N6-甲基腺苷正向调节柯萨奇病毒B3的复制
发布时间：
2025-03-27 21:27
N6-甲基腺苷正向调节柯萨奇病毒B3的复制
赵海年 ，高志云 ，孙佳文 ，乔红秀 ，赵燕 ，崔燕 ，赵宝鑫 ，王韦杰 ，Sandra Chiu 和褚夏
1 河北医科大学病原生物学教研室，河北 石家庄 050017；23031100026@stu.hebmu.edu.cn(赵海年)；17800577@hebmu.edu.cn(高志云)；sunjiawenwy@163.com(孙佳文)；18200787@hebmu.edu.cn(赵燕)；zhaobx@wh.iov.cn(赵宝鑫)；weijiewang@hebmu.edu.cn(王韦杰)
2 河北医科大学教学实验中心，河北 石家庄 050017
中国科学院武汉病毒研究所病毒学国家重点实验室，生物安全大科学研究中心，湖北 武汉 430207
4 中国科学技术大学生命科学与医学部，安徽 合肥 230026
* 通信作者:qiux@ustc.edu.cn(Sandra Chiu)；chuaixia@wh.iov.cn(褚夏)
这些作者对本文贡献相同。
摘要:肠道病毒(如柯萨奇病毒B3)被认为是病毒性心肌炎的常见病因，但其复制和致病的潜在机制在很大程度上仍不清楚。多种病毒的基因组中含有 -甲基腺苷 ，其在病毒复制中起着重要作用。在此，我们通过使用在线生物信息学工具SRAMP和间接免疫荧光测定法(IFA)，预测柯萨奇病毒B3(CVB3)基因组中含有 位点，并发现CVB3感染可改变 相关蛋白的表达和细胞定位。此外，我们发现 修饰抑制剂3-脱氮腺苷(3-DAA)可显著降低CVB3的复制。我们还观察到 甲基转移酶甲基转移酶样蛋白3(METTL3)和METTL14在CVB3复制中起正向作用，而 去甲基化酶脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)或AlkB同源物5(ALKBH5)则起相反作用。敲低 结合蛋白YTH结构域家族蛋白1(YTHDF1)、YTHDF2和YTHDF3可显著降低CVB3的复制。最后，与CVB3野生型(WT)毒株相比，CVB3基因组中的 位点突变降低了CVB3的复制。综上所述，我们的研究结果表明，CVB3可利用 修饰来促进病毒复制，这为CVB3与宿主相互作用的机制提供了新的见解。
关键词:柯萨奇病毒B3；N6-甲基腺苷；复制； A相关蛋白
1. 引言
柯萨奇病毒B3型(Coxsackievirus B3，CVB3)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)，长期以来一直是病毒性心肌炎模型的研究对象[1]。急性病毒性心肌炎(VMC)可能导致心源性猝死，或进展为扩张型心肌病(DCM)，甚至心力衰竭[2]。目前，尚无有效的治疗方法或疫苗，且CVB3感染的机制尚未完全阐明。揭示CVB3诱导心肌损伤的潜在机制对于制定治疗策略至关重要。CVB3是一种无包膜病毒，拥有一条7.4 kb的单链正链RNA。CVB3基因组编码四种结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和七种非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。VP1、VP2、VP3和VP4形成病毒衣壳结构，负责与宿主细胞的受体结合。在七种非结构蛋白中，蛋白酶 和 负责处理病毒多聚蛋白，依赖RNA的RNA聚合酶 参与病毒基因组复制， 和 参与RNA合成 。
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引用:赵，H.；高，Z.；孙，J.；乔，H.；赵，Y.；崔，Y.；赵，B.；王，W.；邱，S.；揣，X. N6-甲基腺苷正向调节柯萨奇病毒B3型复制。《病毒》2024年，第16卷，第1448页。https://doi.org/10.3390/v16091448
学术编辑:乔治·贝洛夫
接收日期:2024年8月3日
