胰腺癌中的支链氨基酸代谢通过调节脂肪酸进入线粒体的过程影响脂质平衡
发布时间：
2026-07-05 21:45
胰腺癌中的支链氨基酸代谢通过调节脂肪酸进入线粒体的过程影响脂质平衡
Klára Gotvaldová D, Jitka Špačková D, Jiří Novotný D, Kamila Baslarová D, Petr Ježek C, Lenka Rossmeislová D, Jan Gojda D 和 Katarína Smolková
摘要
背景:胰腺导管腺癌(PDAC)与宿主支链氨基酸(BCAAs)代谢紊乱有关，然而，BCAA代谢在PDAC发生或发展中的作用尚不明确。缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的线粒体分解代谢是一个多步骤过程，导致短链R-CoA物质的产生。它们随后可以作为短链肉碱(SC-CARs)从线粒体输出，用于合成代谢途径，或从细胞中释放出来。
方法:我们在体外研究了PDAC细胞中BCAA分解代谢的特异性以及细胞对BCAA饥饿的适应策略。我们使用代谢组学和脂质组学来量化对BCAA撤出的主要代谢变化。使用共聚焦显微镜和流式细胞术，我们量化了BODIPY探针的荧光和脂滴(LDs)的水平。我们使用BODIPY偶联的棕榈酸来评估脂肪酸(FAs)进入线粒体的转运。此外，我们还开发了一种定量SC-CARs(BCAA衍生代谢物)的方法。
结果:通过代谢谱分析，我们发现BCAA饥饿导致大量甘油三酯(TG)合成和LD积累。这与抑制活化的FA转运到线粒体基质有关。使用乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂和AMP激酶(AMPK)激活剂可挽救FA导入线粒体的抑制，这两种物质均调节肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1)的激活状态。
结论:我们的数据表明，BCAA分解代谢是长链肉碱(LC-CARs)导入线粒体所必需的，而这种联系的破坏导致活化的FAs重新导向TG合成并沉积到LDs中。我们提出，这种机制可保护细胞免受LC-CARs引起的线粒体过载，它可能是癌症生长过程中对氨基酸扰动的普遍反应的一部分，调节FA的处理和储存。
关键词:BCAA代谢、胰腺癌、线粒体、甘油三酯、脂滴、脂肪酸/转运、荧光显微镜、脂质组学
*通讯作者:
Katarína Smolková
katarina.smolkova@fgu.cas.cz
作者信息完整列表见文章末尾
引言
胰腺导管腺癌(PDAC)是最常见的胰腺肿瘤类型。在过去几十年中，其发病率和归因死亡率一直在持续上升[1,2]。PDAC患者的一年死亡率相当高，这引发了对PDAC代谢的深入研究，以确定可作为预防肿瘤发展靶点的代谢途径。尽管支链氨基酸(BCAAs)分解代谢途径的酶通常是已知的，但我们仍然缺乏关于BCAAs一般分解代谢命运的证据，特别是在癌细胞中的证据。我们目前认识到它们在转氨作用、完全氧化(以及在三羧酸循环中的利用)以及作为代谢前体中的作用，即BCAA衍生的乙酰辅酶A可以是胆固醇的前体，早期BCAA衍生的肉碱(BCAA-CARs)可以参与某些类型脂肪酸(FAs)的合成[3,4]。除此之外，BCAAs，主要是亮氨酸，在生理和病理条件下参与了雷帕霉素复合物1(mTORC1)信号通路的激活以及随后的合成代谢程序[5,6]。BCAA分解代谢与其他代谢途径的相互干扰尚未得到探索，这种相互作用尤其是在源自各自R-CoAs的短链肉碱(SC-CARs)水平上的后果仍然完全未知。
已有多项研究聚焦于支链氨基酸(BCAA)分解代谢在胰腺导管腺癌(PDAC)生长中的作用，但BCAA分解代谢如何促进癌症发展以及在何种程度上发挥作用尚不完全清楚。使用KC和KPC基因模型，Carrer等人在2019年[8]表明，BCAAs被代谢为乙酰辅酶A，特别是在肿瘤发展的早期阶段，即胰腺上皮内瘤变(PanIN)病变中。Li等人[9]证明了线粒体支链氨基酸转氨酶2(BCAT2)在PDAC发展中的作用，并表明其基因缺失会降低转氨活性和呼吸作用[9]，这与二氢硫辛酰胺支链转酰基酶E2(DBT)敲低的情况类似[10]。研究还表明，癌细胞中的BCAT2将癌症相关成纤维细胞提供的支链酮酸(BCKAs)重新氨基化为BCAAs。Lei等人[11]表明，乙酰化促进BCAT2降解，从而抑制BCAA分解代谢和胰腺癌生长。另一方面，BCAT2的过表达通过改善谷胱甘肽稳态使细胞和异种移植肿瘤对铁死亡诱导不敏感[12]。总之，已描述了PDAC中BCAA利用的几种情况，但原位情况可能会根据实际营养和促结缔组织增生情况以及全身底物分布进行调整。
可以合理推测，支链氨基酸(BCAAs)供应或摄入的紊乱会影响细胞行为，也可能影响癌症生物学。例如，BCAAs含量低的小鼠饲料延缓了KC小鼠胰腺上皮内瘤变(PanIN)的发展以及KPC小鼠胰腺导管腺癌(PDAC)的进展[9]。此外，由于泛素特异性蛋白酶1(USP1)去泛素化酶使支链氨基酸转氨酶2(BCAT2)稳定，含有高水平BCAAs的饮食促进了KC小鼠的PanIN[13]。目前，我们无法确定癌细胞中任何潜在的BCAAs利用是由于BCAAs在蛋白质合成中的必需性质，还是这种影响也是代谢性的。为了解决这个问题，我们对PDAC培养细胞中的BCAAs代谢进行了深入分析。我们在此报告，缺乏BCAAs会触发类似于细胞饥饿程序的适应性反应，导致脂滴(LD)积累。因此，我们描述了一种脂肪酸重定向至中性脂质合成的新机制，这也会影响线粒体生物能量学。在我们的模型中，BCAAs可能通过肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1)参与调节线粒体通过 -氧化氧化脂肪酸的能力。此外，我们的工作表明源自BCAAs的短链碳代谢物(SC-CARs)作为营养物质耗尽后下游代谢重塑的介质的作用。
材料与方法
细胞培养
在本研究中，我们使用了常用的人类培养癌细胞系PaTu 8902、MIA PaCa-2和PANC-1，其真实性已通过STR分析(捷克共和国巴里亚)得到确认。细胞在含有10%胎牛血清(Biosera)的1×RPMI 酚红、 的 HEPES、 青霉素/链霉素、1 mM丙酮酸钠、 葡萄糖、 谷氨酰胺以及视情况而定的 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸(各)中培养。根据实验要求，在-BCAA条件下的处理持续 ，即细胞活力测试持续 ，其他实验持续 。通常，在实验前一天更换新鲜培养基。
