环境并避免被免疫系统检测到的策略。在最新的新策略中，检查点免疫疗法对转移性癌症，尤其是乳腺癌的影响有限，对于诊断为这种疾病复发形式的患者，平均5年生存率仍然是一个障碍 。因此，治疗转移需要替代疗法。一项研究LL-37与LL-25相比对MCF-7乳腺癌细胞迁移的影响，报告称 与对照组相比，LL-37导致迁移的MCF7细胞数量增加了两倍。与体内数据一致，添加LL-25(1 µM)中和了LL-37的迁移作用，证实了其抑制潜力。然而，单独的LL-25对细胞迁移没有显著影响 。幸运的是，我们目前的研究表明，nrCap18和阿霉素在 和 浓度下强烈阻碍癌细胞迁移。如观察到的，即使在 孵育后，细胞伤口仍未愈合。相比之下，对照组细胞完全迁移并填补了伤口间隙。然而，由于与原发性肿瘤相比，关于转移灶病理生理特征的知识有限，探索管理和阻止其进展的新策略变得势在必行 。
细胞周期蛋白D1-CDK4/6复合物通过直接磷酸化和稳定称为FOXM1的转录因子在细胞机制中发挥重要作用。这种磷酸化过程导致FOXM1的激活，进而促进细胞周期的进展。此外，它还保护癌细胞，防止它们进入衰老状态。此外，该复合物还参与SMAD3的磷酸化和失活，SMAD3介导TGF诱导的抗增殖反应 。帮助细胞进入S期的重要介质CDK4和CDK6对于多种癌症的起始、发展和存活至关重要。晚期激素受体阳性乳腺癌患者目前的治疗标准已有效地转向包括靶向CDK4/6的药物化合物 。正如预期的那样，CDK4/6抑制剂使敏感肿瘤细胞停滞在细胞周期的G1期。然而，CDK4/6抑制的影响远远超出了这一初始作用 。基于我们对肽处理的研究，观察到CDK4和CDK6基因表达水平有显著降低。这些发现为G1期细胞周期的停止提供了支持。相反，先前的研究表明，在G1期细胞周期停滞不依赖于3种标志物(ER、HER2、P53)的存在 ，因此可能对治疗三阴乳腺癌有效。因此，这种肽可能在治疗三阴乳腺癌中显示出有效性。
结论
我们的研究结果表明，nrCap18肽对癌细胞具有特定的细胞毒性作用。我们的调查还显示，该肽可通过干扰细胞周期来阻碍癌细胞的迁移。进一步深入细致的研究对于全面理解该肽的作用机制和潜在不良反应至关重要。尽管如此，该肽作为一种新型抗癌肽具有广阔的潜力。但要证实这一说法，无疑还需要进行更多的临床前和临床研究。
数据可用性
所有数据和材料均包含在文章中。其他数据将根据要求提供。
收到日期:2024年3月17日；接受日期:2024年6月7日
在线发表日期:2024年6月12日
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nrCap18,三阴性乳腺癌,阿霉素
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