修订日期:2024年8月27日
接受日期:2024年8月28日
发表日期:2024年9月11日
版权所有:(c) 2024作者。许可方:瑞士巴塞尔MDPI。本文是一篇开放获取文章，根据知识共享署名(CC BY)许可协议(https:// creativecommons.org/licenses/by/ 4.0/)的条款和条件分发。
N6-甲基腺苷( )是在多种已知的RNA修饰中，真核生物信使RNA(mRNA)最丰富的内部修饰，它调控着RNA的许多生物学过程[4]，包括剪接[5]、核输出[6]、稳定性[7,8]和翻译效率[9]。mRNA的 修饰大多位于翻译起始位点、终止密码子和 非翻译区( UTR)[10 - 12]，并发生在共有基序 。 修饰是一个动态可逆的过程。 由包含METTL3和METTL14的甲基转移酶复合物以及辅因子威尔姆斯瘤1相关蛋白(Wilms’ tumour 1 - associated protein，WTAP)添加到 上[12,16,17]，并由去甲基化酶FTO或ALKBH5从mRNA上去除[18,19]。诸如含YTH结构域的蛋白YTHDF1 - 3等 结合蛋白识别并结合这种修饰，对 的功能产生重要影响[12]。
多个研究小组已表明，病毒RNA中存在N6 - 甲基腺苷(m⁶A， )修饰，并且在病毒的复制周期中发挥促病毒或抗病毒作用[20,21]。例如，m⁶A修饰正向调节肠道病毒71型(EV71)的复制[22]。在EV71复制过程中，甲基转移酶3(METTL3)与病毒RNA依赖的RNA聚合酶3D相互作用，诱导3D的小泛素样修饰蛋白化(SUMOylation)和泛素化增加，从而促进病毒复制，因为3D以SUMOylation依赖的方式被泛素化，使得SUMOylation和泛素化的相互作用增强了病毒聚合酶的稳定性[23]。然而，m⁶A动态变化负向调节丙型肝炎病毒(HCV)感染性病毒颗粒的产生或释放[24]。在HCV感染期间，YTH结构域家族蛋白(YTHDF)重新定位到脂滴(病毒RNA合成和病毒颗粒组装的场所)，以干扰病毒RNA包装和感染性病毒颗粒的产生。综上所述，这些研究表明m⁶A修饰在病毒复制中起着重要作用。
柯萨奇B3病毒(CVB3)RNA中的m⁶A修饰尚未被鉴定出来，并且m⁶A调节CVB3复制的机制仍不清楚。由于EV71也是肠道病毒属的成员，与CVB3具有相似的结构和基因组，我们推测m⁶A修饰也可能调节CVB3的复制。在这里，我们探索了m⁶A修饰对HeLa细胞中CVB3感染的调节作用，并报道了它通过改变m⁶A水平或m⁶A相关蛋白的表达来正向调节CVB3的复制。这项研究为CVB3感染和发病机制提供了新的见解，这可能有助于开发针对CVB3的有效策略。
2. 材料与方法
2.1. 细胞和病毒
HeLa细胞在添加了10%胎牛血清(FBS)的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM；吉宝公司)中培养。细胞在含5%二氧化碳( )、温度为37°C( )的湿润环境中培养。含有CVB3 pH 3株全长基因组(基因库编号U57056.1)[25]和绿色荧光蛋白(GFP)基因[26]的质粒pMKS1 - CVB3 - eGFP由美国加利福尼亚州拉霍亚市斯克里普斯研究所的拉尔夫·费尔博士慷慨提供。按照制造商的方案，使用脂质体转染试剂2000(Lipofectamine 2000；赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市)将质粒DNA转染到HEK293T细胞中。CVB3病毒在HeLa细胞中通过噬斑形成单位(PFU)进行扩增和滴定。
2.2. 蛋白质免疫印迹法
