搜索历史清除全部记录

最多显示8条历史搜索记录噢~

全部

全部
产品管理
新闻资讯
介绍内容
企业网点
常见问题
企业视频
企业图册

昵称 | 退出

首页

通过核RNA干扰解决转录-复制冲突

发布时间：

2026-07-05 16:28

通过核RNA干扰解决转录-复制冲突

图形摘要

要点

核酸酶切酶结合R环和DNA:RNA杂交体
当R环积累时，Dicer的解旋酶活性可防止基因组不稳定

Dicer在启动子近端暂停位点终止异常的RNA聚合酶II

Dicer与RNase H协作在启动子处生成小RNA

作者

泰瑞·程、本杰明·罗什、法丽达·阿卜杜勒拉赫曼、……、安德烈·韦尔德、莎拉·A.E. 兰伯特

罗伯特·A·马丁森

通信

martiens@cshl.edu

简而言之

核RNA干扰限制了着丝粒功能以外的基因组不稳定性，尽管其机制在很大程度上尚不清楚。在这项研究中，Cheng等人发现，在粟酒裂殖酵母中，当R环积累时，Dicer(Dcr1)会在启动子近端暂停位点终止RNA聚合酶II，否则这会导致与复制机制发生正面碰撞。

通过核RNA干扰解决转录-复制冲突

泰瑞·程，本杰明·罗什，法里达·阿卜杜勒拉赫曼，莱拉·图阿特 - 托德斯基尼，卡琳·弗雷翁，阿萨德·A·拉哈尼，索纳利·巴塔查吉，1 利亚姆·G·施皮尔曼，1 埃默森·杰嫩，1 克里斯汀·崔，1 任杰，安德烈·韦德尔，莎拉·A·E·兰伯特，和罗伯特·A·马丁森

霍华德·休斯医学研究所，冷泉港实验室，美国纽约州冷泉港邦特镇路1号，邮编11724 冷泉港实验室生物科学学院，美国纽约州冷泉港邦特镇路1号，邮编11724

法国格勒诺布尔阿尔卑斯大学高级生物科学研究所RNA、表观遗传学与应激研究团队，法国国家健康与医学研究院U1209，法国国家科学研究中心UMR 53

居里研究所，巴黎文理研究大学，法国国家科学研究中心UMR3348，法国奥赛91400

巴黎萨克雷大学，法国国家科学研究中心UMR3348，法国奥赛91400

法国国家抗癌联盟标记团队，法国奥赛91400

当前地址:美国北达科他大学医学院与健康科学学院生物医学科学系，北达科他州大福克斯，邮编58202

当前地址:中国科学院分子细胞科学卓越创新中心、中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所、中国科学院大学RNA创新国家重点实验室，中国上海，邮编200031

主要联系人

*通讯作者:martiens@cshl.edu

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2025.10.003

摘要

核RNA干扰(RNAi)是异染色质沉默所必需的，但Dicer也通过在复制应激位点释放RNA聚合酶来促进基因组稳定性。R环是在转录 - 复制(T - R)碰撞处积累的三链DNA:RNA结构。我们发现，在积累病理性R环的RNase H缺陷细胞中，Dcr1在转录起始位点(TSS)和终止位点(TES)处理R环，释放暂停的RNA聚合酶，并产生类似于癌细胞中发现的与DNA损伤相关的正义小RNA(sdRNA)的小RNA(sRNA)。遗传学证据表明，在没有Dicer的情况下，新生转录相关的R环与基因组不稳定性有关，解旋酶结构域提供的催化功能让人联想到参与复制的相关古细菌解旋酶。RNase H同源物AGO1通过结合R环促进基因组不稳定性，去除它可缓解复制应激。对复制中间体、DNA和RNA 末端以及全基因组的叉进程性分析表明，Dicer可解决正面的T - R碰撞，这与DNA复制中的古老起源一致。

引言

RNA干扰(RNAi)以其转录后基因调控功能而广为人知，在异染色质沉默和基因组稳定性中具有古老而基本的作用。在裂殖酵母粟酒裂殖酵母中，破坏任何RNAi组分——Dicer(Dcr1)、AGO1或RNA依赖性RNA聚合酶(Rdp1)——都会损害着丝粒周围异染色质的形成和黏连蛋白的募集，导致染色体错分离。除了着丝粒功能外，RNAi还协助DNA损伤反应(DDR)，在植物和动物中，损伤位点附近会产生小RNA(sRNA)，据认为这些小RNA有助于修复。

我们之前发现Dcr1释放RNA聚合酶II(RNA Pol II)以限制转录 - 复制(T - R)应激。这一功能似乎独立于经典RNAi。例如，只有dcr1Δ会积累Rad52焦点，表明存在持续性DNA损伤，而dcr1Δ在减数分裂世代中逐渐失去核糖体DNA(rDNA)拷贝，但在RNase III催化失活等位基因 dcr1 - 5中未观察到这种情况。小鼠胚胎干细胞(mESC)中也记录到了类似的Dicer特异性、不依赖sRNA的染色体表型，这表明其具有广泛的保守性。然而，Dicer如何调节转录以及如何防止基因组不稳定，仍知之甚少。

R环是由DNA:RNA(D:R)杂交体与被置换的单链DNA(ssDNA)组成的三链核酸结构，被认为主要在转录过程中形成。生理性R环可能有益，但调控异常的R环可能会致病，阻碍DNA复制并导致DNA损伤和基因组不稳定。因此，R环受到广泛调控，有两种保守的核糖核酸酶RNase H1和RNase H2专门负责降解D:R杂交体中的RNA部分。它们的作用部分冗余，在双突变体rnh rnh201Δ中，细胞对羟基脲(HU)和喜树碱(CPT)等基因毒性剂变得高度敏感，这突出了去除R环对基因组稳定性的重要性。未解决的R环会阻碍复制体前进，减慢或完全阻止复制叉，需要从相反的叉进行拯救或通过易错的重组依赖性复制(RDR)机制重新启动。在这里，我们着手确定Dcr1在限制T-R应激中的机制，特别是在R环积累的情况下，以及在没有Dcr1时对基因组维持的影响。