分析方法
为了分析支链氨基酸衍生的肉碱种类，我们与BIOCEV研究中心；查尔斯大学理学院质谱实验室的代谢组学设施合作，优化了基于液相色谱-质谱联用的方法。 细胞被用作起始材料。细胞沉淀用137 mM氯化钠和2.7 mM氯化钾洗涤，随后重悬于含有40%乙腈、40%甲醇和 蒸馏水中的甲酸的缓冲液中。样品在冰上孵育并振荡 ，在 以 离心，上清液蒸发并重悬于含有 吲哚-2,4,5,6,7- -乙酸(CDN同位素)作为内标物的 乙腈的 中。进样体积为 。样品在配备TSQ Quan-tiva质谱仪(赛默飞世尔科技)的戴安UltiMate 3000RS液相色谱系统中进行分析，使用电喷雾离子源正模式，具有以下离子源参数:离子传输管温度 ，蒸发器温度 ，喷雾电压 ，鞘气50，辅助气10。使用Luna Omega PS C18 (菲罗门公司，美国加利福尼亚州托伦斯)分离分析物。色谱柱保持在 。缓冲液组成如下:A:水中的 甲酸铵，0.1%甲酸，0.01%七氟丁酸；B:99.8%甲醇，流速为 ，总运行时间为24分钟。采用选择反应监测(SRM)检测和定量选定的化合物。数据在Skyline软件中处理。
对于三羧酸循环(TCA)和线粒体代谢物的靶向代谢组学分析，我们采用了先前报道的基于气相色谱 - 质谱联用(GC-MS)的方法。细胞先用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，胰蛋白酶消化，计数，速冻，并保存在 直至分析。每个样本至少使用 个细胞。细胞代谢物2-氧代戊二酸(347.3)、富马酸(245.2)、苹果酸(335.3)和柠檬酸(273.2)采用先前报道的方法[14, 15]进行测量。此外，基于在NIST质谱库中针对电子电离(EI)特定的分子离子(括号内)，该方法还考虑了分析物琥珀酸(247.2)、天冬氨酸(232.2)、丙氨酸(190.1)和谷氨酸(246.2)。DL-苹果酸-2,3,3-d，(338.3， of )用作内标。总分析时间为 。
对于脂质组学和代谢组学研究，细胞接种于6孔板中，按要求处理后，用PBS快速洗涤，速冻，并保存在 。代谢物采用冷甲醇、甲基叔丁基醚和水的双相溶剂系统进行提取[16]。收集底部(极性)相的一份等分试样，用乙腈/异丙醇混合物进行净化，蒸发后，将干燥提取物重悬于含0.2%甲酸的5%甲醇中，然后在Acquity UPLC HSS T3柱(沃特世)上进行分离。底部相的另一份等分试样蒸发后，重悬于乙腈/水混合物中，并在Acquity UPLC BEH酰胺柱上进行分离。代谢物在负离子和正离子电喷雾离子模式下进行检测(赛默飞世尔科技的Q Exactive Plus仪器)[17]。在后续统计分析之前，将信号强度归一化为各自的总离子计数(TIC)。补充材料2中提供了TIC归一化强度。
流式细胞术
实验前 ，将细胞接种于12孔板中。分析前 添加BCKA和CHS-FBS，而其他处理(DGAT1i、DGAT2i、3-MA)在 添加，或对于 进行分析前添加(巴弗洛霉素A、氯喹)。细胞用 BODIPY 493/503(赛默飞世尔科技)在PBS中染色 ，用PBS洗涤，并用胰蛋白酶消化收获。细胞沉淀重悬于含0.5 mM EDTA的PBS中，用HOECHST 33258(18 μM，默克)染色，使用BD LSRII流式细胞仪在488 nm激发和500 - 550 nm发射下测量荧光强度。使用FlowJo软件(LLC)分析每个活细胞(HOECHST 33258阴性)的BODIPY 493/503的FITC-A荧光强度，并表示为中位荧光强度，将其整合到最终图表中。
实时定量PCR
使用总RNA纯化试剂盒(耶拿生物科学公司)从新鲜细胞中分离RNA，然后使用TATAA GrandScript cDNA合成试剂盒(TATAA生物中心)进行逆转录。使用Forget-Me-Not EvaGreen qPCR预混液(Biotium)和CFX Connect实时定量PCR系统(伯乐)进行Q-PCR。计算得到的交叉点用于计算 值(与对照细胞相比)。引物序列总结在补充材料1的表S1中。
蛋白质免疫印迹法
细胞在含有 Tris-HCl(pH 7.5)、2 mM EDTA、150 mM NaCl、1% Triton X-100的细胞裂解缓冲液中裂解，该缓冲液含有 苯甲基磺酰氟(PMSF)、1%蛋白酶抑制剂混合物(用于 )，在冰上进行。然后将裂解物在 以6,000 xg离心5分钟。通过8 - 12% SDS-PAGE凝胶分离 蛋白质。SDS-PAGE电泳在 进行 ，随后在 进行 。在SDS-PAGE凝胶中分离的蛋白质使用在 进行 的槽式转移系统转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。随后，按照特定抗体的制造商建议，对PVDF膜进行封闭、冲洗，并与一抗和二抗孵育。最后，使用ChemiDoc MP成像系统(Bio-Rad)通过化学发光法检测蛋白质。
活力
将细胞接种到96孔板中，每孔密度为5000 - 10000个细胞。接种24小时后，更换培养基并添加抑制剂。再过 ，进行中性红测定[18]。
呼吸测定法
如先前报道[19]，使用耦合控制方案(CCP)和O2k呼吸计(奥地利Oroboros Instruments)对完整细胞应用高分辨率呼吸测定法(HRR)。在各自的生长培养基中测量细胞。对于完整细胞的 氧化，使用CCP方案，但将细胞重悬于含有1%胎牛血清的生长培养基中。
BSA - 棕榈酸酯缀合物的制备
与BSA缀合的棕榈酸酯制备如下。首先，在 中制备0.17 mM的无蛋白酶和脂肪酸的牛血清白蛋白V组分(Serva，服务科学家)溶液，并在 搅拌直至BSA溶解。然后将 棕榈酸钠通过在 搅拌制成 溶液。将溶液在搅拌下逐渐混合，在 的水浴中孵育 ，然后缓冲至 并最终定容至 棕榈酸酯: BSA。对于呼吸测量，将该 溶液用 RPMI培养基稀释至最终比例为 棕榈酸酯: BSA，并将细胞孵育 。
共聚焦显微镜检查
