OPEN

BIOLOGY

皇家学会出版网站/期刊/皇家学会开放生物学(royalsocietypublishing.org/journal/rsob)

研究

更新

引用本文:利西泰·J等人. 2022 担子菌双色蜡蘑(Laccaria bicolor)和灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)DNA和RNA中氧化5 - 甲基胞嘧啶的分布及调控作用. 《开放生物学》. 12: 210302. https://doi.org/10.1098/rsob.210302

接收日期:2021年10月10日

接受日期:2022年1月14日

学科领域:

生物化学/生物技术/基因组学

关键词:

，Tet蛋白(Tet)，真菌(fungi)，Top - seq技术

通讯作者:

埃迪塔·克里基耶内

电子邮件:edita.kriukiene@bti.vu.It

这些作者对本研究贡献相同。

电子补充材料可在https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5859235在线获取。

皇家学会出版

担子菌双色蜡蘑(Laccaria bicolor)和灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)DNA和RNA中氧化5-甲基胞嘧啶的分布及其调控作用

亚妮娜·利西泰 、科特丽娜·克韦德拉维丘泰 、奥德龙·鲁克谢奈特、埃格莱·戈德柳斯凯特、波维拉斯·吉巴斯、维塔·托姆库泰、格拉日娜·彼得拉伊泰、维托拉斯·马塞维丘斯、绍柳斯·克利马绍斯卡斯和埃迪塔·克里基耶内

维尔纽斯大学生命科学中心生物技术研究所生物DNA修饰系，立陶宛维尔纽斯10257，绍莱特凯奥大道7号

SK(绍柳斯·克利马绍斯卡斯)，0000 - 0002 - 1395 - 2030；EK(埃迪塔·克里基耶内)，0000 - 0003 - 4094 - 456X

TET/JBP家族双加氧酶催化形成三种氧化性DNA 5 - 甲基胞嘧啶(5mC)修饰(氧化5mC，oxi - mCs)——5 - 羟甲基胞嘧啶 、5 - 甲酰基胞嘧啶(5fC)和5 - 羧基胞嘧啶(5caC)，这促使人们对它们在哺乳动物细胞中的功能作用进行了深入研究。然而，在其他真核生物谱系中，这些含量较低的修饰核苷酸之间的功能相互作用仍知之甚少。我们对担子菌双色蜡蘑(Laccaria bicolor)和灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)的DNA和RNA中氧化5mC的含量和分布进行了系统研究，这两种真菌是研究DNA甲基化以及发育和共生过程的成熟模型。定量液相色谱 - 串联质谱分析显示，这两种生物的DNA和RNA中持续存在但分布不均的 和 ，维生素C可上调其含量。RNA中的 (5carC)主要存在于非核糖体RNA中，其中可能包括非编码RNA、信使RNA和小RNA。使用单CG分析技术hmTOP - seq和foTOP - seq对 和 进行全基因组定位，表明氧化5mC参与了基因表达调控和转座元件沉默。这两种真菌中 和氧化5mC的多种作用凸显了后者修饰的表观遗传学重要性，而在标准的全基因组亚硫酸氢盐分析中，这些修饰常常被忽视。

1. 引言

5 - 甲基胞嘧啶(5mC)是一种广泛存在于从细菌到哺乳动物等生物中的DNA修饰。在高等真核生物中，它是一种重要的表观遗传调控因子，可调节基因表达和转座元件(TEs)的沉默 [1 - 3] 。在活跃的DNA去甲基化途径中，TET(10 - 11易位)加氧酶通过将 依次氧化为5 - 羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5 - 甲酰基胞嘧啶(5fC)和5 - 羧基胞嘧啶(5caC)，引入了含量少得多的 氧化形式(图1a)，这一途径在哺乳动物中得到了广泛研究 [5,7 - 11] 。越来越多的人认识到，不同的氧化 修饰(氧化5mC，oxi - mCs)除了作为 去甲基化途径中的唯一中间产物外，还具有独立的表观遗传作用；氧化5mC中最常见的 在健康和癌组织的胚胎发育和基因转录调控中具有重要作用 [12 - 14] ，而更罕见的5fC和5caC倾向于在活跃的增强子 处积累，这表明它们参与了基因活性调控。

^[1]

图1. 氧化的5-甲基胞嘧啶修饰(oxi-mCs)。(a) TET蛋白对5-甲基胞嘧啶(5mC)的连续氧化作用。(b, c) 通过定量液相色谱 - 串联质谱(HPLC - MS/MS)定量分析在常规条件下生长的双色蜡蘑(Laccaria bicolor)和灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)的(b) DNA和(c) RNA中胞嘧啶修饰的出现情况。5-羧基胞嘧啶(5caC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)、5-羟甲基胞嘧啶(5hMC)和5-甲基胞嘧啶(5mC)的含量以对应核苷的校准曲线计算为总鸟嘌呤(G)的百分比。至少使用了两个生物学重复样本。氧化的5mC衍生物在进行HPLC - MS/MS分析之前，还通过HPLC核苷分级分离进行了额外纯化。在双色蜡蘑的RNA中未检测到RNA中的5caC(5caTC)信号。(d) 真菌双色蜡蘑和灰盖鬼伞以及哺乳动物的DNA和总RNA中修饰胞嘧啶丰度的比较，以总G(或C)的百分比表示。小鼠的平均近似DNA数据取自文献[4]，人类的取自文献[5]；RNA数据取自文献[6]。真菌DNA和RNA使用未处理样本(未添加维生素C或未进行衍生化处理)的数据(双色蜡蘑中未评估5-甲酰基核糖胞嘧啶(5frC)(未评估)，未检测到5-羧基核糖胞嘧啶(5carC)(未检测到))。L. b.，双色蜡蘑；C. c.，灰盖鬼伞。

除了TET蛋白在体外和体内对DNA中 的广泛研究外，这些酶在体外也能够将RNA中的 (5mrC)氧化为所有三种氧化的5-甲基胞嘧啶形式(5-羟甲基核糖胞嘧啶(5hmrC)、5-甲酰基核糖胞嘧啶(5frC)、5-羧基核糖胞嘧啶(5carC))[18,19]。此外，体内的5hmrC可以由 衍生而来[20]，这其中有TET双加氧酶的参与[18]，这表明RNA中的 可能经历相同的去甲基化机制。 广泛存在于所有生命领域的编码RNA和非编码RNA中[21]。氧化的5-甲基胞嘧啶也在多种生物的RNA中被发现:哺乳动物、植物、昆虫 。一些研究表明，它们可能会影响RNA的稳定性和翻译，例如果蝇中的5hmrC就有这样的作用[23]。5-羧基核糖胞嘧啶(5carC)最近在哺乳动物RNA中被发现[6]，但与5-羟甲基核糖胞嘧啶(5hmrC)或5-甲酰基核糖胞嘧啶(5frC)相比，关于其普遍性和功能的了解仍然很少[20,22,24,25]。

TET酶属于一个庞大的TET - J结合蛋白(JBP)家族。序列和系统发育分析预测TET - JPB家族起源于噬菌体，并且通常在动物、棘阿米巴属、某些藻类、耐格里属、动质体目、某些细菌和噬菌体中只发现单个或少数几个TET - JPB拷贝。相比之下，真菌，尤其是担子菌(蘑菇、锈菌和黑粉菌)，显示出特定谱系的扩张，拥有众多TET - JPB基因，这些基因通常与一类独特的转座元件(TE)相关。在担子菌双色蜡蘑和灰盖鬼伞中，大多数与转座元件相关的TET - JPB基因(分别为74个中的47个和47个中的32个同源基因)被预测具有催化活性[26 - 28]。

在灰盖鬼伞的DNA中发现了氧化的5-甲基胞嘧啶，在那里使用单分子实时(SMRT)测序同时对它们进行了定位，此外，还通过胞嘧啶5 - 亚甲基磺酸盐免疫沉淀(CMS - IP)对 进行了定位[29]。然而， 双色蜡蘑和 灰盖鬼伞基因组中各个氧化的5-甲基胞嘧啶的分布情况以及各个氧化的5-甲基胞嘧啶对基因表达和转座子调控的影响尚未详细研究。

这两种真菌都属于伞菌目(Agaricales)，伞菌目是担子菌门(Basidiomycota)的一个大类群。灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea， )和双色蜡蘑(Laccaria bicolor， )的基因组相对较小(分别约为37和约 )，其基因组已被测序和组装(双色蜡蘑部分组装) ，并已在DNA甲基化研究中进行了分析[3]。腐生型的灰盖鬼伞是一种经典的真菌模式生物，可在实验室条件下轻松培养，它只需两周即可完成生命周期，并且可以进行基因操作[30,32]。双色蜡蘑是阔叶树和针叶树的重要外生菌根共生体，已被用于研究共生相互作用和生态适应的相关基因 。由于真菌对树木生长和必需营养物质循环起着至关重要的作用，外生菌根共生具有全球生态和经济重要性[34]。

除哺乳动物外，真核生物系统发育类群的DNA和RNA中氧化修饰胞嘧啶(oxi - mCs)的生物学功能仍未得到充分研究。在这里，我们通过定量液相色谱 - 串联质谱法(HPLC - MS/MS)和全基因组分析，分析了双色蜡蘑( )和灰盖鬼伞(C. cinerea)核酸中 氧化形式的分布情况，结果表明 和 持续存在于它们的DNA和RNA中，而 几乎只存在于去除长链polyA的RNA和小RNA中。 和 的高分辨率全基因组图谱显示，它们优先分布在转座元件(TEs)中，转座元件发挥着强大的基因调控作用，并且揭示了氧化修饰胞嘧啶及其前体 对这两种真菌基因表达的不同影响。

2. 材料与方法

2.1. 真菌培养

双色蜡蘑(Laccaria bicolor (Maire) Orton)S238N - H82单倍体单核菌株(NCBI:txid486041)由弗朗西斯·M·马丁(Francis M. Martin)教授慷慨提供。灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)单倍体单核菌株冈山7号(Okayama 7，NCBI: txid240176)从真菌遗传学保藏中心(Fungal Genetics Stock Center，FGSC；编号9003)获得。

灰盖鬼伞的菌丝体在固体(1%琼脂)酵母 - 麦芽 - 葡萄糖(YMG)培养基上保存[35]。为了提取核酸，在11升的烧瓶中加入 液体培养基，接种少量菌丝体，在 条件下避光静置培养14天。为了增强TET活性，菌丝体先培养7天，然后用 维生素 处理2天(除非另有说明)；未处理的对照组培养相同时间。

双色蜡蘑(Laccaria bicolor)菌丝体培养物在 条件下于黑暗中，在固体(2%琼脂)改良帕切夫斯基培养基(含 葡萄糖、 麦芽提取物、 、 、 硫胺素、 、 )上保存。为进行核酸提取，从用琼脂平板上少量菌丝体接种的液体培养基中培养八周后收集菌丝体。为进行维生素C处理，将菌丝体与 维生素 一起孵育2天。

2.2. 真菌DNA的纯化

使用研钵、研杵和液氮，将菌丝体与一小撮聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K25)一起研磨成粉末。将粉末(约 )在 条件下，于 裂解缓冲液(含 Tris - HCl pH 8.0、 乙二胺四乙酸(EDTA)、 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、2% PVP)中与蛋白酶K(赛默飞世尔科技)一起孵育 。然后，使用氯仿提取DNA，并在 条件下，使用1.5倍体积的异丙醇和0.4倍体积的 醋酸钠 沉淀 。

将DNA溶解在 Tris - HCl中，并在 条件下用RNase A/T1(赛默飞世尔科技)处理 ，然后通过氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化。通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA质量，并使用Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒(赛默飞世尔科技)测定浓度。

2.3. 真菌RNA的纯化

如DNA提取所述，首先将菌丝体研磨粉碎。用于蛋白质斑点印迹法的灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)RNA和双色蜡蘑(Laccaria bicolor)RNA，按照供应商的建议，使用RNAzol RT试剂(MRC公司)进行提取。

在其他实验中，灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)的总RNA采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取[36]。将菌丝体粉末(约 )置于 裂解缓冲液(2% CTAB、2%聚乙烯吡咯烷酮K25、100 mM Tris - HCl，pH 、25 mM乙二胺四乙酸(EDTA)，pH 8、2 M氯化钠)中，于 条件下以550转/分钟的速度孵育 。然后通过氯仿萃取和用乙酸钠进行乙醇沉淀来纯化RNA。通过琼脂糖凝胶电泳检查RNA的质量，并用Qubit RNA HS检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司)测定其浓度。

2.4. 对照RNA的制备

对照RNA采用转录助手T7高产转录试剂盒(赛默飞世尔科技公司)，按照供应商的建议，通过体外转录合成。以携带重组sR47(深渊火球菌(Pyrococcus abyssi))基因的线性化pUC18质粒为DNA模板[37]。为合成含5 - 羧基胞嘧啶(5carC)的RNA，反应中使用的5 - 羧基胞苷三磷酸(5caCTP，三链生物技术公司)占胞苷三磷酸(CTP)总量的25%。用RNA清洁浓缩试剂盒 - 5(RCC；赛默飞世尔科技公司)纯化RNA。采用高效液相色谱 - 串联质谱法(HPLC - MS/MS)评估对照RNA中5carC的含量。