结果

缺乏Dcr1时R环诱导的T-R应激

在裂殖酵母(S. pombe)中，R环在着丝粒周围重复序列的复制起点附近的dcr1Δ中积累，此处复制叉会停滞，这表明Dcr1在转录 - 复制冲突(T - R collision)中发挥作用。因此，我们纯化了裂殖酵母的Dcr1并进行了结合测定，证实裂殖酵母的Dcr1在体外能结合R环和D:R杂交体(图1A)，但不结合D环，且这种结合不依赖ATP(图S1A和S1B)。已有研究表明人Dicer在体外也能结合并处理R环，在敲低Dicer后，可在HeLa细胞中检测到R环和不对称叉。我们使用微尺度热泳技术对这种结合进行了定量分析，发现我们的裂殖酵母Dcr1对R环的亲和力高于市售的人Dicer(图S1C和S1D)，不过由于纯度和活性的差异，亲和力可能会有所不同。为了研究Dicer在体内处理R环的作用，我们构建了与RNase H1和RNase H2相关的高阶突变体，这些突变体会在裂殖酵母中积累R环。引人注目的是，在这些RNase H缺陷细胞中诱导出对羟基脲(HU)和喜树碱(CPT)的超敏性(图1B)。这种负相互作用还表现为细胞伸长、多核化(图1C和1D)，细胞倍增时间显著延长(图1E)。由于RNase H突变体因复制依赖性DNA损伤而处于延长的S期且细胞伸长，这些结果表明Dcr1在促进忠实复制方面发挥作用。我们注意到dcr1Δ与rnh201Δ之间的遗传相互作用比与rnh1Δ之间更强(图1B)。这可能是因为RNase H2在双链断裂(DSB)修复和复制重启中还有其他作用。

可以使用S9.6抗体在全基因组范围内检测R环。然而，这种抗体被认为会与双链RNA(dsRNA)发生交叉反应，并且也无法检测到瞬时R环，例如在启动子近端形成的那些。相反，我们通过诱导表达催化失活的、带有标签的人RNase H1，然后进行染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)，在全基因组范围内探测R环，这是一种捕获通常由RNase H处理的启动子近端R环的技术。正如预期的那样，在缺乏RNase H的细胞中，R环在转录起始和终止位点(TSS和TES；图1F)周围积累。然而，在dcr1Δ细胞中，R环略有减少。至关重要的是，三重突变体中的R环水平似乎是累加的(图1F)，这表明Dcr1和RNase H之间的负相互作用不能简单地用Dcr1参与直接处理R环来解释。

与这个想法一致，单独过表达并不能挽救dcr1Δ(图S1E和S1F)。我们还测试了dcr1Δ与人类D:R解旋酶senataxin(SETX)的直系同源物 sen1和dbl8之间的相互作用。在测试的sen 和dbl8Δ条件下，我们没有观察到明显的生长缺陷，也没有观察到和dbl8Δ之间有任何实质性的负相互作用(图S1G和S1H)。经典的RNAi突变体具有有缺陷的着丝粒功能，并且对微管破坏药物噻苯咪唑(TBZ)敏感。我们发现RNase H、Sen1和Dbl8都不会影响dcr1Δ对TBZ的敏感性(图S1F - S1H)，这表明这些表型与经典RNAi无关。出乎意料的是，dcr1Δ sen1Δ双突变体比dcr1Δ细胞对CPT更具抗性(图S1G)。考虑到SETX已知的转录和复制作用，我们注意到在粟酒裂殖酵母中，Sen1主要与RNA Pol III相互作用，而Dbl8与RNA Pol I相互作用。一致地，虽然Dcr1在细胞静止期间释放RNA Pol I中起关键作用，但它在循环细胞中从高转录位点释放RNA Pol II。由于Dcr1也在tDNA位点终止转录， dcr1 sen1 双突变体中的CPT抗性可能反映了Dcr1的这种额外功能。然而，ChIP-seq数据以及dcr1与其他R环处理因子之间遗传相互作用的差异表明，Dcr1并不是通过简单地去除R环来限制T - R应激。

全局R环诱导的暂停缺陷是Dcr1依赖性的

为了研究dcr1Δ中RNA Pol II转录失调的机制，我们对突变体系进行了精确运行测序(PRO-seq) ，以在接近单核苷酸分辨率下研究新生转录。在启动子的紧邻下游，RNA Pol II经常通过与负延伸因子(NELF)和DRB敏感性诱导因子(DSIF)复合物结合而处于暂停状态。然后，RNA Pol II要么通过正转录延伸因子b(P - TEFb)复合物的作用被许可进入有效延伸，要么通过整合酶复合物的最近描述的功能终止，其中INTS11亚基介导RNA内切核酸酶切割，释放RNA Pol II，并且现在已知启动子近端暂停是调节基因表达的关键检查点。

粟酒裂殖酵母保留了DSIF(Spt4/5)和P-TEFb(Cdk9)，但缺少NELF和整合酶复合物。然而，整体的PRO-seq图谱显示RNA聚合酶II在粟酒裂殖酵母中也会暂停(图1G和1H)，正如之前所描述的那样。暂停和终止的程度可以分别用暂停指数和终止指数来量化(PI和TI；见STAR方法)。虽然突变体之间的终止程度相似，但我们观察到rnh1Δ rnh201Δ中的整体暂停增加(图1H - 1J、S1I和S1J)，这表明有效的R环处理是释放暂停所必需的。因此，rnh1Δ rnh201Δ中启动子R环在整体上积累(图1F)，表明暂停的RNA聚合酶II堆积是R环去除效率低下的标志。暂停缺陷是依赖Dcr1的，因为在双突变体中进一步删除dcr1 导致RNA聚合酶的PI下降

《分子细胞》

图1. 在存在R环的情况下，Dicer可防止暂停的RNA聚合酶II意外释放，这会导致复制应激 (A)Dcr1与R环和D:R杂交体在体外结合的电泳迁移率变动分析(EMSA)。

(B)使用10倍稀释在无补充剂或添加指定剂量的基因毒性剂羟基脲(HU)和喜树碱(CPT)的YES平板上对野生型以及rnh1Δ、rnh201Δ和dcr1Δ组合进行点样生长试验。

(C和D)用DNA的DAPI染色的dcr1Δ(C)和dcr1Δ rnh1Δ rnh201Δ三突变体(D)细胞的代表性图像。

(E)野生型以及rnh1Δ、rnh201Δ和dcr1Δ组合的倍增时间。n = 2；误差条表示标准差。

(F)相对于野生型，mh1Δ mh201Δ、dcr1Δ和dcr1Δ rnh1Δ rnh201Δ的R环水平热图。首先将各个基因型的dRNH1 ChIP-seq读数按每百万读数(RPM)进行归一化，然后对输入进行对数归一化。然后将该轨迹与野生型相减。热图显示了所有RNA聚合酶II转录的基因，折叠的基因体以及注释的转录起始位点(TSS)上游500 bp和转录终止位点(TES)下游500 bp。

(G)野生型(黑色)dcr1 (蓝色)、rnh1 rnh201 (灰色)和三突变体(红色)的归一化PRO-seq数据的代表性基因组轨迹。注意基因SPAC7D4.03c的TSS处的峰值以及转录本末端的堆积。

