定义用于生物医学应用的负载氧化石墨烯的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架的免疫相容性
发布时间：
2026-07-06 14:21
定义用于生物医学应用的负载氧化石墨烯的聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架的免疫相容性
安德里亚·帕帕伊 ，乔达诺·佩里尼 ，瓦伦蒂娜·帕尔米耶里 ，安娜·卡尔尼奥尼 ，埃尔莎·韦尔图阿 ，安娜·帕索蒂 ，恩里科·罗萨 ，马尔科·德·斯皮里托 ，安东尼埃塔·罗萨·西利尼 ，马西米利亚诺·帕皮 ，奥内拉·帕罗利尼
生命与公共卫生科学系，圣心天主教大学，弗朗切斯科·维托广场1号，00168罗马，意大利
大学综合医院A. 杰梅利基金会IRCSS，00168罗马，意大利
神经科学系，圣心天主教大学，弗朗切斯科·维托广场1号，00168罗马，意大利
尤金尼亚·梅尼研究中心，波利安布兰卡医院基金会，25124布雷西亚，意大利
以及意大利国家研究委员会复杂系统研究所，陶里尼街19号，00185罗马
文章信息
关键词:
氧化石墨烯
3D打印支架
免疫反应
毒性
适应性免疫
固有免疫
分化
摘要
氧化石墨烯(GO)是一种碳基纳米材料，在生物医学领域如生物成像、药物递送、生物传感器和光疗等方面具有巨大潜力。本研究考察了将GO整合到聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)支架中对人类免疫细胞功能的影响。我们的结果表明，高浓度的GO会降低抗CD3抗体刺激后外周血单个核细胞(PBMC)的活力。这种降低延伸至T淋巴细胞活化，这从对T细胞受体参与的增殖反应减弱以及向T辅助亚群和调节性T细胞的分化受损中明显可见。有趣的是，尽管GO在静息单核细胞中诱导的反应最小，但它显著影响诱导成熟为M1促炎性和M2样免疫调节性巨噬细胞的单核细胞的活力和分化潜能。本研究旨在通过研究掺入不同浓度GO的PLGA支架对原代免疫细胞，特别是从健康供体分离的PBMC的体外免疫调节作用，来填补一个关键空白。我们的发现强调需要优化GO与PLGA的比例以及支架设计，以推进基于PLGA-GO的生物医学应用。
意义声明:氧化石墨烯(GO)由于其独特的性质在生物医学应用中具有巨大潜力。然而，对其引发不良免疫反应的可能性的担忧仍然存在。本研究通过研究掺入不断增加的GO浓度的PLGA支架对人类外周血单个核细胞(PBMC)的体外免疫调节作用，填补了这一关键空白。通过阐明对细胞活力、T细胞增殖和分化以及抗原呈递细胞的成熟/极化的影响，这项工作为设计用于未来临床转化的安全且免疫兼容的基于GO的生物材料提供了有价值的见解。
1. 引言
基于石墨烯的生物材料在生物医学领域展现出广泛的可能性，涵盖生物成像、药物递送、生物传感器和光疗等。其中，氧化石墨烯(GO)作为一种关键的碳基纳米材料脱颖而出，具有广泛的生物医学潜力[1]。利用其化学性质，GO通过锚定基因和药物分子提供了不同的功能化位点。一个显著的应用是通过连接疏水性喜树碱(CPT)类似物来提高肿瘤治疗效率[2]。此外，GO用作热疗载体，通过近红外照射产生热量来介导癌细胞死亡[3]。然而，随着GO在健康领域应用的出现，人们对其对细胞功能的潜在影响以及给药后引发不良免疫系统反应的风险产生了担忧[3]。将分散的纳米颗粒封装在生物相容性基质中，既引起了人们对抑制生物毒性和延长停留时间以及防止降解的关注[4,5]。
* 通讯作者地址:意大利罗马圣心天主教大学公共卫生与生命科学系，弗朗切斯科·维托广场1号，00168。电子邮箱:andrea.papait@unicatt.it(A. Papait)。
同等贡献。
在此背景下，我们提议使用聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，一种经美国食品药品监督管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)批准的可生物降解聚酯共聚物，作为掺入GO的基质材料。饱和聚( -羟基酯)，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，被广泛用于制造用于组织工程应用中三维(3D)支架的可生物降解合成聚合物，在包括牙科、骨科和伤口敷料等各个领域都有广泛应用[6 - 8]。
通过结合聚乳酸(PL)和乙醇酸(GA)的比例，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)能够精确调节包括拉伸强度和柔韧性在内的机械性能，以满足特定的临床需求[9]。增加GA含量可提高支架强度，而较高的PL含量则可改善柔韧性，从而为各种临床应用实现定制设计。控制GA水平可加速支架降解，而调整PL含量则可延长降解时间，从而实现定制的降解和吸收动力学[10,11]。这种聚合物具有优异的生物相容性特性[12,13]，这主要是因为PLGA聚合物很容易被酯酶降解。这种降解过程会导致乳酸和乙醇酸的形成，它们通过三羧酸循环代谢，并通过呼吸、粪便和尿液以二氧化碳和水的形式排出[14,15]。此外，当以低浓度使用时，没有关于聚合物在人体器官中积累的报道。然而，在某些情况下，未能消除这些降解副产物可能会导致酸性产物(乳酸和乙醇酸)在原位积累，当它们在局部高浓度积累时，可能会通过改变生物反应而变得有害[16]。然而，据报道，PLGA引起的炎症反应最小，没有明显的免疫刺激特性，甚至可能具有免疫抑制作用[17-19]。
