从合成蛋白组装体构建自下而上的RNA递送载体
发布时间：
2026-10-08 10:22
从合成蛋白组装体构建自下而上的RNA递送载体
Maren Kirstin Schuhmacher 、Christoph Gruber 、Christopher M. R. Lang 、Ricardo M. W. Ruijpers 、Lyupka Mazneykova 、Brice Beinsteiner 、Ariane Krus 、Barbara Tremmel 、Friederike Reinhardt 、Karoline Kadletz 、Zhe Ma 、Lucie Casalta 、Josep Miquel Cambra Bort 、Dina Y. Otify 、lolo Balken 、Leon Hetzel 、Juliane Merl-Pham 、Tatjana Dorn 、Marina Luchner 、Lea Bauersachs 、Karin Ganea 、Natascha Wieser 、Alexander Emrich 、Emirhan Yağmur 、Katrin Rager 、Gauhar Sagindykova 、Niklas Armbrust 、Julian Geilenkeuser 、Gil G. Westmeyer 、Elvir Becirovic 、Martin Biel 、Rouzanna Istvanffy 、Daniela M. Vogt Weisenhorn 、Dong-Jiunn Jeffery Truong 、Fabian J. Theis 、Gregor Ebert 、Alessandra Moretti 、Ali Ertürk 、Andrea Bähr 、Christian Kupatt 、Marion Jasnin 、Nikolai Klymiuk 、Florian Giesert 及 Wolfgang Wurst
进化引导生物系统占据生态位，病毒是这一原理最成功的范例之一。病毒历经数十亿年进化，实现了遗传信息的高效传递。尽管病毒种类繁多，但多数病毒的衣壳 在大小和形状上已趋同至惊人的相似性。相比之下，用于蛋白质设计的生成模型可构建自然界中不存在的蛋白质结构 。本研究探讨人工智能设计的蛋白质组装体是否可被功能化，以构建不依赖进化轨迹的核酸递送载体。通过将天然蛋白质结构域与合成蛋白质组装体相结合，我们构建了100余种具有独特大小和形状的自下而上的RNA递送载体。这些载体的RNA递送效率比广泛使用的递送载体高出数个数量级。此外，我们证明可通过整合计算设计的肽结合剂来调控其嗜性，并利用它们将具有治疗意义的 cargo RNA 递送至多种细胞模型中。我们以近单细胞分辨率在小鼠体内展示了其中一种载体的生物分布，确认了其安全性，并将其用于在患者来源的细胞和猪体内开展杜氏肌营养不良症的基因编辑治疗策略。本研究表明，利用生成式人工智能构建的蛋白质可通过克服天然蛋白质多样性的限制，用于合理设计具有所需特性的RNA递送系统。
选择压力驱动生物系统向进化景观中的局部极小值演化，使其能够占据生态位 。例如，病毒是经过高度优化的基因转移载体；然而，尽管病毒种类繁多，却都进化出了相似的特征。大多数病毒依赖由数千个亚基组成的大型超分子蛋白质衣壳，这些亚基自组装形成二十面体或螺旋对称结构，以包裹和保护其基因组 。病毒衣壳因其在恶劣环境中的韧性而被选择。然而，当将其重新用作基因工程载体时，需在受控环境中进行处理。这就提出了一个问题:当生物系统被置于其原始生态位之外的环境中时，某些由进化选择的特征是否是不必要的，甚至是有害的。最近开发的用于蛋白质设计的人工智能模型可用于探索这一问题。这些模型能生成在物理上可行但在自然界中不存在的蛋白质 结构 ，从而能够通过非天然蛋白质结构来操控进化轨迹。
在此，我们通过构建由天然蛋白质结构域与人工智能设计的合成蛋白质组装体相结合的自下而上的 RNA 转移载体，来例证这一理念。我们将这些 RNA 载体命名为合成转移载体(STVs)。STVs 与已知的天然 RNA 转移载体不同，具有独特特征，包括循环对称和双面体对称、开放结构以及组装蛋白质的低复杂性。我们开发了一种多维筛选系统，该系统能够测试数百种设计，并确定具有不寻常平面对称性的 STV-C8 是 RNA 递送的最有效结构。我们对 STV-C8 的形状、内容物和包装能力进行了表征，并通过将其与计算设计的肽相结合来调控其嗜性
