太空探索技术公司(SpaceX)第19次商业补给服务任务(CRS - 19)RRRM - 1:太空飞行通过表观遗传触发因子诱导皮肤基因组可塑性
发布时间：
2025-03-29 18:06
太空探索技术公司(SpaceX)第19次商业补给服务任务(CRS - 19)RRRM - 1:太空飞行通过表观遗传触发因子诱导皮肤基因组可塑性
图形摘要
要点
- 暴露于太空环境会导致全基因组适应性表观遗传变化
- 太空暴露引起的全基因组适应性变化仅在部分“响应型”小鼠中出现
- 在太空中，全基因组表观遗传变化标志着基因组可塑性的诱导
- 太空暴露小鼠的全基因组低甲基化导致适应性基因表达
作者
卡纳海亚·辛格(Kanhaiya Singh)，普里扬卡·维尔马(Priyanka Verma)
拉杰尼什·斯里瓦斯塔瓦(Rajneesh Srivastava)，……，阿夫申·贝赫什蒂(Afshin Beheshti)
莉兹·沃伦(Liz Warren)，钱丹·K·森(Chandan K. Sen)
通讯方式
singhk@pitt.edu(卡纳海亚·辛格)
c.k.sen@pitt.edu(钱丹·K·森)
简而言之
组织学；太空医学；表观遗传学；空间科学
文章
太空探索技术公司(SpaceX)CRS - 19任务RRRM - 1太空飞行通过表观遗传触发诱导皮肤基因组可塑性
坎海亚·辛格(Kanhaiya Singh)， 普里扬卡·维尔马(Priyanka Verma)， 拉杰尼什·斯里瓦斯塔瓦(Rajneesh Srivastava)， 亚希卡·拉斯塔吉(Yashika Rustagi)， 马尼谢卡尔·库马尔(Manishekhar Kumar)， 苏米特·S·维尔马(Sumit S. Verma)， 苏吉特·莫汉蒂(Sujit Mohanty)， 阿夫申·贝赫什蒂(Afshin Beheshti)， 莉兹·沃伦(Liz Warren)， 和钱丹·K·森(Chandan K. Sen)
美国宾夕法尼亚州匹兹堡市匹兹堡大学医学院外科系麦高恩再生医学研究所太空生物医学中心
美国印第安纳州印第安纳波利斯市印第安纳大学医学院外科系印第安纳再生医学与工程中心
美国得克萨斯州休斯顿市太空科学促进中心
主要联系人
*通信方式:singhk@pitt.edu(坎海亚·辛格)，c.k.sen@pitt.edu(钱丹·K·森)
https://doi.org/10.1016/j.isci.2024.111382
摘要
基因组可塑性有助于生物适应极端环境条件。我们检验了暴露于太空环境(ESE)会影响表观基因组从而诱导基因组可塑性这一假设。我们从国际空间站(ISS)国家实验室获取了啮齿动物研究参考任务 - 1中的小鼠皮肤样本。通过靶向RNA测序来检测暴露于太空环境的皮肤与地面对照组皮肤之间的基因差异表达，结果显示，在有反应的样本中，血管内皮生长因子(VEGF)介导的血管生成途径因启动子低甲基化而上调。甲基化组测序确定了对太空环境敏感的低甲基化基因，包括发育性血管生成基因Araf、Vegfb和Vegfr1。根据差异表达基因，有反应的样本中血管生成生物功能得到富集。如本文所述，对太空环境暴露的反应而诱导的基因组可塑性，可被视为生物恢复力的一种标志，这种标志在少数暴露于相同应激源的生物(有反应者)中明显存在，而在无反应者中则不存在。可诱导的基因组可塑性可能与对太空环境暴露的自然恢复力有关。
引言
基因组可塑性表现为细胞和组织的可塑性，为哺乳动物适应极端环境条件奠定了基础。 在新达尔文主义理论中，适应是对相对缓慢积累的遗传变异进行选择的结果。然而，如果可选择的或可塑性的表型变异是由基因表达的表观遗传差异产生的，那么更快速的适应性反应是可能的。 在没有遗传变化的情况下，表观遗传改变可以影响基因表达。 这些表观遗传变化可以独立于DNA序列调节基因组活性，并且具有有丝分裂稳定性。 如果产生表型变异的表观遗传信号可以遗传，它们就可以成为适应性进化变化的基础。 基于表观遗传学的快速适应性反应是可能的，因为DNA甲基化导致的表观遗传突变率已被证明比基因突变率高出几个数量级。 理论研究表明，种群可能在基因突变开始积累之前通过表观遗传变异对环境做出反应。表观遗传调控与遗传过程协同作用，使生物体在生理上适应其生存和繁殖的外部环境，为生物体应对不断变化的环境条件提供了一种潜在机制。 诸如DNA甲基化之类的表观遗传变异在大多数物种中都存在，并且在种群之间很常见。
决定人类健康、疾病和生存的生命过程极限，主要是通过在地球地面条件下进行的研究得出的。基于对地面条件下生理学的这种理解，目前设定了生物学的概念极限。我们目前对再生和修复生物学极限的理解也由此确定。在高海拔和海底等极端环境条件下的研究告诉我们，基因组可塑性与适应环境变化的能力有关。 基因组可塑性转化为组织可塑性，并表现为功能适应性，因此与标准地面条件下的已知情况相比，拓展了生物学极限。基因组可塑性中反应最迅速的部分表现为表观遗传变化。在重编程过程中，为了获得可塑性，细胞会重置其DNA甲基化模式和组蛋白翻译后修饰模式，并失去它们的“表观遗传记忆”。10有趣的是，个体中的这种表观遗传变化在太空中更为活跃。 DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制，它积极调节基因表达并维持基因组的完整性。在当前的研究中，我们检验了一个假设，即暴露于太空环境(ESE)会通过DNA低甲基化显著影响表观基因组，从而(图例续下一页)在有反应的个体中诱导啮齿动物的基因组可塑性。无反应的个体无法对太空环境暴露引发的适应性信号做出反应。
图1. 太空环境暴露(ESE)诱导小鼠皮肤产生干性
(A)总研究样本:来自啮齿动物研究8号任务(也称为啮齿动物研究参考任务1)的小鼠皮肤样本是从国际空间站(ISS)国家实验室获取的。在国际空间站的动物饲养舱中飞行的小鼠被归类为太空环境暴露(ESE)组(n = 17)。在类似饲养条件下饲养的地面小鼠(地面对照组； )用作对照。图片由BioRender创建。Kanhaiya, K. (2024) https:// BioRender.com/q43i834。
结果
太空环境暴露(ESE)诱导小鼠皮肤产生干性