考虑到生物材料在植入后会与宿主组织发生相互作用，引发中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DCs)等先天免疫细胞的反应，这一特性对于生物材料来说变得更加关键。这些细胞构成了人体对外来元素的初始防御，并在维持组织内环境稳定方面发挥着关键作用，从而影响愈合和修复过程[20]。各种研究强调了基于氧化石墨烯(GO)的纳米片诱导应激、激发免疫反应以及触发免疫细胞死亡的能力，包括T淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞[21,22]。例如，GO与中性粒细胞胞外陷阱的形成有关[23,24]。此外，GO可以通过激活多个Toll样受体(TLR)途径促进DCs成熟并增强其细胞因子分泌，从而作为一种正向调节剂，同时显示出低毒性。此外，这种GO-聚乙二醇-聚乙烯亚胺(GO-PEG-PEI)组合可以作为一种有效的抗原载体，将抗原运输到树突状细胞中[25]。相反，GO已显示出抑制树突状细胞抗原呈递能力的潜力，从而降低T淋巴细胞的激活[26]。
在本研究中，我们通过使用从健康供体分离的外周血单个核细胞(PBMCs)，分析了负载不同浓度GO的PLGA支架引发的体外免疫反应。我们的研究突出了PLGA-GO构建体对免疫细胞活力、T细胞对外界刺激的增殖和分化能力以及抗原呈递细胞(DCs和巨噬细胞)在获得促炎或免疫调节标志物方面的成熟和极化的影响。
2. 材料和方法
2.1. 伦理声明
从健康供体收集用于研究目的的人类外周血单个核细胞(PBMCs)已获得意大利布雷西亚省伦理委员会“Comitato Etico Provinciale di Brescia”的批准(NP 3968，2020年7月2日)。
2.2. 聚乳酸-乙醇酸共聚物-氧化石墨烯(PLGA-GO)支架的3D打印和表征
使用BIO X 3D生物打印机(Cellink，瑞典哥德堡)进行PLGA - GO支架的3D打印。在打印之前，对氧化石墨烯(Graphenea，美国马萨诸塞州剑桥)进行了光谱和显微镜表征。光谱分析包括动态光散射(DLS)、zeta电位和吸光度测量。DLS和zeta电位分析使用配备 氦氖激光器(633 nm)的马尔文仪器公司(英国伍斯特郡马尔文)的Zetasizer Nano S进行。将氧化石墨烯样品在双蒸水(Milli - Q)中稀释至最终浓度为 。测量在相对于入射光束 的恒定角度下进行。吸光度测量使用Cytation 3细胞成像多模式读数器(美国加利福尼亚州Biotek)进行。为此，将氧化石墨烯在双蒸水(Milli - Q)中稀释至浓度为 。使用配备NanoWizard II(德国柏林JPK Instruments)的原子力显微镜(AFM)进行显微镜表征[27]。使用具有高纵横比锥形硅尖的硅悬臂(CSC36 Mikro - Masch，马其顿索非亚)进行成像，其端部半径约为 ，半锥角为 ，弹簧常数为 。检查小扫描区域 ，并使用JPK数据处理软件(德国柏林JPK Instruments)确定横向尺寸。在氧化石墨烯表征之后，将聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物薄片(中国吉林长春 Rimless Industry)和氧化石墨烯的混合物在二氯甲烷(意大利米兰Carlo Erba)中制备，聚乳酸 - 羟基乙酸共聚物的量固定，氧化石墨烯含量从0变化到 。将混合物搅拌过夜，然后风干。将所得薄膜切成小块并转移到能够加热到 的热塑性打印头(Cellink，瑞典哥德堡)中。使用计算机辅助设计(CAD)软件Rhinoceros(美国西雅图Robert McNeel & Associates)设计支架结构。通过基于挤出的技术完成PLGA - GO支架的打印，打印头温度设置为 ，打印床温度设置为 。挤出压力保持在 ，预流量为 ，打印速度为 。打印后，使用ALPHA II紧凑型傅里叶变换红外光谱仪(布鲁克)进行傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析，以评估支架的表面化学成分。将样品直接放置在晶体上，并在 的波数范围内记录光谱。为了验证椎间盘释放的活性氧(ROS)可能引起的毒性作用，使用了ROS - ID检测试剂盒(Enzo Life Sciences)。该试剂盒允许评估总ROS的相对水平，同时还能够确定超氧化物的产生。该试剂盒包括两个主要成分:用于ROS检测的氧化应激检测试剂(绿色)和超氧化物检测试剂(橙色)。绿色探针直接与多种活性物质反应，产生绿色荧光产物，表明细胞产生了各种类型的ROS。相比之下，橙色探针是一种细胞可渗透的超氧化物检测染料，专门与超氧化物反应，产生橙色荧光产物。在我们的研究中，将PLGA - GO支架在48孔板(美国纽约康宁)中的检测溶液中孵育1小时。孵育后，使用Cytation 3细胞成像多模式读数器(美国加利福尼亚州Biotek)通过在 激发并在 读取发射(绿色探针)以及在 激发并在 读取发射(橙色探针)来记录上清液中的荧光强度。