2.5. 通过蛋白质斑点印迹法分析5 - 羧基胞嘧啶(5caC)

以未修饰的和含5 - 羧基胞嘧啶(5carC)的sR47 RNA作为对照。阳性DNA对照采用含 的寡核苷酸( TAATAATAAT；美塔比昂公司)，并按样品中的最终纳克量与dam - dcm - λ噬菌体DNA(赛默飞世尔科技公司)混合，后者也用作阴性对照。RNA在 条件下于水中 孵育 ，再于 孵育。将样品点样到Hybond - NX膜(通用电气医疗集团生命科学部，英国阿默舍姆)上，干燥后用紫外线交联 。将膜在 乙酸钠(pH 5.2)中用 亚甲蓝(罗斯公司)染色 ，然后在水中冲洗，再在含0.1%吐温20的磷酸盐缓冲盐水(PBS，137 mM氯化钠、2.7 mM氯化钾、 )中洗涤 。

将膜在室温下用含2%脱脂牛奶的Tris缓冲盐水(TBS)(50 mM Tris - HCl，pH 7.4，150 mM NaCl)封闭 。然后，将其在约 的温度下与 抗5 - 羧基胞嘧啶(5caC)抗体(Active Motif产品编号61225，RRID:AB_2793557)在含 牛奶和 吐温20的 TBS中孵育过夜，并用含 吐温20的TBS洗涤三次，每次 。然后，将 抗兔二抗山羊辣根过氧化物酶(HRP)偶联抗体(Active Motif产品编号15015)加入含TBS、2%牛奶和0.1%吐温20的 缓冲液中，并在室温下孵育1小时。用含 吐温20的TBS洗涤三次，每次 ，再用水洗涤两次，然后用显色底物3,3,5,5 - 四甲基联苯胺(TMB；Sigma - Aldrich)对膜进行染色。

2.6. 高效液相色谱 - 串联质谱法

为了定量DNA氧化修饰的胞嘧啶(oxi - mCs)，将约 的DNA进行消化，然后按照文献[15]的方法用高效液相色谱 - 串联质谱(HPLC - MS/MS)对核苷进行分离和分析。未分离的DNA用于评估 ，在维生素 处理后(约 )用于评估 和 ，分析方法同文献[15]。

为分析RNA中的氧化修饰胞嘧啶(oxi - mCs)，首先将约 的灰盖鬼伞(C. cinerea)RNA和5微克含用于校准标准品的未修饰RNA，按照文献[15]中对DNA的处理方法，分离成单独的 、5 - 羟甲基核糖胞苷(5hmrC)和5 - 甲酰基核糖胞苷(5frC)核苷组分。未分离的RNA用于评估 。样品在配备Supelco Discovery HS C18色谱柱( )的高效液相色谱/电喷雾电离串联质谱联用(HPLC/ESI - MS/MS)系统(安捷伦1290 Infinity/6410B三重四极杆)上进行分析，采用线性溶剂梯度，流速为 ，温度为 。溶剂A(水中含0.0075%甲酸)和溶剂B(乙腈中含0.0075%甲酸)的梯度设置参照文献[15]中对应DNA修饰的设置。质谱仪在正离子多反应监测(MRM)模式下运行，记录核苷特异性离子跃迁的强度: ，甲酰基胞苷(frC) 。电离毛细管电压为 ，干燥气温度为 ，流速为 ，碰撞能量为 ，细胞加速器电压为 。 的碎裂电压设置为 ，其他核苷的碎裂电压设置为 。

为分析 衍生化，高效液相色谱(HPLC)梯度设置如下: B；26 - 27分钟，100% - 0% B；27 - 35分钟，0% B；或者0 - 6分钟，0% B；6 - 13.5分钟，0% - 6% B；13.5 - 21.5分钟，6% - 50% B；22 - 26分钟， B；26 - 27分钟，100% - 0% B；27 - 35分钟，0% B。 衍生物的离子跃迁记录为 300.1，碎裂电压设置为 ，碰撞能量为 ，碰撞室加速器电压为 。在每个实验中，将含有合成RNA的 与样品一起进行衍生化，以考虑反应效率可能存在的变化。然后，通过串联质谱(MS/MS)评估该RNA中的衍生化效率和初始 含量，并与未处理的5 - 羧基胞嘧啶(5carC)RNA进行比较。接着，将该RNA与 未修饰的RNA混合，用于5carC衍生物的校准。计算5carC衍生物的MS/MS信号面积与初始5carC含量的相关性。当信号处于校准曲线的线性范围内时可以进行定量，且只有当信噪比为 时才能检测到信号。

衍生化产物的高分辨率质谱在配备双电喷雾离子源(dual - ESI)的Q - TOF 6250质谱仪(安捷伦)上采集。

2.7. (4 - 氨甲基)苄基叠氮及其盐酸盐的合成

2.7.1. 1,4 - 双(叠氮甲基)苯

向搅拌的 - 二氯 - - 二甲苯( ，22.9 mmol)在 - 二甲基甲酰胺(DMF)(60 ml)的溶液中加入叠氮化钠( )和四丁基溴化铵( )。将反应混合物在 (沙浴)下搅拌 。然后在减压下蒸发溶剂至干，加入水。将得到的溶液用乙醚萃取 次，合并有机层，用硫酸钠干燥并蒸发，得到无色固体( )。核磁共振氢谱( )(CDCl ) :7.42(单峰， ，芳环 )，4.61(单峰， )。

2.7.2. 4 - (叠氮甲基)苄胺

合成按照文献[38]进行。向1,4 - 双(叠氮甲基)苯(0.2克，1.06毫摩尔)在 (6毫升)和 (4.5毫升， )的混合物中加入 (0.36克，1.38毫摩尔)，并将该非均相混合物剧烈搅拌 。然后分离有机层，水层用 萃取以除去 和未反应的起始原料。通过加入 溶液(2.5M)将水层的 调节至10，然后用 萃取。合并的萃取液用盐水洗涤，用 干燥，过滤并在真空下蒸发，得到产物，为浅黄色油状物 。该产物无需进一步纯化即可用于下一步反应。 (双峰， )，7.31(双峰， ， )。

2.7.3. 4 - (叠氮甲基)苄胺盐酸盐

将4 - (叠氮甲基)苄胺(0.1克，0.62毫摩尔)在1.1M盐酸甲醇溶液中于室温搅拌 ，然后蒸发该溶液。将所得固体用乙醚洗涤并干燥，得到淡黄色固体 核磁共振 二甲基亚砜 - ， (宽单峰， )，7.54(双峰， ，芳环氢)，7.42(双峰， ，芳环氢)，4.46(单峰， )，4.03(单峰， )。

2.8. 含5carC的RNA的衍生化

5-羧基胞嘧啶修饰的RNA(5carC-RNA)的衍生化方法基于文献[39]。反应前，RNA在 条件下于水中变性 时间，然后在冰上冷却。衍生化分两步进行。为优化第一步反应，将含有5-羧基胞嘧啶的sr47 RNA在 体积的 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(pH 6)中孵育，该缓冲液含有 -羟基琥珀酰亚胺(NHS；西格玛公司)，并与其他四种不同组合的试剂搭配:(a) 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC；西格玛公司)；(b) 8 mM EDC；(c) 2 mM EDC、45%二甲基亚砜(DMSO)；(d) DMSO。NHS和EDC需新鲜配制，混合后最后加入反应体系。第一步反应在 条件下孵育 时间，以 转/分钟的速度振荡。第二步，在最终 体积中加入 (4-氨甲基)苄基叠氮盐酸盐、磷酸钠(pH 7.5，100 mM)和 ，并在 条件下孵育 时间，以 转/分钟的速度振荡。反应液用水稀释2.5倍，然后使用RNA清洁浓缩试剂盒(赛默飞世尔科技公司)纯化RNA。

对于真菌RNA的进一步衍生化，第一步采用(d)条件；第一步中0.7 - 25μg RNA在 体积中孵育，第二步在最终 体积中孵育。

2.9. 真菌RNA分离成不同组分的纯化

使用RNA清洁浓缩-5试剂盒(赛默飞世尔科技公司)将RNA分离成大(长度大于 )和小(长度小于 )两个组分。使用磁珠mRNA纯化试剂盒(英杰公司)从大RNA组分中纯化出聚腺苷酸RNA(PolyA RNA)。根据供应商的建议，使用琼脂糖酶(赛默飞世尔科技公司)从低熔点琼脂糖中凝胶纯化大核糖体RNA。小RNA组分通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行纯化:将碾碎的凝胶在洗脱缓冲液(含 EDTA、 SDS)中于 条件下孵育 时间，以 转/分钟的速度振荡。样品通过超滤离心过滤器(密理博公司)过滤，然后用乙醇沉淀RNA。

2.10. 使用对照DNA片段评估 和 的富集情况

如文献[40]所述，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增从小鼠基因组DNA(gDNA)中制备出在一条链上含有一个 或 位点的模型DNA片段。根据供应商的方案，使用野生型SssI(赛默飞世尔科技)对另一条链中的CG进行甲基化。将模型DNA片段与超声处理后的双色蜡蘑(L. bicolor)DNA按 的比例混合，以模拟修饰的低丰度情况。

我们使用改进后的hMe - Seal和fC - Seal方案[9,41]来检测 和 。对于 的检测，如文献[15]所述，用 将其还原为 。为了区分天然基因组DNA中的 和 ，通过糖基化对 进行保护。对于 的保护，如文献[15]所述，在标记之前，用未修饰的UDP - 葡萄糖对 片段进行糖基化作为对照。使用 UDP - 6 - 叠氮葡萄糖(耶拿生物科学公司)和T4 β - 葡萄糖基转移酶(T4 BGT；赛默飞世尔科技)，在 反应中，按照 的条件对含有 、还原后的 或受保护的 的DNA片段进行标记。反应在 下孵育 ，然后在 下使酶失活 ，并使用DNA清洁浓缩试剂盒(zymo研究公司)进行纯化。

然后，通过向 Tris - HCl(pH 8.5)缓冲液中加入DBCO - S - S - PEG3 - 生物素(耶拿生物科学公司)至 浓度进行生物素化反应，反应在 下孵育 ，并使用DNA清洁浓缩试剂盒(zymo研究公司)对DNA进行纯化。然后按以下步骤富集DNA:将 的Dynabeads MyOne链霉亲和素C1(赛默飞世尔科技)与DNA在 Tris - HCl(pH 8.5)、1 M NaCl和0.01%吐温20(罗斯公司)中于室温下在滚轮上孵育 。用 Tris - HCl(pH 7.5)、 EDTA、 吐温20洗涤磁珠三次，再用 Tris - HCl(pH 7.5)、 EDTA、 和 的吐温20洗涤两次。

使用Maxima SybrGreen qPCR预混液(赛默飞世尔科技公司)，通过定量聚合酶链式反应(qPCR)评估磁珠和上清液组分中的DNA含量；每个反应使用 的引物对。扩增程序设置为:在Rotor - Gene Q实时荧光定量PCR系统(凯杰公司)上，以 进行 个循环，在 下进行 ，最后在 下延伸1分钟。

2.11. 羟甲基胞嘧啶(hMe)封闭和甲酰基胞嘧啶(fC)封闭文库的制备

将基因组DNA在Bioruptor UCD - 200(Diag - enode公司)仪器上于 Tris - HCl(pH 8.5)中进行超声处理，使其片段平均长度达到200 - 250 bp，然后使用DNA清洁浓缩试剂盒(Zymo Research公司)进行纯化。

的保护和 还原为 的操作如文献[15]所述。为了对 和 样本进行相似处理，对两个样本都进行相同的纯化步骤，但对 样本省略未修饰的尿苷二磷酸葡萄糖(UDP - glucose)糖基化和用 还原的步骤。取 的DNA，按照上述方法(见使用对照DNA样本评估 和 的富集情况)，用UDP - 6 - 叠氮葡萄糖和T4 β - 葡萄糖基转移酶(T4 BGT，赛默飞世尔科技公司)进行标记。制备两个对照DNA样本:对于 对照样本，在标记步骤中不添加T4 BGT；对于控制 样本中 保护情况的样本，使用未经过还原步骤的糖基化DNA。

按照使用对照DNA样本评估 和 富集情况中所述，在 反应体系中进行生物素化步骤，然后根据供应商的建议，使用DNA末端修复试剂盒(赛默飞世尔科技公司)对DNA进行末端填充，并使用DNA清洁浓缩试剂盒(Zymo Research公司)进行纯化。然后按照上述方法(见使用对照DNA样本评估 和 的富集情况)，在40 μl的 Tris - HCl(pH 8.5)、1 M氯化钠和0.01%吐温20(Roth公司)中，使用 的Dynabeads MyOne链霉亲和素C1磁珠(赛默飞世尔科技公司)对生物素化的DNA进行富集，通过将磁珠重悬于 的 二硫苏糖醇、 Tris(pH 7.8)中回收DNA，随后在摇床上孵育 。将释放的DNA与磁珠分离。