将细胞在涂有聚-L-赖氨酸的石英盖玻片上培养3天，直至细胞汇合度达到70-80%。然后，将细胞用 BODIPY (赛默飞世尔科技公司)与 HOECHST 33258一起在 于 进行染色。或者，对于线粒体导入实验，将细胞在培养基 中用500 nM BODIPY FL (赛默飞世尔科技公司)染色，随后在 于 用 MitotrackerRed 进行染色。盖玻片在PBS缓冲液中洗涤两次，然后置于配备有 的恒温箱中，并在常规培养基中通过共聚焦显微镜(徕卡TSC SP8 AOBS WLL MP)进行测量。使用HC PL APO NA W CORR CS2，WD 物镜，通过氩激光激发(488 nm)对两种BODIPY染料(BODIPY 和BODIPY FL )进行观察，发射滤光片为500 - 550 nm。对于MitotrackerRed(581644)，我们使用波长为 激发、 发射的WLL激光。对于HOECHST 33258，使用波长为 激发、发射滤光片为415 - 480 nm的氩激光。使用Fiji ImageJ软件将结果评估为与HOECHST 33342相关的BODIPY 493/五十三年荧光平均值(%)。
统计分析
所有以柱状图表示的数据均以均值和标准差(SD)表示。箱线图从最小值到最大值描绘。使用适用于Windows的GraphPad Prism 9.3.1版(GraphPad软件公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥，www.graphpad.com)进行统计显著性计算，采用单向或双向方差分析(ANOVA)，然后进行多重比较检验(软件推荐的Tukey检验、Dunnett检验和Sidak检验)。N代表独立实验的数量，n代表样本量。具有统计学显著性的 值在图中表示为* ** *** ，****p<0.0001。对于火山图， 值使用RStudio 1.4版中的Welch检验计算，使用matrixTests包https://CRAN.R-project.org/ package=matrixTests。如各图注中所指定，在Workflow4metabolomics [20]或Metabo-Analyst 5.0 0 [21]中进行多变量分析。
化学品
我们使用了以下特定化合物进行细胞处理。
化学品与标准
盐酸O-乙酰基-L-肉碱 默克 A6706
丙酰-L-肉碱(Acar 3:0) 默克 91275
虎尾草酰-L-肉碱(Acar 5:1) 默克 39588
异丁酰肉碱(Acar 4:0) 默克 91299
3-甲基巴豆酰-L-肉碱(Acar 5:1) 默克 28986
异戊酰-L-肉碱(Acar 5:0) 默克 91403
2-甲基丁酰-L-肉碱(Acar 5:0) 默克 91519
丁酰-L-肉碱(Acar 4:0) 默克 08984
戊酰基-L-肉碱(Acar 5:0) 默克 04265
(±)-β-羟基异丁酸钠 默克 36105
(±)-3-甲基-2-氧代戊酸钠盐(KMV) 默克 K7125
3-甲基-2-氧代丁酸钠(KIV) 默克 198994
4-甲基-2-氧代戊酸钠(KIC) 默克K0629
苯甲基磺酰氟(PMSF) 默克 329-98-6
蛋白酶抑制剂混合物 MERCK P8340
治疗方法
依替奥，肉碱棕榈酰转移酶1A抑制剂，默克236020，终浓度
二酰基甘油-O-乙酰转移酶1抑制剂A922500，默克A1737，终浓度10
二酰甘油-O-乙酰转移酶2抑制剂DGAT2i(PF-06424439、默克PZ0233)，终浓度
3-甲基腺嘌呤，自噬体抑制剂，默克M9281，终浓度1 mM
巴弗洛霉素A1(BafA)，自噬溶酶体形成抑制剂，艾博抗(Abcam)ab120497，终浓度100 nM
CQ，自噬溶酶体形成抑制剂氯喹，默克C6628，终浓度
ACCi，5-(十四烷氧基)-2-呋喃甲酸(TOFA)，艾博抗公司产品编号ab141578，终浓度
AICAR，5-氨基咪唑-4-甲酰胺1-β-D-呋喃核糖苷，默克A9978，终浓度
AMPKi、化合物C、默克171260，终浓度
盐酸左旋肉碱，默克C0283，终浓度1 mM
BCKA，即KIC(默克K0629)、KIV(默克198994)、KMV(默克K7125)，终浓度
抗体
抗BCAT2兔多克隆抗体，AB Clonal A7426
抗BCKDHA兔多克隆抗体，ABL克隆49806
抗PDHA1小鼠单克隆抗体，英杰公司459400
抗PDHA1(磷酸化S293)兔多克隆抗体，艾博抗 92696
抗ATP5A小鼠单克隆抗体，艾博抗(Abcam)ab14748
抗Tim23小鼠单克隆抗体，艾博抗(Abcam)ab176558
抗Gls1兔单克隆抗体，艾博抗(Abcam)ab156876
抗AMPK 兔多克隆抗体，Cell Signaling #2532
抗磷酸化苏氨酸172的AMPK 兔多克隆抗体，Cell Signaling #2531
山羊产生的抗兔IgG-过氧化物酶抗体，默克A0545
山羊抗小鼠IgG-过氧化物酶抗体，默克A4416
荧光染料
BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentame-thyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) ThermoFisher Scientific D3922
BODIPY FL (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl- 4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid), ThermoFisher Scientific D3821
MitoTracker Red FM, 581/644, ThermoFisher Scientific M22425
Hoechst 33342, ThermoFisher Scientific 62249
结果
培养的胰腺导管腺癌(PDAC)细胞中支链氨基酸(BCAAs)的氧化