https://doi.org/10.1038/s41586-026-10952-3
收到日期:2024 年 9 月 20 日
接受日期:2026 年 7 月 24 日
在线发布日期:2026 年 9 月 2 日
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文章
结合物。无论其结构如何独特，STV-C8在RNA递送效率上比天然同类物及临床使用的脂质纳米颗粒(LNPs)高出几个数量级。我们通过将多种货物RNA递送至多个物种的各类细胞模型中，包括报告RNA、基因编辑器、可编程抗病毒药物和转录因子，证明了STV-C8的多功能性。我们在小鼠模型中以近单细胞分辨率对STV-C8进行了全面的体内生物分布分析，并在两种动物模型中确认了其出色的安全性。最后，我们通过将CRISPR-Cas9基因编辑器递送至患者来源的细胞和猪骨骼肌细胞中，以删除肌营养不良蛋白外显子51，作为杜氏肌营养不良症(DMD)的治疗策略，评估了STV-C8的转化潜力 。
有包膜病毒的衣壳形成蛋白通常由多个结构域组成，这些结构域协调遗传物质的包装，以及在受感染细胞的质膜上组装和释放衣壳。组装好的病毒衣壳的曲面通过膜弯曲诱导囊泡释放的第一步，并且已有研究提出，部分组装的原体以及完全组装的衣壳多聚体均可诱导膜弯曲 。这一观点提出了一个问题:是否可以利用这种机制，通过简单的低维蛋白多聚体从头构建RNA递送载体。为了探索这种可能性，我们利用人工智能设计的具有各种对称性的对称蛋白组装体，以自下而上的方法构建了数百种不同的载体。
合成组装体的筛选
蛋白质设计的生成模型(如RFdiffusion )可产生形状各异的蛋白质组装体，包括二十面体、双面体和环状对称结构，其大小和架构与天然衣壳差异显著(图1a)。为将这类合成蛋白质组装体用作自下而上的RNA转移载体，我们将它们与三个功能结构域融合，这些结构域通常是衣壳形成蛋白的组成部分:膜结合结构域、晚期出芽结构域和RNA结合结构域 (图1b)。我们选用特征明确的二十面体蛋白质组装体HE0902 (扩展数据图1a)作为这类STV载体的初始支架，并将其与褐家鼠磷脂酶Cδ的普列克底物蛋白同源结构域(PHPLCδ)衍生的膜结合结构域融合。此外，我们创建了由多种病毒出芽基序组成的合成出芽结构域。该合成晚期出芽结构域(SynL)的出芽效率超过了天然HIV p6 L结构域(扩展数据图1b-d)。为实现RNA包装，我们在构建体中添加了高亲和力RNA结合蛋白 。我们用这些初始STV构建体与含对应包装信号的RNA转染HEK293T细胞，并量化STV介导的靶RNA释放到细胞培养上清液中的量。所有构建体均成功将其RNA货物转移至上清液，其中基于串联PCP(tdPCP)构建的STV构建体效率最高(图1c)。此外，我们证实，VSV-G作为融合蛋白共表达，可使这些合成囊泡将EGFP货物RNA递送至靶细胞(扩展数据图1e, f)。
HE0902具有与许多病毒衣壳相似的二十面体对称性。在STV-HE0902可实现高效RNA释放和转移的初步结果鼓励下，我们尝试将非天然对称性嵌入STV支架中。为全面表征这些载体，我们开发了一种筛选方法，以监测三个相关维度:(1)STV释放、(2)STV摄取和(3)RNA转移效率。简言之(详细描述见补充说明1)，将STV构建体与HiBiT标签融合，通过HiBiT与重组LgBiT蛋白互补，可量化STV释放到上清液中的量。对于摄取的表征 效率，我们创建了表达LgBiT的报告细胞系，利用该细胞系通过HiBiT/LgBiT互补测量靶细胞对STV的摄取。此外，报告细胞还表达萤火虫荧光素酶的C端拆分部分(C-split-Fluc)。STV介导的编码Fluc N端拆分部分(N-split-Fluc)的mRNA递送，可通过全长Fluc的重构来量化mRNA递送效率(图1d和扩展数据图2a-c)。