将DNA与4.2 pmol的Ion Torrent条形码接头(凯普生物系统公司，Kapa Biosystems)在含有 ATP、 聚乙二醇4000(PEG4000)和 连接酶(赛默飞世尔科技公司，Thermo Scientific)的 反应体系中过夜连接。然后使用MagJet NGS清理和片段大小选择试剂盒(赛默飞世尔科技公司，Thermo Scientific)去除接头。接着，将连接了接头的DNA与 2 - 巯基乙醇在室温下孵育 (以防止核苷酸间二硫键交联的意外形成)，随后在含有 并补充了 脱氧核苷三磷酸(dNTP)、 引物和 Taq DNA聚合酶(赛默飞世尔科技公司，Thermo Scientific)的 Taq缓冲液中进行PCR。PCR循环条件为: ， 个循环，每个循环包括 ，最后在 下延伸 。使用MagJet NGS清理和片段大小选择试剂盒(赛默飞世尔科技公司，Thermo Scientific)对文库进行片段大小选择，选取 的片段，并进行Ion Proton(赛默飞世尔科技公司，Thermo Scientific)测序。

2.12. hmTOP - seq和foTOP - seq文库的制备

使用Covaris M220仪器对DNA进行超声处理，以产生约200 - 250个碱基对(bp)的片段，并使用DNA清洁浓缩试剂盒(Zymo Research公司)进行纯化。按照上述hMe - Seal和fC - Seal文库的制备方法，将5 - 甲酰胞嘧啶(5fC)还原为 进行保护，并对 进行叠氮标记(此步骤中DNA的 )。然后，根据供应商的建议，使用DNA末端修复试剂盒(赛默飞世尔科技公司)在 条件下对DNA进行末端填充 ，并使用GeneJet纯化试剂盒(赛默飞世尔科技公司)进行纯化。接着，在 条件下，于 其缓冲液(赛默飞世尔科技公司)中，在 dATP存在的情况下，使用 的klenow聚合酶(赛默飞世尔科技公司)对DNA进行dA加尾处理 ，在 条件下使酶失活 ，随后通过GeneJet(赛默飞世尔科技公司)柱子进行纯化。使用 的 连接酶(赛默飞世尔科技公司)，在 其缓冲液(赛默飞世尔科技公司)中，于 条件下将部分互补退火的接头A1/A2(2.25 ，A1 P - GATTGGAAGAGTGGTTCAGCAGGAA TGCTGAG和A2 5’ ACACTCTTTCCCTACATGACACTCT TCCAATCT)与DNA连接过夜，然后在 条件下热灭活 ，并进行柱纯化(DNA清洁浓缩试剂盒；Zymo Research公司)。

然后按照文献[15]的方法进行TOP - seq文库富集和制备，并将文库进行Ion Proton(赛默飞世尔科技公司)测序。

2.13. RNA文库的制备

使用RNAzol RT试剂(MRC公司)提取双色蜡蘑(Laccaria bicolor)的RNA，按照供应商的建议用DNaseI(赛默飞世尔科技公司)进行处理，并使用RCC(Zymo Research公司)纯化长度大于 的片段。然后，根据供应商的建议，使用Ribo - Zero Gold rRNA去除试剂盒(酵母；Illumina公司)去除核糖体RNA，并使用RCC(Zymo Research公司)纯化长度大于 的片段。进一步使用适用于Illumina的Collibri链特异性RNA文库制备试剂盒(Invitrogen公司)在赛默飞世尔科技波罗的海公司制备RNA文库并进行测序(每个样本约 条双端读数)。

2.14. 分析的序列和序列注释

从联合基因组研究所基因组门户([42]；https://genome.jgi.doe.gov/portal/；RRID:SCR_002383)下载全基因组序列和注释信息:双色蜡蘑(L. bicolor)使用V2版本[31]，灰盖鬼伞(C. cinerea)使用V1版本[30]。从NCBI SRA PRJNA122153 [3]下载亚硫酸氢盐测序数据。从NCBI SRA - PRJEB4912 [43]下载灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)的polyA RNA测序数据。

使用InterProScan v. 86.0([44]；https://github.com/ebi - pf - team/interproscanhttp:// www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/；RRID:SCR_005829)，采用标准参数，并查找相应的基因本体论(Gene Ontology，GO)术语和通路注释(-goterms和 - pa选项)来识别蛋白质结构域。使用RepeatModeler V2.0.1(http:// www.repeatmasker.org/RepeatModeler/；RRID:SCR_015027)和RepeatMasker V4.1.0(https://www.repeatmasker.org/，RRID:SCR_012954)来识别每个基因组中的重复序列(使用标准参数)。使用遗传信息研究所(Genetic Information Research Institute，GIRI)的Censor [45](https://www.girinst.org/；RRID: SCR_012762)对转座元件(Transposable Element，TE)类别进行分类。TE簇被定义为富含TE的区域，并使用内部脚本进行识别。简而言之，将基因组划分为长度为100 bp的不重叠窗口，并识别出TE含量至少为 的窗口。将识别出的窗口合并为核心簇(窗口之间的距离为 )，并进一步合并距离小于 的核心簇。然后，我们选择长度至少为 且TE含量至少为 的簇。最后，通过将识别出的簇向两侧各延伸 来形成最终的TE簇。

使用内部脚本识别独特基因。简而言之，使用本地blastp([46]；https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ executables/blast+/LATEST/；RRID:SCR_001010)来识别相似的蛋白质序列。相似度阈值至少为 且成对比对覆盖率至少为 (在 和 两端最多有 个不匹配区域)的序列被识别为非独特序列。使用在线NCBI保守结构域数据库搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd；RRID:SCR_002077)，将属于TET - JPB超家族(cl24253)的基因识别为TET基因。

2.15. DNA测序数据分析

使用自定义分析流程分析hMe - Seal和fC - Seal数据。简而言之，使用FASTX - Toolkit(http://hannonlab.cshl.edu/fastx_ toolkit/；RRID:SCR_005534)按长度(最小长度15)对原始读段进行过滤并修剪(PHRED )，使用BWA([47]；http://bio - bwa.sourceforge.net/；RRID:SCR_010910)进行比对，并过滤以仅包含 读段。使用自定义R脚本根据最左侧和最右侧的比对位置去除PCR重复。对去重后的数据按修饰类型和生物体进行下采样，使其大小相等。然后将参考基因组划分为不重叠的 窗口，并计算每个窗口的覆盖率。为了去除背景信号，我们评估样本及其对照中的每个窗口:如果样本覆盖率至少是对照样本覆盖率的1.2倍，则将覆盖率差异用作窗口内的修饰水平。

使用BISMARK([48]；http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/ projects/bismark/；RRID:SCR_005604)流程，采用默认设置分析全基因组亚硫酸氢盐测序(Whole - Genome Bisulfite Sequencing，WGBS)数据。对于CG比例分析，仅选择至少有五条读段覆盖的CG进行进一步分析。对于富集分析，使用甲基化程度超过50%的CG。

按照[49]中所述对原始hmTOP - seq/foTOP - seq数据进行分析，并进行了一些修改:仅选择长度大于 的读段进行比对，使用hisat2([50]；https://daehwankimlab.github.io/ hisat2/；RRID:SCR_015530；使用 - no - spliced - alignment以防止剪接比对)进行比对，并且仅使用在组合技术重复样本中覆盖率至少为2的CG以及长度大于 的支架/染色体进行分析。

2.16. RNA测序分析

使用FASTQC程序(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/；研究资源标识符:SCR_014583)评估原始数据的质量，并根据制造商的建议，使用BBMAP软件包中的BBDUK(sourceforge.net/projects/bbmap/；研究资源标识符:SCR_016965)对读数进行修剪。使用hisat2 [50]程序(https://daehwankimlab.github.io/hisat2/；研究资源标识符:SCR_015530；使用的选项为 -no-unal -no-mixed -no-discordant -dta)，以双色蜡蘑(L. bicolor)V2 [31]和灰盖鬼伞(C. cinerea)[30]的参考基因组为模板进行数据比对，并使用samtools markdup v. 1.12([51]；http://www.htslib.org；研究资源标识符:SCR_002105)去除重复序列。使用StringTie v. 2.0.3([52]；https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/；研究资源标识符:SCR_016323)以每百万转录本(transcripts per million，TPM)为单位评估基因表达水平，并使用DESeq2([53]；https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html；研究资源标识符:SCR_015687)鉴定差异表达基因。将表达基因定义为TPM > 0.05的基因。

2.17. 统计分析

使用公式 计算修饰比例，其中 为修饰的CG数量， 为每个基因中CG的总数。仅使用非零表达/修饰基因计算表达和修饰组(十分位数和四分位数)。低/高修饰基因定义为处于第一个或最后一个十分位数范围内的基因。通过计算与基因组区域重叠的所有或选定的CG(或hMe - Seal和fC - Seal的200 bp非重叠区间)的列联表进行富集分析。使用Fisher精确检验估计优势比和 值。所有统计计算均使用R 3.4.0.3(https://www.r - project.org；研究资源标识符:SCR_001905)进行。

3. 结果

3.1. 检测双色蜡蘑( . bicolor)和灰盖鬼伞( . cinerea)中 的氧化形式

我们通过蛋白质印迹法(western dot - blot)和高效液相色谱 - 串联质谱法(HPLC - MS/MS)分析，测量了从双色蜡蘑(L. bicolor)和灰盖鬼伞(C. cinerea)菌丝体中提取的DNA里氧化甲基胞嘧啶(oxi - mCs)的全局含量。通过HPLC - MS/MS分析，我们观察到双色蜡蘑中 和 的含量(分别约为鸟嘌呤(G)的0.0008%和约0.001%)比灰盖鬼伞(约0.0002%)高四到五倍。在这两种真菌中， 和 的含量相近(图 ，d)，这与哺乳动物DNA不同，在哺乳动物DNA中，5 - 羟甲基胞嘧啶(5hmC)是最丰富的氧化甲基胞嘧啶(例如，在小鼠胚胎干细胞中，约 的 、约 的 、约 的 ；[4])，而5 - 羧基胞嘧啶(5caC)的含量最低(约占所有氧化甲基胞嘧啶的 ；另见图 )。这些结果与使用针对 的抗体进行的蛋白质印迹分析结果相反(电子补充材料，图S1A)，该分析显示灰盖鬼伞DNA中5caC信号很强(电子补充材料，图S1A)。因此，我们推测，在蛋白质印迹分析中DNA里观察到的 信号可能是由于 抗体与真菌提取物中的某些杂质发生交叉反应，或者是由于存在可能也含有 的残留RNA。实际上，我们通过蛋白质印迹法在灰盖鬼伞RNA中检测到了 (电子补充材料，图 )，并通过HPLC - MS/MS证实了RNA中存在 (图 ；电子补充材料，图S1B)，尽管其含量远低于蛋白质印迹分析的预期值(电子补充材料，图S1A)，这表明可能与真菌提取物中的未知成分发生了交叉反应。重要的是，观察到的 (图 )和 (电子补充材料，图S1B)水平与哺乳动物RNA中报道的水平相似(占鸟嘌呤的百分比:5 - 甲基核糖胞嘧啶(5mrC)约0.25%；5 - 羟甲基核糖胞嘧啶(5hmrC)约0.004%；5 - 羧基核糖胞嘧啶(5carC)约0.0001% [6]；另见[20]；图1d)。

3.2. 5 - 羧基胞嘧啶(5caC)在RNA中的分布

我们试图通过高效液相色谱 - 串联质谱法(HPLC - MS/MS)探究两种真菌RNA中5 - 羧基胞嘧啶(5carC)的丰度和分布。对 进行定量是一项艰巨的任务，因为首先，它需要大量的RNA(最多约 )；其次，为了将5carC与在质谱/质谱中保留时间相似的大量胞嘧啶分离，必须在质谱分析之前进行高效液相色谱核苷分级分离和纯化。为了提高对 的检测能力，我们采用了一种用于DNA中 化学衍生化的方法[17,39]，该方法通过1 - 乙基 - 3 - (3 - 二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)化学将(4 - 氨甲基)苄基叠氮与羧基结合。在我们优化的条件下(见电子补充材料、方法和图S2A)，合成RNA中约 的 发生了衍生化，这与DNA中 的反应性相似[39]。值得注意的是，5carC衍生物的质谱信号强度与未衍生化的 相比增加了约20倍(电子补充材料，图S2B)，并且其不同的保留时间消除了事先分级分离的需要。此外，5carC衍生物的质谱信号与输入样品中 的含量呈线性关系(电子补充材料，图S2D)，并且具有高选择性，因为在与不同量的未修饰RNA混合的样品中可以很好地检测到该信号(电子补充材料，图S2E)。由于平均而言，仅能检测到低至0.6飞摩尔的衍生化 ，因此所开发的衍生化方法非常适合测量真菌和其他生物样品中的 。

在两种真菌的标准培养条件下，衍生化使我们能够检测到灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea， )总RNA中的 (图 ；电子补充材料，图S3A)。为了增加 的含量，我们用维生素 处理这两种真菌，已有研究表明，维生素 可增强哺乳动物细胞中TET酶的氧化活性，而不改变RNA水平 。值得注意的是，正如预期的那样，维生素 处理增强了灰盖鬼伞中的信号(图 ；电子补充材料，图S3A)，并在双色蜡蘑(Laccaria bicolor)中诱导出非常强的5carC衍生物信号(图2d；电子补充材料，图S3A)。这证实了灰盖鬼伞中存在5carC，并表明在某些生物学情况下，双色蜡蘑中可能会出现5carC。

