N6-甲基腺苷通过AjULK-AjYTHDF/AjEEF-1α轴调控体腔细胞自噬助力刺参抵御灿烂弧菌感染
发布时间：
2025-04-04 09:51
论文 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04929-5 开放获取
N6-甲基腺苷通过AjULK-AjYTHDF/AjEEF-1α轴调控体腔细胞自噬助力刺参抵御灿烂弧菌感染
刘吉庆 、邵依娜 、李冬冬 、李成华
N6-甲基腺苷(m6A)修饰是最丰富的转录后修饰之一，可在多种病理过程中介导自噬。然而，m6A在灿烂弧菌感染刺参期间调控自噬的功能机制尚未明确。本研究发现，通过敲低甲基转移酶样蛋白3(AjMETTL3)抑制m6A水平，会显著降低灿烂弧菌诱导的体腔细胞自噬，并导致胞内灿烂弧菌载量增加。在此条件下，Unc-51样激酶1(AjULK)表现出最显著的m6A水平差异表达。值得注意的是，过表达AjMETTL3时敲低AjULK可逆转灿烂弧菌介导的自噬。进一步研究表明，敲低AjMETTL3并不改变AjULK mRNA转录水平，但会降低其蛋白表达。此外，YTH结构域家族蛋白(AjYTHDF)被鉴定为AjULK的阅读蛋白，并以m6A依赖性方式促进AjULK表达。更重要的是，AjYTHDF介导的AjULK表达依赖于其与翻译延伸因子1-α(AjEEF-1 )的相互作用。综上，我们的研究揭示了m6A通过AjULK-AjYTHDF/AjEEF-1 依赖途径促进体腔细胞自噬来抵抗灿烂弧菌感染，为刺参疾病防治提供了理论依据。
自噬是指细胞将包裹的胞质成分(包括入侵病原体、受损细胞器或蛋白质)通过双层膜结构封装后，由溶酶体降解的自我消化过程 。其主要功能是在细胞面临应激性死亡威胁时维持生存，已成为真核细胞维持稳态和实现自我更新的进化保守机制 。自噬还参与对抗入侵病原体的先天免疫防御，如福氏志贺菌、结核分枝杆菌、弓形虫和李斯特菌 。选择性转运微生物至溶酶体的自噬类型称为异源自噬 。在哺乳动物(可能包括其他后生生物)中，自噬的抗菌防御作用可能超越直接清除病原体 。越来越多研究表明RNA转录后调控对自噬信号通路的重要贡献 。
N6-甲基腺苷(m6A)作为转录后调控中最丰富的方式之一，在多种生理和病理过程中发挥重要作用 。m6A主要出现在RRACH序列中，主要由包括写入器、擦除器和读取器在内的几种 调控因子协调作用 。甲基转移酶样蛋白3(METTL3)、METTL14和Wilms肿瘤1关联蛋白是催化m6A修饰形成的主要"写入器" 。为维持m6A修饰的动态平衡，脂肪量和肥胖相关基因(FTO)以及AlkB同源蛋白5 RNA去甲基酶(ALKBH5)可去除该修饰 。读取蛋白主要包括YTH m6A RNA结合蛋白家族、胰岛素样生长因子 结合蛋白家族以及异质核核糖核蛋白C，它们能识别修饰以影响mRNA稳定性、翻译、亚细胞定位和可变剪接，从而执行不同的生物学功能 。YTH m6A RNA结合蛋白家族是最具功能性的读取蛋白 。
自噬与m6A的关系最早于2018年在智人中被描述。FTO可消除ULK转录本内的m6A分布，从而促进ULK1蛋白、微管相关蛋白轻链3(LC3)的产生及自噬流 。 调控自噬的方式在不同生物体或生理过程中也存在差异。FTO缺失介导的自噬相关基因5(ATG5)和ATG7转录本的m6A修饰会招募读取蛋白YTHDF2，这在小鼠中促进降解并损害自噬体形成 。相反， 修饰在某些情况下可促进自噬。典型例子是ALKBH5的缺失会提高BCL-2转录本的m6A水平，导致卵巢癌细胞中 转录本的降解，通过破坏BCL-2-Beclin1复合体来启动自噬 。