基于已建立的方法，我们筛选了39个STV构建体，这些构建体由具有二十面体、双面体或环状对称性的合成组装结构域组成(图1e)。许多STV构建体从生产细胞中高效释放，并将其货物RNA递送至靶细胞。值得注意的是，基于非天然双面体和环状对称性构建的STV在很大程度上优于其二十面体对应物(图1f-h)。我们还发现STV释放效率与货物RNA递送之间存在相关性。基于环状对称性构建的STV每个包装蛋白可转移更多RNA，表明其RNA装载能力强于其他对称性(如二十面体)(扩展数据图2d)。我们用四种性能最佳的设计(HE0490、HE0499和HE0505(均为D3对称性)以及HE0690(C8对称性))，证实了另一种货物RNA(EGFP mRNA)对未修饰靶细胞的高递送效率(扩展数据图2e)。这些结果表明，具有非天然对称性的人工智能设计蛋白质组装体可用于创建几乎无限数量的合成RNA递送载体。为展示这种大规模扩展的潜力，我们设计了另外30个具有C8对称性的组装体，该对称性是性能最佳的结构HE0690的对称性(扩展数据图3)。尽管它们基于相同的C8对称性构建，但这些新创建的结构在序列和结构组成上高度多样，可对其进行筛选以获得定制特性，如改变的包装密度或低免疫原性。
为进一步扩大STV的设计空间，我们将已鉴定的HE0690组装结构域与多种膜结合结构域组合。我们使用FoldSeek 进行基于结构的搜索来选择这些膜结合结构域，以 物种的PHPLC6结构域作为模板结构。我们在所有物种的无限制搜索、人类蛋白质的限制性搜索以及ESMAtlas 宏基因组蛋白质搜索中，共筛选出29个结构域(扩展数据图4a-d)。我们构建了膜结合结构域与SynL-tdPCP-HE0690融合的文库，并使用已建立的STV释放、STV摄取和RNA转移效率筛选方案对其进行测试(扩展数据图4e)。该分析表明，来自美洲黑熊(Ursus americanus，UaPHPLC)的膜结合结构域是一种此前未被鉴定的PH结构域，是RNA包装和转移的高效结构域(扩展数据图4f-h)。此外，我们证实UaPHPLC-STV在生产细胞中具有稳定的膜定位，并验证了其将EGFP mRNA高效转移至靶细胞的能力(扩展数据图4i-k)。由UaPHPLC和SynL-tdPCP-HE0690组成的STV构建体随后被命名为STV-C8(图2a)。
STV-C8 的表征与编程
在优化结构域组成后，我们将STV-C8的特性表征为一种自组装的RNA递送载体。与缺失膜结合结构域的对照组(图2b)相比，使用STV-C8囊泡可使上清液中的 cargo RNA 富集超过10,000倍。为进一步分析STV-C8的特性，我们建立了一种超速离心纯化方法(扩展数据图5a和补充图1a)，并分析了每个颗粒的数量以及每个颗粒的绝对蛋白和/或RNA含量(补充图2)。此外，我们对纯化后的STV-C8颗粒的RNA含量进行了表征，发现EGFP cargo RNA 显著富集(图2c)。与之前的报道一致 ，mRNA 被排除在STV-C8颗粒之外，推测是因为它们无法被包装(扩展数据图5b)。除RNA外，我们还对STV-C8颗粒的蛋白含量进行了表征，发现与出芽相关的ESCRT蛋白显著富集(图2d和扩展数据图5c)。在哺乳动物细胞中表达VSV-G会诱导囊泡释放 。我们发现，STV-C8的表达使VSV-G的固有出芽能力增强了50倍以上(扩展数据图5d)。接下来，我们对STV-C8诱导产生的囊泡进行成像，并通过冷冻电子断层扫描(cryo-ET)表征其尺寸分布(图2e)。在转染了STV-C8的细胞的纯化上清液中，我们观察到直径范围为 至 的囊泡，其中大多数直径为 ，而在未转染的对照细胞的上清液中，我们未检测到任何此类囊泡。冷冻电子断层扫描分析显示，这些囊泡内部存在数十种蛋白结构，其典型直径为 (扩展数据图6a、b)；这与预期的STV-C8组装体一致，尽管无法解析该组装体的精确原子结构。基于观察到的STV-C8囊泡的尺寸分布，我们表征了不同纯化条件的影响。我们发现，在15%的碘克沙醇组分中，STV-C8囊泡明显富集，表现为RNA和蛋白含量富集，以及向靶细胞的递送效率最高(扩展数据图6c)。这些囊泡的尺寸和形状与AlphaFold预测的STV-C8寡聚体结构匹配(扩展数据图6d)。