来自啮齿动物研究8号任务(也称为啮齿动物研究参考任务1)的小鼠皮肤样本是从国际空间站(ISS)国家实验室获取的。小鼠在国际空间站上一个已建立的啮齿动物栖息地 中飞行 (图1A)。在类似饲养条件下饲养的地面小鼠(地面对照组； )用作对照(图1A)。使用DE - seq2软件鉴定差异表达基因，然后使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件识别两组之间的通路变化。共鉴定出1498个可用于分析的差异表达转录本( 值 )(图1B和图1C；表S1)。对太空环境暴露组皮肤样本中的差异表达转录本进行比较后发现，859个(57.3%)转录本上调，而639个(42.7%)转录本下调(图1C)。使用IPA软件对太空环境暴露组中高表达的差异表达基因进行经典通路富集分析(图1D)。所呈现的经典通路被确定为(1)DNA甲基化，(2)胚胎干细胞(ESC)多能性，(3)血管内皮生长因子(VEGF)信号传导，(4)缺氧诱导因子 (HIF1 )信号传导，以及(5)沉默调节蛋白信号传导通路(图1D)。在胚胎干细胞多能性通路中上调的基因包括激活素A受体1型(Acvr1)、 -连环蛋白1(Ctnnb1)、核受体亚家族5组A成员2(Nr5a2)、神经营养受体酪氨酸激酶3(Ntrk3)、蛋白激酶D1(Prkd1)、端粒酶逆转录酶(Tert)和Wnt家族成员6(Wnt6)(表S2)。基于差异表达基因预测上调的生物学功能包括胚胎干细胞多能性、细胞自我更新和胚胎干细胞增殖(图1E)。
太空环境暴露(ESE)中5 - 甲基胞嘧啶水平的二分法:有反应者和无反应者
对差异表达转录本的IPA(Ingenuity Pathway Analysis，英吉尼亚通路分析)分析确定，DNA甲基化是小鼠皮肤暴露于ESE(环境模拟暴露)后显著富集的主要经典通路(图1C)。因此，对DNA甲基化进行了后续研究。这些研究发现，对ESE暴露的反应是二分的，因此根据整体甲基化水平确定了两个不同的组——无反应组和反应组。在反应组而非无反应组中，5 - 甲基胞嘧啶(5 - mC；DNA甲基化的标志物)水平急剧降低(图2A和2B；表S3)。通常情况下，5 - mC水平降低表示DNA去甲基化，与相应基因表达的诱导有关。 免疫组织化学研究表明，ESE诱导的5 - mC降低效应仅限于特定的E - 钙黏蛋白 上皮细胞和F4/80 髓系细胞区室(图2C和2D)。内皮细胞(PECAM1 )区室不参与这种表观遗传调控(图2E)。为了了解观察到的整体甲基化变化对特定基因和相关通路的影响，采用了无偏DNA甲基化(甲基化组)测序方法(表S4)。
ESE在反应组中诱导全基因组低甲基化
使用简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)进行的成对比较确定了具有统计学意义的差异甲基化区域(DMRs)，q值截断值 且甲基化差异高于25%。与基础对照组相比，反应组ESE队列中的低甲基化DMRs数量(1278个)是无反应组ESE队列(590个)的两倍多(q值截断值<0.01且甲基化差异>25%)(图3A - )。与无反应组直接比较时，反应组中也观察到低甲基化DMRs数量增加(图S1A - S1C)。有趣的是，反应组和无反应组ESE队列之间的这种差异甲基化事件并不局限于任何特定的基因组区域或染色体，这表明存在全基因组去甲基化过程(图3I、3J和S1D)。对反应组中差异基因通路的IPA分析确定了三个显著低甲基化的主要经典通路。与基础对照组或无反应组ESE队列相比，反应组中的核因子 B(NF - B)、HIF - 1 和衰老通路发生了低甲基化(图4A - 4D和S1E)。对上述通路中富集的候选基因的鉴定显示，发育性血管生成基因，如FMS样酪氨酸激酶1(Flt1，也称为血管内皮生长因子受体[Vegf - R1])、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶A - Raf(Araf)和Vegfb在反应组ESE队列中发生了低甲基化(图4E和4F)。已知候选基因的这种低甲基化会在陆地条件下引起适应性变化(例如，血管生成)。 相反，Flt1启动子的高甲基化与VEGF通路基因的表达和功能降低相关，从而损害血管生成。 为了进一步了解这种低甲基化对基因表达的功能影响，使用IPA软件中的疾病和功能分析工具分析了无反应组和反应组之间的差异表达基因(DEGs)。无反应组小鼠与肌肉功能和收缩力丧失、突触发育过程受损、脂肪减少有关
(B) 为了量化ESE组小鼠皮肤( )与基础对照组( )之间的转录差异，进行了靶向RNA测序。使用英吉尼亚通路分析(IPA)软件共鉴定出1498个分析就绪的差异表达转录本(p值 0.05)。火山图和(C)维恩图显示了ESE组皮肤样本中差异表达基因(DEG)的比较情况，859个(57.3%)转录本上调，而639个(42.7%)转录本下调。
(D) 使用Ingenuity Pathway Analysis (IPA)软件对在ESE组中高表达的差异表达基因(DEGs)进行经典通路富集分析。所呈现的经典通路被确定为(1)DNA甲基化，(2)胚胎干细胞多能性，(3)血管内皮生长因子(VEGF)信号通路，(4)低氧诱导因子1(HIF1) 信号通路，以及(5)沉默调节蛋白(Sirtuin)信号通路。
(E) IPA生成的通路图展示了参与人类胚胎干细胞(ESC)多能性通路的候选基因。在ESE组皮肤样本中预测上调的生物功能包括ESC多能性、细胞自我更新和ESC增殖。另见图S5以及表S1和表S2；n代表动物数量。
图360 e360|> 关于此图的图360作者展示，请访问https://doi.org/10.1016/j.isci.2024.111382。
(下一页图例)与有反应者相比，无反应者存在酸代谢异常和肌病功能增强的情况(图S2)。有反应者更具恢复能力。后续的免疫组织化学研究证实，有反应者组织中相应蛋白质的表达确实上调。
ESE诱导的启动子低甲基化增加了血管生成基因的表达
全基因组简化代表性重亚硫酸盐测序(RRBS)甲基化组分析显示，发育性血管生成标志物如Flt1和Araf在所有三个主要基因组区域(即启动子、外显子和内含子)均发生低甲基化。与地面对照组单独比较时，在有反应的ESE队列中，Araf基因发生了显著的ESE诱导低甲基化(41.2%)，而无反应队列中为29.4%(图5A - 5C和图S3)。这种低甲基化与有反应的ESE队列中RAF原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(ARAF)蛋白表达增加有关(图5D)。使用靶向亚硫酸氢盐测序研究其他关键血管生成基因Flt1和血管内皮生长因子B(Vegfb)时，也观察到了类似的低甲基化趋势(图6A - 6C和图S4A - S4C)。基于差异表达基因，与无反应者(激活 得分 )相比，有反应者的血管生成生物功能得到富集(激活 得分 )。上游调控因子分析预测，与无反应者(激活 得分 )相比，有反应者中血管内皮生长因子(VEGF)被激活(激活 得分 )(图6D)。综上所述，这两组高通量基因组分析(RRBS和mRNA测序)证明了VEGF介导的血管生成通路上调，并且在有反应的ESE队列中被激活。