然后，我们研究了5-羧基胞嘧啶(5carC)在各类RNA中的分布情况:含多聚腺苷酸(polyA)尾的RNA、去除多聚腺苷酸的大RNA(长度超过 )和小RNA(长度短于 )。对于灰葡萄孢菌( . cinerea)，我们还分离出了大核糖体RNA，并将小RNA池进一步分馏为5.8S核糖体RNA、5S核糖体RNA、转运RNA(tRNA)、长度≥ 的tRNA组分以及长度短于 (这是微小RNA(miRNA)的典型长度)的RNA(电子补充材料，图S3B)。在用维生素C处理的双色蜡蘑(L. bicolor)中，5carC在去除多聚腺苷酸的大RNA和多聚腺苷酸RNA中相对丰富，而在小RNA池(长度短于 )中几乎检测不到信号(图 )。在未处理的灰葡萄孢菌中，小RNA中的 水平最高；然而，维生素 处理使去除多聚腺苷酸的大RNA中的5carC含量增加(图2b)。多聚腺苷酸RNA、5.8S核糖体RNA和转运RNA仅在一次生物学重复中，经维生素 处理后显示出微弱信号，而28S、18S和5S核糖体RNA组分在两种条件下均未检测到 (图 ；电子补充材料，表S1)。经维生素 处理后， 和长度短于22个核苷酸的RNA组分中的5carC水平也有所增加(图2c；电子补充材料，表S1)。这些组分中相对较强的5carC信号表明，它们对长度短于200个核苷酸的小RNA池中的5carC信号贡献最大。值得注意的是，我们观察到，经维生素 处理2天后，总RNA和小RNA中的 含量下降， 含量增加，这可能证明了TET蛋白通过对 的连续氧化形成了氧化修饰的胞嘧啶(oxi - mCs)。维生素 处理5天后， 和 的含量进一步升高，但 的含量未升高，这可能是 恢复过程的结果(图 )。有趣的是，在所有条件下，灰葡萄孢菌的多聚腺苷酸RNA中均未检测到 。

图2. 使用化学衍生法对担子菌双色蜡蘑(L. bicolor)和灰盖鬼伞(C. cinerea)RNA中的5-羧基胞嘧啶(5carC)进行高效液相色谱 - 串联质谱(HPLC - MS/MS)定量分析。(a) 使用(4 - 氨甲基)苄基叠氮进行化学衍生法检测5carC。灰盖鬼伞RNA中5carC(红色，20 µg RNA)和5carC衍生物(品红色，5 µg RNA)的质谱/质谱信号。绿色显示的是5carC标准品(10 fmol)，蓝色显示的是5carC衍生物(1 fmol)。(b, c) 对灰盖鬼伞不同RNA组分中化学衍生后的5carC进行HPLC - MS/MS分析，以及(d) 双色蜡蘑的分析。真菌用维生素C(vitC)处理2天(b, c, d)或5天(b)。未处理的双色蜡蘑RNA未进行分级分离，因为它未显示5carC信号。使用了两个生物学重复。星号表示仅在两个重复之一中检测到并定量了信号(在校准曲线的线性范围内)的样品；圆圈表示在两个重复之一中可检测到信号但无法定量(在校准曲线的线性范围之外)的样品；未显示任何信号的样品未包括在内(另见电子补充材料，表S1)。总RNA(Total)；小RNA(small)，通过柱纯化富集的小于200 nt的RNA组分；去除多聚腺苷酸的大RNA(large polyA - depleted)，大于200 nt的富集RNA，其中去除了含多聚腺苷酸尾(polyA)的RNA； 转运RNA(tRNA) 22 nt，小于tRNA且大于22 nt的RNA； 22 nt，小于22 nt的RNA。小RNA(小于200 nt的RNA)组分包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、tRNA和小于tRNA的RNA；去除多聚腺苷酸的大RNA组分包括28S、18S RNA和其他大于200 nt的RNA(另见电子补充材料，图S3B)。

综上所述，在灰盖鬼伞中，除了最丰富的 核糖体RNA(rRNAs)之外的大RNA中存在5carC，表明它与缺乏或具有短多聚腺苷酸尾的信使RNA(mRNAs)或非编码RNA相关。考虑到双色蜡蘑中的多聚腺苷酸RNA在维生素C处理后获得了5carC，这种修饰可能在某些生物学条件下产生。值得注意的是，在灰盖鬼伞和双色蜡蘑的小RNA池中，5carC的含量几乎不受维生素 的影响，这表明这种修饰不会导致或指示RNA降解。然而，我们不能排除小RNA总池中微弱的5carC信号是大RNA降解的结果，或者它是否来自非常短的调控RNA，如在真菌中鉴定出的微小RNA(miRNA，在灰盖鬼伞中发现了类似微小RNA的RNA；[56])；这仍有待阐明。

3.3. 全基因组范围内 和 的分析

接下来，我们使用基于 和 亲和富集的hMe - Seal及其改进版本fC - Seal，研究了最丰富的氧化修饰5 - 甲基胞嘧啶(oxi - mCs) 和 在双色蜡蘑(Laccaria bicolor， )和灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)基因组中的分布情况 。我们首先在模型DNA片段上优化了用于分析真菌DNA的方案，该方案对 和 表现出良好的特异性(材料与方法；电子补充材料，图S4)。为了比较双色蜡蘑和灰盖鬼伞中这两种氧化修饰5 - 甲基胞嘧啶的基因组分布，我们通过富集 和 的方案处理了它们的基因组DNA，并对制备好的文库进行测序，测序覆盖度适中(双色蜡蘑为25倍，灰盖鬼伞为45倍)。在这两种真菌中，长度为 且包含 和 的基因组区间彼此有适度重叠(双色蜡蘑和灰盖鬼伞的杰卡德系数分别为0.51和0.33)。此外，这两种信号都与全基因组亚硫酸氢盐测序数据(WGBS，[3])有高度重叠，全基因组亚硫酸氢盐测序数据代表了 和 的综合信号(在包含WGBS修饰信号的200 bp基因组区间中，分别有56.65%和69.70%与hMe - Seal重叠，双色蜡蘑和灰盖鬼伞中分别有 和 的WGBS区间与fC - Seal基因组区间重叠)。对包含 和 的区域与各种基因组元件进行的富集分析表明，这两种修饰主要发生在与基因相关的区域、基因间转座元件(TEs)以及基因间区域，与 类似(图 )。这与使用其他方法对灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea， )中 的分析结果一致， 被证明分布在转座元件及其周围区域、着丝粒、未表达的孤儿基因和多拷贝旁系同源基因中[29]。我们还观察到，在这两种真菌的TET基因处 都有富集，且在灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea， )中这种富集更强。

图3. 双色蜡蘑(L. bicolor)和灰盖鬼伞(C. cinerea)基因组中5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-甲基胞嘧啶(5mC)修饰的分布。(a) 通过羟甲基化DNA选择性化学标记测序(hMe-Seal)和甲酰化DNA选择性化学标记测序(fC-Seal)(200碱基对区间)、羟甲基化DNA末端氧化测序(hmTOP-seq)和甲酰化DNA末端氧化测序(foTOP-seq)(单个CG位点)获得的5hmC和5fC信号，以及全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)获得的5mC信号(使用甲基化程度超过50%的CG位点，[3])在各种基因组特征上的富集情况(优势比(OR)的log2值)。显著性通过Fisher精确检验获得。非显著估计值( )用“X”标记。UTR5和UTR3分别为基因的5′和3′非翻译区。(b) 两种真菌中包含和不包含转座元件(TE)(TE+/TE - )的基因组元件(外显子、内含子、基因间区域)的比例(以碱基对和CG数量计)。int，基因间区域。(c) 双色蜡蘑中表达(转录本每百万映射读数(TPM) 0.05，Exp)和未表达(NoExp)的TET基因中5hmCG和5fCG的比例，以及(d) 双色蜡蘑和灰盖鬼伞所有基因中5hmCG和5fCG的比例。所有成对Wilcox检验的 值均小于或等于所示的 值。(e) 根据基因5mCG比例分层的基因组中氧化修饰的甲基胞嘧啶(oxi - mCs)的比例。下方列出了每组中的基因数量。仅使用含有oxi - mCs的基因。使用线性模型拟合绘制的数据。TE，转座元件；重复序列，其他重复序列(串联重复、小卫星和微卫星)，不包括TE。分别用vitC+或vitC - 标记是否用维生素C处理的样本。L. b.，双色蜡蘑；C. c.，灰盖鬼伞。

与大多数担子菌一样，这两种真菌中最丰富的转座元件是属于长末端重复序列(LTR)类的I类(逆转录转座子)元件，其中吉普赛(Gypsy)和科皮亚(Copia)家族数量最多[30,31,57]。这两种真菌中的LTR逆转录转座子密切相关[58]。第二丰富的转座元件组由末端反向重复序列(TIR)组(II类，DNA转座子)代表。据报道，双色蜡蘑基因组比灰盖鬼伞基因组含有更大的转座元件家族(例如，[59]中报道双色蜡蘑有4662个LTR，而灰盖鬼伞有907个；双色蜡蘑有511个TIR，而灰盖鬼伞有12个)。此外，与灰盖鬼伞不同，转座元件并不局限于亚端粒或着丝粒区域，而是分布在整个基因组中，形成不同类型转座元件的簇 。图 显示了这两种真菌不同的基因组组成:尽管两种真菌的基因间区域中转座元件最为丰富，但在双色蜡蘑中观察到基因间转座元件的比例更高。值得注意的是，在灰盖鬼伞中，只有非常小比例的注释蛋白质编码基因含有转座元件，而在双色蜡蘑中这一比例增加到约 。

由于真菌中的基因相对较短(双色蜡蘑平均 [31]；灰盖鬼伞为1.8千碱基 [30])，基于亲和富集的方法的中等分辨率(根据我们实验中的DNA片段长度约为150 - 400碱基对)可能会导致氧化修饰的甲基胞嘧啶(oxi - mC)在基因组元件上的分布结果出现重叠，特别是对于转座元件，其在双色蜡蘑和灰盖鬼伞中的中位长度分别为 和 。因此，我们接下来的目标是通过基于末端氧化测序(TOP - seq)策略的单CG位点映射技术来细化 和 的分布 [60]，更多地关注双色蜡蘑，因为到目前为止，尚未对其富含转座元件的基因组中的oxi - mCs进行分析。

为增强真菌DNA中的氧化修饰5-甲基胞嘧啶(oxi - mC)信号，我们进行了维生素C处理:高效液相色谱 - 串联质谱(HPLC - MS/MS)显示，双色蜡蘑(Laccaria bicolor， . bicolor)中 的含量从约0.0004%增加到0.0007%， 的含量从 增加到 ；在灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea，C. cinerea)中， 的含量从约0.0002%增加到0.0014%，5 - 甲酰基胞嘧啶(5fC)的含量从0.0004%增加到0.002%(电子补充材料，图S5)。为分析这些样本中的 ，我们采用了最近开发的羟甲基化拓扑异构酶测序(hmTOP - seq)方法[49]。此外，我们还开发了其改进版本——甲酰基化拓扑异构酶测序(foTOP - seq)，即在进行hmTOP - seq文库制备之前将 还原为 (见电子补充材料，方法部分)，并使用该方法生成双色蜡蘑中的 图谱。由于双色蜡蘑和灰盖鬼伞基因组中的 主要出现在CG环境中[3]，我们将分析重点放在CG上，这些CG分布在所有主要的基因组元件中，在外显子和基因间区域的比例更大(图 )。在双色蜡蘑DNA中，我们分别在hmTOP - seq和foTOP - seq文库的两个重复样本中鉴定出275922个5 - 羟甲基化CG(5hmCG)和271761个5 - 甲酰基化CG(5fCG)(平均 覆盖度)，如预期的那样，在维生素 处理后，其数量分别增加到 和349758个5fCG。在标准条件下培养的灰盖鬼伞中，我们在hmTOP - seq文库的两个重复样本中鉴定出 (平均 覆盖度)。在各种基因组元件中，含 和含 的区域之间存在较高的相关性(基因的皮尔逊相关系数 ，重复序列的为0.49)，这表明双色蜡蘑中 和 有很强的重叠。对鉴定出的氧化修饰mC的CG在基因组元件中的富集分析结果与上述hMe - Seal和fC - Seal的结果基本一致，并且显示出维生素C处理和未处理样本具有相似的趋势(图3a): 和 在转座元件(TEs)、基因间区域富集，大多数修饰的TEs位于基因间区域(电子补充材料，图S6A)和含TE的基因中，而在 和 中缺失。虽然两种真菌的外显子和内含子总体上氧化修饰mC含量较低，但在灰盖鬼伞的外显子中观察到稍强的富集。有趣的是，尽管通过全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)获得的修饰信号显示灰盖鬼伞的 非翻译区(UTR)和 非翻译区(UTR)中修饰信号缺失，但它们在5hmCG和5fCG中显示出微弱的富集。与双色蜡蘑不同，灰盖鬼伞中含氧化修饰mCG的TE的基因组元件仅占所有元件的一小部分(电子补充材料，图S6A)。