自噬作为刺参先天免疫的一种方式，在我们先前的研究中显示出对灿烂弧菌感染的重要抗菌作用 。然而，自噬背后的调控机制仍 largely未知。本研究中，我们证实m6A修饰与响应灿烂弧菌感染的自噬之间存在正相关。此外，刺参中已知的自噬起始因子Unc-51样激酶1(AjULK)被m6A修饰，并参与刺参METTL3(AjMETTL3)介导的自噬。更重要的是，我们发现并证实了一个保守的YTH结构域家族蛋白读取蛋白(AjYTHDF)能以m6A依赖的方式促进AjULK表达。尤为重要的是，我们验证了AjYTHDF介导的AjULK表达依赖于其与延伸因子1-α(AjEEF-1 )的相互作用。这些发现丰富了我们对 在海洋无脊椎动物先天免疫中作用的认识，并为 的疾病预防和治疗提供了见解。
结果
m6A甲基化通过调控自噬抵抗灿烂弧菌感染。已有研究表明自噬能帮助宿主抵御病原体侵袭 。我们前期研究发现刺参体腔细胞的自噬活性和m6A甲基化水平在 灿烂弧菌感染期间显著升高 ，但二者关系尚未阐明。为探究自噬是否受 甲基化调控，我们采用siRNA敲低关键m6A甲基转移酶AjMETTL3。qRT-PCR和蛋白质印迹证实si-AjMETTL3能显著降低AjMETTL3表达(附图1)。透射电镜显示，在灿烂弧菌感染条件下，si-AjMETTL3组自噬体数量较si-NC组显著减少(图1a)。免疫荧光分析同样显示，si-AjMETTL3组的AjLC3绿色荧光与溶酶体红色荧光强度明显减弱(图1b, c)。当AjMETTL3被敲低时，灿烂弧菌刺激下的AjLC3-II/I比值较si-NC组下调。Baf-A1处理进一步加剧了AjMETTL3敲低组中AjLC3-II/I比值的降低，表明自噬流在AjMETTL3敲低状态下受损(图1d, e)。这些结果共同证明m6A甲基化修饰是 灿烂弧菌诱导体腔细胞自噬的正向调控因子。我们既往研究证实刺参自噬可抵抗灿烂弧菌感染 。为验证 在应对 灿烂弧菌感染中的免疫功能，我们检测了体腔细胞细菌载量。si-AjMETTL3组的可培养灿烂弧菌数量较si-NC组显著增加(图1f, g)。综上，结果证明 在 灿烂弧菌感染 刺参过程中发挥抗菌作用。
自噬起始因子AjULK是AjMETTL3的靶基因。为深入解析AjMETTL3介导自噬的分子机制，我们在自噬相关基因(ATGs)中筛选潜在靶点。基于已发表的m6A测序数据(PRJNA774950)和刺参ATGs，我们筛选出15个 灿烂弧菌感染后m6A甲基化水平显著变化的ATGs；其中 是 甲基化水平变化最显著的基因 。AjULK已被证实是调控 灿烂弧菌诱导自噬的起始因子 。m6A测序发现AjULK转录本编码区存在两个m6A甲基化位点(图2b)。MeRIP-qPCR证实灿烂弧菌感染组的AjULK m6A甲基化水平较未处理组显著升高(图2c)。在AjMETTL3敲低条件下，AjULK蛋白水平显著下降(图2e)，而 的mRNA水平未改变(图2d)。与此一致，AjULK下游基因(包括AjBeclin-1和AjATG13)的表达均显著抑制，而Ajp62蛋白水平在此条件下明显上升(图2e)。