(H)在未同步化的野生型(黑色)、dcr1 (蓝色)、mh1 rmh201 (灰色)和三突变体(红色)细胞中通过3′-OH RNA末端检测暂停的RNA聚合酶。PRO-seq读数按每百万读数(RPM)进行归一化，并映射到所有RNA聚合酶II转录基因的折叠基因体加上注释的TSS上游500 bp和TES下游500 bp的全基因组元图上。

(I)基于(H)中的PRO-seq读数，归一化为野生型后的转录暂停指数(PI)的密度图。虚线表示每种基因型的中位数。

(J)基于(H)中的PRO-seq读数，归一化为野生型后，对分离良好的基因(见STAR方法)的转录终止指数(TI)的密度图。虚线表示每种基因型的中位数。

(K)分别通过磷酸化丝氨酸-5和磷酸化丝氨酸-2 ChIP-seq检测起始RNA聚合酶II(顶部)和延伸RNA聚合酶II(底部)。读数映射到所有RNA聚合酶II转录的基因上，并如(H)中那样进行归一化。

II转录基因(图S1K)。单独的dcr1Δ具有野生型(WT)水平的暂停，在三重突变体中，我们观察到暂停水平低于WT(图1I和S1I)。这是由于基因体上更高的读数计数(图1H)导致的，表明存在计划外的暂停逃逸。在顶部10%暂停的基因中，暂停缺陷更为明显(图S1L)，并且与表达水平相关(图S1M)。我们得出结论，Dcr1在限制计划外的RNA Pol II暂停释放方面具有全局功能，但在启动子R环由RNase H积极解决的基因中尤为如此。支持这一观点的是，携带丝氨酸-5磷酸化(标记早期起始聚合酶 )的RNA Pol II在三重突变体的基因体中富集(图1K)，我们认为这是暂停调控失调的结果。

为了研究dcr1Δ中的暂停缺陷是否会影响基因表达，我们使用总RNA测序(RNA-seq)对处于异步对数期的细胞进行基因表达分析。在dcr1Δ单突变体、rnh1Δ rnh201Δ双突变体和三重突变体中，基因大多上调而非下调(图S2A)，但如前所述， dcr1缺失对转录组的影响不大——只有注释转录本上调(图S2A，橙色点)。着丝粒转录本在dcr1Δ和三重突变体中均有可重复的上调(图S2A，蓝色点)。相比之下，我们观察到参与转录延伸和终止的基因没有变化(图S2A，黄色点)，这表明我们突变体中的暂停缺陷不是由于这些因子的调控失调所致。dcr1Δ诱导的基因在任何特定的生物学过程中都没有富集，但这组基因在rnh1 A rnh201Δ中也上调，在三重突变体中失调更严重(图S2B和S2C)。这些基因在WT中低表达。然而，这种重叠表明存在一种涉及Dcr1和RNase H的共同调控机制。我们还寻找了在三重突变体中特异性失调但在dcr1Δ和rnh1Δ rnh201Δ细胞中未失调的基因(见STAR方法)。尽管选择标准较为宽松，但仅发现15个基因上调(图S2D)。值得注意的是，6个基因(tef101、tef102、tef103、SPAC29A4.02c、tef3和cpc2)与翻译延伸相关，这表明在三重突变体中，尽管全局基因表达谱相对不变，但细胞处于翻译应激状态，这可能源于转录保真度的破坏。值得注意的是，我们没有发现基因表达与暂停行为之间的任何相关性——例如，dcr1Δ诱导基因的暂停在任何突变体中都没有显著改变(图S2E)。总之，这表明新生转录动力学的变化在很大程度上与全局稳态基因表达谱解耦。

Dcr1与一般转录因子协同作用以实现暂停释放

接下来，我们通过正向和反向遗传分析研究Dcr1的作用。一般转录因子(GTF)的等位基因抑制的着丝粒周围异染色质沉默和/或静止缺陷，我们测试了其中五个调控早期转录的因子(tfs1Δ、mst2Δ、fcp1 - Y580*、tbp1 - D156Y和med31 - ins)。它们所有不仅能够抑制dcr1Δ中的TBZ敏感性，还能抑制三重突变体dcr1Δ rnh1Δ rnh201Δ中的HU敏感性(图S3A)。接下来，我们通过甲磺酸乙酯(EMS)诱变筛选在三重突变体中获得了14个抗HU的抑制子。为了鉴定候选单核苷酸多态性(SNP)，我们进行了全基因组测序，并通过回交或重新引入SNP验证了8个(见STAR方法；表S4；图S3B - S3E及以下)。值得注意的是，大多数复制应激抑制子也对应于调控早期转录的GTF，这强烈表明在dcr1Δ中诱导了T - R冲突。

其中一个抑制子tfa2-L238*导致转录因子II E(TFIIE)复合物的较小亚基TFIIE- 截短。尽管预测截短区域高度无序(图S3F)，但对酿酒酵母和人类亚基的结构和生化研究表明，该区域与转录因子II H(TFIIH)复合物接触以刺激启动子开放。因此，tfa2-L238*可能通过降低RNA聚合酶II启动子逃逸效率赋予三重突变体对HU的抗性。有趣的是，单突变体tfa2-L238*对TBZ敏感(图S3E)，表明其在着丝粒周围异染色质功能中起作用。事实上，着丝粒周围转录本dg/dh在tfa2-L238*中去抑制(图S3G)，但在对TBZ不敏感的另一个三重突变体抑制子epl1-T449A中没有去抑制(图S3D)。

在我们的无偏向筛选中，med20的等位基因频繁出现(14个抑制子中有3个)，并且是dcr1Δ最强的抑制子之一(图S4)。Med20是中介体头部模块中Med8/18/20“活动颚”亚复合物的一部分，其缺失会损害着丝粒周围沉默。我们获得的三个med20等位基因，命名为med20-1至med20-3，破坏了med20-1(Y44S)和med20-2(W37A)的保守残基，或者在med20-3的情况下，在F108处导致移码，导致在第128位提前终止并截短大约一半的蛋白质(图S4A)。我们通过回交和对med20突变体进行基因分型来确认这些抑制子(图S4B-S4D)。虽然med20-1和med20Δ都赋予了对HU的抗性且均对TBZ不敏感(图2A和S4E)，但只有med20Δ积累了着丝粒周围转录本dg/dh(图S4F)。事实上，med20-1抑制了dcr1Δ的沉默以及细胞静止表型(图S4F和S4G， )。因此，Med20在着丝粒周围沉默和dcr1Δ诱导的基因组不稳定性中的作用在功能上是可分离的，这意味着T-R应激触发位点位于着丝粒之外。med20-1导致全局暂停增加，在背景中显著升高(图2B)，同时基因体读数和TI下降(图2C和2D)。这表明med20-1通过限制过多的RNA聚合酶II逃逸来抑制dcr1Δ表型。与这种预测的功能一致，med20-1还限制了三重突变体中过多的基因体通读(图2D-2F)。