细胞在补充了蛋白酶抑制剂混合物(碧云天，中国上海)的RIPA缓冲液(碧云天，中国上海)中裂解，取 总蛋白进行 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。将样品转移至PVDF免疫印迹膜(赛默飞世尔科技)上，并用抗VP1(丹麦哥斯楚普Dako公司，M7064)、抗METTL3(中国武汉Proteintech公司，15073 - 1 - AP)、抗METTL14(Proteintech公司，26158 - 1 - AP)、抗FTO(Proteintech公司，27226 - 1 - AP)、抗ALKBH5(Proteintech公司，16837 - 1 - AP)、抗YTHDF1(Proteintech公司，17479 - 1 - AP)、抗YTHDF2(Proteintech公司，24744 - 1 - AP)、抗YTHDF3(Proteintech公司，25537 - 1 - AP)和 -微管蛋白(Proteintech公司，66240 - 1 - Ig)抗体进行印迹。相应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和纯山羊抗小鼠IgG(H + L)(Proteintech公司，SA00001 - 1)和相应的辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和纯山羊抗兔IgG(H + L)(Proteintech公司，SA00001 - 2)用作二抗。使用增强化学发光(ECL)成像仪(Gene公司)通过WesternLumaxLightTM Superior(ZETA)对膜进行分析。
2.3. 间接免疫荧光测定(IFA)
在感染前1天，将HeLa细胞以 的汇合度接种于六孔板中，随后用CVB3(感染复数 = 1)感染细胞并孵育 。然后，用PBS洗涤细胞三次，用4.0%多聚甲醛固定15分钟，用0.5% Triton X - 100透化约 ，并在室温下用 山羊血清封闭 。将细胞与一抗按制造商建议的稀释度在 下孵育过夜，用PBS洗涤三次，并在室温下用适当的二抗染色 。用Hoechst染色细胞核。在奥林巴斯共聚焦显微镜下观察载玻片。
2.4. 定量逆转录聚合酶链反应(qRT - PCR)
使用TRIzol试剂(中国北京天根生化科技有限公司)提取总RNA。使用HiScript III逆转录酶(中国南京诺唯赞生物科技股份有限公司)对 总RNA进行逆转录。使用chamQ通用SYBR qPCR预混液(诺唯赞)在Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 3(赛默飞世尔科技公司)上进行实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)。通过将循环阈值(Ct)值与HS-ACTB的Ct值进行归一化处理，得到 值，从而获得相对基因表达水平。用于基因表达检测的引物如下:柯萨奇病毒B3型(CVB3，正向:5′-CGA TCA ACA GTC AGC GTG G-3′，反向:5′-TGG CCG GAT AAC GAA CGC-3′)和人β-肌动蛋白(HS-ACTB，正向:5′-CCT GGC ACC CAG CAC AAT-3′，反向: -GGG CCG GAC TCG TCA TAC- )。扩增条件为 下进行 个循环，每个循环包括 下 、 ，以及 下 ；最后在 下延伸 。
2.5. 稳定细胞系的构建
通过将靶向人类特异性基因的短发夹RNA(shRNA)或非特异性寡核苷酸连接到慢病毒表达载体pCDH中，敲低甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、甲基转移酶样蛋白14(METTL14)、脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)、 AlkB同源蛋白5(ALKBH5)、YTH结构域家族蛋白1(YTHDF1)、YTH结构域家族蛋白2(YTHDF2)和YTH结构域家族蛋白3(YTHDF3)的表达。