为了评估缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸对源自胰腺导管腺癌的培养细胞(PaTu 8902、MIA PaCa - 2和PANC - 1)活力的总体贡献，我们在支链氨基酸缺失的培养基中培养细胞 ，并与无葡萄糖和无谷氨酰胺条件下相比测量其活力。与葡萄糖和谷氨酰胺饥饿类似，支链氨基酸缺失(-BCAA)抑制了所有三种测试细胞系的细胞生长和细胞存活(图1a)，但该效应与去除谷氨酰胺或葡萄糖不具有叠加性(未显示)。为了解决支链氨基酸是否是有助于三羧酸循环周转的氧化底物这一问题，我们测量了在支链氨基酸缺失条件下三种癌细胞系的呼吸参数。除MIA PaCa - 2在最大呼吸时外，支链氨基酸饥饿导致所有三种源自胰腺导管腺癌的细胞系的呼吸速率下降，基础呼吸(图1b)和最大呼吸(图S1a)均下降。葡萄糖饥饿细胞中呼吸和三羧酸循环中间体的升高可归因于瓦尔堡效应和克雷布斯效应的部分解除抑制[22]。支链氨基酸缺失导致三羧酸循环中间体略有下降，但参与线粒体转氨反应的游离氨基酸水平，即丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸未下降(图1c)。在支链氨基酸饥饿条件下，线粒体网络形状(图S1c)以及特定亚区室的线粒体蛋白表达(BCKDHA、BCAT2、TIM23、ATP5A、PDH、P - PDH、GLS1；图S1d)均未受影响，但我们能够检测到支链氨基酸分解代谢基因表达的一些下调(图S1b)。此时，我们无法得出支链氨基酸在体外培养的胰腺导管腺癌细胞中是否被完全氧化，或者它们是否支持线粒体中其他氧化底物的途径从而导致呼吸下降的结论。因为我们已经证实处于支链氨基酸缺失条件下的胰腺导管腺癌细胞是有活力的并且通过呼吸消耗氧气，所以我们认为这些条件是后续实验的有效模型。
图1支链氨基酸饥饿影响细胞生长和线粒体代谢。a细胞活力测定，比较饥饿72小时后无葡萄糖(-Glc)、无谷氨酰胺(-GIn)和无支链氨基酸(-BCAA)条件。双向方差分析后进行Tukey多重比较检验。N > 4，n > 50。显著性标准:* ；** ；*** *** 。b使用指定细胞系和饥饿条件(包括支链氨基酸)通过高分辨率呼吸测定法测量完整细胞的呼吸。实验前细胞在无支链氨基酸条件下饥饿48小时。双向方差分析后进行Tukey多重比较检验。N>3，n≥6。显著性标准:*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，***p<0.0001。c通过气相色谱 - 质谱法测量的线粒体代谢物水平，表示为与完全培养基(对照)相比的log2倍变化。实验前细胞饥饿48小时。柠檬酸(CIT)、2 - 氧代戊二酸(2OG)、琥珀酸(SUCC)、富马酸(FUM)、苹果酸(MAL)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)和丙氨酸(Ala)
无支链氨基酸条件诱导线粒体和线粒体外途径的代谢变化
除了在氧化或转氨作用中发挥作用外，支链氨基酸(BCAA)分解代谢还与胰腺导管腺癌(PDAC)中脂肪组织中奇数链和支链脂肪酸(FAs)、脂肪酸、甘油三酯(TGs)[23]以及胆固醇[8]的合成有关。我们研究了这些代谢途径是否会受到PDAC中BCAA缺失的影响。为了以复杂的方式分析与BCAA消耗相关的代谢重塑，我们对在BCAA耗尽条件下处理的细胞提取物进行了代谢组学和脂质组学分析，并寻找细胞系之间的共同特征。首先，对极性和非极性分析物的多变量分析导致在主成分3(PC3，t3)中对 -BCAA和+BCAA组进行分层(图2a)。与PC3相关的代谢物在载荷图中呈现，包括代谢途径甘油三酯、醚连接甘油三酯(TGs-O)、胆固醇酯(CEs)和游离氨基酸的分析物，而在下调的代谢物中，有BCAA分解代谢的下游代谢物，包括短链碳链氨基酸(SC-CARs)和支链碳链氨基酸(BCAA-CARs)。这些途径的变化也通过单变量分析确定，并在火山图中突出显示(图2b)。SC-CARs(包括BCAA-CARs)由线粒体肉碱O-乙酰转移酶(CRAT，EC 2.3.1.7)在BCAA分解代谢途径中产生的各自的R-辅酶A中间体合成，如先前所示[3,4]，代表BCAAs合成功能的前体。受BCAA饥饿影响最显著且一致的脂质是甘油三酯 ，以及分别对PaTu 89,02、MIA PaCa-2和PANC-1而言的 ；图S2)。
在BCAA耗尽条件下，脂滴的形成和自噬上调
我们进一步尝试解释在支链氨基酸(BCAA)耗竭时导致甘油三酯(TG)积累的机制。为了确认并扩展脂质组学数据，我们使用荧光探针BODIPY (以下简称BODIPY)对TG进行染色，采用流式细胞术和共聚焦显微镜观察。成像实验显示，在缺乏BCAA的细胞中脂滴(LD)积累，尤其是在MIA PaCa - 2和PaTu 8902细胞中(图3a、b、S3b)。有趣的是，肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1)抑制剂依托莫昔芬(ETO)也会导致LD积累，这表明我们观察到脂肪酸(FA)库从线粒体转向TG合成。事实上，抑制二酰甘油O - 酰基转移酶1(DGAT1)，这是催化TG合成最后一步的酶之一，导致MIA PaCa - 2和PaTu 8902细胞中LD形成下调(图3b、c、S4e)，通过流式细胞术定量(图S3a)。然而，抑制DGAT2对阻止LD形成无效。用活性炭处理的血清(CHS - FBS)处理细胞 以抑制FA进入细胞，与缺乏BCAA的处理相比，并未导致LD形成显著减少，这表明TG是由内源性FA合成的。因此，我们用3 - 甲基腺嘌呤(3 - MA)抑制自噬体形成，用巴弗洛霉素A(BafA)和氯喹(CQ)抑制自溶酶体形成，以减少源自降解膜的FA的可用性[24]。3 - MA、BafA和CQ有效地降低了缺乏BCAA样本中的BODIPY荧光，但在含有BCAA的样本中未降低，表明自噬在BCAA饥饿期间发生，并通过释放FA促进LD积累。因此，BCAA饥饿类似于先前报道的其他营养饥饿模型(汉克斯平衡盐溶液，HBSS)[25 - 27]。在缺乏BCAA的胰腺导管腺癌(PDAC)细胞中，几乎未观察到催化LD形成的酶的基因表达变化(补充图S3c)。我们得出结论，BCAA耗竭通过依赖DGAT1的途径诱导TG合成，并且如使用自噬抑制剂处理所证明的，自噬被启动。重要的是，补充支链α - 酮酸(BCKA)在无BCAA条件下阻止了LD形成这表明源自BCAA的代谢物和BCAA分解代谢，而非BCAA本身，意味着TG积累的作用(图3b、S3b)。