讨论
在地球存在的38亿年时间尺度上，两足类人猿在700万年的时间里进化而来。 啮齿动物在地球上估计已经存在了1亿年。 正是在这段时间里，地球上的进化产生了适应地球生命的表型。发育可塑性，即对自然选择具有适应性和响应性，使得生物能够从相同的基因型资源中做出不同的表型选择。进化和生态力量决定了生物类群的表型。如果这就是我们今天所知的陆地生理学的基础，那么问题是，生命在暴露于极端生活条件(无论是陆地还是外星)时，能多快地重新调整。对于适应陆地生活的生命形式来说，太空是一个充满敌意的环境。 为了应对外星条件，陆地生物必须在呼吸和代谢过程、肌肉和骨骼组成以及体重方面进行重大适应。 在人类中，这种对极端太空环境(ESE)的适应涉及一系列基因组和表观基因组变化。 除了这些短期影响外，ESE显然还有可能影响进化生物学。 身体对这种生存需求做出响应的能力是衡量恢复力的一个指标。
目前空间生物学的研究主要集中在与地球生活相比身体结构和功能的丧失方面。具体例子包括骨量和肌肉量的流失、心血管系统功能减退、免疫调节失调以及新陈代谢的变化。尽管这些变化被广泛归类为“不适应”，但必须认识到，这些变化只是身体适应过程的部分体现，因为身体试图在极端空间环境(ESE)条件下的宇宙飞船中生存。我们很少关注在身体试图应对和适应外星条件时，与上述“不适应”同时可能出现的身体功能增强情况。为了理解身体在太空环境下发生的适应性变化的重要性，我们必须摒弃任何偏离地球生活常态就是不适应和病态的假设，采用一种不同的视角。本文报道的，生物体对极端空间环境(ESE)做出反应而产生的基因组可塑性，可被视为生物适应能力的一种标志，这种适应能力在少数暴露于相同压力源的生物体中表现明显。
众所周知，暴露于极端空间环境(ESE)会导致不同个体出现不同的生物学结果。例如，不同个体的骨量或体重流失情况各不相同。 同一基因型在不同环境条件下产生不同表型的能力，这一概念在进化生物学中已被普遍接受。反应规范定义了基因型在环境梯度上所表达的表型范围。 本研究中出现的极端空间环境(ESE)反应者 - 非反应者模式支持这样一种观点，即在基因型相近的近交系小鼠中，基因组对极端空间环境(ESE)的可塑性敏感性可能存在很大差异。从超过12000名申请成为宇航员的人中，美国国家航空航天局(NASA)挑选了10人作为宇航员候选人，并使其具备飞行资格。这种选拔过程能否有效识别那些能自然诱导基因组对极端空间环境(ESE)产生可塑性反应的人，还有待进一步研究。此外，这种对极端空间环境(ESE)的自然适应能力，对于像载人火星任务这样的长期太空任务而言，在选拔参与此类项目的宇航员时具有至关重要的价值。
图2. 极端空间环境(ESE)反应者和非反应者中5 - 甲基胞嘧啶水平的二分法
(A) 使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒测量的5 - 甲基胞嘧啶(5mC)百分比，数据来自(i)地面对照组(n = 18)和极端空间环境(ESE)组(n = 17)；(ii)根据5mC百分比，极端空间环境(ESE)组进一步分为反应者ESE亚组(n = 4)和非反应者ESE亚组(n = 13)。数据以平均值 标准差(SD)表示。 ；采用单因素方差分析(one - way ANOVA)，随后进行Tukey多重比较检验。
(B) 使用ELISA试剂盒测量的地面对照组、上述反应者ESE亚组(n = 4)和非反应者ESE亚组中5 - 羟甲基胞嘧啶(5hmC)的百分比 。数据以平均值 标准差(SD)表示。
(C) 对地面对照组 、反应者ESE亚组 和非反应者ESE亚组( )中 - 钙黏蛋白共定位的免疫组织化学(IHC)分析。共定位系数以平均值 标准误(SEM)表示。* ；采用单因素方差分析(one - way ANOVA)，随后进行Tukey多重比较检验。
(D) 对地面对照组 、反应者ESE亚组 和非反应者ESE亚组 中5mC + / F4 / 80 + 共定位的免疫组织化学(IHC)分析。共定位系数以平均值 标准误(SEM)表示。* ；采用单因素方差分析(one - way ANOVA)，随后进行Tukey多重比较检验。比例尺， 。
(E)对地面对照组(n = 6)、ESE应答组(n = 4)和ESE非应答组(n = 6)中5-甲基胞嘧啶阳性(5mC+)/血小板内皮细胞黏附分子阳性(CD31+)共定位情况进行免疫组织化学(IHC)分析。共定位系数以平均值±标准误( SEM)表示。比例尺为 。另见附表S3。n表示动物数量。(图例续于下一页)
图3. ESE诱导应答者全基因组低甲基化
(A)ESE非应答组( )与地面对照组( )总甲基化区域的火山图。在总共鉴定出的79487个差异甲基化区域(DMR)中，有1037个显著DMR(差异甲基化的q值小于0.01且差异至少为25%)被鉴定出来。在这1037个显著DMR中，ESE应答组中有590个呈低甲基化，447个呈高甲基化。
(B)对(A)中鉴定出的显著DMR进行聚类热图分析并生成热图。
美国国家航空航天局(NASA)双胞胎研究报告了对实际或模拟太空飞行环境(ESE)的表观遗传变化。 在飞行条件下的CD4细胞区室中，报告了全基因组平均甲基化水平的细微下降。飞行中与飞行前局部甲基化变化的比较显示，参与血小板衍生生长因子(PDGF)通路反应的基因出现富集。此外，暴露于ESE的宇航员在返回后的几天内血浆血管内皮生长因子(VEGF)水平升高，并在返回后6个月持续升高。综上所述，ESE使血管生成基因去甲基化，从而增强其表达。这些发现与本研究的总体结果一致。血管系统似乎对ESE特别敏感。 血液重新分布被广泛认为是对微重力的急性期反应。 在微重力环境下，地球上脚部动脉压力最高、头部动脉压力最低的模式被打破，因此对血管系统提出了应对要求。 血管系统对微重力的功能适应包括通过激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)-内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路来上调一氧化氮合酶(NOS)并随后合成一氧化氮(NO)。 这些基因表达的变化可归因于长期暴露于ESE后DNA甲基转移酶家族成员(DNMT1、3a和3b)丰度的降低以及十一-十一易位(TET)家族蛋白(TET1、2和3)水平的升高，这反过来又诱导启动子低甲基化。 在本研究中，在ESE应答组中观察到低甲基化诱导的血管内皮生长因子(Vegf)和Fms相关酪氨酸激酶1(Flt1)基因表达增加。已知这些基因通过PI3K-Akt-eNOS通路发出信号。