2.3. 细胞凋亡检测
为评估细胞活力和凋亡情况，按照制造商说明(美国新泽西州富兰克林湖BD生物科学公司)使用FITC-Annexin V-碘化丙啶(PI)试剂盒。在室温黑暗条件下孵育15分钟后，样品用结合缓冲液进行两次洗涤步骤。随后，将细胞重悬至最终体积为 用于后续分析。
染色后的细胞在染色后一小时内使用FACS Symphony A3系统(美国新泽西州富兰克林湖BD生物科学公司)通过流式细胞术进行分析。收集的数据使用FlowJo 10.7v软件(美国新泽西州富兰克林湖BD生物科学公司)进行分析。细胞被区分为早期凋亡阶段(Annextin V+/PI-)、晚期凋亡阶段(Annextin V+/PI+)和坏死阶段(Annexin V-/PI+)。
2.4. 石墨烯功能化支架存在下PBMC增殖分析
为研究氧化石墨烯(GO)功能化支架(称为PLGA-GO)对活化外周血单个核细胞(PBMCs)的影响，采用了一种系统方法。人外周血单个核细胞(PBMCs)通过密度梯度离心从肝素化全血样本中获得，使用Histopaque 1077(美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich公司)。
PBMCs以每孔 个细胞的密度接种在96孔板中。通过用 抗CD3单克隆抗体(Orthoclone OKT3，意大利科洛尼奥蒙泽塞杨森-西拉格公司)处理PBMCs来实现活化。
然后将活化的PBMCs在RPMI 1640培养基(补充有10%热灭活胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素，均来自美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich公司)中培养3天。在培养期间，PBMCs暴露于不同的实验条件下，包括存在聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)支架(中国吉林长春瑞姆莱斯工业公司)或用不同百分比氧化石墨烯 功能化的PLGA支架(中国吉林长春瑞姆莱斯工业公司)，表示为PLGA+GRAPH OX。对照条件是单独培养活化的PBMCs或仅在PLGA支架存在下培养。所有实验条件，包括对照，均重复进行三次。
通过分析掺入的5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)来评估PBMC增殖，这是一种先前描述的技术[28]。简要地说，在刺激后第3天，PBMCs暴露于 EdU(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德生命技术公司)。在随后16至18小时的孵育期后，收获细胞并对EdU掺入进行定量。这通过在室温下将2.5 3-叠氮基-7-羟基香豆素(德国耶拿耶拿生物科学公司)引入缓冲溶液(由 Tris-HCl pH 8.0、10 mM L-抗坏血酸和2 mM CuSO4组成)中30分钟来进行。使用FACS Symphony A3(BD生物科学公司)对获取的细胞进行分析。使用Flowjo v10.7软件评估EdU阳性增殖细胞的百分比，并进行E-Fluor 780(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆赛默飞世尔公司)染色以从分析中排除非存活细胞。
2.5. 使用流式细胞术鉴定 辅助亚群和 调节细胞
采用流式细胞术全面研究氧化石墨烯(GO)功能化支架对T细胞向辅助性T(Th)亚群(Th1、Th2、Th17、Th1/Th17)和调节性T细胞(Tregs)分化的影响。分析了表征不同T细胞亚群的特异性细胞表面标志物和转录因子的表达。将活化的外周血单核细胞(PBMC)与聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)支架单独或用不同百分比的氧化石墨烯 进行功能化处理后进行共培养。共培养5天后，收获活化的PBMC并在 下离心5分钟。为了在分析中排除无活力细胞，使用了活细胞染料 - Fluor 780(赛默飞世尔)。进行流式细胞术分析以鉴定特定的T细胞亚群。为此，使用了以下抗体:BD Biosciences公司的CD3(克隆UCHT1)、CD4(克隆VIT-4)、CD45RA(克隆HI100)、CD196(克隆11A9)、CD183(克隆1C6/CXCR3)、CD25(克隆M-A25)，以及Miltenyi公司的CD194(克隆REA279)。