本研究中使用的针对每个基因的shRNA序列如下:shMETTL3:5′-GCAAGAATTCTGTGACT ATGG-3′，shMETTL14:5′-GCTTAACCCATTAGTACTATC′，shFTO:5′-GCTGAAATATCCT AAACTAAT-3′，shALKBH5:5′-GTCCGTGTCCTTCTTIAGCGA-3′，shYTHDF1:5′-GGATA CAGTTCATGACAATGA-3′，shYTHDF2:5′-GGTTCTGGATCTACTCCTTCA-3′，shYTHDF3: -GCAATGATACTTTGAGTAAGG- 。shNC: -GGTGAAGGTGATGCAACATAC- 。通过将pCDH与包装质粒pLP1、pLP2和pVSV-G共转染至293T细胞来制备慢病毒。随后用假病毒颗粒感染肝癌细胞系HepG2。为获得稳定转染的细胞系，用嘌呤霉素处理细胞。通过qPCR和蛋白质免疫印迹法验证敲低效率，并将细胞用于后续实验。
2.6. 甲基化RNA免疫沉淀结合实时荧光定量PCR(MeRIP-qPCR)
使用 RNA富集试剂盒(美国纽约Epigentek公司)进行MeRIP实验。简而言之，通过与磁珠结合的 捕获抗体下拉包含 区域的目标片段，然后释放、纯化并洗脱富集的RNA。最后，进行qRT-PCR以定量目标基因甲基化的变化。
2.7. 细胞计数试剂盒-8(CCK-8)
将HeLa细胞以每孔5000个细胞的密度接种于含 胎牛血清(FBS)的DMEM培养基的96孔板中。大约 后，将培养基更换为含不同浓度3 - DAA(HY - W013332，MCE)的 孔培养基。在3 - DAA条件下培养细胞 后，小心移除培养基，向每孔加入含CCK8(HY - K0301 - 3000T，MCE)溶液且补充了10% FBS的DMEM培养基 ，并将细胞在 下再孵育 。用BioTeK酶标仪(美国加利福尼亚州圣克拉拉市安捷伦科技公司)读取 处的吸光度。
2.8. 统计分析
使用Prism软件(v10.2.0)通过非配对学生 检验对数据进行分析，统计学显著性定义为 。
3. 结果
3.1. 修饰调控柯萨奇B3病毒(CVB3)复制
为了研究CVB3 RNA是否发生 A修饰，我们首先利用在线生物信息学工具SRAMP(http://www.cuilab.cn/sramp/，于2023年5月16日访问)预测 位点，发现CVB3 RNA基因组包含 修饰位点，包括1个非常高置信度位点、7个高置信度位点、9个中等置信度位点和11个低置信度位点(图1A和补充表S1)。
图1. 修饰调控CVB3复制。(A)通过在线生物信息学工具SRAMP预测CVB3基因组RNA上的 修饰位点。(B)在指定时间从感染CVB3的HeLa细胞中提取总RNA，其中HeLa细胞用指定浓度的3 - DAA预处理 。通过qRT - PCR对CVB3 RNA进行定量，以HS - ACTB作为对照。* ，** 。(C)在感染CVB3之前，用指定浓度的3 - DAA对HeLa细胞预处理 。进行蛋白质印迹法以确定VP1的表达。(D)在感染CVB3之前，用指定浓度的3 - DAA对HeLa细胞预处理 ，并在感染后的指定时间收集上清液，以噬斑形成单位(PFU)测量病毒滴度。** 。(E)感染CVB3的HeLa细胞的荧光显微镜图像。通过荧光显微镜在指定时间监测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。显示了 放大倍数(比例尺为 )的显微照片。用ImageJ软件对荧光强度进行定量。* 。
众所周知，3-脱氮腺苷(3-DAA)通过降低S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)来阻断mRNA的[m⁶A]修饰[27 - 29]，这可能会影响病毒的复制，如甲型流感病毒(IAV)[30]、1型疱疹病毒(HSV - 1)[31]和卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)[32]。接下来，我们研究了3 - DAA对CVB3复制的影响。我们首先检测了用不同浓度的3 - DAA处理[24小时]后的HeLa细胞活力。我们发现，在[10μM]和[20μM]的3 - DAA处理下，细胞存活率分别为97.02%和86.85%，与对照组相比无显著差异(图S1)。