此外，我们通过天然PAGE分析了转染STV-C8的细胞的上清液，发现了高分子质量的组装体，证实了STV-C8的多聚体性质(扩展数据图6e和补充图1b)。为进一步阐明释放的囊泡中STV-C8寡聚体的结构，我们重建了囊泡断层图；这些断层图显示了STV-C8组装体的存在。我们使用AlphaFold3预测的模型进行对接，以评估组装体尺寸与包装RNA分割的一致性(扩展数据图6f和补充图3)。尽管STV-C8组装体通常比病毒衣壳小，但它们诱导释放的囊泡尺寸与有包膜病毒释放的囊泡相似 。这表明囊泡尺寸存在生物物理上的最优值，并支持了最初的假设:非天然合成蛋白组装体通过膜弯曲启动出芽，其功能与天然衣壳原体类似。此外，我们的观察结果表明，STV-C8可能在其寡聚体表面包装 cargo RNA，因为tdPCP RNA结合蛋白朝向HE0690结构的外侧，周围的膜为 cargo RNA 提供保护。
图 1 | 自组装 STVRNA 载体的设计与筛选。a，病毒与人工智能设计的蛋白组装体的大小和形状比较。展示了代表性的二十面体(I)、双面体(D)和环状(C)对称结构。b，STV 结构示意图，以及通过在细胞中表达合成蛋白组装体来模拟病毒释放和 RNA 包装的原理。c，基于 HE0902 的 STV 构建体释放 RNA 的 RT-qPCR 定量，该构建体由不同的 RNA 结合蛋白组成(箱线图中，中心线代表中位数，箱体代表四分位距，须代表最小值和最大值；双侧未配对 Student’s 检验； 个生物学重复)。d，通过 HiBiT 检测筛选 STV 释放的方案，该检测基于报告细胞中 LgBiT-HiBiT 相互作用实现 STV 摄取，以及基于报告细胞中 split-Fluc 的重建实现 RNA 递送效率的测定。e，测试 STV 的实验流程 在 时间内的释放、摄取和 RNA 表达，发光测量用于检测生产细胞上清液中的 HiBiT 信号，以量化包含不同人工智能设计组装结构域的 STV 构建体的释放量( 个生物学重复，平均值± s.d.)。g，在表达 LgBiT 的 split-Luc 报告细胞裂解液中进行发光测量，通过从基因组表达的 LgBiT 与含 HiBiT 的 STV 重建 NanoLuc，以测试不同 STV 构建体的摄取情况( 个生物学重复，平均值± s.d.)。 ，在表达 C-split-Fluc 的报告细胞裂解液中进行萤火虫荧光素酶测量，以量化不同 STV 构建体的 N-split-Fluc RNA 递送效率( 个生物学重复，平均值± s.d.)。从 e 到 的箭头颜色对应荧光素酶发射的波长。A，组装结构域；L，晚期出芽结构域；MBD，膜结合结构域；RNA BP，RNA 结合蛋白。
图 2 | STV-C8 RNA 载体的表征与编程。a，优化后的 STV-C8 构建体，包含来自 PHPLC 的 pleckstrin 同源结构域、源自病毒 ESCRT 募集基序的合成出芽结构域(SynL)、假单胞菌噬菌体 PP7 的串联衣壳蛋白(tdPCP)以及具有 C8 对称结构的人工智能设计组装结构域(HE0690)。b，STV-C8 释放到上清液中的目标 RNA 相对于膜结合缺陷型对照组的 RT-qPCR 结果( 个生物学重复，平均值± s.d.)。c，生产细胞和 STV-C8 的 RNA 测序相关性( 个生物学重复)。展示了每种 mRNA 在上清液和胞质中相对于所有 mRNA 的读数计数(红色表示线粒体 RNA，绿色表示 EGFP cargo)。d，出芽(+SynL)和非出芽(-SynL)STV-C8 构建体的纯化上清液的蛋白质组学比较(紫色表示 ESCRT 相关蛋白； 个生物学重复)。e，STV-C8 囊泡断层扫描体积的代表性 6.52-Å 厚切片(顶部；比例尺， )及对应的三维分割图(底部)，显示了 STV 膜(灰色)和 STV-C8 蛋白组装体(青色)。f，STV-C8 与其他基因编码递送载体在不同靶细胞系中递送 EGFP mRNA 的比较(通过流式细胞术定量；每种 mRNA 均标记有相应的包装信号； 个生物学重复的均值 标准差)。g，STV-C8 或 LNP 递送的 EGFP mRNA 输入量与 EGFP 阳性细胞的关系(STV-C8 RNA 含量通过绝对 RT-qPCR 定量； 个生物学重复的均值 标准差)。