图2 BCAA饥饿诱导代谢重塑。a偏最小二乘判别分析(PLS - DA)得分图(左)描绘了基于PC3(t3)中BCAAs的存在与否对样本进行分层的情况。PLS - DA使用TIC归一化数据在Workflow4metabolomics中进行。与PLS - DA对应的载荷图(右)显示BCAA/BCKA与TG种类之间呈负相关。b与 + BCAA处理相比， - BCAA处理细胞的火山图描绘了几种脂质和代谢类别，即BCAA/BCKA、短链肉碱(SC - CAR)、源自BCAA的肉碱(BCAA - CAR)、长链肉碱(LC - CAR)、胆固醇酯(CE)、二酰甘油(DG)、胆固醇、甘油三酯(TG)醚键连接的TG(TG - O)、游离脂肪酸(FA)、游离氨基酸(AA)和三羧酸循环代谢物(TCA)。在实验前细胞饥饿48小时。P值通过使用RStudio中的matrixTests包进行的韦尔奇t检验计算。
(见下页图。)
图3 在缺乏支链氨基酸(BCAAs)的胰腺导管腺癌(PDAC)细胞中，甘油三酯合成和脂滴上调。a 左图，使用BODIPY 493/503(绿色)对中性脂质进行成像，使用Hoechst 33342(蓝色)对细胞核进行成像，显示PaTu 8902和MIA PaCa-2细胞中脂滴的积累。右图，BODIPY 493/503荧光强度的量化表示为相对于HOECHST 33342的百分比。N = 2，n≥4。采用单因素方差分析(ANOVA)，随后进行Tukey多重比较检验。b PaTu 8902(上)和MIA PaCa-2(下)的流式细胞术；从 事件计算的BODIPY™ 493/503平均荧光强度。在实验前，细胞在缺乏BCAA的条件下饥饿48小时。颜色编码:黑色代表对照，绿色代表3-MA，橙色代表CQ，玉米黄色代表BafA，蓝色代表 -BCAA，红色代表BCKA，浅蓝色代表DGAT1i，粉色代表DGAT2i，灰色代表活性炭处理的血清。采用单因素方差分析，随后进行Tukey多重比较检验。N>3，n≥6。显著性标准:*p<0.05；**p>0.01；***p<0.001，***p<0.0001。c 工作方案(右图)描绘了实验中使用的抑制剂，可能与脂滴形成有关。肉碱棕榈酰转移酶1A抑制剂(CPT1，依托莫昔芬(ETO)，50 μM)，二酰甘油-O-乙酰转移酶1抑制剂(DGAT1，A922500，10 μM)，二酰甘油-O-乙酰转移酶2抑制剂(DGAT2)，PF-06424439，20 μM)，自噬起始抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA，1 mM)，自噬抑制剂巴弗洛霉素A1(BafA，100 nM)，自噬抑制剂氯喹(CQ，100 μM)，活性炭处理的胎牛血清(CHS-FBS)。由BioRender.com创建
图3(见上一页图例)
在无支链氨基酸的条件下，脂肪酸从细胞质向线粒体的转运受到抑制
先前的研究报道了在饥饿模型中脂解衍生的脂肪酸向线粒体的转运[26, 28, 29]，因此我们询问支链氨基酸水平是否会干扰脂肪酸激活及其后续储存与氧化的动态过程。为了确定支链氨基酸 - 脂肪酸相互作用的功能后果，我们使用高分辨率呼吸测定法来估计在有和没有支链氨基酸的情况下，牛血清白蛋白 - 棕榈酸刺激的 氧化。无法将长链肉碱 - 酰基载体转运到基质空间会导致呼吸速率降低。这种方法的缺点是，牛血清白蛋白 - 棕榈酸刺激的呼吸在常规状态下通常不被识别，但在最大呼吸速率方面可以预期会有明显差异(见安捷伦科技公司的“棕榈酸氧化应激测试试剂盒”相关方案)。实际上，在缺乏支链氨基酸的细胞中，添加脂肪酸16:0后的最大呼吸速率较低，并且在含有支链氨基酸的培养基中，依托莫昔芬(ETO)处理能够更大程度地抑制呼吸(图4a，S4a)。该实验表明，在缺乏支链氨基酸的细胞中，长链肉碱 - 酰基载体到达线粒体基质的速率较低，并且在对照细胞中 氧化功能正常。
为了进一步阐述我们的假设，我们使用了荧光脂肪酸共轭物(从这里开始为BODIPY FL ，C16 - BODIPY)并追踪其细胞命运。正如预期的那样，用ETO处理导致脂肪酸共轭物沉积到脂滴中(图4b)。反之，用DGAT1i处理会诱导荧光棕榈酸酯进入线粒体。然而，在支链氨基酸缺乏的条件下，进入线粒体的过程显著减轻，并且通过补充BCKA或支链氨基酸得以挽救(在下一章中详述)。成像和生物能量学数据均一致显示在支链氨基酸缺乏的条件下脂肪酸中间体向线粒体的递送存在缺陷。线粒体网状结构的C16 - BODIPY染色减少表明肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)和/或肉碱 - 脂酰肉碱转移酶(CACT)受到抑制，但 -氧化或肉碱棕榈酰转移酶2(CPT2)未受抑制。
为支持成像数据的结论，我们对在添加或不添加支链氨基酸(BCAA)条件下培养的MIA PaCa-2细胞进行了脂质组学分析，这些细胞用二酰甘油酰基转移酶抑制剂(DGATi)和依他莫昔芬(ETO)处理。我们预期抑制肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)的功能会导致长链肉碱(LC-CAR)水平下降，而抑制 -氧化或肉碱/有机阳离子转运体(CACT)[30]会导致LC-CAR积累(图S4b)。首先，用DGAT1抑制剂处理诱导了大量的LC-CAR和脂肪酸(FAs)(图4c)，尽管相对于用DGAT1抑制剂处理的添加BCAA的细胞，在BCAA饥饿的细胞中只有脂肪酸水平更高(图S4d)。作为概念验证，我们还用ETO处理细胞，观察到LC-CAR大量下调以及脂肪酸和甘油三酯(TGs)上调(图4c，S4e)。同样，BCAA耗竭也导致LC-CAR水平降低和脂肪酸水平升高，添加支链α-酮酸(BCKA)可有效挽救这种情况。还值得注意的是，CPT1抑制导致分子量更高的甘油三酯积累(54个碳及以上，图S4e)，而有趣的是，BCAA短缺导致碳数和饱和度水平的均匀变化。
基于成像和生物能量学评估，我们得出结论，BCAA饥饿通过抑制CPT1和/或CACT损害了LC-CAR向线粒体基质的转运，因此……
(见下页图。)