随后，选择[10μM]和[20μM]的3 - DAA用于后续实验。分别通过逆转录定量PCR(RT - qPCR)、蛋白质印迹法和噬斑形成单位(PFU)测定法检测CVB3 RNA拷贝数、VP1蛋白和病毒滴度。此外，通过荧光显微镜监测CVB3 GFP表达，并使用ImageJ软件(版本1.53c)对荧光强度进行定量。结果显示，用3 - DAA处理后，CVB3 RNA拷贝数、VP1蛋白表达、病毒滴度和荧光强度显著降低(图1B - E)。综上所述，这些发现表明[m⁶A]修饰可能影响CVB3的复制。
3.2. CVB3感染调节[m⁶A]相关蛋白的表达模式
为了进一步验证[m⁶A]修饰与CVB3复制之间的关系，我们研究了CVB3感染后宿主[m⁶A]相关蛋白的表达和细胞定位。采用蛋白质印迹法和免疫荧光染色法进行这些分析。我们注意到，感染后[24小时](hpi)时，METTL3和METTL14蛋白水平略有下降，而在CVB3感染期间，FTO和ALKBH5的蛋白水平没有显著变化。此外，感染后36小时，YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的蛋白水平显著下降(图2A)。关于宿主[m⁶A]相关蛋白的细胞定位，免疫荧光结果显示，CVB3感染后，METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5和YTHDF3从细胞核转移到细胞质(图2B - E，H)。相反，在未感染和感染的HeLa细胞中，YTHDF1和YTHDF2主要位于细胞质中(图2F，G)。这些发现表明，CVB3感染调节了[m⁶A]甲基转移酶、去甲基化酶和结合蛋白的蛋白表达和亚细胞分布。
图2. CVB3感染改变[m⁶A]相关蛋白的表达模式。(A)感染CVB3(MOI = 0.01)的HeLa细胞在[24小时]和[36小时]收获。通过蛋白质印迹法检测[m⁶A]相关蛋白的表达。(B - H)感染CVB3或模拟感染的HeLa细胞在感染后[48小时](hpi)的共聚焦显微镜图像。细胞核(蓝色)和病毒蛋白(红色)分别用Hoechst和VP1特异性抗体标记。[m⁶A]相关蛋白(绿色)用所示抗体染色。比例尺，[10μm]。
3.3. METTL3和METTL14增强HeLa细胞中CVB3的复制
为评估 修饰对柯萨奇病毒B3型(CVB3)复制的影响，我们首先通过在HeLa细胞中敲低甲基转移酶样蛋白3(METTL3)和甲基转移酶样蛋白14(METTL14)，然后感染CVB3，分析了甲基转移酶复合物在CVB3复制中的作用。我们通过短发夹RNA(shRNA)敲低HeLa细胞中内源性的METTL3和METTL14，并通过蛋白质印迹法(western blot)评估这两种蛋白的表达情况(图S2A、B)。我们发现，与对照组相比，敲低METTL3和METTL14导致CVB3 RNA拷贝数、病毒衣壳蛋白1(VP1)的合成、病毒滴度和绿色荧光蛋白(GFP)表达显著降低(图3A - H)。综上所述，我们的研究结果表明， 甲基转移酶METTL3和METTL14通过增强CVB3 RNA的表达、VP1蛋白的合成以及感染性颗粒的产生来促进CVB3的复制。
图3. METTL3和METTL14增强HeLa细胞中CVB3的复制。(A、E)在指定时间从敲低METTL3或METTL14的CVB3感染的HeLa细胞中提取总RNA。以人β - 肌动蛋白(HS - ACTB)为内参，通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT - PCR)对CVB3 RNA进行定量分析。** 。(B、F)HeLa细胞中METTL3和METTL14被敲低时VP1蛋白的表达情况。(C、G)敲低METTL3或METTL14的HeLa细胞感染CVB3，在感染后的指定时间收集上清液，以噬斑形成单位(PFU)为单位测定病毒滴度。* ，** 。(D、H)CVB3感染的HeLa细胞的荧光显微镜图像。在指定时间通过荧光显微镜监测GFP的表达情况。显示了 放大倍数(标尺为 )的显微照片。使用ImageJ软件对荧光强度进行定量分析。** 。