h，A549 细胞在递送细胞转录的 STV-C8 包装的 mTagBFP2 mRNA 或 -甲基假尿苷修饰或未修饰的 LNP 包装 mRNA 后 IFNβ 报告基因的激活。mRNA 剂量经调整以达到可比的表达水平。i，通过整合人工智能设计的微型结合蛋白来编程 STV-C8 细胞类型特异性的概念。j，使用突变型 VSV-G 与受体靶向微型结合蛋白将 EGFP mRNA 递送至 HEK293TEGFR 或 IL-7Rα 敲入细胞系的流式细胞术定量( 个生物学重复的均值)。MB，微型结合蛋白。
鉴于 STV-C8 的结构不同，我们接下来研究了它将 cargo RNA 递送至细胞的效率，与先前已建立的递送系统相比如何。我们将 EGFP mRNA 向靶细胞的递送效率，与常用的基因编码系统进行了对比:病毒样颗粒(VLPs) 、包膜蛋白纳米笼(EPN24) 以及用于细胞递送的选择性内源性封装(SEND) 。对于每种载体类型，我们在 mRNA 中添加了相应的包装信号，并比较了其在来自三个物种的四种细胞系中的递送效率。我们将每个系统的编码序列克隆到 CAG 启动子驱动的质粒骨架中；将等量的 VSV-G、 cargo 和包装质粒转染至 HEK293T 细胞；连续 3 天收集上清液；浓缩上清液；并将处理后的样品以相同体积加入靶细胞中。在所有测试的细胞系中，我们发现经 STV-C8 递送的 EGFP mRNA 使靶细胞的 EGFP 表达水平最高(图 2f)。同样，我们使用从 Addgene 直接获取的质粒，在每个系统中包装了编码 Cre 重组酶的 mRNA，也发现 STV-C8 递送 Cre mRNA 的效率更高(扩展数据图 6g)。为进一步评估 STV-C8 作为 RNA 载体的性能，我们将其与临床使用的 LNP 进行了对比，后者由 COVID-19 疫苗 BNT162b2 中使用的可电离脂质 ALC-0315 配制而成。我们对 LNP 和 STV-C8 包装的 EGFP mRNA 进行系列稀释，并与靶细胞 HEK293T 共孵育，发现 STV-C8 的转染率比 LNP 高出 1000 倍以上(图 2g)。此外，我们分析了 STV-C8 或 LNP 递送的、可诱导特定 EGFP 蛋白表达水平的 mRNA 剂量。STV-C8 诱导与 LNP 递送的 mRNA 相同表达水平所需的 mRNA 剂量，降低了 10000 倍以上(扩展数据图 6h 和补充图 4)。HibiT 标签是 STV-C8 构建体的一部分，使用该标签可进一步表征摄取动力学。通过向经 STV-C8 处理的分裂荧光素酶(split-Luc)报告细胞中加入活细胞荧光素酶底物 Endurazine，我们监测了 STV-C8 囊泡向靶细胞的摄取过程，发现其在 后开始发生，最大摄取量出现在 10-12 小时后(扩展数据图 6i)。
未修饰的 mRNA 是先天免疫应答的强效触发因子 。因此，我们测试了 STV-C8 递送的 RNA 是否会诱导干扰素信号传导。质粒 DNA 是已知的先天免疫应答触发因子，与之不同，用含 RNA 的 STV-C8 处理 A549-IFN 报告细胞后，未检测到任何干扰素应答(补充图 5a)。我们推测 cargo RNA 的生物产生过程可能会减轻干扰素应答。为验证这一假设，我们体外转录了 mTagBFP2 mRNA(加帽且多聚腺苷酸化)，其中含有常规尿苷或 -甲基假尿苷。我们将这些 mRNA 包装进 LNP，同时还 制备了经 STV-C8 包装的 mTagBFP2 mRNA。我们用这些样品处理 A549-IFN 报告细胞。正如预期，未修饰的 mRNA 会导致报告细胞强烈激活，而修饰后的 mRNA 和 STV-C8 递送的 mRNA 均未诱导报告细胞激活(图 2h)。