这是关于RRRM - 1任务的首批报告之一，为未来关于该任务的文献提供了背景。由于本文呈现的数据来自雌性，因此未捕捉到性别特异性差异。某些DNA甲基化模式、甲基转移酶水平以及其他表观遗传调节因子可能因性别而异。 为解决这一局限性，利用美国国家航空航天局太空生命开放科学知识库(基因实验室编号:GLDS - 239；https://doi.org/10.26030/s7k9 - 7958)对日本宇宙航空研究开发机构(JAXA)MHU - 2任务中雄性小鼠的股部皮肤进行了额外分析。与雌性小鼠类似，在雄性小鼠中也观察到了预测的生物学功能上调，如胚胎干细胞(ESC)多能性、细胞自我更新和ESC增殖(图S5A)。在ESE作用下，雄性小鼠中其他出现类似上调的通路包括VEGF信号通路、缺氧诱导因子(HIF)信号通路和沉默调节蛋白信号通路(图S5B)。这些观察结果为未来在人类中研究这一模式奠定了基础。
将基因组可塑性理解为极端太空环境(ESE)的函数这一更大目标，可能会确定哺乳动物适应性生理的极限。因此，将会出现一种范式，即我们对哺乳动物生理学及其应对压力能力的理解将发生转变。这将为梳理出诱导快速表观遗传变化的极端太空环境(ESE)的特定变量和组成部分，并将有关组织可塑性的知识转化为治疗策略奠定基础。在科学前沿，我们可能会发现决定身体功能极限的细胞状态和命运。未来的研究将采用单细胞RNA测序和空间转录组学研究等工具，以深入了解组织和器官生物学。在转化应用方面，再生疗法将从本研究的发现中获得灵感。
研究的局限性
本研究的局限性包括样本量相对较小，以及与飞行中样本的收集和回收相关的明显挑战 诸如微重力、太空辐射暴露、心理压力、营养和运动等影响因素无法单独分离和测试，因此本研究中所研究的极端太空环境(ESE)涉及众多起作用的变量，从微重力等已知因素到有待确定的极端太空环境(ESE)因素。出于本研究的目的，分离这些起作用的变量并非关注重点，因此我们将极端太空环境(ESE)视为一个综合变量。
资源可用性
主要联系人
有关资源和试剂的进一步信息及请求应直接联系主要联系人Chandan K Sen(c.k. sen@pitt.edu)，他将予以提供。
材料可用性
本研究未产生新的独特试剂。
数据和代码可用性
生成的批量RNA测序和RRBS甲基化数据已存入基因表达综合数据库(GEO)，登录号分别为GSE268753和GSE268755。本文未报告任何原创代码。分析本文所报告数据所需的任何额外信息，可应要求从主要联系人处获取。
(C) 饼图显示了比较中高甲基化和低甲基化区域的百分比。在1037个显著的差异甲基化区域(DMRs)中，有590个(56.89%)在有反应的极端太空环境(ESE)组中呈低甲基化，447个(43.11%)呈高甲基化。
(D) 与地面对照组相比，无反应的极端太空环境(ESE)组中各染色体的低甲基化和高甲基化区域百分比以柱状图形式呈现。(E) 有反应的极端太空环境(ESE)组( )与地面对照组( )相比的差异甲基化区域(DMRs)火山图。在总共鉴定出的82489个差异甲基化区域(DMRs)中，鉴定出1987个显著的差异甲基化区域(q值小于0.01且差异至少为25%的差异甲基化区域)。在1987个显著的差异甲基化区域(DMRs)中，有1278个在有反应的极端太空环境(ESE)组中呈低甲基化，709个呈高甲基化。
(F) 有反应的极端太空环境(ESE)组( )与地面对照组( )相比的显著差异甲基化区域(DMRs)聚类热图。对1987个显著的差异甲基化区域(q值小于0.01且差异至少为25%的差异甲基化区域)进行聚类，并生成热图。
(G) 饼图显示了比较中高甲基化和低甲基化区域的百分比。在1987个显著的差异甲基化区域(DMRs)中，有1278个(64.32%)在有反应的极端太空环境(ESE)组中呈低甲基化，709个(35.68%)呈高甲基化。
(H) 与地面对照组相比，有反应的极端太空环境(ESE)组中各染色体的低甲基化和高甲基化区域百分比以柱状图形式呈现。(I) 条形图显示了无反应组中差异甲基化区域(DMRs)的基因组分布百分比(外显子、内含子、启动子或基因间区域)，(J) 有反应的极端太空环境(ESE)组中差异甲基化区域(DMRs)的基因组分布百分比。另见图S1和图S2，表S4。n代表动物数量。
图4. 极端太空环境(ESE)诱导的启动子低甲基化增加了血管生成基因的表达
(A) 条形图显示，与地面对照组(n = 6)相比，有反应的ESE队列(n = 4)中外显子、内含子和启动子区域注释的显著差异甲基化区域(DMR)。(B) 条形图显示，与地面对照组(n = 6)相比，无反应的ESE队列(n = 6)中外显子、内含子和启动子区域注释的显著DMR。(C) 使用Ingenuity通路分析(IPA)的比较分析功能，与地面对照组 相比，有反应的ESE队列( )中外显子、内含子和启动子区域注释的DMR富集的经典通路。
(D) IPA生成的无反应ESE队列(n = 6)中，与地面对照组 相比，外显子、内含子和启动子区域注释的DMR富集的经典通路。
(E) 热图显示，与地面对照组 相比，有反应的ESE队列(n = 4)中参与NF - κB通路的基因表达模式，以及(F) HIF1或其他通路的基因表达模式。n代表动物数量。
图5. ESE诱导的基因低甲基化增加了血管生成基因的表达
(A) 对地面对照组、有反应的ESE队列和无反应的ESE队列中Araf基因甲基化状态的靶向验证。基因组轨迹显示Araf基因座(顶部)。代表性的DNA甲基化轨迹(底部)显示，与无反应的ESE皮肤或对照皮肤相比，有反应的ESE皮肤中甲基化CpG的水平降低。基因组轨迹的完整图像也显示在图S3中。
(B) 维恩图显示，与地面对照组 相比，有反应的ESE队列(n = 4)中Araf基因低甲基化(蓝色)和高甲基化(红色)CpG的百分比，以及(C) 与地面对照组 相比，无反应的ESE队列 中Araf基因低甲基化和高甲基化CpG的百分比。