图4 在BCAA饥饿的细胞中，脂肪酸向线粒体的转运转向甘油三酯合成。a 使用高分辨率呼吸测定法测量完整细胞(PaTu 8902)的常规或最大呼吸。添加或不添加ETO的牛血清白蛋白 - 棕榈酸酯(FA 16:0)的呼吸速率表明了 -BCAA和 +BCAA处理之间的差异。该测定在含有1%胎牛血清和牛血清白蛋白 - 棕榈酸酯(34 μM牛血清白蛋白，200 μM棕榈酸酯)的RPMI中进行。采用单因素方差分析，随后进行Tukey多重比较检验。N > 3，n ≥ 9。显著性标准:***p < 0.001，***p < 0.0001。b 使用荧光脂肪酸共轭物(BODIPY FL C ，C16 - BODIPY，绿色)和线粒体网络(Mitotracker™ Red)的共聚焦显微镜成像显示，仅在含BCAA的处理中，荧光标记的棕榈酸酯才会导入线粒体，在DGAT1抑制剂处理的细胞中(甘油三酯合成抑制)这种导入增加。在BCAA缺乏条件下未观察到C16 - BODIPY的导入。ETO处理抑制C16 - BODIPY导入线粒体并诱导脂滴形成。c 在指定条件下，即 -BCAA、+BCAA、ETO处理和DGAT1处理下，LC-CAR和脂肪酸种类的Log2倍变化，活化脂肪酸(R - CoA)将被重定向到甘油三酯合成。然而，考虑到BCAA饥饿时LC-CAR下降以及C16 - BODIPY的线粒体靶向减少，我们倾向于CPT1而非CACT抑制导致脂滴积累的可能性。
图4(见上一页图例。)
支链氨基酸衍生的短链酰基肉碱连接线粒体支链氨基酸代谢和甘油三酯代谢
接下来，我们旨在确认在 -BCAA 条件下 BCAA - CARs 的短缺情况。或者，可能存在其他代谢物在 -BCAA 条件下减少，并且调节 LC - CAR 进入线粒体。在 PLS - DA 分析(图 2a，b)中，PC3 末端中 TG 和 BCAA/BCKA 物种的分层表明 BCAA 与 TG 代谢之间存在负相关。因此，我们对 TG 与数据集中所有可用的单个代谢物/脂质进行了相关性分析，计算了 Pearson 系数，并寻找负相关，因为补充此类代谢物理论上应能挽救 BCAA 耗尽条件下 C16 - BODIPY 的导入。为了分析测试化合物对 SC - CAR 水平的挽救作用，我们优化了基于 LC - MS 的方法来检测 BCAA - CARs，即异戊酰、异丁酰、2 - 甲基丁酰、惕各酰以及下游物种丙酰和乙酰肉碱。该方法能够区分丁酰/异丁酰肉碱和戊酰/异戊酰肉碱的异构体。我们证实了在 BCAA 饥饿期间 BCAA - CARs 的下调，但乙酰肉碱除外(图 5a)，乙酰肉碱并非专门针对 BCAA 分解代谢。有趣的是， - 氧化产物丁酰和戊酰 - CAR 的水平没有变化。BCAA - CARs 的水平通过 BCKAs 和肉碱处理得到挽救(图 5b)，但乙酸盐、甲基丙酮酸、泛酸或二甲基 酮戊二酸(与 TG 呈负相关的代谢物)则没有这种作用。同样，BCKAs 与 -BCAA 处理一起挽救了 C16 - BODIPY 进入线粒体，游离肉碱和 BCAA 过夜处理也有同样效果(图 5c)，但泛酸和二甲基 酮戊二酸则没有(图 S5)。这些数据证实线粒体中 BCAA 的氧化导致典型 SC - CAR 物种的形成，并且 BCAA 饥饿期间它们的减少可以通过 BCKAs 得到挽救。
乙酰辅酶 A 羧化酶调节 BCAA 饥饿诱导的 LD 形成
先前已观察到，在饥饿以及自噬通量激活、内质网应激和mTORC1失调的情况下会出现脂滴积累[25, 27, 31, 32]。在底物饥饿期间处理代谢通量的另一种保守机制是AMPK信号传导[33 - 35]。AMPK的一个靶点是乙酰辅酶A羧化酶(ACC)，其产物是丙二酰辅酶A，一种有效的CPT1抑制剂[34]。活化的AMPK对ACC的磷酸化抑制了其活性，这导致丙二酰辅酶A水平下调，并解除了对CPT1的潜在抑制。为了测试ACC活性对支链氨基酸饥饿诱导的脂滴形成的影响，我们在用ACC抑制剂(TOFA，ACCi)处理后检测了BODIPY荧光。我们观察到在支链氨基酸缺乏的条件下BODIPY荧光显著降低(图6a，c)，证实了CPT1抑制在缺乏支链氨基酸的情况下有助于脂滴的形成。接下来，我们测试了AMPK的磷酸化状态(即激活状态)，并观察到在支链氨基酸饥饿的细胞中AMPK磷酸化受到抑制(图6b，S6b)。随后，我们使用ACCi、AMPK激活剂AICAR和AMPK抑制剂Compound C(Comp C)对BODIPY荧光进行了定量。在支链氨基酸缺乏的条件下，AICAR将脂滴抑制到对照水平。相反，Comp C在对照细胞中诱导了BODIPY荧光，但在支链氨基酸饥饿的细胞中没有(图6c)。此外，ACCi和AICAR抑制了C16 - BODIPY的脂滴染色，有利于其进入线粒体，在富含支链氨基酸的细胞以及支链氨基酸饥饿的细胞中均是如此(图6d)，而Comp C完全阻止了C16 - BODIPY进入线粒体。为了验证这种激活/抑制轴在我们的细胞系统中是否有效，我们使细胞缺乏葡萄糖和谷氨酰胺，并验证了C16 - BODIPY的导入(图S6a)。正如预期的那样，葡萄糖的去除导致荧光染料进入线粒体，而谷氨酰胺饥饿导致脂滴形成以及C16 - BODIPY极少进入线粒体。这些数据表明，由于ACC和AMPK活性的变化，在支链氨基酸饥饿的细胞中脂肪酸进入线粒体的过程受到抑制。
甘油三酯合成可保护细胞免受线粒体中长链 - 肉碱过载的有害影响
此外，我们询问脂滴形成是否是有助于细胞在支链氨基酸饥饿中存活的适应性表型的一部分。人们普遍认为，甘油三酯合成可能会中和细胞质中非酯化脂肪酸(尤其是多不饱和脂肪酸(PUFAs))的潜在毒性作用，多不饱和脂肪酸易于氧化并可导致细胞脂毒性[36 - 38]。实际上，在支链氨基酸饥饿的细胞中，多不饱和脂肪酸水平在不同程度上升高，尤其是在MIA PaCa - 2细胞中(图S7a)。甘油三酯池中酯化的脂肪酸饱和度也显著降低(图S7b)。如果甘油三酯合成中和了潜在的脂毒性，那么在支链氨基酸耗尽的细胞中抑制DGAT1会更有害。另一方面，Nguyen等人的报告[25]暗示，在饥饿细胞中DGAT1诱导的毒性是由于脂肪酸(长链 - 肉碱)直接进入线粒体而没有先沉积到甘油三酯中，导致“线粒体的选择性脂毒性功能障碍”。如果应用于我们的系统，DGAT1i处理对能够将脂肪酸导入线粒体的细胞(即完全条件下的细胞和葡萄糖饥饿的细胞，但不是谷氨酰胺饥饿或支链氨基酸饥饿的细胞)会更有害。在培养基中含有支链氨基酸的细胞中，抑制甘油三酯合成对细胞的损害明显更大，在这些细胞中脂滴积累不太明显(图7a)。似乎在没有支链氨基酸的情况下诱导形成脂滴是脂肪酸进入线粒体受阻的结果，而不是对细胞质脂毒性的反应。此外，支链氨基酸饥饿的细胞对ACCi处理(诱导线粒体脂肪酸导入)不太敏感，这可能是因为如Nguyen等人[25]所暗示的，处理前线粒体中的脂肪酸负载较低。