在用BD Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)固定和透化后，对转录因子FoxP3进行细胞内染色。抗FoxP3抗体(克隆R16-715，BD Biosciences)在 下与细胞在黑暗中孵育30分钟。使用FACS Symphony A3(BD Biosciences)流式细胞仪采集样本，并使用Flowjo 10.7v(BD Biosciences)软件进行后续分析。鉴定辅助性T亚群和Tregs的门控策略如下。首先，对CD4 + CD45RA阴性细胞进行门控以鉴定T效应细胞。在T效应细胞门内，鉴定Th亚群:Th1:CD196-CD183+，Th17/Th1:CD196 + CD183+，以及Th2:CD196-CD183-CD194+。通过对CD25 细胞进行门控来鉴定调节性T细胞(Tregs)[28]。
二、6. 单核细胞向抗原呈递细胞分化的分析
为了刺激向树突状细胞(mDCs)的分化，将总共 外周血单核细胞(PBMC)在48孔板中培养4天(康宁公司)。该培养在 重组人IL-4(R&D Systems，美国明尼阿波利斯，MN)和50 ng/mL粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，Miltenyi Biotec，德国北莱茵-威斯特法伦州贝吉施格拉德巴赫)存在下，使用 RPMI 1640完全培养基(西格玛奥德里奇)进行。通过添加 脂多糖(LPS，西格玛奥德里奇)持续两天来实现完全成熟过程。
为了生成单核细胞来源的M1巨噬细胞，将 PBMC在24孔板中培养4天(康宁公司)。该培养在 GM-CSF(Miltenyi Biotec，德国北莱茵-威斯特法伦州贝吉施格拉德巴赫)存在下，使用0.5 mL RPMI 1640完全培养基(西格玛奥德里奇)进行。通过用20 ng/mL干扰素γ(IFN-γ)处理细胞 ，随后给予 LPS(西格玛-奥德里奇)并再孵育两天，实现向M1巨噬细胞的完全分化。
为了获得M2来源的巨噬细胞，将 接种于24孔板中，在含有20 ng/mL M-CSF(德国北莱茵-威斯特法伦州贝吉施格拉德巴赫的美天旎生物技术公司)的 RPMI完全培养基中于 培养4或5天，随后补充 白细胞介素-4(IL-4；德国北莱茵-威斯特法伦州贝吉施格拉德巴赫的美天旎生物技术公司)培养 ，然后补充 脂多糖(Sigma-Aldrich)培养 。
通过流式细胞术分析评估向M1巨噬细胞的分化。通过E-Fluor 780染色区分的活细胞进行一组表面标志物表达的分析。门控策略最初包括排除CD3阴性细胞，随后评估CD11b阳性群体中CD11b(克隆ICRF44)的表达。进一步检测包括评估CD163(克隆GHI/61)、CD209(克隆DCN46)、CD197(克隆3D12)、CD86(克隆2331 (FUN-1))和CD14(克隆MP9)的表达。所有抗体均来自BD Biosciences。
2.7. 统计分析
数据以带有Tukey变化的小提琴截断图表示。使用单因素或双因素方差分析(ANOVA)比较参数。使用Q-Q概率图评估分布的正态性，并通过Shapiro-Wilk检验和Kolmogorov-Smirnov检验进行分析评估。每个实验的详细统计信息，包括中位数、四分位数和样本量(n)，在图注中提供。使用Prism 9(美国加利福尼亚州拉霍亚的GraphPad软件)进行统计分析。 值为 被认为具有统计学意义。
图1. 3D打印支架的表征。氧化石墨烯(GO)的吸收光谱(A)。水中氧化石墨烯的流体动力学半径和zeta电位(B)。氧化石墨烯的原子力显微镜(AFM)成像(C)和横向尺寸(D)。比例尺1 µm。PLGA(E)和PLGA-GO(F)支架的傅里叶变换红外光谱，显示相对吸收峰。3D打印支架的总活性氧(ROS)产生(G，H)。
结果
3.1. PLGA-GO支架的3D打印及表征
支架由不同浓度的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和氧化石墨烯(GO)组成，浓度范围为0至 [29]。在打印之前，首先通过光谱和显微镜技术对GO进行表征。吸收光谱显示在230至 波长范围内有GO特有的明显峰。吸收光谱显示在 附近有一个宽峰，归因于芳族C-C键的 跃迁，在300 nm左右有一个肩峰，表明n - 跃迁，如图1A所示[30,31]。图1B报告了GO的动态光散射(DLS)散射和zeta电位测量结果。GO的流体动力学半径在 处达到峰值，表面净电荷为 。GO的原子力显微镜(AFM)图像(图1C)显示出与预期的GO片形态一致的明显特征。高度分析表明GO片的厚度为 ，与先前的报道一致[32]。图1D报道的横向尺寸约为 ，与DLS数据一致。在对GO进行表征之后，通过基于挤出的技术对PLGA - GO支架进行3D打印。PLGA的量固定，GO的量从0.5变化到 。