两个抑制子——rpb1-T481K和rpb2-R1118H——直接影响RNA聚合酶II全酶的大亚基。这两个等位基因都是不育的，我们通过将它们重新导入各自的突变体来验证其抑制能力(图2G和S3B)。这些等位基因破坏了RNA聚合酶II催化中心内彼此靠近的高度保守残基(图S5)，rpb1-T481K靠近协调离子用于双金属离子催化的NADFDGD基序，而rpb2-R1118H影响与转录泡内模板DNA和新生RNA接触的“开关3”区域。我们

《分子细胞》

图2. 通用转录因子介导R环依赖性复制应激

(A) WT、dcr1Δ、mh1Δ rnh201Δ和三重突变体dcr1Δ rnh1Δ rnh201Δ，有或没有突变的med20-1等位基因，在不添加或添加TBZ或HU的YES平板上的点样生长测定。

(B和C) dcr1Δ、med20-1和dcr1Δ med20-1中暂停指数(PIs)(B)和终止指数(TIs)(C)相对于WT归一化后的密度图。虚线表示每种基因型中位数。

(D) 使用PRO-seq通过对异步野生型(黑色)、dcr1Δ rnh1Δ rnh201Δ(红色)、med20-1(橙色)和med20-1 dcr1Δ rnh1Δ rnh201Δ(蓝色)细胞中3’-OH RNA末端进行测序来检测暂停的RNA聚合酶。读数如在图1H中那样进行归一化和映射。

(E和F) 在归一化为野生型后，dcr1Δ rnh12Δm120L、med20-1和med20-1 dcr1Δ rnh1Δ rnh201Δ中PI(E)和TI(F)的密度图。虚线代表每种基因型的中位数。

(G) 将野生型、dcr1Δ、rnh1Δ rnh201Δ和三重突变体dcr1Δ rnh1Δ rnh201Δ，有或没有突变的rpb1-T481K等位基因，点种在没有补充物或有TBZ或HU的YES平板上的斑点生长试验。

(H和I) 在归一化为野生型后，dcr1Δ、rpb1-T481K和dcr1Δ rpb1-T481K中PI(H)和TI(I)的密度图。虚线代表每种基因型的中位数。

通过进行PRO-seq进一步研究了rpb1-T481K。虽然我们观察到全局中位数暂停水平没有变化(图2H)，但rpb1-T481K导致TI显著降低，主导了dcr1Δ的表型(图2I)。我们推测苏氨酸到赖氨酸的突变取代了催化三联体，以类似于“慢”聚合酶突变体的方式损害了RNA Pol II的持续合成能力。靠近转录泡，已知共转录R环在那里产生，这与D:R杂交体在Dcr1依赖性暂停释放中的作用一致。

Dcr1的解旋酶活性促进基因组维持

由于先前的研究表明，dcr1-5(一种RNase III催化失活等位基因)在rDNA拷贝维持方面没有缺陷，这与dcr1Δ不同，我们进行了靶向结构域分析，以揭示Dcr1的哪一部分负责其基因组维持表型。我们删除了Piwi/Argonaute/Zwille(PAZ)样结构域(图S6A)、DUF283结构域、N端解旋酶结构域(ΔHel)以及包含dsRBD结构域和核保留信号的C端103个氨基酸(ΔC103)。我们还生成了dcr1-K38R和dcr1-K38A，破坏了保守的DExD解旋酶沃克A基序 (图3A)。如先前所述，着丝粒周围的沉默丧失，并且所有突变体中的细胞对TBZ有不同程度的敏感性(图S6B和S6C)，表明完整、有功能的Dcr1是正确的着丝粒功能所必需的。出乎意料的是，dcr1-K38A，但不是dcr1-K38R也不是dcr1-ΔHel，导致对CPT敏感(图3B、S6C和S6D)。由于解旋酶缺失没有CPT表型，因此dcr1-K38A代表一个显性等位基因。这种表型与RNase H是相加的，因为我们发现与所有测试的dcr1等位基因之间存在负相互作用(图S6E)。我们如先前所述重复了rDNA拷贝测定并发现只有dcr1-K38A，但不是dcr1-K38R，在减数分裂世代中未能维持野生型rDNA拷贝水平(图3C)。比较F0和F3之间的rDNA拷贝数，dcr1-K38A显示出rDNA拷贝的最严重损失，甚至超过dcr1Δ(图3D)，再次暗示了显性表型。PRO-seq分析仅在dcr1-K38A中揭示了暂停缺陷(图3E - 3G)并且没有显著的终止缺陷(图3F)，模拟了三重突变体(图1F - 1H)。

图3. Dicer的解旋酶结构域对于暂停和基因组稳定性是必需的

(A) 粟酒裂殖酵母Dcr1的结构域架构，突出显示了本研究中使用的突变体。未按比例绘制。

(B) 在不添加指定浓度的喜树碱(CPT)和羟基脲(HU)的YES平板上对野生型、dcr1-K38R和dcr1-K38A进行斑点生长测定。Rad51Δ作为阳性对照。

(D) F0和F3代中各种dcr1等位基因的相对rDNA拷贝数(野生型F0 = 1)的qPCR定量。

(E) 通过对异步野生型、dcr1Δ、dcr1 - K38R和dcr1 - K38A细胞中 - OH RNA末端进行测序来检测暂停的RNA聚合酶的PRO - seq。读取结果的映射和标准化方法与图1F相同。

(F和G) 根据(E)中的PRO-seq数据，将dcr1Δ、dcr1-K38R和dcr1-K38A中所有注释基因的PI(F)和TII(G)归一化至野生型后的密度图。虚线表示每种基因型的中位数。

Ago1在R环诱导的基因组不稳定中拮抗Dcr1

Dcr1的基因组稳定性功能在功能上与其在依赖sRNA的着丝粒周围沉默中的作用是可分离的，例如epl1-T449A和各种med20等位基因，它们抑制了一种缺陷但没有抑制另一种缺陷(图S3和S4)。由于Dcr1参与sRNA生物合成，我们进行了sRNA测序以确定RNase H缺失是否影响sRNA群体。我们在野生型的转录起始位点(TSS)检测到有义链sRNA的强烈峰值，其长度主要在25至40 nt之间(图4A和4B)。这些启动子衍生的sRNA的产生冗余地依赖于Dcr1和RNase H，反映了在暂停位点的早期转录终止。在转录终止位点(TES) 也观察到sRNA积累，并且也依赖于Dcr1和RNase H(图4A和4B)。然而，我们在终止位点的PRO-seq读数中没有观察到实质性变化(图1H和1J)。由于PRO-seq仅量化转录活性RNA聚合酶，在dcr1Δ 中转录终止位点下游积累的RNA Pol II并未积极参与转录，可能会经历替代的终止机制。