(D) 对地面对照组、ESE有反应者和ESE无反应者(n = 3)中ARAF强度的免疫组织化学(IHC)分析。共定位系数在图像上表示为平均值 ± 标准误。* ；有反应的ESE组与地面对照组相比；采用单因素方差分析，随后进行Tukey多重比较检验。比例尺，20 µm。n代表动物数量。
致谢
K.S.的研究项目得到了美国国防部拨款W81XWH - 22 - 1 - 0146和HT94252410131；美国国立卫生研究院(NIH)R01拨款DK136814 - 01；以及宾夕法尼亚州联邦政府拨款的支持。C.K.S.的研究项目得到了NIH - R01拨款DK128845、DK141513、DK135447和DK125835的支持。
作者贡献
K.S.、P.V.和C.K.S.设计了该研究。K.S.、P.V.、Y.R.、M.K.、S.V.、S.M.和R.S.参与了实验及相关数据分析。K.S.和C.K.S.撰写了手稿。L.W.和A.B.审阅并编辑了手稿。所有作者都阅读并批准了最终手稿。
利益声明
作者声明无利益冲突。
写作过程中生成式人工智能和人工智能辅助技术的声明
在撰写本文的过程中，作者使用Dall E3生成了图形摘要的示意图。使用该工具后，作者使用Adobe Photoshop对内容进行了审阅和编辑，并对出版物的内容承担全部责任。
图6. ESE诱导的启动子低甲基化增加了有反应者中血管内皮生长因子(VEGF)介导的血管生成通路
(A) 对地面对照组、有反应的ESE队列和无反应的ESE队列中Vegfb基因启动子甲基化状态进行靶向验证。基因组轨迹显示Vegfb基因座(顶部)。代表性的DNA甲基化轨迹(底部)显示，与无反应的ESE皮肤或对照皮肤相比，有反应的ESE皮肤中甲基化CpG的水平降低。
(B) 维恩图显示了有反应的ESE队列(n = 4)与地面对照组 相比，以及(C)无反应的ESE队列 与地面对照组 相比，Veg/fb基因中低甲基化(蓝色)和高甲基化(红色)CpG的百分比。
(D) 为了量化有反应的ESE队列小鼠皮肤与地面对照组之间的转录差异，进行了靶向RNA测序。使用IPA对有反应的ESE队列中高表达的差异表达基因(DEGs)进行上游调控因子预测分析。VEGF信号通路中的候选基因在有反应的ESE队列中富集。另见图S4、表S5。n表示动物数量。
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本文的在线版本提供了详细方法，包括以下内容:
- 关键资源表
- 实验模型和研究参与者详情
- 小鼠皮肤样本
- 方法详情
- RNA测序与分析
- 简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)分析
- 英吉尼蒂通路分析(IPA)
- 靶向亚硫酸氢盐测序
- 5-甲基胞嘧啶(5-mc)和5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)酶联免疫吸附测定(ELISA)
- 组织学和免疫组织化学(IHC)
- 量化与统计分析
补充信息
补充信息可在https://doi.org/10.1016/j.isci.2024.111382 在线获取。
接收日期:2024年6月6日
修订日期:2024年10月11日
接受日期:2024年11月11日
发表日期:2024年11月14日
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导致糖尿病血管病变。《分子治疗》(Mol. Ther.)25，2689 - 2704。https:// doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.09.009。
57. 辛格(Singh)，K.，辛哈(Sinha)，M.，帕尔(Pal)，D.，塔巴苏姆(Tabasum)，S.，尼亚瓦利(Gnyawali)，S.C.，科纳(Khona)，D.，萨卡尔(Sarkar)，S.，莫汉蒂(Mohanty)，S.K.，索托 - 冈萨雷斯(Soto - Gonzalez)，F.，坎纳(Khanna)，S.等(2019年)。皮肤上皮 - 间充质转化激活因子ZEB1以血糖状态依赖的方式调节伤口血管生成和愈合
。《糖尿病》(Diabetes)68，2175 - 2190。https://doi.org/10.2337/ db19 - 0202。
58. 拉斯塔吉(Rustagi)，Y.，阿布哈舍姆(Abouhashem)，A.S.，维尔马(Verma)，P.，维尔马(Verma)，S.S.，埃尔南德斯(Hernandez)，E.，刘(Liu)，S.，库马尔(Kumar)，M.，古达(Guda)，P.R.，斯里瓦斯塔瓦(Srivastava)，R.，莫汉蒂(Mohanty)，S.K.等(2022年)。内皮磷脂酶Cγ2(Endothelial Phospholipase Cgamma2)改善血管内皮生长因子(VEGF)治疗后糖尿病缺血性肢体挽救的效果。《糖尿病》(Diabetes)71，1149 - 1165。https://doi.org/10.2337/db21 - 0830。
明星★方法
关键资源表
| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
| 抗体 | ||
| 抗5-甲基胞嘧啶抗体(兔单克隆抗体) | 细胞信号技术公司(Cell Signaling Technology) | 产品编号:28692S；研究资源识别符(RRID):AB 2798962 |
| 抗5-羟甲基胞嘧啶抗体(兔单克隆抗体) | 艾博抗公司(Abcam) | 产品编号:ab214728；研究资源识别符(RRID):AB_2797407 |
| 抗E-钙黏蛋白抗体(大鼠单克隆抗体) | 赛默飞世尔科技公司(Invitrogen) | 产品编号:13 - 1900；研究资源识别符(RRID):AB_2533005 |
| 抗CD31抗体(大鼠单克隆抗体) | BD生物科学公司(BD Pharmingen) | 产品编号:550274；研究资源识别符(RRID):AB 393571 |
| 抗F4/80抗体(大鼠单克隆抗体) | 伯乐公司(Bio - Rad) | 产品编号:MCA497R；研究资源识别符(RRID):AB 323279 |