采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)来验证支架的化学成分(图1E，F)。PLGA和PLGA - GO的光谱在2990和 处均显示出特征吸收峰，分别指示 和 基团的 拉伸[33]。此外，两种支架在 (对应于酯键的 拉伸)和 (对应于 拉伸)处均显示出峰[34]。值得注意的是，在PLGA - GO光谱中证实了GO掺入3D打印材料中，其中观察到一个从3600到 的宽吸收峰，归因于 拉伸振动，以及在 处的一个较窄峰，与 键相关。为了对3D打印支架的潜在毒性进行初步评估，我们评估了培养基中活性氧(ROS)的产生[35]。为此，我们通过使用两种不同的探针来区分一般ROS和超氧阴离子:一种用于检测一般ROS的绿色荧光染料(图1G)，例如过氧化氢 、过氧亚硝酸盐 、羟基自由基(OH - )、一氧化氮(NO)和过氧自由基(ROO)；一种橙色荧光探针(图1H)，能够检测O2 - 。在用探针孵育支架后，我们没有观察到活性氧和超氧阴离子产生的统计学上显著的实质性增加。
3.2. 嵌入PLGA基质中的氧化石墨烯(GO)对PBMCs的活力影响较小
在研究氧化石墨烯(GO)对免疫细胞功能的影响之前，我们调查了在聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)支架中暴露于浓度不断增加的GO是否会影响未刺激的PBMC(图2A)和活化的PBMC的活力(图1B)。我们采用碘化丙啶-膜联蛋白V(PI-AnnV)检测法来确定暴露于不同GO浓度下的存活(AnnV-PI-)、早期凋亡(AnnV+ PI-)、晚期凋亡(AnnV+ PI+)和坏死(AnnV- PI+)免疫细胞的比例。我们的观察结果显示，在未刺激的PBMC中，无论GO浓度如何，活力均无明显差异(图1A)；而在刺激的PBMC中，较高的GO浓度(2%和5%)导致细胞活力略有下降(图2B)。单独的PLGA支架在未刺激的PBMC和用抗CD3刺激的PBMC中均未观察到毒性作用。
3.3. 高浓度氧化石墨烯(GO)降低刺激的PBMC的增殖
鉴于观察到对活化PBMC活力的影响极小，我们研究了GO在哪些浓度范围内会影响PBMC增殖。对未刺激的PBMC的分析(图3A)表明，单独的PLGA支架或添加浓度不断增加的GO似乎都不能诱导免疫原性反应。然而，在检查PBMC对抗CD3单克隆抗体直接刺激的反应能力时，单独的PLGA支架略微降低了PBMC的活化，尽管这种影响没有统计学意义。此外，GO偶联的PLGA支架的存在以浓度依赖的方式显著抑制了抗CD3单克隆抗体刺激后PBMC的增殖，在测试的最高浓度(PLGA-GO 5%)时达到显著水平(图3B)。
图2. 嵌入PLGA基质中的GO浓度增加对PBMC的活力有轻微影响。未刺激的(A)和抗CD3(aCD3)刺激的PBMC(B)在含有不同浓度氧化石墨烯 (GO)的PLGA支架存在下培养。对照条件由在无支架情况下培养的PBMC(第一行，红色)和仅由PLGA基质构成的支架存在下的PBMC(第二行，深蓝色)表示。结果以存活、早期凋亡、晚期凋亡或坏死细胞的百分比表示。结果以小提琴图显示中位数(粗线)、第25和第75四分位数。 个独立实验。数据通过了夏皮罗-威尔克检验和柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫正态性检验，因此呈现正态分布。
3.4. 氧化石墨烯(GO)影响CD4+ 淋巴细胞的分化
鉴于高浓度的GO抑制了活化PBMC的增殖，我们研究了GO是否会影响CD4+淋巴细胞向各种辅助性T(Th)亚群的分化。虽然GO浓度增加不会影响静息CD4+淋巴细胞上分化标志物的表达(图4A)，但它们显著影响了活化PBMC的分化(图4B)。更详细地说，1%的GO能够减少CD4+ T淋巴细胞向炎性Th1亚群的分化，当使用 GO时，这种影响达到统计学意义(图4B)。相反，最高浓度的GO促进了向Th2亚群的分化，在向Th1/Th17和Th17亚群的极化方面未观察到显著差异(图4B)。
图3. 嵌入PLGA基质中的较高浓度氧化石墨烯可降低受刺激的外周血单核细胞(PBMC)的增殖。与未刺激的PBMC(A)和抗CD3刺激的PBMC(B)中的对照条件(红色)相比，在存在不同浓度氧化石墨烯 (GO)的PLGA支架的情况下，用抗CD3单克隆抗体(aCD3)刺激PBMC。结果表示为Edu阳性增殖细胞的百分比。结果以小提琴图显示，显示中位数(粗线)、第25和第75四分位数(* ，*** 与对照(PBMC +抗CD3)相比)，A: ；单个实验。数据通过了Shapiro-Wilk检验和Kolmogorov-Smirnov正态性检验，因此呈现正态分布。
此外，由于之前观察到抗CD3刺激后T淋巴细胞增殖减少，我们研究了这种增殖缺乏是否反映了T细胞激活状态的降低。因此，我们检查了激活标志物CD25的表达。从1%开始增加GO浓度，导致CD25表达显著降低，表明T细胞激活受损(图4B)。