递送载体除效率外的关键特性是其细胞类型特异性。近期已构建出保留内体逃逸活性但丧失与靶受体LDLR结合能力的VSV-G突变体。当与抗体联用时，这类“盲态”VSV-G可引导VLPs优先靶向其他受体 。我们考虑是否可将人工设计蛋白的概念拓展至细胞类型特异性的编程，以克服抗体来源有限的问题。我们将针对EGFR或IL-7Rα的计算机设计肽结合剂添加至STV-C8颗粒 ，方法是将这些结合剂与信号肽及跨膜结构域融合，并在生产STV-C8(EGFP)的细胞中与盲态VSV-G(K63Q/R370Q)共同表达。STV-C8(EGFP)从质膜出芽后，这些合成结合模块会整合到STV-C8表面，并介导细胞类型特异性(图2i及扩展数据图7a)。我们将经编程的STV-C8(EGFP)添加至EGFR或IL-7Rα靶细胞，通过流式细胞术检测其被受体表达细胞摄取的情况。我们发现经编程的STV-C8对相应靶细胞系具有强偏好性(图2j)，并确认同时表达两种受体的细胞可被含有EGFR或IL-7Rα结合剂的STV-C8(EGFP)感染(扩展数据图7b)。我们还发现，表面同时带有两种结合剂的STV-C8(EGFP)，在同时表达两种受体的靶细胞中的摄取量进一步增加，提示可能存在叠加效应。这一发现可进一步用于精准的细胞类型特异性靶向，且与此前基于抗体片段的靶向策略相比，可能具有更高的摄取效率 (扩展数据图7c, d)。
腺相关病毒(AAV)和慢病毒等病毒被广泛用于将遗传物质递送至细胞，但它们的包装容量有限。因此，我们对STV-C8可高效包装的 cargo 大小进行了表征。我们将恒定长度的EGFP mRNA与不同长度的mRuby3 mRNA共包装。在测试的mRNA长度范围(1-10 kb)内，我们在靶细胞中检测到EGFP和mRuby3的表达水平相似，表明STV-C8在大多数 cargo RNA 的长度范围内无包装限制(扩展数据图8a)。我们提出假设:与病毒不同，HE0690寡聚体表面的RNA包装而非衣壳内部的包装，可能放宽了STV-C8的大小限制。此外，我们未检测到STV-C8诱导细胞凋亡的迹象(扩展数据图8b)，确认STV-C8在 储存条件下至少稳定1周，这将有助于其实际应用(扩展数据图8c)，并确定了最佳 cargo RNA/STV-C8/融合蛋白比例(扩展数据图8d-h)。
将mRNA递送至细胞模型中
已证明STV-C8可作为转运载体，将报告RNA高效转入多种细胞系，我们随后将一组相关 cargo RNA 递送至复杂细胞模型中。近期，研究人员通过蛋白质语言模型在计算机上生成了新型CRISPR蛋白序列。我们证实，其中一种蛋白OpenCRISPR-1(参考文献29)可通过STV-C8实现高效递送，并在交通光报告基因(TLR)细胞中诱导出与野生型Cas9相似的编辑效率 (补充图5b)。接下来，我们测试了STV-C8将EGFP cargo RNA递送至多层细胞模型的能力。利用STV-C8(EGFP)转导从诱导多能干细胞(iPS细胞)衍生的人类视网膜类器官中分离得到的视网膜色素上皮(RPE)球体，我们在球体内部层也观察到了EGFP的表达，证明STV-C8可介导药物递送至外层细胞以外的区域(图3a、b及补充图6a、b)。我们还在作为悬浮细胞模型的原代人单核细胞中观察到了高递送效率(图4c)。随后，我们从小鼠脑中分离得到原代皮质星形胶质细胞，并在该模型中证实STV-C8(EGFP)具有高转导效率(图3d、e)。此外，我们将编码前神经元转录因子Ascl1的mRNA递送至皮质星形胶质细胞，在超过30%的细胞中诱导了ASCL1的表达(图3f)。基因编辑器的高效递送是新型递送载体最具应用价值的方向之一。我们在Cas9 mRNA的3’非翻译区(UTR)添加了PP7包装信号，并在单引导RNA(sgRNA)的四内环中克隆了两个带有PP7信号的sgRNA，同时加入了靶向肌营养不良蛋白基因外显子51上下游内含子区域的间隔序列。已有研究表明，肌营养不良蛋白基因外显子51的缺失是挽救大部分DMD相关表型的可行策略 。我们用STV-C8(Cas9/sgRNA)颗粒处理原代猪成纤维细胞(图3g)。对处理细胞的肌营养不良蛋白基因座进行扩增后发现，缺失频率约为40%(图3h及补充图7a)。为进一步证明STV-C8的灵活性，我们包装并递送了可编程抗病毒蛋白Cas13d-NCS 。我们在Cas13d-NCS mRNA的3’UTR以及靶向SARS-CoV-2基因组的CRISPR RNA(crRNA)的3’端添加了PP7信号。我们制备了STV-C8(Cas13d-NCS/crRNA)颗粒，将其递送至iPS细胞衍生的人肺细胞中，并用SARS-CoV-2-GFP感染这些细胞(图3i及补充图6c)。通过活成像系统监测病毒复制情况，结果显示STV-C8递送的Cas13d-NCS几乎完全阻断了病毒(图3j、k)。为进一步验证STV-C8颗粒的治疗潜力，我们测试了其在人血液样本中的稳定性，发现其不受血液处理的影响(图3I)。