3.4. 脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)和α - 酮戊二酸依赖的双加氧酶5(ALKBH5)抑制HeLa细胞中CVB3的复制
接下来，我们通过在HeLa细胞中敲低内源性的FTO和ALKBH5，然后感染CVB3，研究了 去甲基化酶在CVB3复制中的作用。我们通过shRNA敲低HeLa细胞中内源性的FTO和ALKBH5(图S3A、B)。与敲低METTL3和METTL14的结果相反，敲低FTO和ALKBH5导致CVB3 RNA水平、VP1蛋白水平和病毒滴度显著增加(图4A - C、E - G)。然而，我们观察到GFP表达没有显著变化(图4D、H)。总体而言，这些结果表明， 去甲基化酶FTO和ALKBH5对CVB3的复制起负调控作用。
图4. FTO和ALKBH5抑制HeLa细胞中CVB3的复制。(A、E)在指定时间从敲低FTO或ALKBH5的CVB3感染的HeLa细胞中提取总RNA。以HS - ACTB为内参，通过qRT - PCR对CVB3 RNA进行定量分析。** 。(B、F)在HeLa细胞中敲低FTO和ALKBH5，然后感染CVB3，通过蛋白质印迹法评估VP1的表达情况。(C、G)敲低或未敲低FTO或ALKBH5的HeLa细胞感染CVB3，在感染后的指定时间收集上清液，以PFU为单位测定病毒滴度。** 。(D、H)CVB3感染的HeLa细胞的荧光显微镜图像。在指定时间通过荧光显微镜监测GFP的表达情况。显示了 放大倍数(标尺为 )的显微照片。使用ImageJ软件对荧光强度进行定量分析。
3.5. YTH结构域家族蛋白1(YTHDF1)、YTH结构域家族蛋白2(YTHDF2)和YTH结构域家族蛋白3(YTHDF3)干扰CVB3 RNA的表达
由于N6-甲基腺苷(m⁶A)结合蛋白在识别N6-甲基腺苷(m⁶A)修饰方面具有重要功能[12]，我们进一步研究了N6-甲基腺苷(m⁶A)阅读器YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3在柯萨奇B3病毒(CVB3)复制中的功能。通过蛋白质印迹法证实了YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3在HeLa细胞中的敲低效率(图S4A - C)。感染CVB3后，结果显示，敲低YTHDF1和YTHDF2会导致CVB3 RNA拷贝数、VP1蛋白、病毒滴度和绿色荧光蛋白(GFP)表达显著降低，而敲低YTHDF3仅导致CVB3 RNA拷贝数和GFP表达降低(图5A - L)。这些结果共同表明，YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3可在CVB3感染期间干扰CVB3 RNA的表达。
3.6. N6 - 甲基腺苷(m⁶A)缺失的CVB3突变体的复制缺陷
最后，我们消除了CVB3基因组中某个N6 - 甲基腺苷(m⁶A)位点，以验证N6 - 甲基腺苷(m⁶A)修饰的影响。我们选择了SRAMP预测结果中置信度非常高的一个位点。随后，我们在不改变氨基酸的情况下突变了第4519位核苷酸处的腺嘌呤(A)残基(图6A)。N6 - 甲基腺苷(m⁶A)修饰的RNA免疫沉淀(MeRIP - qPCR)显示，与野生型(WT)CVB3相比，m⁶A⁻突变体的相对N6 - 甲基腺苷(m⁶A)水平显著降低(图6B)。值得注意的是，m⁶A⁻ A突变体的病毒滴度低于CVB3 WT。因此，CVB3基因组的N6 - 甲基腺苷(m⁶A)修饰可能对CVB3复制起正调控作用(图6C)。