当我们评估GO对调节性T细胞的影响时，我们观察到了类似的趋势(图4C-D)。虽然在未刺激的PBMC中未观察到影响(图4C)，但在抗CD3刺激的PBMC中明显存在显著差异(图4D)。确实，所使用的两个最高GO浓度(2%和5%)降低了CD4+细胞向Treg亚群的极化(图4D)。最后，对于所有研究的亚群，我们发现PLGA支架耐受性良好，与对照条件相比没有导致显著差异。
3.5. 高浓度氧化石墨烯对诱导分化为M2巨噬细胞的单核细胞活力有不利影响
为了评估GO对固有免疫的影响，我们将诱导分化为抗原呈递细胞(M1和M2巨噬细胞、mDC)的人单核细胞与浓度不断增加的GO共培养。首先，我们观察到单独的PLGA支架对各种单核细胞衍生群体的活力没有显著影响。同样，我们的研究结果表明，GO对静息单核细胞的活力没有显著影响(图5)。然而，当单核细胞被诱导分化为促炎性M1巨噬细胞或免疫调节性M2巨噬细胞时，我们观察到细胞活力降低，且与GO浓度增加相关。在单核细胞分化为M2巨噬细胞的情况下，这种影响达到统计学显著性，特别是在测试的两个最高GO浓度(PLGA-GO2%和PLGA-GO5%)时。最后，当单核细胞被诱导分化为成熟树突状细胞(mDC)时，无论测试的GO浓度如何，细胞活力均未观察到显著差异。
3.6. 氧化石墨烯(GO)影响单核细胞向抗原呈递细胞分化的能力
然后，我们研究了GO对单核细胞向抗原呈递细胞极化的影响。如先前报道，单独的PLGA支架与对照相比，对所有研究的免疫群体，包括单核细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞和mDC，均未诱导显著变化。此外，我们观察到，与之前对CD4淋巴细胞的观察结果类似，在没有刺激的情况下，GO不影响单核细胞的分化(图6A)。仅中等浓度的GO降低了共刺激分子CD86的表达。然而，当单核细胞被诱导分化为M1或M2巨噬细胞时，我们观察到与单核细胞暴露的GO浓度直接相关的显著差异。在M1分化的情况下，高浓度的GO导致分化标志物CD197的表达降低(图6B)。在分化为M2巨噬细胞的过程中观察到最明显的影响(图6C)。在GO浓度超过1%时，通常与M2巨噬细胞相关的标志物CD14的表达显著降低。更显著的是，M2巨噬细胞的成熟标志物CD163以及CD209显著降低(图6C)。
有趣的是，在单核细胞分化为成熟树突状细胞(mDCs)的过程中，未观察到所研究标志物表达的差异(图6D)。在这种情况下，无论分析的GO浓度如何，标志物表达水平均未检测到变化(图6D)。
4. 讨论
氧化石墨烯(GO)因其在包括医学[36]在内的各个领域的广泛应用而备受关注。尽管具有潜力，但GO对人类免疫系统的影响仍是一个了解有限的领域。本研究旨在探讨嵌入生物相容性PLGA生物材料中的GO如何影响人外周血单核细胞(PBMC)的活力和极化，并可能影响不同免疫细胞群体的活力和分化。
选择聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)作为生物材料是基于其优异的生物相容性和低炎症活性[12,13]。这种材料很容易被酯酶降解，并通过代谢废物从体内有效清除[14,15]。此外，当低浓度使用PLGA时，没有关于聚合物在人体器官中积累的报道[16]。此外，已观察到PLGA仅诱导最小的炎症反应并显示免疫抑制作用[17-19]。相反，其他研究表明，暴露于PLGA，无论是微粒还是纳米颗粒形式，都可导致小鼠巨噬细胞中白细胞介素-1 和肿瘤坏死因子 水平升高，这表明炎症细胞因子的释放与尺寸有关[37]。另一项研究指出，PLGA有能力诱导树突状细胞成熟为炎症表型[38]。我们的研究结果与文献报道一致，即PLGA对免疫细胞没有毒性或免疫原性作用。具体而言，我们观察到仅暴露于PLGA支架的外周血单核细胞没有表现出任何免疫原性反应。该支架没有诱导促炎反应或改变T淋巴细胞、巨噬细胞或树突状细胞的分化，从而支持将PLGA用作氧化石墨烯的包埋策略。
图4. 嵌入PLGA基质中的氧化石墨烯浓度增加会影响抗CD3单克隆抗体(mAb)刺激后CD4 + T淋巴细胞的分化。在存在不同浓度氧化石墨烯 的PLGA支架的情况下，未刺激的PBMC(A)或用抗CD3 mAb(aCD3)刺激的PBMC(B)针对不同的Th亚群(Th1(CD138 + CD196 -)、Th1/Th17(CD138 + CD196 +)和Th2(CD138 - CD196 - CD194 +)、Th1/T117(CD183 + CD196 +)和Th17(CD183 - CD196 +))。此外，评估了T淋巴细胞活化标志物CD25的表达(A - B)。在用抗CD3 mAb激活六天后，通过流式细胞术评估Treg的诱导，并表示为未刺激的PBMC(C)和用aCD3刺激的PBMC(D)中CD45RA - FoxP3 + CD25hi细胞的百分比。结果以小提琴图表示，显示中位数(粗线)、第25和第75四分位数(* ，** ，**** 与对照PBMC +抗CD3相比)， 个独立实验。数据通过了Shapiro - Wilk检验和Kolmogorov - Smirnov正态性检验，因此呈现正态分布。