《分子细胞》

图4. Dicer从R环产生类似于损伤相关小RNA(sdRNA)的小RNA，这些R环通过Ago1介导复制应激

(A) 在野生型(黑色)、dcr1Δ(蓝色)、mh1Δ rmh201Δ(灰色)和三重突变体(红色)中检测小RNA(顶部)、染色体结合的Ago1(中间)和与Ago1相关的小RNA(底部)。小RNA、Ago1染色质免疫沉淀和Ago1 RNA免疫沉淀测序读数映射到所有注释基因，并按图1F进行标准化。

(B)野生型(黑色)、dcr1Δ(蓝色)、rnh1Δ rnh201Δ(灰色)和三重突变体(红色，以核苷酸(nt)表示)中总sRNA(左)和与Ago1相关的sRNA(右)的大小分布。

(D) 在不添加任何物质或添加指定剂量的噻苯哒唑(TBZ)、羟基脲(HU)和喜树碱(CPT)的YES平板上，对野生型以及rnh1Δ、rnh201Δ和ago1Δ细胞组合进行10倍稀释的斑点生长测定。

(E) 在不添加补充剂或添加指定剂量的噻苯哒唑(TBZ)、羟基脲(HU)和喜树碱(CPT)的YES平板上，对野生型以及mh1Δ、mh201Δ、ago1Δ和dcr1Δ细胞组合进行10倍稀释的斑点生长测定。

(F) 在无补充剂或添加指定剂量的TBZ、HU和CPT的YES平板上，对WT以及rnh1Δ、rnh201Δ、ago1-D580A和dcr1Δ细胞组合进行10倍稀释的斑点生长试验。

接下来，我们对小RNA结合蛋白Ago1进行了染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)，以分析其在常染色质转录本周围的结合模式。Ago1的结合模式在很大程度上与小RNA的模式一致，并且通过依次删除和而降低(图4A)。一种可能性是这些小RNA被加载到Ago1上，我们通过进行Ago1 RNA免疫沉淀(RIP)来进行测试。与在小RNA测序中观察到的转录起始位点(TSS)和转录终止位点(TES)峰相反，在基因体内发现了与Ago1相关的正义链小RNA，并且在dcr1Δ细胞中显著升高(图4A)。这些基因小RNA的大小为20 - 25个核苷酸，类似于着丝粒小干扰RNA(siRNA)(图4B)，因此与依赖Dcr1的启动子小RNA不同。

Ago1的ChIP-seq图谱在很大程度上与小RNA的图谱匹配，但如通过RIP-seq所确定的，小RNA未加载到Ago1上，这一观察结果使我们推测，在转录诱导的复制应激期间，Ago1通过以病理性方式结合染色质而对Dcr1起拮抗作用。因此，在高剂量的羟基脲(HU)和喜树碱(CPT)处理下，只有dcr1Δ而不是ago 表现出生长缺陷(图4C)。这促使我们对ago1进行进一步的遗传学研究。我们首先测试ago1是否会以与dcr1类似的方式与核糖核酸酶H(RNase H)发生遗传相互作用。我们观察到ago1Δ与或单独之间没有相互作用，但ago1缺失实际上抑制了rnh1 rnh201 细胞对HU和CPT的敏感性(图4D)，其作用方式与相反。这些结果与之前的提议一致，即Ago1在细胞周期检查点和胞质分裂的调节中作用于Dcr1的下游。因此，我们构建了dcrlΔ、ago1Δ和rnh1Δ rnh201Δ的突变体组合。我们观察到和之间没有负相互作用，因为双突变体在表型上与相同。然而，引人注目的是，ago 能够抑制使核糖核酸酶H突变体对HU和CPT超敏的能力(图4E)。上述结果表明，dcr1Δ使rnh1Δ rnh201Δ超敏需要Ago1。

在没有小RNA的情况下，Ago1在很大程度上仍与转录终止位点(TES)结合这一事实(图4A)表明Ago1具有独立于其经典RNA干扰功能的作用。相应地，切割缺陷型Ago1 - D580A未能抑制和三重突变体对HU和CPT的敏感性(图4F)。因此，启动子近端小RNA代表了一类独特的小RNA，其生物合成依赖于Dcr1和RNase H，但不与Ago1结合。

Dcr1限制高转录区域的基因组不稳定性

上述所有证据表明，Dicer调节新生转录以限制T-R应激。接下来，我们研究了在没有Dcr1的情况下复制是如何受到影响的。我们使用工程化的RTS1复制叉屏障(RFB)叉停滞试验评估了dcr1Δ如何影响叉的进展，其中Rtf1结合的RTS1以极性方式阻断复制体的进展，需要RDR进行拯救。尽管复制阻断与转录无关，但在该系统中已报道了D:R杂种的积累。 RDR容易发生复制滑移(RS) 并且可以用由片段重复的ura4-sd20等位基因产生的回复来检测(图5A) 。Dcr1的缺失导致RFB下游RS略有下降( 倍减少)，发生在复制重新启动期间(图5B)。相比之下，上游RS的频率与WT相比增加了倍。这可能表明新生链降解更广泛，导致RFB下游的叉重新启动在dcr1Δ中更频繁地发生。与该假设一致，在RFB处的二维凝胶电泳(2DGE)(图5C和5D)显示，当RFB被激活时，在RTS1屏障处有一个与停滞叉相对应的强信号。Exo1介导的切除叉可以被检测为朝向线性弧下降的尾巴，并且在dcr1Δ中信号更强(图5E)。

我们还分析了高度转录的rDNA重复序列中的复制叉进展，其中包含程序性RFB和特征明确的复制起点(图5F)。2DGE分析表明，虽然WT和dcr1Δ在对应于沿RFB的程序性叉暂停的Y弧上都显示出预期的强度(图5G和5H)，但只有dcr1Δ在包含起点的片段中积累了额外的暂停信号(图5H，红色箭头)，以及类似于重组中间体/联合分子的X峰结构。这些结果表明，当通过高度转录的rDNA单元进行复制时，dcr1Δ中的复制受到阻碍，如先前在着丝粒处观察到的那样。总之，我们的数据表明Dicer通过限制新生链降解来防止rDNA处的HR介导的叉重新启动和潜在的重组。