由于转座元件(TEs)可能会映射到真菌基因组中的多个位置，因此我们同时使用多映射位点分析了hm/foTOP - seq数据(见电子补充材料，方法部分)，并将其用于除与全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)比较之外的所有后续分析。在多映射方法中，在双色蜡蘑(L. bicolor)的转座元件中鉴定出的修饰 比例要高得多(电子补充材料，图S6A)。对不同类别的转座元件进行的氧化修饰的甲基胞嘧啶(oxi - mCG)富集分析表明，两种真菌中的逆转录转座子和DNA转座子类别具有相似的富集情况；在DNA转座子中，5 - 羟甲基胞嘧啶(5hmCGs)/5 - 甲酰基胞嘧啶(5fCGs)在末端反向重复序列(TIRs)以及在基因丰富区域的双色蜡蘑中发现的一种螺旋子家族中富集[58]。对于II类元件，在长末端重复序列(LTR，如吉普赛(Gypsy)、科皮亚(Copia))和一些非长末端重复序列家族(DIRS或LINE)中观察到了富集现象(电子补充材料，图S6B)。尽管转座元件家族的丰度差异很大，其中长末端重复序列的数量最多，但所有家族的可比富集情况表明，通过氧化修饰的甲基胞嘧啶(oxi - mCs)对转座元件的调控可能相似。

为了比较氧化修饰的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(oxi - mCGs)及其前体 在基因和转座元件(TEs)中的分布情况，我们采用之前描述的策略 来计算修饰的胞嘧啶鸟嘌呤(CG)比例。重要的是，对于全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)数据，计算得到的全基因组范围内基因的 比例与 甲基化值具有良好的相关性(灰盖鬼伞(C. cinerea)的相关性为0.94，双色蜡蘑(L. bicolor)的相关性为0.54)。因此，该策略能够直接比较通过WGBS和我们基于半定量TOP - seq方法测量的不同数据和修饰情况。在灰盖鬼伞( . cinerea)中，绝大多数基因含有 (在分析的13237个基因中，有13185个单映射基因和13215个多映射基因)，而在双色蜡蘑(L. bicolor)分析的22910个基因中，分别使用单映射和多映射方法时，在19760个和20320个基因中发现了氧化修饰的胞嘧啶(oxi - mCs)。我们观察到oxi - mCGs和 之间存在良好的一致性，这种一致性在灰盖鬼伞( . cinerea)中更强(图3e)。在灰盖鬼伞(C. cinerea)中，含5 - 甲基胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(5mCG)的基因呈双峰分布:一大组基因(约11900个)表现为 缺失或含量较低，且 比例处于平均水平；第二丰富的一组由高度富含 和 的基因组成(约890个基因， 且 比例平均)。在双色蜡蘑(L. bicolor)中，大多数基因(约19500个)表现出较低的 和oxi - mCG比例( 且氧化修饰的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(oxi - mCG)平均比例为0.09)，并且 和oxi - mCG比例处于中等水平(大于0.2但小于 且oxi - mCG平均比例为0.23)的基因数量超过了高度修饰的基因组(大于 且oxi - mCG平均比例为0.26)。值得注意的是，与灰盖鬼伞(C. cinerea)相比，在双色蜡蘑( . bicolor)中观察到数量多得多的未甲基化但含oxi - mCG的基因(双色蜡蘑中有7709个含5 - 羟甲基胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(5hmCG)的基因和8163个含5 - 甲酰基胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(5fCG)的基因，而灰盖鬼伞中有2205个含5hmCG的基因)，这表明两种真菌中 氧化产物的转换存在明显差异(图3e)。尽管在双色蜡蘑( . bicolor)的19760个含氧化修饰的 的基因中，有14396个基因同时具有 和 修饰，但也检测到了仅有一种类型的oxi - mCG修饰的基因(分别有3018个和2346个基因具有 和 )。

InterProScan分析仅为双色蜡蘑(L. bicolor)中约 个氧化修饰5-甲基胞嘧啶(oxi - mC)程度最高的基因提供了基因本体论(GO)术语，并显示这些基因与许多不同的细胞过程相关(超过 个术语)，这表明很可能 / 与特定基因并无关联。在蛋白质二聚化活性(GO:0046983)、核酸结合(GO:0003676)、G蛋白偶联受体信号通路(GO:0007186)、GTP酶活性(GO:0003924)、鸟苷核苷酸结合(GO:0019001)、G蛋白β/γ亚基复合物结合(GO:0031683)、ATP结合(GO:0005524)以及核酸内酯键水解催化(GO:0004518)等功能和过程中发现了更多的基因(10 - 17个)。在未被GO术语定义但具有已鉴定结构域或基序的基因中，大多数被鉴定为转座酶，这些转座酶也属于2 - 酮戊二酸 - 铁依赖性双加氧酶(2OGFeDO)超家族的加氧酶结构域(基于Pfam注释)。

3.4. 与基因表达的关联

为了评估氧化修饰5 - 甲基胞嘧啶(oxi - mCs)对真菌基因表达的影响，我们对在正常和高维生素 条件下培养的双色蜡蘑( . bicolor)菌丝体进行了全转录组测序。对于灰葡萄孢菌( . cinerea)，我们使用了在标准条件下培养的菌丝体的公开可用的polyA RNA测序数据[43]。尽管在我们的分析中鉴定出的大多数双色蜡蘑TET基因(46个基因，见方法部分)具有 修饰(图 )，但只有其中四个氧化修饰5 - 甲基胞嘧啶鸟嘌呤(oxi - mCG)比例较低的基因显示出可检测到的表达(转录本每百万映射读数(TPM)> 0.05)，并且可能参与了oxi - mCs的产生(图 )。一般来说，我们确定了oxi - mCs与未表达基因的优先关联(图 )。此外，所有多拷贝基因比单拷贝基因具有更高的oxi - mC修饰程度和更低的表达水平(电子补充材料，图S6C和D)，这与灰葡萄孢菌中 的报道结果一致[29]。由于含转座元件(TE)的基因和基因间区域在 中富集程度最高(图 )，我们进一步探究了基因的表达和修饰与TE存在的关系。已知在真菌中，TE的插入甚至与TE的接近都会下调基因表达[63]。尽管真菌中的TE通过DNA甲基化[64]和异染色质形成[65,66]在全局上转录失活，但 氧化对TE活性的影响尚不清楚。我们发现，在这两种真菌中，当基因及其可能包含启动子的上游区域与TE重叠时，它们的 修饰程度更高(图 ；电子补充材料，图S8A)，因此，这些基因的表达水平更低(图 )。与TE重叠或被TE包围的双色蜡蘑基因表现出最高的oxi - mC修饰程度和最低的表达水平(图 )。由于TE中氧化修饰5 - 甲基胞嘧啶鸟嘌呤(oxi - mCG)的比例相对较高(电子补充材料，图S7A)，这有力地证实了TE对基因 修饰水平的影响，同时也证实了其对基因表达的负面影响。

据报道，在一些真菌中，甲基化程度较高、活性较低的基因分布在转座元件(TE)簇中 [63,64]。在双色蜡蘑(L. bicolor)的基因组中检测到了TE簇 [34]。为了对双色蜡蘑和灰盖鬼伞(C. cinerea)进行比较分析，我们重新鉴定了TE簇，将其定义为长度至少为 且重复序列含量至少为 的区域(见电子补充材料，方法部分)。正如预期的那样，在双色蜡蘑中发现的簇数量要多得多:双色蜡蘑和灰盖鬼伞中分别有207个和82个TE簇，分别覆盖20966119 bp和2578862 bp(分别占基因组的35.48%和7.2%)，且每个簇平均分别有60个和8个TE。我们观察到，簇中的TE比孤立的TE表现出更高的 比例(电子补充材料，图S7A)，并且高度氧化的甲基化胞嘧啶(oxi - mCG)修饰的TE与低表达相关(电子补充材料，图S7B)。与簇中TE的高oxi - mCG比例一致，位于TE簇(及其上游区域)中的基因在 中富集程度最高(图 和电子补充材料，图S8A)，并且与簇外或无TE的基因相比表达量最低(图 ；电子补充材料，图S7C、S8B、S8C)。

一般来说，在双色蜡蘑中，大多数与TE簇相关的基因(7095个中的4312个)被发现不表达(平均 和 比例)，而TE簇外的15815个基因中只有3618个被沉默(平均 和 比例)，这证明了TE的沉默效应。簇中表达基因的修饰胞嘧啶测量比例略高于簇外基因，平均为 和 (簇外为0.035 和 )。

由于基因和转座元件(TEs)包含所有三种胞嘧啶状态，即 、 ，我们进一步试图研究单个胞嘧啶修饰在基因表达调控中的相互作用。我们根据 比例对所有基因进行分组，并评估它们的表达随氧化甲基胞嘧啶(oxi - mC)比例增加的变化情况。引人注目的是， 含量与表达之间的关系在双色蜡蘑(L. bicolor)和灰盖鬼伞( . cinerea)中有所不同(图 )。在灰盖鬼伞( . cinerea)中，低甲基化基因(5mCG比例为0 - 0.1)检测到正相关关系，这与在哺乳动物中观察到的 对表达的积极影响一致[67]，而在高甲基化和羟甲基化基因(比例为 )中，表达较弱或不存在。在双色蜡蘑( . bicolor)中，只有在比较无氧化甲基化胞嘧啶(oxi - mCGs)和低氧化甲基化胞嘧啶比例(高达0.1)的两组基因时，表达与 比例之间的正相关关系才明显，而 比例高于该值的基因大多被沉默，无论其 含量如何。与转座元件(TE)簇相关的基因和簇外基因也观察到相同的趋势，只是簇内基因的表达水平较低。为了评估CG比例测量对基因修饰评估的相关性，我们还计算了相同 组的CG覆盖率值:两组数据总体上相符，但 修饰值较高的组除外，这些组在双色蜡蘑( . bicolor)中显示低甲基化基因的下调较弱，在灰盖鬼伞( . cinerea)中未显示强烈的下调(电子补充材料，图S7D)。这表明存在含有少量高度修饰(即高覆盖率)的 位点的基因，并表明使用TOP - seq数据分析的两个参数可以收集到互补信息。

图4. 双色蜡蘑(L. bicolor)和灰盖鬼伞(C. cinerea)中羟甲基胞嘧啶(ShmC)、5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-甲基胞嘧啶(5mC)与基因表达的关系。(a) 羟甲基化胞嘧啶鸟嘌呤(ShmCG)和甲酰化胞嘧啶鸟嘌呤(5fCG)的比例；(b) 所有与转座元件(TE)相关(TE+，距离小于1 kb)或不相关(TE–)，或存在于转座元件簇中的基因(在簇内)的表达情况。分别使用克鲁斯卡尔 - 沃利斯检验(Kruskal–Wallis)和单因素方差分析(one-way ANOVA)来检验组内差异( 值 < 0.05)。(c) 羟甲基化胞嘧啶鸟嘌呤(5hmCG)和甲酰化胞嘧啶鸟嘌呤(5fCG)的比例；(d) 根据转座元件的位置分组的基因表达情况(干净，在1 kb距离内未检测到转座元件；上游或下游，在基因上游或下游1 kb内检测到转座元件；上下游，在基因上下游均检测到转座元件；重叠，转座元件与基因重叠)。分别使用克鲁斯卡尔 - 沃利斯检验(Kruskal–Wallis)和单因素方差分析(one-way ANOVA)来检验组内差异( 值 < 0.05)。(e) 根据差异甲基化基因中5fCG和5hmCG基因比例分层的基因表达情况(全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)数据中的5mCG比例显示在图表上方)。(f) 比较转座元件簇内外根据高(H)和低(L)基因5mCG和5hmCG比例分组的不同修饰基因的表达情况。星号表示使用 检验计算的 值。(g) 双色蜡蘑中三种5mC - 、5fC - 和5hmC - 修饰的胞嘧啶鸟嘌呤(CG)含量低(L)，以及灰盖鬼伞中5mCG/5hmCG含量低的基因，在转座元件簇内外无(N)这些修饰时的基因表达情况。星号表示使用 检验计算的 值。L. b.，双色蜡蘑(L. bicolor)；C. c.，灰盖鬼伞(C. cinerea)；n.s.， 值 > ；* ；** ；*** ；*** 。

对双色蜡蘑( . bicolor)和灰盖鬼伞( . cinerea)中不同胞嘧啶修饰比例高低的基因的特写观察再次表明，在双色蜡蘑中，两种氧化的5 - 甲基胞嘧啶形式(仅显示 的数据)强烈抑制转座元件簇内外的基因:对于高度和低度甲基化的基因组，只有5hmCG比例低的基因有表达，而高度 修饰的基因则被沉默(图 )。相比之下，在灰盖鬼伞中，当基因甲基化水平较低时，较高的 水平标志着更活跃的基因( 值 < )，但大量的 和 协同作用抑制基因(在低基因 水平下，与低 水平相比，较高的 含量往往会下调基因)，高 比例的抑制作用更强( 值 < )。另一方面，尽管在两种真菌中都观察到氧化甲基胞嘧啶(oxi - mCs)的沉默作用，以及在灰盖鬼伞中 的沉默作用，但发现所有胞嘧啶修饰水平低的基因比无修饰的基因表达更强烈 。两种真菌之间观察到的差异可能表明，双色蜡蘑中比灰盖鬼伞中更丰富的转座元件存在不同的调控机制。然而，我们不能排除这些差异是由于双色蜡蘑( . bicolor)基因组中基因和转座元件注释不佳造成的[31,63]。