此外，我们的研究发现，虽然氧化石墨烯(GO)浓度的增加并未影响未受刺激的外周血单核细胞(PBMCs)和单核细胞，但在细胞刺激后观察到了显著变化。具体而言，暴露于高浓度的GO会逐渐损害受刺激的T淋巴细胞的活力以及激活和分化能力。激活标志物CD25的表达显著降低进一步证明了对激活的负面影响，CD25通常在刺激后表达 [39,40]。这种降低，再加上观察到的增殖减少，表明激活失败或T淋巴细胞对激活刺激的反应能力减弱。
图5. 嵌入聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)基质中的氧化石墨烯(GO)浓度增加，会影响单核细胞或分化为抗原呈递细胞的单核细胞的活力。在含有不同浓度氧化石墨烯 和5%(GO)的PLGA支架存在的情况下，与红色对照条件相比，未刺激的单核细胞或用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)+脂多糖(LPS)+干扰素γ(IFNγ)刺激的单核细胞(M1巨噬细胞)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)+LPS+肿瘤坏死因子α(TNFα)刺激的单核细胞(M2巨噬细胞)或GM-CSF-+白细胞介素-4(IL-4)+LPS刺激的单核细胞(mDC)，在六天后收获，以评估其单独影响单核细胞活力或诱导单核细胞分化为M1或M2巨噬细胞或成熟树突状细胞(mDC)的能力。结果以表达百分比呈现，并显示小提琴图，显示中位数(粗线)、第25和第75四分位数(* ，*** ，**** 与对照相比P<0.0001)， 为独立实验。数据通过了夏皮罗-威尔克正态性检验，因此呈现正态分布。
有趣的是，对细胞活力的最小影响表明，嵌入PLGA支架中的GO可能通过破坏代谢过程[41]显著阻碍T淋巴细胞的激活。
此外，GO的影响不仅限于CD4+T淋巴细胞分化为促炎Th亚群的能力降低，还扩展到免疫调节性CD4+调节性T细胞(Treg)亚群。
事实上，白细胞介素-2(IL-2)受体表达的降低会导致雷帕霉素靶蛋白(mTOR)刺激的减少，从而影响T淋巴细胞的完全激活和分化。一组研究表明，IL-2-IL2R信号在效应T细胞的分化中起重要作用。这个过程涉及转录因子Kruppel样因子2(KLF2)的下调，KLF2控制关键归巢分子如SP1、CD62L、CCR7和各种趋化因子受体的表达。作者报告说，KLF2的下调取决于磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的激活，并需要mTOR的激活[41]。相比之下，这些发现与其他发现不同，其他发现报告游离的GO纳米颗粒会显著刺激Th1/Th2细胞因子的分泌，表明T细胞向这些亚群的分化增加[42]。本研究中GO在PLGA基质中的嵌入性质可以解释这种差异，因为它减少了直接的细胞接触。
当我们分析GO对固有免疫的影响时，也得到了类似的结果。更详细地说，增加GO的浓度不会影响静息单核细胞的活力；然而，当单核细胞被诱导分化为促炎M1巨噬细胞或抗炎M2巨噬细胞时，存在浓度依赖性毒性作用。我们从健康供体的原代细胞中获得的结果与使用细胞系的研究结果一致。事实上，在巨噬细胞上观察到的一致的细胞毒性作用与先前涉及巨噬细胞系的报告一致，如人THP-1和RAW 264.7细胞[43]。然而，应该强调的是，虽然对细胞系的毒性作用在浓度为 时开始明显[43]，但在我们使用的原代细胞中，从 开始观察到毒性作用， 对应于我们研究中测试的GO的最高浓度。从这个意义上说，原代细胞为研究毒理学效应提供了更准确和相关的模型，最终有助于更好地理解和预测人类健康结果。
图6. 嵌入聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)基质中的氧化石墨烯(GO)浓度增加会影响单核细胞向抗原呈递细胞的分化。在不同浓度氧化石墨烯(GO，0.5%、1%、2%和5%)的PLGA支架存在下，对分化(图B、C、D)或未分化(图A)为巨噬细胞(M1:图B和M2:图C)或树突状细胞(DC，图D)的外周血单核细胞(PBMC)进行表型分析，并与红色对照条件(不含GO的PLGA)进行比较。在分化方案开始时添加支架，以评估其影响单核细胞向M1或M2巨噬细胞或成熟DC(mDC)分化的能力。在培养期结束时，通过流式细胞术评估CD14、CD1a、CD209、CD197和CD163以及共刺激分子CD80和CD86(DC用CD83代替CD80和CD86)的表达。结果以表达百分比表示，并显示小提琴图，显示中位数(粗线)、第25和第75四分位数(* ，*** ，*** 与对照相比)， 个独立实验。数据通过了夏皮罗-威尔克检验和柯尔莫哥洛夫-斯米尔诺夫正态性检验，因此图A和B呈现正态分布。对于图C，数据通过了达戈斯蒂诺-皮尔逊综合K2检验。