图5. YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3干扰CVB3 RNA的表达。(A、E、I)在指定时间从敲低YTHDF1、YTHDF2或YTHDF3的CVB3感染的HeLa细胞中提取总RNA。通过实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT - PCR)对CVB3 RNA进行定量，以人β - 肌动蛋白(HS - ACTB)作为对照。**P < 0.01。(B、F、J)在HeLa细胞中敲低YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3，并在CVB3感染后进行蛋白质印迹法检测VP1的表达。(C、G、K)用CVB3感染敲低YTHDF1、YTHDF2或YTHDF3的HeLa细胞，并在感染后的指定时间收集上清液，以噬斑形成单位(PFU)测量病毒滴度。*P < 0.05，**P < 0.01。(D、H、L)CVB3感染的HeLa细胞的荧光显微镜图像。通过荧光显微镜在指定时间监测GFP表达。显示了×200放大倍数(比例尺为100μm)的显微照片。用ImageJ软件对荧光强度进行定量。*P < 0.05，**P < 0.01。
图6. m⁶A缺失的柯萨奇B3病毒(CVB3)突变体存在复制缺陷。(A)野生型(WT)和m⁶A突变型CVB3的示意图。展示了野生型和突变株的序列。(B)采用甲基化RNA免疫沉淀定量聚合酶链反应(MeRIP - qPCR)评估野生型(WT)和m⁶A突变型CVB3的RNA m⁶A修饰情况。通过m⁶A免疫沉淀(IP)/输入和免疫球蛋白G(IgG)IP/输入计算每组中m⁶A的富集情况。* p < 0.05，** p < 0.01。(C)感染后4、24、36和48小时的病毒滴度(噬斑形成单位/毫升，PFU/mL)。用CVB3野生型(WT)或m⁶A突变株感染HeLa细胞，并在感染后的指定时间收集上清液，以PFU为单位测量病毒滴度。p < 0.05。
4. 讨论
m⁶A修饰是一种重要的转录后调控机制，在多种病毒的复制过程中发挥着重要作用。在此，我们通过SRAMP分析预测CVB3基因组含有m⁶A修饰，并且m⁶A修饰抑制剂3 - DAA可显著抑制CVB3的复制。此外，我们的研究结果表明，在CVB3感染期间，甲基转移酶样3(METTL3)和甲基转移酶样14(METTL14)可促进CVB3的复制；然而，脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO)和 AlkB同源蛋白5(ALKBH5)则具有相反的作用。我们还发现，m⁶A阅读蛋白YTH结构域家族蛋白1(YTHDF1)、YTHDF2和YTHDF3通过影响CVB3 RNA的表达来促进CVB3的复制。最后，我们观察到CVB3的m⁶A突变体在m⁶A位点突变后抑制了CVB3的复制。综上所述，我们的研究结果表明m⁶A修饰在CVB3的复制过程中起着重要作用。
几十年来，人们已在病毒基因组中发现了m⁶A，但直到近年来，m⁶A修饰的调控功能才得到认可[33,34]。m⁶A修饰会影响病毒的复制，并对感染结果产生重大影响。多项研究报告称，人类免疫缺陷病毒(HIV)[35]、甲型流感病毒(IAV)[36]、丙型肝炎病毒(HCV)[24]、寨卡病毒(ZIKV)[37]和肠道病毒71型(EV71)[22]等病毒的基因组中存在m⁶A修饰。因此，我们利用在线生物信息学工具SRAMP来研究CVB3 RNA是否存在m⁶A修饰。结果显示，CVB3基因组也存在m⁶A修饰，这与其他病毒的情况相似。进一步的研究需要使用MeRIP - seq来确认CVB3基因组中的m⁶A位点。
相关研究表明，病毒感染会改变m⁶A相关蛋白的表达模式[22,38]。我们观察到，与未感染的HeLa细胞相比，METTL3和METTL14的蛋白水平略有下降，而YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3的蛋白水平明显下降。CVB3感染后，METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5和YTHDF3从细胞核扩散到细胞质。然而，CVB3感染后YTHDF1和YTHDF2的亚细胞定位未发生改变。这些结果表明，CVB3感染改变了m⁶A相关蛋白的表达和亚细胞定位，这作为CVB3复制的潜在机制值得深入研究。我们检测了CVB3 VP1与m⁶A相关蛋白的共定位情况。作为一种RNA病毒，CVB3在细胞质中复制，m⁶A相关蛋白的转移表明CVB3 RNA可能发生m⁶A甲基化，并且CVB3的复制可能受m⁶A修饰的调控。