4. 讨论

为了理解双色蜡蘑(L. bicolor)和灰盖鬼伞(C. cinerea)中存在多个TET - JPB基因可能产生的结果，我们研究了 氧化形式在真菌菌丝体核酸中的分布情况。我们在这两种真菌的DNA中都检测到了三种氧化甲基胞嘧啶(oxi - mCs)， 和 的水平相似，这与哺乳动物DNA中 的丰度远高于 的情况相反(图 )。这可能表明 和 在真菌中具有不同的周转速率或生物学作用。与哺乳动物不同，双色蜡蘑和灰盖鬼伞有许多TET - JPB基因(47 - 74个基因)，而哺乳动物中只有三个此类基因 。尽管有众多的TET - JBP基因，但只有少数基因表现出微弱的表达(本研究和[29])；因此，在双色蜡蘑( )和灰盖鬼伞( )基因组中观察到的氧化甲基胞嘧啶水平相对较低并不意外。在三种氧化甲基胞嘧啶修饰中，灰盖鬼伞( )DNA中的 含量最低(图 )，这与[29]报道的 含量最丰富的情况相反。高效液相色谱 - 串联质谱(HPLC - MS/MS)和蛋白质斑点印迹分析中检测到的 比例差异，可能是由于所用 抗体的交叉反应性所致，这对基于抗体的真菌样本分析方法的可靠性提出了质疑。出于这个原因，我们通过高效液相色谱 - 串联质谱(HPLC - MS/MS)对双色蜡蘑和灰盖鬼伞的DNA和RNA中的氧化甲基胞嘧啶进行了全面表征。

我们在灰盖鬼伞(C. cinerea)的RNA中发现了5-羧基胞嘧啶(5carC)，并开发了一种化学衍生化方法，以便通过高效液相色谱 - 串联质谱(HPLC - MS/MS)对其进行检测，5carC是最罕见且研究最少的氧化修饰胞嘧啶(oxi - )。在不同类型的RNA中，5carC在去除多聚腺苷酸(polyA)的大RNA中被检测到，这表明它可能与缺乏或具有短polyA尾巴的信使RNA(mRNA)或非编码RNA有关。已有研究表明，一些真菌含有相当比例的缺乏polyA尾巴的mRNA [68]，并且短polyA尾巴在真核生物的高表达基因中很常见 [69]。在灰盖鬼伞的小RNA中也检测到明显的5carC信号，在比转运RNA(tRNA)短的RNA中发现的5carC含量最高。用维生素 处理真菌菌丝体后，其RNA和DNA中的氧化修饰甲基胞嘧啶(oxi - mCs)含量增加，这支持了TET蛋白可能参与 氧化过程。在标准培养条件下，我们的方法在双色蜡蘑(L. bicolor)中未检测到5carC，但用维生素C处理后，其大RNA和polyA RNA中的5carC含量显著增加，这表明在细胞内维生素 浓度较高时(真菌自然合成维生素 或其类似物 [70])，或者例如在与植物相互作用后，5carC可以形成。令人惊讶的是，我们的数据显示灰盖鬼伞的polyA RNA部分中不存在5-甲酰基胞嘧啶(5fC， )，仅在双色蜡蘑经维生素 处理后的 中检测到5fC，这表明氧化修饰甲基胞嘧啶在真菌中的作用与哺乳动物不同，在哺乳动物中，polyA RNA中5carC和5fC的比例最高 [6]。尽管灰盖鬼伞总RNA中5carC的含量(约为鸟嘌呤(G)的0.00001 - 0.00005%)和双色蜡蘑中(约为0.0004%)较低，但它们与在不同哺乳动物组织中测定的含量范围相似(0.00004 - 0.0005%； [6])(图1d)。如对灰盖鬼伞TET蛋白在DNA上的体外分析所报道的那样，TET蛋白对生成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC， )的活性相对较弱 [71]，这可能是所有氧化修饰甲基胞嘧啶中5carC含量最低的原因，或者5hmC可能通过切除机制(如胸腺嘧啶DNA糖基化酶或直接脱羧成胞嘧啶)从DNA和RNA中被主动去除 [72]。然而，到目前为止，在真菌中尚未发现胸腺嘧啶DNA糖基化酶(在灰盖鬼伞中预测到一个潜在基因； [29])或其他切除机制的活性。

我们对真菌RNA中氧化修饰胞嘧啶( )存在情况的研究为这一研究较少的修饰提供了有价值的信息，尽管其生物学功能的机制尚未确定。 可能会影响RNA的几何结构，类似于DNA中的5carC，它会加宽小沟并使双链部分变松散，而不像更具稳定作用的 [73]。RNA中的其他胞嘧啶修饰已被证明会影响各种生物体中RNA的性质、稳定性和功能。信使RNA(mRNA)中的5-甲基胞嘧啶(m5C， )能够使其从人HeLa细胞的细胞核中转运出来，或者转运到拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株的远端部位 [74]。一些研究预测m5C会影响mRNA的稳定性 [74]。此外，还发现m5C会影响调节性长链非编码RNA与染色质修饰复合物的结合 [75]。与降低mRNA翻译水平的m5C不同，5-羟甲基尿嘧啶(5hmrC)在果蝇中可能有利于mRNA的翻译 [23]。有趣的是，5fC( )被证明会使小鼠内源性逆转录病毒转录本 不稳定。

与腐生型灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea，约6%，[30])相比，外生菌根真菌双色蜡蘑(Laccaria bicolor)的基因组中，转座元件(Transposable elements，TEs)占比更大(高达37.9% [63])。真菌中TEs的扩增被认为与植物的互利共生或寄生相互作用有关，从而促进了有利于适应宿主植物的遗传变异[57]，并且与其他真菌生活方式相比，外生菌根共生体中的TE含量显著更高[77]。我们基于hmTOP-seq [49]对两种真菌DNA中 -和 -修饰的CG二核苷酸进行的分析表明，它们在TEs处积累，这与已发表的灰盖鬼伞中 [3]和 的分布情况一致[29]。我们发现，真菌中的大多数基因都具有氧化 。基因与富含氧化甲基胞嘧啶(oxi-mC)的TEs的关联会导致基因受到抑制，并影响基因 的修饰水平。对位于TE簇内部和外部的基因进行的单独分析表明，簇内的基因，尤其是未表达的基因，其 修饰水平最高，这与对其他真菌 的 分析结果一致。相比之下，灰盖鬼伞的基因表达随着 修饰水平的升高而逐渐增加，与TEs的存在无关。

重要的是，通过我们分析修饰CG片段的策略，我们能够直接比较三种胞嘧啶状态 和 的含量，以及它们与基因表达调控的关系。在双色蜡蘑中，这三种状态的含量呈正相关——这与哺乳动物中氧化甲基胞嘧啶的比例形成鲜明对比，在哺乳动物中， 和 之间，或 和 水平之间估计呈负相关[17,78]。引人注目的是，对基因中单个胞嘧啶修饰的分析表明，在双色蜡蘑中，高基因 或 修饰(而非 修饰)具有强烈的抑制作用。相比之下，在灰盖鬼伞中，更活跃的基因以较高的 水平和较低的 水平为特征，只有高 水平与高基因 水平一起才开始对表达产生负面影响。尽管在两种真菌中都观察到氧化甲基化CG(oxi-mCGs)具有强烈的抑制作用，但仍需要低水平的 修饰来诱导表达。

据我们所知，这是首次对 及其氧化衍生物 与真菌中基因表达之间的关系进行详细分析。观察到那些因高度 修饰的转座元件(TEs)而导致高氧化甲基胞嘧啶(oxi - mC)水平的基因沉默，这表明 的氧化可能是真菌实现的一种额外调控/抑制机制，例如通过招募抑制性蛋白到转座元件上，就像哺乳动物中的TET蛋白那样[79]。这种机制对于转座元件相关的扩展库以及5 - 羟甲基胞嘧啶(5 hmC)/5 - 甲酰基胞嘧啶(5fC)修饰的TET - JPB基因的自我调控也可能很重要。氧化甲基胞嘧啶(oxi - mCs)和 对双色蜡蘑(L. bicolor)和灰盖鬼伞(C. cinerea)基因表达的不同影响，证实了胞嘧啶修饰在不同真菌物种中可能发挥的多种作用[3,80]。在双色蜡蘑与植物共生进化过程中可能出现了几种机制，这些机制与有助于适应的转座元件积累一起，对大量转座元件的有害影响起到了强有力的控制作用。

已确定的 和氧化甲基胞嘧啶(oxi - mC)修饰的分布情况，以及这两种真菌的基因表达谱，为研究表观遗传机制提供了独特的资源，并凸显了单个氧化胞嘧啶修饰的重要性。需要进一步的研究来深入了解氧化甲基胞嘧啶(oxi - mCs)在双色蜡蘑和灰盖鬼伞的其他发育阶段以及许多不同真菌中的作用多样性和分布情况。

数据获取途径。本文报道的原始和处理后的测序数据可在基因表达综合数据库(GEO)上在线获取:GSE185551。本文中呈现的图表、数据分析源代码以及用于生成最终图表的数据可在Zenodo上获取，链接为https://doi.org/10.5281/zenodo.5846594。

数据在电子补充材料中提供[81]。

作者贡献。J.L.:调查研究、方法学、验证、可视化、撰写初稿、撰写 - 审核与编辑；K.K.:调查研究、方法学、资源、软件、验证、可视化、撰写初稿、撰写 - 审核与编辑；A.R.:调查研究、方法学；E.G.:调查研究、方法学；P.G.:调查研究、方法学、软件、可视化；V.T.:调查研究、方法学；G.P.:调查研究、方法学；V.M.:调查研究、方法学；S.K.:正式分析、获取资金、撰写初稿；E.K.:概念化、正式分析、获取资金、方法学、项目管理、监督、撰写初稿、撰写 - 审核与编辑。

所有作者均对发表内容给予最终批准，并同意对本文所开展的工作负责。

利益冲突声明。我们声明不存在利益冲突。资金支持。本研究部分得到了欧洲研究理事会的资助(授予S.K.的资助编号为ERC - AdG - 2016/742654)。技术方面的羟甲基化/甲酰化胞嘧啶测序(fo/hmTOP - seq)进展得到了欧洲社会基金的支持，依据活动措施编号09.3.3 - LMT - K - 712“通过实施世界级 项目提高研究人员资质”，与立陶宛研究理事会签订的资助协议(授予E.K.的资助编号为09.3.3 - LMT - K - 712 - 01 - 0041)。

致谢。我们感谢弗朗西斯·M·马丁教授提供双色蜡蘑样本，感谢赛默飞世尔科技波罗的海公司制备双色蜡蘑的RNA文库(使用赛默飞世尔科技的Invitrogen Collibri链特异性RNA文库制备试剂盒用于Illumina测序平台)以及进行Illumina测序。我们感谢Z. Staševskij在羟甲基化胞嘧啶测序(hmTOP - seq)实验过程中提供的帮助，感谢Ieva Stirblytè、Kotryna Skardžiūtè和Milda Narmontè提供的技术支持。

参考文献

1. Feng S等人. 2010 植物和动物中甲基化模式的保守性和差异性. 美国国家科学院院刊 107, 8689 - 8694. (doi:10.1073/ pnas.1002720107)

2. Straussman R, Nejman D, Roberts D, Steinfeld I, Blum B, Benvenisty N, Simon I, Yakhini Z, Cedar H. 2009 人类基因组中 岛甲基化谱的发育编程. 自然结构与分子生物学 16, 564 - 571. (doi:10.1038/nsmb.1594)

3. 泽马赫(Zemach A)、麦克丹尼尔(McDaniel IE)、席尔瓦(Silva P)、齐尔伯曼(Zilberman D)。2010年真核生物DNA甲基化的全基因组进化分析。《科学》杂志328卷，916 - 919页。(doi:10. 1126/science.1186366)

4. 伊藤(Ito)S、沈(Shen)L、戴(Dai)Q、吴(Wu)SC、柯林斯(Collins)LB、斯文伯格(Swenberg)JA、何(He)C、张(Zhang)Y。2011年，Tet蛋白可将5-甲基胞嘧啶转化为5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶。《科学》(Science)333卷，1300 - 1303页。(doi:10.1126/science.1210597)

5. 唐Y，郑S - J，齐C - B，冯Y - Q，袁B - F。2015年 通过化学衍生化结合液相色谱 - 串联质谱分析灵敏且同时测定基因组DNA中的5 - 甲基胞嘧啶及其氧化产物。《分析化学》(Anal. Chem.)87, 3445 - 3452。(doi:10.1021/ac504786r)

6. 黄 W，蓝 M - D，齐 C - B，郑 S - J，魏 S - Z，袁 B - F，冯 Y - Q。2016年形成与

RNA中5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)氧化产物的测定。《化学科学》(Chem. Sci.)，7, 5495 - 5502. (doi:10.1039/c6sc01589a)