| 抗ARAF抗体(兔多克隆抗体) | 武汉三鹰生物技术有限公司(Proteintech Group) | 产品编号:22129 - 1 - AP；研究资源识别符(RRID):AB_2879001 |
| Alexa 568标记的抗绵羊抗体 | 赛默飞世尔科技公司(Invitrogen) | 产品编号:A - 21099；研究资源识别符(RRID):AB 2535753 |
| Alexa 568标记的抗大鼠抗体 | 艾博抗公司(Abcam) | 产品编号:ab175476；研究资源识别符(RRID):AB 2813739 |
| Alexa 488标记的抗兔抗体 | 赛默飞世尔科技公司(Invitrogen) | 产品编号:A - 11008；研究资源识别符(RRID):AB_143165 |
| 生物样本 | ||
| 股骨皮肤样本(约10 - 16周龄)，雌性BALB/cAnNTac小鼠，塔科尼克生物科学公司(Taconic Biosciences) | 国际空间站(ISS)国家实验室生物样本共享计划 | 啮齿动物研究8号任务(RRRM - 1) |
| 关键商业检测试剂盒 | ||
| DNeasy血液与组织试剂盒 | 凯杰公司(Qiagen) | 69504 |
| MethylFlash 甲基化DNA定量酶联免疫吸附测定试剂盒 | Epigentek公司 | P-1030 |
| MethylFlash 全基因组DNA羟甲基化(5 - hmC)酶联免疫吸附测定试剂盒 | Epigentek公司 | P-1032 |
| PicoPure RNA提取试剂盒 | 赛默飞世尔科技公司(Applied Biosystems) | 产品编号:KIT0204 |
| RNase混合酶 | 赛默飞世尔科技公司(Invitrogen) | 产品编号:AM2288 |
| 安捷伦AmpureXP磁珠 | 贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter) | A63882 |
| DNF - 488高灵敏度基因组DNA分析试剂盒 | 安捷伦科技公司(Agilent) | 产品编号:DNF - 488 - FR |
| 优质简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)试剂盒 | 戴纳格公司(Diagenode) | C02030033 |
| EZ DNA甲基化快速试剂盒 | 赛默飞世尔科技公司(Zymo Research) | D5030 |
| MiSeq V2 300bp测序试剂套装 | 因美纳公司(Illumina) | 产品编号:MS - 102 - 2001 |
| 已存档数据 | ||
| 原始数据和分析数据 | 本文 | 基因表达综合数据库(GEO):GSE268753和GSE268755 |
| 原始数据和分析数据 | 日本宇宙航空研究开发机构(JAXA)MHU - 2任务 | 基因实验室(GeneLab)编号:GLDS - 239；https://doi.org/10.26030/s7k9 - 7958 |
| 软件和算法 | ||
| ImageJ图像处理软件 | 美国国立卫生研究院(NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Zen软件 | 蔡司显微镜 | https://www.zeiss.com/microscopy/en/ products/software/zeiss-zen-lite.html |
| FastQC/MultiQC(快速质量控制/多重质量控制) | 不适用 | 0.11.5 |
| STAR(超快速通用RNA-seq比对器，Spliced Transcripts Alignment to a Reference) | 多宾等人 | 2.5 |
| NGSUtils(下一代测序工具集)，bamutils | 布里斯等人 | 0.5.9 |
| subread/featureCounts(子读取/特征计数) | 廖等人 | 1.5.1 |
| edgeR(经验贝叶斯离散估计，Empirical analysis of Digital Gene Expression data in R) | 罗宾逊等人 | 3.30.3 |
| 参考基因组 | 加州大学圣克鲁兹分校基因组数据库(University of California, Santa Cruz) | mm10/refGene(小鼠基因组版本10/参考基因) |
| Methylkit(甲基化分析工具包) | R语言/生物导体(R/Bioconductor) | 1.7.0 |
| annotatr(注释工具) | R语言/生物导体(R/Bioconductor) | 不适用 |
(续下页)
| 续 | ||
| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
| 转录本剪接比对的分层索引(Hierarchical Indexing for the Spliced Alignment of Transcripts，HISAT2) | Kim等人 | 不适用 |
| SAMtools | Li等人 | 0.1.19 |
| Ingenuity通路分析(Ingenuity Pathway Analysis，IPA)数据库 | 凯杰公司(QIAGEN Inc) | 不适用 |
| StringTie | Pertea等人 | 1.2.1 |
| DE - seq2 | Love等人 | 不适用 |
| ggplot2 | Ito等人 | 不适用 |
| 其他 | ||
| 蔡司Axio Scan荧光显微镜 | 蔡司显微镜 | https://www.zeiss.com/microscopy/en/ products/imaging-systems/axioscan-for- biology.html |
| 生物分析仪2100 | 安捷伦(Agilent) | https://www.agilent.com/en/product/ automated-electrophoresis/bioanalyzer- systems/bioanalyzer-instrument |