图5 BCAA衍生的肉碱作为LC-CAR氧化的调节剂发挥作用。a 通过LC-MS方法定量测定-BCAA处理后BCAA-CARs的Log2倍变化。配对t检验。N>3，n≥9。显著性标准:***p<0.001，***p<0.0001。b BCAA-CARs在BCAA缺乏条件下与BCKA、游离肉碱及其他与线粒体代谢相关化合物的拯救作用。c 共聚焦显微镜显示BCAA(过夜)、BCKA(48小时)和游离L-肉碱(1 mM，过夜)处理对线粒体脂肪酸导入的拯救作用
用DGAT1i抑制LD形成被认为会将脂肪酸重新导向线粒体，这会导致线粒体脂毒性，而在缺乏BCAAs或谷氨酰胺的情况下可以预防这种脂毒性。为了验证这一想法，我们研究了停止抑制CPT1是否会使细胞对DGAT1抑制敏感。ACCi挽救了BCAA饥饿细胞中线粒体对C16-BODIPY的摄取(图6d)。ACCi与DGAT1i联合使用的负面影响在葡萄糖饥饿细胞或完全培养基中的细胞中更为明显，但在所有测试细胞系中累加效应都很明显(图7b)。因此，与能够轻易摄取脂肪酸的细胞相比，谷氨酰胺或BCAAs饥饿的细胞中线粒体对LC-CARs摄取的抑制具有保护作用。这一系列证据表明，抑制LD形成并强制将活化脂肪酸导入线粒体对细胞活力可能有害，且有害作用的程度取决于预先存在的线粒体脂肪酸负载量。
总之，我们证明线粒体和LDs都是自噬过程中释放的脂肪酸的缓冲隔室。由于TG合成受到抑制，游离脂肪酸被转运到线粒体中，从而导致细胞毒性。然而，缺乏某些氧化底物，如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺，可能通过AMPK-ACC-CPT1轴抑制脂肪酸向线粒体的转运，并防止线粒体的脂毒性功能障碍。
讨论
全身性BCAA波动伴随PDAC进展，以及与PDAC相关的癌症恶病质的发展[39]。BCAAs对PDAC肿瘤生长的重要性仍不清楚；有研究表明，在体外和体内，PDAC细胞对BCAAs的代谢利用既增加又可忽略不计[8-10, 12, 13, 23, 40]。因此，我们分析了BCAA代谢与其他代谢途径的相互作用，并证明PDAC来源细胞的BCAA饥饿会导致TG合成增加和LD生物合成增强，这可能是持续自噬产生脂肪酸的结果。非脂肪组织中LD的形成是一种在各种代谢信号后避免脂肪酸在细胞质中过量的策略，而脂解随后的 -氧化是利用TG释放的脂肪酸的主要机制。在此，我们讨论在缺乏BCAAs的情况下，线粒体对LC-CARs摄取的下调也有助于LD生物合成。
为了评估BCAAs的代谢功能，我们评估了来自具有不同遗传背景的人PDAC的三种细胞系的生物能量学和代谢组学特征。令人惊讶的是，我们发现BCAA缺乏会导致TG合成，在较低程度上也会导致CEs合成，从而导致LD积累(图2a、b和图3a \b)。这与在心肌中的观察结果相反，在Zucker肥胖大鼠中，限制BCAA饮食后心肌中的TG池减少[41]。然而，我们的模型可以被视为细胞水平上氨基酸饥饿的替代模型，氨基酸饥饿已被证明会引发细胞膜的消耗和随后的LD生物合成[25, 26]。尽管我们没有研究BCAA缺乏下自噬起始的细节，但我们的数据表明，BCAA饥饿本身能够引发自噬，类似于HBSS处理[25, 26]。PDAC细胞中自噬的诱导也被描述为对谷氨酰胺或葡萄糖去除的反应[42, 43]。我们工作的创新之处在于实验证据表明，BCAA缺乏细胞中DGAT1依赖性TG合成是活化物质递送受损的结果
(见下页图)
图6 ACC的抑制挽救了线粒体脂肪酸的导入并减少了脂滴。a 在MIA PaCa-2细胞中，共聚焦显微镜显示ACCI处理后脂滴的损失。b AMPK以及磷酸化的AMPK(P-AMPK，磷酸化的AMPKa(Thr172))的蛋白质水平。c 用BODIPY染色并用ACCi(10 μM，过夜)、AICAR(500 μM，过夜)和化合物C(10 μM，过夜)处理的PaTu 8902和MIA PaCa-2细胞的流式细胞术，与对照相比。单向方差分析后进行Tukey多重比较检验。N = 3。n≥5。d 在MIA PaCa-2细胞中，共聚焦显微镜显示ACCi、AICAR和化合物C处理后的C16-BODIPY染色 脂肪酸进入线粒体，并将其重新导向合成代谢反应。使用一系列方法，我们已经证明了线粒体中脂肪酸利用与甘油三酯池中脂肪酸储存之间的相互关系，反之亦然(图4b、c、S4e)。因此，与之前的报道相比，我们的研究揭示了一种导致脂滴积累的新细胞机制，即细胞质脂肪酸向线粒体的导入受到抑制，从而导致脂滴生物合成。
图6(见上一页图例。)
图7 脂肪酸向线粒体的导入对细胞活力有负面影响。a 在含或不含支链氨基酸的培养基中，用DGAT1i、DGAT2i和ACCi处理MIA PaCa-2细胞72小时后的细胞活力。数值为未添加药理抑制剂的各自对照的百分比。单向方差分析后进行Tukey多重比较检验。N>3，n>12。显著性标准:*** p<0.001，*** p<0.0001。b 在完全培养基、无谷氨酰胺、无葡萄糖和支链氨基酸缺失的细胞(-BCAA)中，用DGAT1i、DGAT1i+ACCi和DGAT1i+肉碱处理MIA PaCa-2后的细胞活力。数值为未添加药理抑制剂的各自对照的百分比。单向方差分析后进行Tukey多重比较检验。N>3， 。显著性标准:*** ***