其他研究表明，高浓度的GO纳米颗粒会在RAW细胞中诱导细胞毒性，这与有关原始石墨烯的观察结果一致[44]。值得注意的是，GO已被证明会引发线粒体膜电位(MMP)耗竭和细胞内活性氧增加，通过线粒体途径导致细胞凋亡[44]。
此外，GO纳米片在细胞内化后，可以定位于F-肌动蛋白丝，导致细胞周期改变并诱导细胞凋亡和氧化应激。这种效应在免疫细胞(RAW-264.7)和骨组织来源的细胞(Saos-2、MC3T3-E1前成骨细胞)中均有记录[45]。另一项研究报告称，单层石墨烯通过在质膜上形成孔来降低A549肺癌细胞和巨噬细胞样RAW264.7细胞的细胞活力，最终导致细胞死亡[46]。此外，当用各种生物分子还原GO时，与未还原的GO相比，在癌细胞和非癌细胞类型中均表现出更高的细胞毒性[47]。与GO相关的这种细胞死亡增加与其亲水性有关，与疏水性还原GO(rGO)相比，亲水性更有利于细胞摄取[47]。
如先前关于静息T淋巴细胞的报道，GO对静息单核细胞没有诱导负面影响。同样，对典型标志物的分析表明，无论所检测的GO浓度如何，对未刺激的单核细胞中CD14或CD80的表达均无影响。当单核细胞被诱导分化为M1巨噬细胞时，观察到了GO的有害影响，随着GO浓度的增加，参与巨噬细胞募集的分化标志物CD197减少[48]。令人惊讶的是，在单核细胞分化为免疫调节性M2样巨噬细胞的过程中观察到了最显著的影响，其中较高的GO浓度降低了CD14表达并下调了CD163和CD209，这些标志物通常与M2样巨噬细胞相关[49,50]。
观察到的这种效应可能归因于GO在分化过程中对单核细胞活力的影响。支持这一假设的是，我们关于单核细胞分化为成熟树突状细胞(DC)的结果表明，暴露于不断增加的GO浓度下没有毒性作用。对DC分化标志物没有影响反映了缺乏浓度依赖性变化。这一结果与其他报道GO介导的DC分化抑制的研究形成对比，主要是由于共刺激分子CD83水平降低[51]。在我们的研究中，这种效应可能通过将GO掺入PLGA基质中而得到缓解。
5. 结论
将氧化石墨烯(GO)掺入聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等聚合物中，可增强其在生理条件下的稳定性，并减轻免疫反应。我们的研究结果表明，虽然PLGA中的GO对未刺激的外周血单核细胞(PBMC)的活力没有显著影响，但它会阻碍T淋巴细胞的分化，尤其是在高浓度时。这突出了精确优化生物材料以防止损害免疫功能的必要性。有趣的是，掺入GO对单核细胞的影响最小，但显著降低了M1和M2巨噬细胞的活力，影响它们向M2样巨噬细胞的分化。观察到的与先前关于游离GO纳米颗粒研究的差异可能归因于PLGA基质提供的细胞相互作用减少。
尽管这是一项体外研究，缺乏互补的体内研究，但我们的研究通过检查PLGA-GO支架对从健康供体分离出的PBMC的影响，而不是使用肿瘤衍生或永生化细胞系，在文献中大多数类似研究中脱颖而出，从而提供了更高的生理相关性。
我们的研究结果表明，虽然PLGA在高浓度GO时可以减轻免疫相关的不良反应，但由于这些浓度可能会显著损害免疫功能，因此需要谨慎。鉴于PLGA-GO纳米颗粒在药物递送和热疗中的潜在应用，全面的风险评估势在必行，以充分了解它们对人类健康的潜在影响。
资金信息
本研究得到了意大利卫生部、意大利研究与大学部(MIUR，5x1000，2017年PRIN资助号2017RSAFK7)、AIRC在IG 2019-ID. 23124项目下的资助(MP)以及对从事研究活动的私人实体的资助贡献 - C.E.P.R.(202年至2022年)。此外，圣心天主教大学通过D1线(OP)为本研究项目及其发表提供了资金。
CRediT作者贡献声明
安德里亚·帕帕伊特:撰写 - 审阅与编辑、撰写 - 原始草案、验证、方法学、调查、形式分析、数据整理。乔达诺·佩里尼:撰写 - 审阅与编辑、撰写 - 原始草案、方法学、调查、形式分析、数据整理。瓦伦蒂娜·帕尔米耶里:撰写 - 审阅与编辑、撰写 - 原始草案、监督。埃尔莎·韦尔图阿:方法学、调查。安娜·帕索蒂:方法学、调查。恩里科·罗萨:方法学、调查。马尔科·德·斯皮里托:撰写 - 审阅与编辑、撰写 - 原始草案、监督。安东尼埃塔·罗莎·西利尼:撰写 - 审阅与编辑、撰写 - 原始草案。马西米利亚诺·帕皮:撰写 - 审阅与编辑、撰写 - 原始草案、监督、资金获取、概念化。奥内拉·帕罗利尼:撰写 - 审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或可能影响本文所报告工作的个人关系。
数据可用性
数据将根据要求提供。
致谢
我们要感谢“圣心天主教大学综合医院”基金会(IRCCS)的“G-STeP 3D 生物打印研究核心设施”和“G-STeP 显微镜核心设施”在样本处理方面所做的贡献。
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氧化石墨烯,3D支架
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