| 诺瓦测序仪6000(NovaSeq 6000) | 因美纳(Illumina) | https://www.illumina.com/systems/ sequencing-platforms/novaseq.html |
| 4200 TapeStation系统 | 安捷伦(Agilent) | https://www.agilent.com/en/product/ automated-electrophoresis/tapestation- systems/tapestation-instruments/4200- tapestation-system-228263 |
实验模型与研究参与者详情
小鼠皮肤样本
通过国际空间站(ISS)国家实验室的生物样本共享计划获取了35只年轻(约10 - 16周龄)雌性BALB/cAnNTac小鼠(塔科尼克生物科学公司)的股骨皮肤样本，本研究未涉及活体动物。这些小鼠来自太空探索技术公司(SpaceX)CRS - 19啮齿动物研究8号任务[也称为啮齿动物研究参考任务1(RRRM - 1)]，是与利兹·沃伦博士合作从国际空间站国家实验室获得的。有关RRRM - 1任务的详细信息可通过国际空间站实验室的太空科学促进中心(CASIS)研究档案库(www.iss - casis.org/research - on - the - iss/solicitations/2018 - rodent - research/)获取。简而言之，本研究调查了17只被送往太空的小鼠的皮肤样本[其中10只在轨道上飞行22 - 23天后实施安乐死；7只在着陆后实施安乐死(在太空中停留40天，在处死前恢复2天)]以及18只年龄匹配的地面对照动物的皮肤样本。
方法详情
RNA测序与分析
对于靶向RNA测序，使用ABI Picopure RNA分离试剂盒提取总RNA，并使用安捷伦2100生物分析仪进行质量评估。使用安捷伦SureSelect定制cDNA转换模块，加上带有小鼠全外显子V2(67.1Mb)的SSEL XTHS试剂试剂盒，用30 - 200ng的RNA制备双端文库。在Illumina NovaSeq 6000平台上使用NovaSeq 6000 S2试剂盒进行测序，读长为100bp。使用STAR(拼接转录本与参考基因组的比对工具)将测序读段比对到指定的参考基因组。 为评估RNA测序数据的质量，使用bamUtils确定落入参考基因不同注释区域(外显子区、内含子区、剪接位点、基因间区、启动子区、非翻译区等)的读段数量。
对于差异基因表达(DEG)分析，排除低质量的比对读段(包括比对到多个位置的读段)，并使用featureCounts 对基因水平的表达进行定量。使用edgeR进行DEG分析。 在这个流程中，应用的统计方法使用负二项式广义线性模型和似然比检验。
如图1所述，为了对地面对照和太空环境暴露(ESE)进行比较，使用转录本拼接比对的分层索引(HISAT2)将处理后的原始测序读段比对到小鼠参考基因组(mm39)。 使用SAMtools(版本0.1.19)对生成的SAM(序列比对/映射)文件进行后处理 ，将SAM文件转换为BAM(二进制比对/映射)文件，然后对输出的BAM文件进行排序和索引。使用StringTie(版本1.2.1 提供的Python脚本(pre - pDE.py)解析排序后的BAM文件，以获得跨样本的基因水平计数矩阵。使用DE - seq2对该计数矩阵进行ESE和地面对照样本之间的差异表达分析。 在所有比较中鉴定出的差异表达且具有统计学意义的基因通过R语言中的ggplot 包生成的火山图进行展示。
简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)分析
使用Diagenode表观基因组学服务(Diagenode，产品编号G02020000)对使用DNeasy血液与组织试剂盒(Qiagen，产品编号69504)按照制造商说明从鼠类皮肤样本中分离的总DNA进行了简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)分析。通过4200 TapeStation系统(安捷伦)测定起始DNA材料的数量和样本完整性。将基因组DNA用RNase混合酶(赛默飞世尔科技，产品编号AM2288)在 处理30分钟，以去除污染的小RNA。处理后，使用Agencourt® AmpureXP磁珠(贝克曼库尔特)以磁珠:样本为2:1的比例纯化DNA。使用Qubit®双链DNA宽范围检测试剂盒(赛默飞世尔科技)测量DNA浓度，并使用片段分析仪 和DNF - 488高灵敏度基因组DNA分析试剂盒(安捷伦)评估质量。使用高级简化代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)试剂盒(Diagenode产品编号C02030033)制备RRBS文库。使用100ng基因组DNA开始文库制备。文库制备完成后，将样本混合在一起。最终文库扩增后，使用Agencourt® AMPure® XP磁珠(贝克曼库尔特)以磁珠:样本为1.45:1的比例进行PCR纯化。RRBS文库混合样本在NovaSeq6000(Illumina)上进行50bp双端测序(PE50)。
使用FastQC 0.11.8版本对获得的测序读数进行质量控制。使用Trim Galore! 0.4.1版本去除接头。然后使用bismark v0.20.0将读数与小鼠参考基因组GRCm38/mm10进行比对。 在此步骤中使用内参对照序列检查亚硫酸氢盐转化率并验证亚硫酸氢盐处理的效率。使用R/Bioconductor软件包methylkit v1.7.0 进行差异甲基化分析。对CpG数据集进行过滤，去除低覆盖度(每个比较组的所有样本中覆盖度低于 的CpG被丢弃)和极高覆盖度的区域，以丢弃可能存在PCR偏差的读数(覆盖度高于第99.9百分位数的CpG被丢弃)。然后对样本间的读数覆盖度分布进行归一化处理。使用逻辑回归对各组进行成对比较，以识别差异甲基化区域(DMR)，窗口和步长均为1000bp。计算p值后，methylkit使用滑动窗口模型(SLIM)将p值校正为用于多重比较检验的q值。q值阈值< 0.01且甲基化差异大于25%的DMR被确定为具有统计学意义。使用R/Bioconductor软件包annotatr 对所有DMR进行注释，使用来自UCSC的refGene和CpG岛注释信息。注释包括两个类别:(i)与CpG岛的距离和(ii)区域注释。区域分析将DMR分为三类，即外显子、内含子和启动子。