7. 塔希利亚尼(Tahiliani)M等人，2009年，5 - 甲基胞嘧啶向5 - 羟甲基胞嘧啶的转化

MLL伙伴蛋白TET1对哺乳动物DNA的作用。《科学》杂志324卷，930 - 935页。(doi:10.1126/science.1170116)

8. 于M等人，2012年。哺乳动物基因组中5-羟甲基胞嘧啶的碱基分辨率分析。《细胞》杂志，第149卷，第1368 - 1380页。(doi:10.1016/j.cell. 2012 - 04.027)

9. 宋CX等人，2011年。选择性化学标记揭示了5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine)在全基因组范围内的分布。《自然·生物技术》(Nat. Biotechnol.)，29卷，68 - 72页。(doi:10.1038/nbt.1732)

10. 沈L、吴H、迪普D、山口S、达莱西奥AC、冯H - L、张K、张Y。2013年全基因组分析揭示了依赖TET和TDG的5 - 甲基胞嘧啶氧化动态。《细胞》杂志第153卷，第692 - 706页。(doi:10.1016/j.cell.2013.04.002)

11. 吴H，吴X，沈L，张Y。2014年 利用甲基化酶辅助亚硫酸氢盐测序进行活性DNA去甲基化的单碱基分辨率分析。《自然·生物技术》(Nat. Biotechnol.)32卷，1231 - 1240页。(doi:10.1038/nbt.3073)

12. 井上A(Inoue A)，张Y(Zhang Y)。2011年，小鼠植入前胚胎中5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine)的复制依赖性丢失。《科学》杂志334卷，194页。(doi:10. 1126/science.1212483)

13. 廉(Lian)CG等人，2012年，5-羟甲基胞嘧啶的缺失是黑色素瘤的一个表观遗传学标志。《细胞》(Cell)杂志，第150卷，第1135 - 1146页。(doi:10.1016/j.cell.2012.07.033)

14. 哈恩·马(Hahn MA)等人，2013年，哺乳动物神经发生过程中5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine)和染色质标记的动态变化。《细胞报告》(Cell Rep.)，第3卷，第291 - 300页。(doi:10.1016/j.ceIrep.2013.01.011)

15. 利西泰·J、吉巴斯·P、斯卡尔久泰·K、斯坦克维丘斯·V、鲁克谢奈泰·A、克里乌基埃内·E。2020年 一种无需亚硫酸氢盐的基因组5-羧基胞嘧啶碱基分辨率分析方法。《细胞报告》(Cell Rep.)，32卷，108155页。(doi:10. 1016/j.ceIrep.2020.108155)

16. 内瑞·F(Neri F)、因卡尔纳托·D(Incarnato D)、克雷佩洛娃·A(Krepelova A)、拉佩利·S(Rapelli S)、安塞尔米·F(Anselmi F)、帕尔拉托·C(Parlato C)、梅达纳·C(Medana C)、达尔·贝洛·F(Dal Bello F)、奥利维耶罗·S(Oliviero S)。2015年 5 - 甲酰基胞嘧啶和 5 - 羧基胞嘧啶的单碱基分辨率分析揭示启动子 DNA 甲基化动态。《细胞报告》(Cell Rep.)，10 卷，674 - 683 页。(doi:10.1016/j.ceIrep.2015.01.008)

17. 陆·X(Lu X)、韩·D(Han D)、赵·BS(Zhao BS)、宋·C - X(Song C - X)、张·L - S(Zhang L - S)、多雷·LC(Doré LC)、何·C(He C)。2015年 5 - 甲酰基胞嘧啶和 5 - 羧基胞嘧啶的碱基分辨率图谱揭示全基因组 DNA 去甲基化动态。《细胞研究》(Cell Res.)，25 卷，386 - 389 页。(doi:10.1038/cr.2015.5)

18. 傅·L(Fu L)等人。2014年 Tet 介导的 RNA 中 5 - 羟甲基胞嘧啶的形成。《美国化学会志》(J. Am. Chem. Soc.)，136 卷，11582 - 11585 页。(doi:10.1021/ja505305z)

19. 巴萨坦塔 - 桑切斯·M(Basanta - Sanchez M)等人。2017年 TET1 介导的 RNA 中 5 - 甲酰基胞嘧啶(5fC)氧化为 5 - 羧基胞嘧啶(5caC)。《化学生物化学》(ChemBioChem)，18 卷，72 - 76 页。(doi:10.1002/cbic.201600328)

20. 胡贝尔·SM(Huber SM)、范·德尔夫特·P(van Delft P)、门迪尔·L(Mendil L)、巴赫曼·M(Bachman M)、斯莫利特·K(Smollett K)、维尔纳·F(Werner F)、米斯卡·EA(Miska EA)、巴拉萨布拉马尼亚姆·S(Balasubramanian S)。2015年 RNA 中 5 - 羟甲基胞嘧啶的形成和丰度。《化学生物化学》(ChemBioChem)，16 卷，752 - 755 页。(doi:10.1002/cbic.201500013)

21. 莫托林·Y(Motorin Y)、利科·F(Lyko F)、赫尔姆·M(Helm M)。2010年 RNA 中的 5 - 甲基胞嘧啶:检测、酶促形成和生物学功能。《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)，38 卷，1415 - 1430 页。(doi:10.1093/nar/gkp1117)

22. 张·H - Y(Zhang H - Y)、熊·J(Xiong J)、齐·B - L(Qi B - L)、冯·Y - Q(Feng Y - Q)、袁·B - F(Yuan B - F)。

2016年 哺乳动物 DNA 和 RNA 中 5 - 羟甲基胞嘧啶和 5 - 甲酰基胞嘧啶的存在。《化学通讯》(Chem. Commun.)，52 卷，737 - 740 页。(doi:10. 1039/c5cc07354e)

23. 德拉特·B(Delatte B)等人。2016年 RNA 生物化学。全转录组范围内 RNA 羟甲基胞嘧啶的分布和功能。《科学》(Science)，351 卷，282 - 285 页。(doi:10.1126/science.aac5253)

24. 朗特里·IA(Roundtree IA)、埃文斯·ME(Evans ME)、潘·T(Pan T)、何·C(He C)。2017年 基因表达调控中的动态 RNA 修饰。《细胞》(Cell)，169 卷，1187 - 1200 页。(doi:10.1016/j.cell. 2017.05.045)

25. 王·Y(Wang Y)等人。2021年 单碱基分辨率图谱揭示 mRNA 中独特的 5 - 甲酰基胞苷。《美国化学学会化学生物学》(ACS Chem. Biol.)，17 卷，77 - 84 页。(doi:10.1021/acschembio. 1c00633)

26. 伊耶尔·LM(Iyer LM)、张·D(Zhang D)、麦克斯韦·伯勒斯·A(Maxwell Burroughs A)、阿拉文·L(Aravind L)。2013年 参与 DNA 碱基氧化、糖基化和其他复杂修饰的新型生化系统的计算鉴定。《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)，41 卷，7635 - 7655 页。(doi:10.1093/nar/gkt573)

27. 伊耶尔·LM(Iyer LM)、张·D(Zhang D)、德·索萨·RF(de Souza RF)、普基拉·PJ(Pukkila PJ)、饶·A(Rao A)、阿拉文·L(Aravind L)。2014年 TET/JBP 基因的谱系特异性扩增和一类新的 DNA 转座子塑造真菌基因组和表观遗传景观。《美国国家科学院院刊》(Proc. Natl Acad. Sci. USA)，111 卷，1676 - 1683 页。(doi:10. 1073/pnas.1321818111)

28. 伊耶尔·LM(Iyer LM)、塔希利亚尼·M(Tahiliani M)、饶·A(Rao A)、阿拉文·L(Aravind L)。2009年 预测参与核酸碱基氧化和其他复杂修饰的新型酶家族。《细胞周期》(Cell Cycle)，8 卷，1698 - 1710 页。(doi:10. 4161/cc.8.11.8580)

29. 查韦斯(Chavez)L等人，2014年，双孢蘑菇(Coprinopsis cinerea)中TET/JBP双加氧酶产生的氧化甲基胞嘧啶的同步测序。《美国国家科学院院刊》(Proc. Natl Acad. Sci. USA)111卷，E5149 - E5158页。(doi:10.1073/pnas. 1419513111)

30. 斯塔吉奇(Stajich)JE等人，2010年，从蘑菇双孢蘑菇(Coprinopsis cinerea，曾用名Coprinus cinereus)的组装染色体洞察多细胞真菌的进化。《美国国家科学院院刊》107卷，11889 - 11894页。(doi:10.1073/pnas.1003391107)

31. 马丁(Martin)F等人，2008年，双色蜡蘑(Laccaria bicolor)的基因组为菌根共生提供了见解。《自然》(Nature)452卷，88 - 92页。(doi:10.1038/nature06556)

32. 普基拉(Pukkila)PJ，2011年，双孢蘑菇(Coprinopsis cinerea)。《当代生物学》(Curr. Biol.)21卷，R616 - R617页。(doi:10.1016/j.cub.2011.05.042)

33. 达格雷(Daguerre)Y等人，2017年，通过全基因组表达谱分析和植物共生真菌双色蜡蘑(Laccaria bicolor)转录因子库的功能分析描绘菌根发育的调控网络。《BMC基因组学》(BMC Genom.)18卷，737页。(doi:10.1186/s12864 - 017 - 4114 - 7)

34. 马丁(Martin)F、塞洛斯(Selosse)M - A，2008年，双色蜡蘑(Laccaria)基因组:一个共生体蓝图的解码。《新植物学家》(New Phytol.)180卷，296 - 310页。(doi:10.1111/j.1469 - 8137.2008.02613.x)

35. 拉奥(Rao)PS、尼德普鲁姆(Niederpruem)DJ，1969年，毛头鬼伞(Coprinus lagopus，布尔概念)形态发生过程中的碳水化合物代谢。《细菌学杂志》(J. Bacteriol.)100卷，1222 - 1228页。(doi:10.1128/JB.100.3.1222 - 1228.1969)

36. 彼得(Peter)M、科勒(Kohler)A、迪普莱西(Duplessis)S、马丁(Martin)F，2006年，RNA

从外生菌根中提取。见《根际研究方法手册》(主编:J·卢斯特(J Luster)、R·D·芬利(RD Finlay))，第458 - 459页。瑞士比尔门斯多夫:瑞士联邦森林、雪和景观研究所(Swiss Federal Research Institute WSL)。

37. 诺利沃斯(Nolivos)S、卡尔普西(Carpousis)JC、克卢埃 - 多尔瓦尔(Clouet - d’Orval)B，2005年，K环(K - loop)，火球菌(Pyrococcus)C/D引导RNA的一个普遍特征，是与K转角(K - turn)相关的RNA结构基序。《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)33卷，6507 - 6514页。(doi:10.1093/nar/gki962)

38. 刘(Lau)K - N、周(Chow)H - F、陈(Chan)M - C、黄(Wong)K - W，2008年，通过点击化学合成的树枝状聚合物有机凝胶:由于协同官能团结合和树枝状尺寸效应而具有显著的凝胶化特性。《德国应用化学国际版》(Angew. Chem. Int. Ed Engl.)47卷，6912 - 6916页。(doi:10.1002/anie.200801870)

39. 陆(Lu)X、宋(Song)C - X、苏尔瓦赫(Szulwach)K、王(Wang)Z、魏登巴赫(Weidenbacher) 金 修饰辅助亚硫酸氢盐测序(CAB - Seq)用于检测DNA中的5 - 羧基胞嘧啶。《美国化学会志》(J. Am. Chem. Soc.)135卷，9315 - 9317页。(doi:10.1021/ja4044856)

40. 柳特克维丘泰(Liutkevičiūtè)Z、克里乌基涅(Kriukienè)E、利西泰(Ličytè)J、鲁迪泰(Rudytè)M、乌尔巴纳维丘泰(Urbanavičiūtè)G、克利马绍斯卡斯(Klimašauskas)S，2014年，DNA C5 - 甲基转移酶对5 - 羧基胞嘧啶的直接脱羧作用。《美国化学会志》136卷，5884 - 5887页。(doi:10.1021/ja5019223)

41. 宋(Song)C - X等人，2013年，全基因组5 - 甲酰胞嘧啶谱揭示其在表观遗传启动中的作用。《细胞》(Cell)153卷，678 - 691页。(doi:10.1016/j.cell. 2013.04.001)

42. 诺德伯格(Nordberg H)、坎托(Cantor M)、杜谢科(Dusheyko S)、华(Hua S)、波利亚科夫(Poliakov A)、沙巴洛夫(Shabalov I)、斯米尔诺娃(Smirnova T)、格里戈里耶夫(Grigoriev IV)、杜布查克(Dubchak I)。2014 美国能源部联合基因组研究所的基因组门户:2014 年更新。《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)42 卷，D26 - D31 页。(doi:10.1093/nar/ gkt1069)

43. 普拉扎(Plaza DF)、林(Lin C - W)、范德韦尔登(van der Velden NSJ)、埃比(Aebi M)、金茨勒(Künzler M)。2014 模式蘑菇灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)的比较转录组学揭示了组织特异性武器库和保守的有性发育调控网络。《BMC 基因组学》(BMC Genom.)15 卷，1 - 17 页。(doi:10.1186/ 1471 - 2164 - 15 - 492)