为了研究Dicer如何在全基因组范围内防止基因组不稳定,我们对DNA损伤特征进行了测序。组蛋白H2A(γH2AX)的磷酸化是面对DNA损伤时最早的反应之一。我们的结果显示在中TSS上游H2A磷酸化富集，以及三重突变体 rnh201Δ(图6A)，表明启动子周围存在持续的DNA损伤。为了探究损伤的性质，我们采用了3’OH末端的全基因组连接然后测序(GLOE-seq)，它检测游离的 -OH单链DNA末端，并将读数与转录的有义链或反义链进行比对。三重突变体在TSS和TES周围的游离3’-OH单链DNA末端在全基因组范围内增加(图6A)，表明暂停的RNA Pol II和未解决的R环导致了DNA断裂。一种可能性是这些断裂与迎面而来的T-R冲突有关(图6B):在转录反义链上，游离的单链DNA末端在TSS处积累，与RNA Pol II起始处的前导链终止一致。在转录有义链上，游离的 -OH单链DNA末端在暂停位点下游达到峰值，但在三重突变体中，另一个峰值在TSS紧上游积累(图6A)。这可能分别反映了通过同源重组(HR)对停滞或反向叉的处理以去除暂停的RNA Pol II，导致新生链切除(图5D)，以及由汇聚叉进行拯救(图6B)。

GLOE-seq还能检测到由冈崎片段产生的依赖复制的 -OH末端。因此，可以通过计算复制叉方向性(RFD)指数来推断复制模式的变化，RFD指数定义为基因组区域内反向链(克里克链)过量读数与总读数的比率。我们观察到全基因组范围内的RFD模式与标记复制起点的Orc4 ChIP-seq峰相对应(图6C)。在dcr1Δ和三重突变体中，这种偏差有所降低(图6C和6D)。虽然这可能是由于前导链读数增加或滞后链读数减少，或者复制速度普遍下降，但一个有趣的可能性是，由于存在暂停的RNA Pol II和未解决的R环，复制叉和相关的断裂在启动子处而不是在起点处积累。这支持了Dicer通过限制由路障引起的叉处理和切除来限制启动子相关断裂的观点(图5E)。

Dcr1可防止复制叉迎头停滞

为了区分这些可能性，我们使用纳米孔长读测序来估计

《分子细胞》

图5. Dicer促进程序性复制叉阻滞附近高转录基因的忠实复制

(A) 包含报告基因等位基因ura4-sd20(红色矩形)的构建体示意图，其与来自第三条染色体上rDNA位点的定向复制叉阻断元件RTS1-RFB相关联。RFB整合在距强复制起点(ori)5 kb处。去除硫胺素后，从着丝粒向端粒移动的复制叉以极性方式被阻断。ura4-sd20等位基因包含一个由微同源性侧翼的20 nt重复序列。当ura4-sd20等位基因由重新启动的复制叉复制时，非连续DNA合成会经历RS，导致重复序列的缺失和功能性ura4 基因的恢复。

(B) 所示菌株和构建体中RS的频率。柱状图表示平均值置信区间。使用学生检验进行统计分析，并与野生型进行比较。。

(C) 使用ura4作为探针，对异步野生型和dcr1Δ细胞中的复制中间体(RI)进行二维凝胶电泳(2DGE)分析。图中显示了在RFB上游发生滑动的硫胺素处理(RFB关闭)和未处理(RFB开启)细胞的代表性凝胶(A)。红色箭头表示“尾巴”信号，代表滞后链切除(D)。数字表示RFB 的标准偏差(SD)效率。

(D) 在RFB开启条件下，在Asel限制片段内观察到的RIs示意图。灰色线条表示补骨脂素交联的RIs部分消化产生的二次信号。注释见(G)。

(E) 来自 (C) 的切除叉的尾部定量。柱状图表示平均值标准误。使用学生检验进行统计分析，与野生型相比。。

(F) 第三条染色体上rDNA基因座的示意图。标明了探针和限制酶切位点。H，HindlII；B，BamHI；K，KpnI；ars，自主复制序列；ETS，外部转录间隔区；RFB，程序性和极性RFB。橙色箭头表示rRNA的转录单元。

(G) 二维凝胶电泳分析RI预期迁移行为的示意图。“Y弧”是一系列分支逐渐变长的Y形RI，由所分析DNA片段内复制叉的推进产生。“气泡弧”对应于复制起点的启动。垂直的X峰是由与dcr1Δ细胞中经历同源重组的RI对应的X形DNA连接分子产生的。

(H) 在野生型和dcr1Δ细胞中，通过二维凝胶电泳(2DGE)对包含起始位点的HindIII - KpnI限制片段(顶部)和包含复制叉阻滞位点(RFB)的BamHI - BamHI限制片段(底部)进行RI分析的代表性图像。红色箭头表示dcr1 细胞中起始位点两侧T - R碰撞产生的叉暂停信号，而黑色箭头分别表示野生型细胞中程序化RFB的位置。

* ，*** ；无显著性差异(NS)。

以全基因组方式分析单个复制叉。在此，用溴脱氧尿苷(BrdU)对能够掺入外源核苷的粟酒裂殖酵母菌株进行脉冲追踪，并使用NanoForkSpeed 检测BrdU掺入模式并将其分类为复制叉(图7A和7B；见STAR方法)。在野生型中，我们观察到野生型的复制叉速度中位数为分钟(图7C)，这与真核生物中的估计大致一致，尽管单个复制叉速度差异很大，范围

分子细胞

图6. Dicer在R环依赖性T-R碰撞中挽救停滞的复制叉

(A)在未同步化的野生型(黑色)、dcr1(蓝色)、rnh1Δ mh201(灰色)和三突变体(红色)细胞中检测DNA损伤、游离3′-OH单链DNA末端和游离3′-OH RNA末端(暂停的RNA聚合酶)。从上到下:(上部)通过yH2A X的ChlP-seq检测的DNA损伤，以组蛋白H2A进行标准化；(中部)通过GLOE-seq从转录的有义链和反义链检测游离3′-OH单链DNA末端；(下部)通过PRO-seq在转录暂停位点检测3′-OH RNA末端。GLOE-seq和PRO-seq的读数计数如在图1F中那样进行映射和标准化。

(B)转录起始位点(TSS)处的转录-复制碰撞、转录暂停位点处的复制叉逆转以及汇聚叉的拯救与游离单链DNA末端(A中的有义峰)在暂停位点下游停滞以及汇聚叉的前导链DNA末端在三突变体的TSS处停滞一致。野生型中暂停位点处以及dcr1Δ和三突变体细胞中终止位点(TES)处的游离单链DNA末端(A中的反义峰)对应于在转录-复制碰撞处停滞的前导链末端。