为了解释这一现象，我们思考了三种可能导致脂肪酸(FA)进入线粒体解偶联的机制，即肉碱/有机阳离子转运体1(CPT1)的抑制、由于支链氨基酸(BCAA)衍生的肉碱缺乏导致的肉碱/有机阳离子载体(CACT)抑制，以及线粒体中 氧化的抑制(图S4b)。几个因果关系指向BCAA缺乏时CPT1的抑制，例如:(i)C16-硼二吡咯(C16-BODIPY)缺乏线粒体靶向性；(ii)长链肉碱(LC-CAR)减少而非积累；(iii)对乙酰辅酶A羧化酶(ACC)抑制剂托法替尼(TOFA)有反应，因为它是唯一能够挽救C16-BODIPY线粒体靶向性的药物。在包括胰腺癌细胞系PANC-1细胞在内的几种体外细胞模型中也证实了与CPT1抑制相关的甘油三酯(TG)合成[44]。另一方面，利用光化性角化病和皮肤鳞状细胞癌模型，已证明CACT抑制会导致LC-CAR积累[3, 0]。重要的是，其他人已经注意到LC-CAR与TG呈负相关[45, 46]。这支持了我们关于BCAA饥饿时CPT1抑制而非CACT抑制的结论(见图S4b中描述的模型情况)。至于CPT1失活的机制，我们推测CPT1可能通过ACC合成的丙二酰辅酶A被抑制，这是CPT1活性调节的保守途径[33 - 35]。例如，在葡萄糖饥饿时，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)磷酸化并抑制ACC，这导致CPT1抑制的解除和代谢转换为脂肪酸氧化[33]。在我们的研究中，去除葡萄糖也很容易促进脂肪酸进入线粒体(图S6a)。相反，ACC抑制剂TOFA恢复了脂肪酸的线粒体导入(图6d)，以及AMPK抑制剂AICAR，这与我们关于BCAA缺乏时通过AMPK信号抑制CPT1的假设一致。除了TOFA和AICAR，只有通过支链α-酮酸(BCKAs)以及部分游离肉碱才能恢复线粒体导入。然而，我们意识到共聚焦显微镜的分辨率不允许我们明确区分C16-BODIPY在线粒体膜间隙(IMS)或基质中的靶向性(图4b)。尽管由于使用了药理抑制剂以及我们研究的体外性质，我们的论证被认为是初步的，但我们能够确认指向CPT1抑制的级联反应的几个步骤，包括BCAA缺乏时AMPK磷酸化的降低(图6b)。需要进一步的基因操作来进一步阐明BCAA缺乏时脂肪酸进入线粒体受抑制的确切机制。
随后，我们探究了在BCAA饥饿状态下抑制脂肪酸进入线粒体有什么好处。我们的数据支持这样一种假设，即非脂解来源的脂肪酸进入线粒体可能对线粒体功能有害[25, 45]。在我们的研究中，二酰甘油酰基转移酶1(DGAT1)的抑制对能够将脂肪酸导入线粒体的细胞，即补充了BCAA的有或无葡萄糖的细胞，危害更大，而对不能将脂肪酸导入线粒体的细胞，即BCAA和谷氨酰胺饥饿的细胞，危害较小。我们可以推测，导入线粒体的LC-CAR超过了 氧化的能力，因此BCAA饥饿细胞中对DGAT1抑制的保护表型源于线粒体中LC-CAR的低导入量，而不是维持脂滴(LD)的能力。因此，用ACC抑制剂(TOFA)处理BCAA缺乏的细胞激活脂肪酸导入也会降低细胞活力。据此，非脂肪组织中的脂滴可能作为缓冲隔室，隔离未导入线粒体的游离胞质脂肪酸。另一方面，有人提出通过脂解从甘油三酯释放的脂肪酸池直接进入线粒体，没有任何特定毒性[26]。所有这些观察结果表明，在DGAT1抑制后促进脂肪酸直接进入线粒体超过了 氧化处理LC-CAR的能力，这对细胞活力有负面影响。因此，脂滴可以被认为是一个临时的细胞隔室，调节胞质中的脂肪酸池及其在细胞和线粒体中的分布。
然而，关于支链氨基酸 - 肉碱载体(BCAA - CARs)在我们的模型系统中的作用也存在争议。我们试图证明支链氨基酸的分解代谢产物可能是脂肪酸进入线粒体以及随后甘油三酯积累的实际机制联系。该假设背后的推理是，BCAA - CARs可能参与肉碱/有机阳离子转运体(CACT)介导的长链酰基肉碱(LC - CARs)交换，而不是游离肉碱。原则上，支链氨基酸被分解为短链辅酶A(SC - CoAs)，它们进一步被氧化或由名为肉碱乙酰基转移酶(CRAT)的酶作用。CRAT的主要功能是通过产生BCAA - CAR和SC - CAR中间体来避免R - CoA积累，这些中间体可以从线粒体输出[7, 47]。我们对以下问题很感兴趣:这些源自支链氨基酸的SC - CARs的缺乏是否是长链酰基肉碱进入线粒体受阻的主要原因，以及它们的失衡是否会引发一系列导致肉碱棕榈酰转移酶1(CPT1)抑制和甘油三酯积累的事件。重要的是，Long等人的一份报告表明，去铁胺耗尽铁后，甘油三酯积累与源自支链氨基酸的肉碱呈负相关[48]，这表明除了支链氨基酸饥饿外，其他机制也可能扰乱SC - CAR平衡。支链氨基酸相关的线粒体肉碱与甘油三酯合成之间的联系值得进一步研究，理想情况下是在线粒体功能障碍的背景下进行，因为越来越多的证据表明甘油三酯合成增强和脂滴生物合成与线粒体相关干扰有关[26, 49 - 51]。
询问支链氨基酸(BCAA)种类是否真的是胰腺导管腺癌(PDAC)细胞中的氧化底物时，我们倾向于这样一种解释，即BCAA代谢通过将脂肪酸(FAs)导入线粒体来支持 氧化。我们在三羧酸(TCA)代谢物中未检测到稳定同位素标记的 缬氨酸和亮氨酸的任何确凿信号(未显示)，这与[40]一致。除了呼吸速率降低和TCA循环中间体减少外，我们未观察到线粒体标志物有任何一致的变化，这表明线粒体生物发生不受BCAA饥饿的影响。在缺乏BCAA的细胞中，棕榈酸的氧化减少(图4a、S4a)；然而，我们的实验无法表明 氧化能力是否降低，或者其底物水平是否由于导入减少而受损。然而，我们意识到这种解释存在明显的模糊性，但无法使用现有的方法和手段来证实我们的假设。
我们研究的局限性在于，我们未能展示将脂肪酸输入与支链氨基酸氧化产物联系起来的详细分子机制。此外，根据现有数据，我们无法得出所提出的机制是否仅在支链氨基酸饥饿时才独特，或者它是否代表了响应自噬的底物重新分布的一般途径。此外，源自支链氨基酸的肉碱的作用以及AMPK - ACC轴在CPT1抑制中的作用值得进一步探索。未来使用基因方法的研究可能会揭示各自的生理和病理适用性。然而，我们的研究与胰腺导管腺癌进展过程中已证明的底物变化相关[39]。
结论
总之，我们从与其他线粒体和线粒体外途径(包括合成代谢和分解代谢途径)相互作用的角度，阐述了支链氨基酸分解代谢的新方面，并对由代谢信号介导的线粒体 - 细胞质相互作用提供了新的见解。在我们的研究中，支链氨基酸饥饿表现为脂滴积累，这是由于脂肪酸在氧化和储存之间分布动态变化所致。从机制上讲，所研究的表型源于长链肉碱转运体进入线粒体的受阻，很可能是由于AMPK信号减弱，这导致乙酰辅酶A羧化酶激活以及下游肉碱棕榈酰转移酶1的抑制。活化的脂肪酸随后被重新导向甘油三酯合成并储存在脂滴中。我们得出结论，支链氨基酸消耗的减少可以调节脂肪酸进入 氧化的通量，并防止线粒体底物过载。
胰腺癌,支链氨基酸,线粒体,癌细胞
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