44. 琼斯(Jones P)等人。2014 InterProScan 5:基因组规模的蛋白质功能分类。《生物信息学》(Bioinformatics)30 卷，1236 - 1240 页。(doi:10.1093/bioinformatics/ btu031)

45. 科哈尼(Kohany O)、根特斯(Gentles AJ)、汉库斯(Hankus L)、尤尔卡(Jurka J)。2006 重复序列数据库(Repbase)中重复元件的注释、提交和筛选:repbaseSubmitter 和 Censor。《BMC 生物信息学》(BMC Bioinform.)7 卷，474 页。(doi:10.1186/ 1471 - 2105 - 7 - 474)

46. 阿尔特舒尔(Altschul SF)、吉什(Gish W)、米勒(Miller W)、迈尔斯(Myers EW)、利普曼(Lipman DJ)。1990 基本局部比对搜索工具。《分子生物学杂志》(J. Mol. Biol.)215 卷，403 - 410 页。(doi:10.1016/S0022 - 2836(05)80360 - 2)

47. 李(Li H)、德宾(Durbin R)。2009 利用 Burrows - Wheeler 变换实现快速准确的短读长比对。《生物信息学》(Bioinformatics)25 卷，1754 - 1760 页。(doi:10.1093/ bioinformatics/btp324)

48. 克鲁格(Krueger F)、安德鲁斯(Andrews SR)。2011 Bismark:一种灵活的

亚硫酸氢盐测序(Bisulfite - Seq)应用的比对器和甲基化调用器。《生物信息学》(Bioinformatics)27 卷，1571 - 1572 页。(doi:10. 1093/bioinformatics/btr167)

49. 吉巴斯(Gibas P)、纳尔蒙特(Narmontè M)、斯塔舍夫斯基(Staševskij Z)、戈尔杰维丘斯(Gordevičius J)、克利马绍斯卡斯(Klimašauskas S)、克里基耶内(Kriukienè E)。2020 通过共价连接导向测序实现 5 - 羟甲基胞嘧啶的精确基因组定位。《公共科学图书馆·生物学》(PLoS Biol.)18 卷，e3000684。(doi:10.1371/journal.pbio.3000684)

50. 金(Kim D)、兰米德(Langmead B)、萨尔兹伯格(Salzberg SL)。2015 HISAT:一种低内存需求的快速剪接比对器。《自然方法》(Nat. Methods)12 卷，357 - 360 页。(doi:10. 1038/nmeth.3317)

51. 李(Li H)等人。2009 序列比对/映射格式和 SAMtools。《生物信息学》(Bioinformatics)25 卷，2078 - 2079 页。(doi:10.1093/bioinformatics/btp352)

52. 佩尔泰亚(Pertea M)、金(Kim D)、佩尔泰亚(Pertea GM)、利克(Leek JT)、萨尔兹伯格(Salzberg SL)。2016 使用 HISAT、StringTie 和 Ballgown 对 RNA - seq 实验进行转录本水平的表达分析。《自然 protocols》(Nat. Protoc.)11 卷，1650 - 1667 页。(doi:10.1038/nprot. 2016.095)

53. 洛夫(Love MI)、胡贝尔(Huber W)、安德斯(Anders S)。2014 使用 DESeq2 对 RNA - seq 数据进行倍数变化和离散度的适度估计。《基因组生物学》(Genome Biol.)15 卷，550 页。(doi:10.1186/s13059 - 014 - 0550 - 8)

54. 尹(Yin R)等人。2013 抗坏血酸增强 TET 介导的 5 - 甲基胞嘧啶氧化并促进哺乳动物的 DNA 去甲基化。《美国化学会志》(J. Am. Chem. Soc.)135 卷，10396 - 10403 页。(doi:10.1021/ja4028346)

55. 米诺(Minor EA)、考特(Court BL)、杨(Young JI)、王(Wang G)。2013 抗坏血酸盐诱导十一 - 十一易位(Tet)甲基胞嘧啶双加氧酶介导的 5 - 羟甲基胞嘧啶生成。《生物化学杂志》(J. Biol. Chem.)288 卷，

13669 - 13674 页。(doi:10.1074/jbc.c113.464800)

56. 刘爱仪(Lau AYT)、谢宇(Xie Y)、张美琪(Cheung MK)、张炳强(Cheung PCK)、关浩生(Kwan HS)。2020年灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)芽管生长早期的全基因组mRNA和miRNA分析。《真菌遗传学与生物学》(Fungal Genet. Biol.)，142卷，103416页。(doi:10.1016/j.fgb. 2020.103416)

57. 卡斯塔内拉(Castanera)R、博尔戈尼奥内(Borgognone)A、皮萨巴罗(Pisabarro)AG、拉米雷斯(Ramírez)L. 2017 担子菌中转座因子的生物学、动态变化及其应用. 《应用微生物学与生物技术》(Appl. Microbiol. Biotechnol.)101, 1337 - 1350. (doi:10. 1007/s00253 - 017 - 8097 - 8)

58. 拉贝(Labbé)J、缪拉(Murat)C、莫兰(Morin)E、图斯卡恩(Tuskan)GA、勒塔孔(Le Tacon)F、马丁(Martin)F. 2012 外生菌根真菌双色蜡蘑(Laccaria bicolor)中转座因子的特征. 《公共科学图书馆·综合》(PLoS ONE)7, e40197. (doi:10.1371/journal. pone.0040197)

59. 弗洛达斯(Floudas)D 等. 2012 从31个真菌基因组重建酶促木质素分解的古生代起源

《科学》(Science)336, 1715 - 1719. (doi:10.1126/science.1221748)

60. 斯塔舍夫斯基(Staševskij)Z、吉巴斯(Gibas)P、戈尔杰维丘斯(Gordevičius)J、克里基涅(Kriukienè)E、克利马绍斯卡斯(Klimašauskas)S. 2017 拴系寡核苷酸引物测序法(TOP - Seq):一种用于DNA表观基因组分析的高分辨率经济方法. 《分子细胞》(Mol. Cell)65, 554 - 564. (doi:10.1016/j.molcel.2016.12.012)

61. 戈尔杰维丘斯(Gordevičius)J、纳尔蒙特(Narmonté)M、吉巴斯(Gibas)P、克韦德拉维丘泰(Kvederavičiūtè)K、汤姆库泰(Tomkutě)V、帕洛亚(Paluoja)P、克留茨科夫(Krjutškov)K、萨卢梅茨(Salumets)A、克里基涅(Kriukienè)E. 2020 用于无创产前检测的母体游离DNA中胎儿未修饰和5 - 羟甲基化CG位点的鉴定. 《临床表观遗传学》(Clin. Epigenetics)12, 153. (doi:10.1186/s13148 - 2020 - 00938 - x)

62. 纳尔蒙特(Narmontè)M、吉巴斯(Gibas)P、达纽奈泰(Daniūnaité)K、戈尔杰维丘斯(Gordevičius)J、克里基涅(Kriukienè)E. 2021 神经母细胞瘤细胞的多组学分析揭示了恶性转化的多样性. 《细胞与发育生物学前沿》(Front Cell Dev. Biol.)9, 727353. (doi:10.3389/fcell.2021.727353)

63. 卡斯塔内拉(Castanera)R 等. 2016 转座因子与真菌基因组:对全基因组结构和转录谱的影响. 《公共科学图书馆·遗传学》(PLoS Genet.)12, e1006108. (doi:10.1371/journal. pgen.1006108)

64. 博尔戈尼奥内(Borgognone)A、卡斯塔内拉(Castanera)R、莫塞利(Morselli)M、洛佩斯 - 瓦拉斯(López - Varas)L、鲁比(Rubbi)L、皮萨巴罗(Pisabarro)AG、佩莱格里尼(Pellegrini)M、拉米雷斯(Ramírez)L. 2018 平菇(Pleurotus ostreatus)生命周期中转座子相关的表观遗传沉默. 《DNA研究》(DNA Res.)25, 451 - 464. (doi:10.1093/dnares/dsy016)

65. 索耶(Soyer)JL 等. 2014 植物病原真菌油菜黑胫病菌(Leptosphaeria maculans)中效应基因表达的表观遗传调控. 《公共科学图书馆·遗传学》(PLoS Genet.)10, e1004227. (doi:10.1371/journal.pgen.1004227)

66. 赛德尔(Seidl)MF、托马(Thomma)BPHJ. 2017 转座因子指导植物与微生物之间的协同进化. 《遗传学趋势》(Trends Genet.)33, 842 - 851. (doi:10.1016/ j.tig.2017.07.003)

67. 吴(Wu)H、张(Zhang)Y. 2014 逆转DNA甲基化:机制、基因组学和生物学功能. 《细胞》(Cell)156, 45 - 68. (doi:10.1016/j.cell.2013.12.019)

68. 格里芬(Griffin)DH. 1996 真菌生理学. 纽约，纽约州:约翰·威利父子出版公司. 详见https://books.google.com/ books/about/Fungal_Physiology.html?hl=&id= IBYWQaKzrFkC.

69. 利马(Lima)SA、奇普曼(Chipman)LB、尼科尔森(Nicholson)AL、陈(Chen)Y - H、伊(Yee)BA、杨(Yeo)GW、科勒(Coller)J、帕斯奎内利(Pasquinelli)AE. 2017 短聚腺苷酸尾是高表达基因的保守特征. 《自然·结构与分子生物学》(Nat. Struct. Mol. Biol.)24, 1057 - 1063. (doi:10.1038/nsmb.3499)

70. 勒沃斯·F. 1999年 植物中抗坏血酸(ascorbic acid)的生物合成与代谢以及真菌中抗坏血酸类似物的生物合成与代谢。《植物化学》52卷，193 - 210页。(doi:10. 1016/s0031-9422(99)00145-4)

71. 张·L等人 2014年 灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)中的一种TET同源蛋白(CcTET)，能在生化层面将5 - 甲基胞嘧啶转化为5 - 羟甲基胞嘧啶、5 - 甲酰基胞嘧啶和5 - 羧基胞嘧啶。《美国化学会志》136卷，4801 - 4804页。(doi:10.1021/ja500979k)

72. 冯·Y等人 2021年 哺乳动物基因组中由十 - 十一易位酶产生的5 - 羧基胞嘧啶的直接脱羧作用形成了一种新的DNA主动去甲基化机制。《化学科学》12卷，11322 - 11329页。(doi:10.1039/ d1sc02161c)

73. 傅·T等人 2019年 胸腺嘧啶DNA糖基化酶识别由5 - 甲酰基胞嘧啶和5 - 羧基胞嘧啶引起的小沟几何结构变化。《化学科学》10卷，7407 - 7417页。(doi:10.1039/C9SC02807B)

74. 薛·C、赵·Y、李·L. 2020年 RNA胞嘧啶 - 5甲基化研究进展:检测、调控机制、生物学功能及其与癌症的关联。《生物标志物研究》8卷，1 - 13页。(doi:10.1186/s40364- 020-00225-0)

75. 阿莫特·T、苏利耶尔·M·F、维勒·A、贾·X - Y、菲格尔·H、韦勒·H、米库拉·R、卢瑟·A. 2013年 长链非编码RNA作为胞嘧啶甲基化的靶点。《RNA生物学》10卷，1003 - 1008页。(doi:10.4161/rna.24454)

76. 瓜拉尔·D等人 2018年 在多能干细胞中，TET2通过RNA依赖的染色质靶向作用控制内源性逆转录病毒。《自然遗传学》50卷，443 - 451页。(doi:10.1038/s41588-018-0060-9)

77. 宫内·S等人 2020年 菌根真菌的大规模基因组测序为共生性状的早期进化提供了见解。《自然通讯》11卷，5125页。(doi:10.1038/s41467-020- 18795-w)

78. 布斯·M·J、马尔西科·G、巴赫曼·M、贝拉尔迪·D、巴拉萨布拉曼尼安·S. 2014年 单碱基分辨率下DNA中5 - 甲酰基胞嘧啶的定量测序。《自然化学》6卷，435 - 440页。(doi:10.1038/ nchem.1893)

79. 德尼兹·Ö、弗罗斯特·J·M、布兰科·M·R. 2019年 DNA修饰对转座元件的调控。《自然遗传学综述》20卷，417 - 431页。(doi:10.1038/s41576-019- 0106-6)

80. 比威克·A·J、霍夫迈斯特·B·T、鲍尔斯·R·A、蒙多·S·J、格里戈里耶夫·I·V、詹姆斯·T·Y、斯塔吉奇·J·E、施密茨·R·J. 2019年 整个真菌生命树中胞嘧啶甲基化的多样性。《自然生态与进化》3卷，479 - 490页。(doi:10. 1038/s41559-019-0810-9)

81. 利西泰·J等人 2022年 氧化型5 - 甲基胞嘧啶在担子菌双色蜡蘑(Laccaria bicolor)和灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)的DNA和RNA中的分布及调控作用。FigShare平台。

© 2022 作者。由皇家学会根据知识共享署名许可协议(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)发布，该协议允许在注明原作者和来源的前提下进行无限制使用。 ↑