图3 | STV-C8 依赖的 cargo RNA 向多种细胞模型的递送。a，将 EGFP mRNA 包装进 STV-C8 并递送至人单核细胞悬浮细胞及 iPS 细胞衍生的 RPE 球状体中。b，STV-C8 转导 2 天后，对 RPE 球状体冷冻切片进行共聚焦成像，切片中包含 EGFP mRNA，并用 RPE65(RPE 细胞的特异性标记蛋白)进行共染色(代表性图像；比例尺: )。c，流式细胞术分析:处理 24 小时后，未转导或用含 EGFP mRNA 的 STV-C8 转导的人单核细胞。d，将编码 ASCL1 转录因子与 EGFP 的多顺反子 mRNA 包装进 STV-C8，并转导原代小鼠星形胶质细胞。e，STV-C8 包装 EGFP mRNA 转导 3 天后，原代小鼠星形胶质细胞的荧光成像(代表性图像；比例尺: )。f，对转导了含 ASCL1 的 STV-C8 并经 ASCL1 染色的星形胶质细胞进行 ASCL1 阳性细胞定量(双侧未配对 Student’s 检验， 对照组与 处理组独立星形胶质细胞培养物的平均值 标准差)。g，STV-C8 介导的 Cas9/sgRNA 递送示意图 导入猪成纤维细胞，通过在侧翼内含子中切割的sgRNA导致肌营养不良蛋白外显子51缺失。h，用STV-C8处理的猪成纤维细胞在处理后3天，对肌营养不良蛋白基因进行代表性PCR扩增。i，STV-C8介导的靶向SARS-COV-2的Cas13d-NCS向病毒感染的人肺细胞的递送。j，用STV-C8(Cas13d-NCS/crRNA)处理的、感染了SARS-CoV-2-GFP(感染复数:10)的iPS细胞源人肺细胞的荧光成像，感染后24小时(p.i.)(代表性图像；比例尺: )。k，STV-C8(Cas13d-NCS/crRNA)处理的iPS细胞源人肺细胞中SARS-CoV-2-GFP复制的活细胞成像，持续 ( 个生物学重复的平均值± 标准差)。l，在用人全血和血清样品预处理STV-C8递送载体后，测量N-分裂荧光素酶(N-split-Luc)mRNA向分裂荧光素酶(split-Luc)报告细胞的递送(双侧未配对Student’s 检验， 个生物学重复的平均值± 标准差)。
图4 | STV-C8在小鼠和猪模型中的生物分布及基因编辑货物的递送。a，通过小鼠全身清除成像分析STV-C8介导的EGFP表达的体内生物分布示意图。i.v.，静脉注射。b，经EGFP mRNA或空STV-C8囊泡处理的清除小鼠体内EGFP表达的腹侧视图，静脉注射72小时后用光片显微镜成像(代表性图像；EGFP呈绿色，组织自发荧光呈灰色；比例尺: )。虚线框标出了c中放大的区域。c，清除后EGFP信号的成像 肺、肝、脾和肾组织中EGFP信号的成像(代表性图像；比例尺: ；肾组织从不同平面成像)。d，通过局部注射STV-C8载体将Cas9/sgRNA递送至猪肌肉的示意图。e，肌内注射后，编辑后的肌营养不良蛋白基因 的代表性PCR分析。用STV-C8(Cas9/sgRNA)处理后，基因的第51号外显子被删除。f，PCR条带的桑格测序结果，对应处理后猪肌肉细胞中缺失的第51号外显子。
向动物模型递送mRNA
在证实STV-C8可将多种货物RNA有效递送至多种细胞模型后，我们接下来在动物模型中对该系统进行了测试；据我们所知，这是人工智能设计的蛋白质在体内测试的首批案例之一。我们向小鼠静脉注射STV-C8(EGFP)，并采用先进的全身清除与成像技术，以近单细胞分辨率全面分析STV-C8介导的EGFP表达的生物分布 (图4a)。我们在肺部检测到强烈且高度特异性的表达，但在肝脏中未检测到表达，而肝脏是大多数脂质载体的常见靶组织(图4b、c及补充图8)。成像方法的高分辨率使我们能够检测到肺部的点状表达模式，提示该组织内的特异性。此外，我们未检测到 全身注射STV-C8产生的任何免疫学或毒理学副作用(扩展数据图9)。