m⁶A修饰在病毒感染过程中发挥着促进病毒或抑制病毒的作用，并且可以正向调节甲型流感病毒(IAV)[30]、肠道病毒71型(EV71)[27]和人偏肺病毒(HMPV)[39]的复制；负向调节丙型肝炎病毒(HCV)[24]和寨卡病毒(ZIKV)[37]的复制；以及对人类免疫缺陷病毒(HIV)[35,40 - 42]和人呼吸道合胞病毒(HRSV)[42,43]的复制起正负双向调节作用。在本研究中，我们发现3 - DAA抑制m⁶A水平可显著降低CVB3的RNA拷贝数、VP1蛋白表达和病毒滴度。我们观察到，敲低m⁶A“写入器”蛋白METTL3和METTL14也有相同的效果，而敲低m⁶A“擦除器”FTO和ALKBH5则通过影响CVB3 mRNA合成、蛋白合成和病毒释放来促进CVB3的复制。这些结果表明，m⁶A修饰可能在CVB3感染中发挥促进病毒的作用。此外，我们观察到YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3通过影响CVB3 mRNA合成来调节CVB3的复制。这些结果与近期关于m⁶A机制正向调节IAV、EV71和HMPV的报道一致。此外，其他m⁶A相关蛋白的影响还需要进一步研究。
此外，在CVB3基因组中的m⁶A位点发生突变后，我们观察到与野生型(WT)基因组相比，CVB3基因组中的m⁶A修饰导致病毒滴度和相对m⁶A水平显著降低。这些结果与肠道病毒71型(EV71)和甲型流感病毒(IAV)的情况相似。这些结果还表明，CVB3基因组中第4518位核苷酸的m⁶A修饰会影响病毒颗粒的释放。因此，CVB3基因组中的m⁶A修饰在CVB3复制中起着重要作用。
5. 结论
综上所述，我们的研究结果表明， 修饰对柯萨奇B3病毒(CVB3)的复制具有正向调控作用。与 相关的蛋白质在CVB3复制过程中，通过影响CVB3的mRNA合成、蛋白质合成和病毒释放发挥不同的作用。然而，其潜在的调控机制仍有待进一步探索。例如，与CVB3复制相关的过程可能会受到CVB3基因组的 修饰的影响。本研究为治疗CVB3感染引起的传染病提供了实验依据和治疗靶点。
补充材料:以下支持信息可从以下链接下载:https://www.mdpi.com/article/10.3390/v16091448/s1，图S1:m6A甲基化抑制剂3 - DAA抑制HeLa细胞中CVB3的复制；图S2:通过蛋白质印迹法检测HeLa细胞中METTL3(A)和METTL14(B)的敲低效率；图S3:通过蛋白质印迹法检测HeLa细胞中FTO(A)和ALKBH5(B)的敲低效率；图S4:通过蛋白质印迹法检测HeLa细胞中YTHDF1(A)、YTHDF2(B)和YTHDF3的敲低效率；表S1:CVB3 RNA的N6 - 甲基腺苷 修饰位点预测。
作者贡献:概念构思和监督，X.C.和S.C.；资金获取，Y.Z.、H.Q.和S.C.；初稿撰写，Y.Z.、Y.C.和H.Q.；数据整理，Z.G.、W.W.和B.Z.；论文审核和编辑，J.S.、Y.Z.、X.C.和S.C.；可视化处理，W.W.和H.Z.。所有作者都已阅读并同意发表该论文的版本。
资金支持:本研究得到了河北省科技计划项目(20277705D)、河北省自然科学基金(H2020206352)、河北省教育厅科技项目(QN2018150)、河北省医学科学研究项目(20220973)和河北省中医药研究项目(2021119)的资助。
伦理委员会声明:不适用。
知情同意声明:不适用。
数据可用性声明:本文提供了所有相关数据。
利益冲突声明:作者声明无利益冲突。
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