(C)对来自(A)的GLOE-seq数据进行复制叉方向性(RFD)分析。RFD定义为一个区域内反向(克里克链，REV)读数相对于正向(沃森链，FWD)读数的比率，计算为(REV - FWD)/(REV + FWD)。通过Orc4 ChlP-see (下部轨迹)检测复制起点，其对应于前导链到滞后链的转变。

(D)所有注释起点(pombase/oriDB)处RFD分布的小提琴图，揭示了和三突变体细胞全基因组范围内显著的复制叉不对称性。值代表单向方差分析的结果。

***p < 0.0005；NS，不显著。

从0.5到 (去除异常值的顶部和底部之后)。我们观察到各种突变菌株中复制速度的全局变化，在中复制速度中位数下降了，在三突变体中又下降了，降至 (图7C)。奇怪的是，我们在突变体中观察到速度有适度增加，考虑到R环积累通常与叉进展受阻相关，这令人惊讶。

我们将同向或迎面穿过注释基因的单个叉进行了分离。在核糖体DNA(rDNA)中，当叉迎面行进时，我们观察到速度大幅降低(图7D)，正如预期的那样。引人注目的是，在所有mRNA基因中，当叉迎面行进时，我们观察到复制速度有类似的显著降低，但仅在三突变体中如此(图7E)。导致复制全局减慢，而与转录方向性无关，这一事实与仅当R环积累时暂停缺陷才是病理性的一致，就像在突变体中那样。因此，Dcr1通过与R环的迎面碰撞促进叉的进展。

《分子细胞》

图7. Dicer通过处理R环拯救迎面而来但非同向的转录-复制碰撞

(A)用于通过纳米孔测序检测复制叉的脉冲追踪标记示意图。

(B)来自脉冲标记的野生型(FY2317)细胞的单个纳米孔测序读数示例，显示使用NanoForkSpeed处理后的BrdU含量。发散叉(复制泡)表现为标记核苷酸的簇，叉速度通过边界处相对信号密度的斜率计算。使用可用的专用软件生成图。

(C)野生型和突变体细胞中检测到的叉的全局估计复制速度的小提琴图。p值代表单向方差分析的结果。在和三突变体细胞中叉进展显著更慢。

(D)小提琴图展示了映射到rDNA位点的所有复制叉的估计复制速度，根据与rRNA转录的迎头(Head)或同向(Co)进行分离。值代表单因素方差分析的结果。

(E)小提琴图展示了注释mRNA转录本附近所有复制叉的估计复制速度分布，根据与转录方向的迎头或同向转录以及基因型进行分离。p值代表单因素方差分析的结果。

(F)在T - R碰撞期间Dicer对R环进行启动子近端切割的模型。所示的大多数蛋白质在复制应激期间是沉默所必需的和/或与Dicer负相互作用。

* ；NS，不显著。

讨论

Dicer是一种古老的蛋白质，被认为自最后一个真核生物共同祖先(LECA)以来就已存在。复制起点经常在转录起始位点(TSS)附近发现，产生T - R冲突，并且在酿酒酵母属中，序列特异性复制起点的出现与RNA干扰的丧失相关，这被认为会增加T - R冲突。我们在粟酒裂殖酵母中的发现支持了这一假设，将RNA干扰置于解决启动子处T - R冲突的关键角色(图7F):当RNA聚合酶II在TSS处病理性停滞时 - 例如当R环积累时 - Dcr1限制了计划外的暂停释放并且依赖于其解旋酶结构域的催化活性。这种功能的缺失会导致T - R冲突，从而导致复制应激。这得到了三条证据的支持。首先，Dcr1和核糖核酸酶H在全基因组表达基因的TSS和TES处的小RNA产生中协同作用，对应于在核糖核酸酶H突变体中积累的R环的位置，并且是T - R应激的标志(图1F和4A)。其次，遗传学研究(图2、S3和S4)鉴定了通用转录因子(GTF)的多个等位基因，强烈表明dcr1Δ诱导的T - R应激与早期转录之间的联系。第三，新生转录动力学的PRO - seq分析揭示了启动子近端暂停的改变，但终止行为的变化相对较小(图1F - 1H)。这进一步得到了Dcr1抑制剂med20 - 1的支持，其具有显著增强的暂停，特别是在dcr1Δ中(图2B - 2D)。

在三重突变体dcr1Δ rnh1Δ rnh201Δ中，细胞变得细长，有多个隔膜和细胞核(图1D)。因此，对复制表型的一种解释可能是细胞周期检查点的实施存在缺陷，可能导致在DNA合成完成之前进行有丝分裂进程。这在RNA干扰突变体中确实有充分的记录，但由于几个原因，这不太可能是主要原因。首先，虽然dcr1Δ和ago1Δ都是检查点缺陷型，但只有dcr1Δ对高剂量的基因毒性药物敏感(图4D)。此外，只有dcr1Δ，而不是ago1Δ，与rnh1Δrnh201Δ负相互作用(图4E)，排除了两者在同一途径中执行相同功能的可能性。ago1Δ能够部分抑制三重突变体表型(图4F)这一事实表明Ago1是表型表现所必需的。因此，我们得出结论，仅检查点调节缺陷不足以解释本研究中呈现的数据。

我们注意到Dcr1与整合酶复合物之间的相似之处，最近有研究表明，整合酶复合物通过内切核酸酶切割作用，将RNA聚合酶II从常染色质转录本中释放出来。首先，人类整合酶被招募到启动子近端暂停的RNA聚合酶II上，并且DICER与BRCA1和AGO1/2合作，在暂停位点产生20-35个核苷酸的损伤相关小RNA(sdRNA)，与本文报道的情况类似，这表明DICER也被招募到暂停的RNA聚合酶II上。我们观察到Dcr1在R环存在的情况下调节RNA聚合酶II位点的暂停，这进一步支持了这一点。其次，整合酶被认为是通过其置换的单链DNA链被招募到启动子近端的R环上。人类DICER和粟酒裂殖酵母Dcr1都能结合R环 (图1A和S1C)。因此，Dicer和整合酶在招募过程中具有共同机制。第三，整合酶通过切割机制终止暂停的RNA聚合酶II，在此过程中产生短RNA。我们的结果表明，启动子近端的小RNA部分依赖于功能性的Dcr1，这与人类DICER切割R环并在暂停位点产生小RNA的情况大致相符。最后，整合酶的RNA聚合酶II去除功能已被证明可以限制R环诱导的复制应激，这与我们发现Dcr1降低RNase H缺陷细胞中的基因毒性应激的结果相似。由于粟酒裂殖酵母缺乏整合酶复合物，我们认为粟酒裂殖酵母中的Dcr1在功能上等同于高等真核生物中的整合酶复合物，在启动子处终止病理性RNA聚合酶II，并在此过程中产生小RNA。事实上，在秀丽隐杆线虫中，整合酶通过终止启动子近端暂停的RNA聚合酶II参与PIWI相互作用RNA(piRNA)的生物合成，这表明早期RNA聚合酶终止与RNA干扰之间存在密切联系。