英捷吉通路分析(IPA)
在鉴定出差异表达基因(DEG)/差异甲基化区域(DMR)后，使用英捷吉通路分析(IPA)数据库(- QIAGEN公司，加利福尼亚州雷德伍德城，www.qiagen.com/ingenuity)鉴定富集通路，该数据库根据现有文献预测数据集中富集的生物网络。如我们之前报道的那样，使用IPA对显著的DEG/DMR进行经典通路分析。 为了比较富集的经典通路之间的相似性和差异，使用IPA中的比较分析功能对对应于基因启动子、外显子和内含子的DMR进行比较分析。 使用条形图和热图可视化经典通路和DMR。对于DEG，手动选择激活 得分 的通路以条形图呈现。
靶向亚硫酸氢盐测序
为验证全基因组RRBS研究的结果，对分离的DNA样本进行处理，并使用靶向亚硫酸氢盐测序服务(Zymo Research公司，美国加利福尼亚州尔湾市)进行分析。使用Zymo Research公司专有的亚硫酸氢钠转化DNA特异性引物设计工具Rosefinch设计引物，针对指定感兴趣区域(ROI)的CpG位点进行检测。以下区域为靶向区域:(i)Araf1 - (>mm10_dna范围=chrX:20848583 - 20848893；链 = +)；(ii)Flt1 - (>mm10_dna范围=chr5:147724930 - 147726782；链 = -)；以及(iii)Vegfb - (>mm10_dna范围=chr19:6987203 - 6987964；链 = -)。设计参数的选择应使PCR扩增子理想情况下大于100 bp但小于 。此外，引物设计应尽可能避免与感兴趣区域的 位点退火。引物验证后，按照制造商的说明，使用EZ DNA甲基化 - 闪电 试剂盒(Zymo Research公司，D5030)对提供的样本进行亚硫酸氢盐转化。按照制造商的说明，使用ROI特异性引物对和Fluidigm Access Array 系统对所有样本进行多重扩增。根据Fluidigm仪器的指南，将所得的扩增子汇集起来进行收获和后续的条形码标记。条形码标记后，将样本汇集、纯化(DNA清洁与浓缩器 - 5 )，并根据制造商的指南，使用MiSeq V2 300bp试剂试剂盒(Illumina公司)和双端测序方案进行大规模平行测序准备。
使用标准的Illumina碱基识别软件识别序列读数，并使用Bismark将其比对回参考基因组。 默认使用双端比对，因此要求读数1和读数2都在一定距离内比对，否则读数1和读数2都将被丢弃。使用bismark_genome_preparation命令和整个参考基因组构建索引文件。运行Bismark时应用 - non_directional参数。所有其他参数设置为默认值。在甲基化检测过程中，从扩增子中去除引物中的核苷酸。每个采样胞嘧啶的甲基化水平估计为报告C的读数数量除以报告C或T的总读数数量。对序列数据进行解复用，并评估样本读数覆盖率、比对效率、独特CpG覆盖率和亚硫酸氢盐转化率。甲基化比率(meth_ratio)通过甲基化CpG计数/总CpG计数来计算。分析中包括以下数量的高质量CpG:(i)Araf1 = 19个CpG；(ii)FIt1 = 89个CpG；以及(iii)Vegfb = 59个CpG。
5 - 甲基胞嘧啶(5 - mc)和5 - 羟甲基胞嘧啶(5 - hmC)酶联免疫吸附测定(ELISA)
按照制造商的说明，使用DNeasy血液与组织试剂盒(Qiagen公司，产品编号69504)从皮肤样本中分离总基因组DNA。为检测整体DNA甲基化状态(5 - mC)，使用MethylFlash 甲基化DNA定量试剂盒(比色法；Epigentek公司，产品编号P - 1030)。此外，为检测整体DNA羟甲基化状态，使用MethylFlash 整体DNA羟甲基化(5 - hmC)ELISA简易试剂盒(比色法；Epigentek公司，产品编号P - 1032)。该检测共使用100 ng DNA。使用Synergy HTX多模式酶标仪(Agilent公司)在450 nm处测定吸光度。为确定每个DNA样本的特定甲基化状态，使用以下公式计算总DNA中 或 的百分比:
其中S代表输入DNA样本的量(ng)。
组织学和免疫组织化学(IHC)
如前所述，对包埋在最佳切片温度(OCT)复合物中的皮肤组织进行了皮肤组织学检查。 将OCT包埋的组织进行冷冻切片 ，用冷丙酮固定，用 正常山羊血清(NGS)封闭，并与针对抗5-甲基胞嘧啶(5-mC，#28692S，Cell Signaling Technology；1:200稀释)、抗5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC，#ab214728，abcam；1:200稀释)、E-钙黏蛋白(#13 - 1900，Invitrogen；1:400稀释)、E-钙黏蛋白(#13 - 1900，Invitrogen；1:400稀释)、CD31(#550274，BD Pharmingen；1:200稀释)、F4/80(#MCA497R，Bio - Rad；1:200稀释)；ARAF(#22129 - 1 - AP，Proteintech Group, Inc.；1:100稀释)的特异性一抗孵育，随后用合适的荧光标记二抗(Alexa 568标记的 -羊抗，#A - 21099，Invitrogen，1:200稀释；Alexa 568标记的α - 大鼠抗，# ab175476，Abcam，1:200稀释；Alexa 488标记的α - 兔抗，#A - 11008，Invitrogen，1:200稀释)孵育。使用蔡司Axio Scan Z1显微镜在Zen blue成像软件的引导下采集并分析图像。 使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)分析免疫组织化学(IHC)图像。
量化与统计分析
用于RNA测序分析、简化代表性重亚硫酸盐测序(RRBS)分析、靶向亚硫酸氢盐测序、5 - mC和5 - hmC酶联免疫吸附测定(ELISA)以及免疫组织化学(IHC)分析的统计分析方法和软件在相应的方法部分、结果以及图注中提供。“ ”的确切值及其代表的含义在每个图的图注中给出。中心、离散度和精度度量的定义在相应图的图注中提供。
小鼠皮肤,表观基因组,太空环境
表观信息
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