目前正在探索外显子跳跃策略用于杜氏肌营养不良症(DMD) 的治疗。我们最近报道，CRISPR-Cas9介导的肌营养不良蛋白基因外显子51缺失，可在杜氏肌营养不良症(DMD)猪模型中诱导肌肉和心脏功能的表型拯救 。由于该研究中使用的腺相关病毒(AAV)据报道偶尔会引发严重副作用 ，因此我们评估了STV-C8作为遗传药物的递送方式，例如用于杜氏肌营养不良症(DMD)的治疗。我们首先证实STV-C8可将货物RNA高效递送至肌肉细胞(扩展数据图10a)。接下来，我们将用于缺失肌营养不良蛋白基因外显子51的CRISPR-Cas9系统包装到STV-C8颗粒中，并将其注射到猪的肌肉中(图4d)。我们扩增了肌营养不良蛋白基因座，证实经STV-C8(Cas9/sgRNA)处理的肌肉中成功缺失了外显子51(图4e、f，扩展数据图10b及补充图7b)。与全身注射的情况一样，我们在经STV-C8局部处理的肌肉中未检测到任何免疫反应(扩展数据图10c-e)。为进一步证明该策略可作为杜氏肌营养不良症(DMD)的可行治疗方法，我们使用了来自杜氏肌营养不良症(DMD)患者的骨骼肌细胞(Δ52)，并用STV-C8(Cas9/sgRNA)处理这些细胞。我们证实外显子51成功缺失(扩展数据图10f-h及补充图7c和9a)，且
文章
DMD 开放阅读框(补充图 9b)。我们承认肌内递送并不直接适用于 DMD，未来研究需要解决比较性能、靶向性和细胞类型特异性的问题；然而，在大型动物模型和 DMD 患者的骨骼肌细胞中成功缺失外显子 51，加上良好的安全性，表明 STV-C8 具有强大的临床潜力。
讨论
本研究证实，可利用RFdiffu- 设计的蛋白质组装体从头构建合成RNA转移载体。通过建立多维筛选平台，我们测试了100余种结构各异的STV构建体。利用STV-C8，我们开发出一种载体架构，其RNA转移效率优于生物及化学载体，并将其应用于向多种人源、鼠源及猪源细胞和动物模型递送各类 cargo RNA，包括转录因子、基因编辑器和可编程抗病毒药物。
病毒种类繁多，但多数都趋向于将其基因组包装在具有二十面体和螺旋对称结构的大型多聚蛋白外壳中 。我们并未模仿这类天然衣壳特征 ，而是利用基于人工智能的蛋白质设计，构建出非典型但功能正常的RNA转运载体，其性能优于天然同类载体。STV-C8的高转运效率，结合其独特的尺寸和形状特征，表明从头构建RNA转运载体时，克服进化约束可能是有益的。
本研究构建的载体是当前蛋白质设计方法的理想应用案例，这类方法在构建静态、对称结构方面非常有效，但在生成动态蛋白质或酶活性方面存在局限 。未来的进展，例如纳入分子动力学数据或开发整合结构、序列和功能注释的多模态模型，有望扩展这些模型在解决复杂生物学问题方面的能力 。应用能实现蛋白质真正从头设计的工具，可克服天然蛋白质多样性的局限，为生物学和生物医学研究的各个领域开辟新方向。
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德国奥伯施莱斯海姆亥姆霍兹慕尼黑中心发育遗传学研究所。 德国弗赖辛慕尼黑工业大学生命科学学院。 德国奥伯施莱斯海姆亥姆霍兹先锋园区。 德国加兴慕尼黑工业大学自然科学学院生物科学系。 德国奥伯施莱斯海姆亥姆霍兹组织工程与再生医学研究所，
扩展数据图 1 | 基本 STV 结构域的详细表征。a，初始组装结构域 的解析结构及大小。b，源自 ESCRT 招募病毒肽的合成出芽结构域 SynL 的设计理念。c，在 d 面板中测试的包含不同出芽结构域的基本 STV 设计。d，基于 HiBiT 对 STV 释放的定量分析，方法为 融合不同出芽结构域( 为平均值， 为生物学重复次数)。e，基本 STV 构建体递送 EGFP mRNA 的示意图。f，由带有 SynL 结构域的原始 STV 构建体介导，向 HEK293T 细胞递送 EGFP mRNA，通过流式细胞术定量( 为平均值， 为生物学重复次数)。
人工蛋白组装体,载体STV,CRISPR
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