虽然我们不能排除RNase III结构域在介导T-R应激中的作用(图S6)，但解旋酶结构域似乎发挥了更突出的作用。例如，rDNA拷贝的维持不依赖于RNase III结构域的催化活性但依赖于功能性解旋酶(图3B)。在这里，我们发现Dcr1-K38A的突变，而不是Dcr1-K38R的突变，导致了额外的基因组不稳定表型。沃克A基序中的赖氨酸突变为精氨酸和丙氨酸，将分别消除ATP水解和结合，就像Rad51类重组酶的情况一样。事实上，黑腹果蝇Dcr-2在有或没有ATP或与不可水解的ATPγS一起孵育时，表现出不同的核酸代谢活性，这表明在Dicer中，ATP结合和水解也是可分离的事件，对Dicer活性产生不同的影响。

我们进一步研究了在没有Dicer的情况下基因组不稳定的后果。在dcr1Δ和rnh1Δ rnh201Δ中，我们都观察到TSS周围磷酸化H2A的积累，但只有在三重突变体中，它才表现为代表DNA断裂的可检测GLOE-seq峰(图6A)。这表明Dcr1或RNase H的缺失会激活DDR途径，这与磷酸化H2A是最早的损伤标记之一一致，但这不一定意味着存在DNA断裂。从GLOE-seq结果中，我们还观察到RFD图谱的改变，表明复制相关的断裂在启动子处而不是在起始点积累。我们通过2DGE分析以及使用长读测序的单分子复制图谱证明了这一点。我们表明，随着复制叉正面进入转录单元，复制直接减慢，这支持了Dcr1在存在R环时防止T-R冲突中的作用。

我们检测到小RNA(sRNA)映射到转录链的转录起始位点(TSS)和转录终止位点(TES)，这在很大程度上依赖于Dcr1和核糖核酸酶H(RNase H)(图4A)。反义sRNA的缺失表明正义链sRNA是新生转录本的切割产物。sRNA是否发挥功能作用仍不清楚，可能是Dcr1和RNase H通过核酸内切机制终止RNA聚合酶II(RNA Pol II)的结果。由于产生的sRNA未加载到AGO1上，因此它不太可能将AGO1招募到TSS和TES。

《分子细胞》

文章相反，有人推测AGO1是通过与R环结合而被招募的。事实上，AGO蛋白的PIWI结构域类似于RNase H结构域，并且原核AGO蛋白通常对DNA底物表现出很强的亲和力。 AGO1在Dcr1的下游起作用，我们发现AGO1确实被Dicer和RNase H招募到TSS，尤其是TES(图4A)。由于ago1Δ抑制了dcr1Δ的基因组不稳定表型(图4F)，我们提出AGO1异常招募到停滞的RNA Pol II对复制构成了障碍。

最近的进化研究表明，AGO蛋白和Dicer在被纳入沉默途径之前具有不同的功能。作为阿斯加德古菌的后代，真核生物共同祖先(LECA)很可能是与预先存在的功能性AGO蛋白一起进化的。事实上，已发现古菌AGO蛋白参与复制终止。另一方面，Dicer似乎是一种真正的真核生物特异性融合蛋白，其结构域起源于细菌和古菌。值得注意的是，与Dicer解旋酶最接近的原核同源物是一种古菌蛋白Hef，它参与解决停滞的复制叉。 AGO蛋白和Dicer的进化起源仍然是一个活跃的研究领域，并且在阿斯加德古菌中含有RNA引导的AGO蛋白的“防御岛”内发现了一个DExD结构域解旋酶和RNase III - dsRBD嵌合基因，这表明在LECA之前就出现了原始RNA干扰(RNAi)途径。然而，鉴于进化背景和本文给出的结果，我们推测Dicer和AGO蛋白的古老功能早于沉默途径的出现，并且在于限制复制应激。

研究的局限性

虽然本研究概述了Dicer影响TSS附近T - R碰撞的机制原理，但通过进一步实验将能获得更深入的理解。例如，PRO - seq只能检测活性RNA聚合酶，而其他形式的聚合酶也可能在基因体内构成复制障碍。同样，延伸到基因体内的R环需要其他检测技术，并且可能发挥与在启动子处发现的那些不同的额外作用。最后，我们没有探讨Dicer在转录终止中的作用，而这可能也很重要。

资源可用性

主要联系人

如需进一步信息以及资源和试剂请求，请联系主要联系人罗伯特·马丁森(martiens@cshl.edu)。

材料可用性

如有需要，可提供新生成的菌株，应联系主要联系人。

数据和代码可用性

所有原始数据和处理后的数据已存入基因表达综合数据库(GEO)，编号为GEO: GSE278850。原始成像数据已存入Mendeley数据，可通过doi: https://doi.org/10.17632/tbd9698xsj.1访问。
虽然本手稿中未生成新的脚本，但用于下游分析和图形生成的管道可在https://github.com/martienssenlab/R - loop - manuscript访问。
如需重新分析本文报告的数据所需的任何其他信息，可向主要联系人索取。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院(R35GM144206)和霍华德·休斯医学研究所授予R.A.M.的资助；居里研究所、法国国家科学研究中心、法国抗癌联盟基金会“2020年标记团队”(EL2020LNCC/Sal)、法国国家科研署基因分布项目、重新定义项目(ANR-19-CE12-0016-03)以及SpaceForkIN项目(ANR-23-CE12-0007)授予S.A.E. L.的资助；法国国家科研署(ANR-13-BSV2-0012-01)授予A.V.的资助；以及法国抗癌联盟授予F.A.的资助。作者感谢冷泉港实验室共享资源的协助，该资源部分由癌症中心支持基金(5PP30CA045508)资助。测序数据可在基因表达综合数据库(GSE278850)获取。

作者贡献

T.C.、A.V.、S.A.E.L.和R.A.M.设计了本研究；T.C.、B.R.、F.A.、L.T.-T.、K.F.、A.A.L.、S.B.、L.G.S.、E.J.、C.C.和J.R.进行了实验。T.C.在B.R.的协助下分析了数据。T.C.和R.A.M.撰写了论文。A.V.、S.A.E.L.和R.A.M.获得了资金。