为深入探究AjULK mRNA上的m6A甲基化修饰是否对其表达调控起关键作用，我们针对 的m6A甲基化位点分别构建了野生型和突变型荧光素酶报告载体(分别命名为AjULK-WT和AjULK-Mut)(图2f)。双荧光素酶检测显示，过表达AjMETLL3能显著上调AjULK-WT-2组的荧光素酶报告活性，而AjULK-WT-1、AjULK-MUT-1和AjULK-MUT-2组的活性未发生改变(图2g)。这些结果表明m6A通过第二个甲基化位点促进了AjULK的表达。
m6A通过AjULK调控灿烂弧菌诱导的自噬。作为m6A修饰的靶标，我们推测AjULK参与m6A介导的自噬过程。为验证该假说，我们检测了不同条件下的自噬水平。在体腔细胞中注射AjMETTL3 mRNA后，OE-AjMETTL3组的AjMETTL3 mRNA和蛋白表达量较OE-NC组分别显著升高 (图3a, b)。同时，OE-AjMETTL3组的AjULK蛋白水平也较OE-NC组上调，但其mRNA水平未发生变化(图3a, b)。在此条件下， 透射电镜观察显示，与OE-NC组相比，灿烂弧菌感染能显著增加OE-AjMETTL3组自噬体数量(图3c)。然而敲低AjULK可逆转该
图1 m6A甲基化促进体腔细胞自噬并抵抗灿烂弧菌感染。a 刺参分别转染si-NC或si-AjMETTL3 小时后，经 灿烂弧菌感染 小时，透射电镜显示si-NC+灿烂弧菌组自噬体增多现象在si-AjMETTL3+灿烂弧菌组显著减弱。红色箭头指示自噬体。比例尺 。b 相同处理条件下，免疫荧光分析显示si-NC+灿烂弧菌组中AjLC3与溶酶体荧光强度增强的现象在si-AjMETTL3组大幅降低。蓝、绿、红色信号分别代表细胞核、AjLC3及溶酶体。比例尺 。c 各组样本1000个细胞中AjLC3阳性率统计显示，数据以均值±标准差(SDs)( )表示，星号标示组间显著性差异: 与 (单因素方差分析)。d Western blot显示si-NC+灿烂弧菌组升高的AjLC3-II/I比值在si-AjMETTL3组下降。使用10 nM巴弗洛霉素A1处理时，敲低AjMETTL3对灿烂弧菌诱导的AjLC3-II/I比值降低效应更为显著。各泳道蛋白上样量均为50 µg。e 通过ImageJ软件计算蛋白条带密度，数据以均值 SD( )表示，星号标示 与 的组间显著性差异(单因素方差分析)。f, g 刺参转染si-NC或si-AjMETTL3 小时后，注射 灿烂弧菌( )继续培养 小时，平板计数法显示si-AjMETTL3+ .splendidus组体腔细胞内细菌载量较si-NC组显著增加。比例尺 。数据以均值 表示，星号标示 与 的组间显著性差异(单因素方差分析)。误差棒代表SDs。过表达AjMETTL3的体腔细胞中自噬体增多(图3c)。免疫荧光显示AjMETTL3过表达增强AjLC3荧光信号，而该效应可被AjULK敲低所逆转(图3d, e)。Western blot证实过表达组AjLC3-II/I比值高于OE-NC组，但AjULK缺失能恢复该比值(图3g)。此外，过表达AjMETTL3可降低体腔细胞内 .splendidus载量，该保护作用可被AjULK敲低所抵消(图3h, i)。结果表明AjMETTL3通过调控AjULK介导的自噬通路抵抗灿烂弧菌感染。
AjYTHDF是一种介导AjULK表达的阅读蛋白(reader protein)。m6A甲基化通过特定m6A结合蛋白调控mRNA稳定性和翻译过程 。YTHDF1能识别并促进m6A修饰的 翻译。在刺参转录组中仅发现一个AjYTHDF成员，系统进化树显示其与YTHDF1同源性最高(附图2)。为验证AjYTHDF是介导m6A调控AjULK表达的阅读蛋白，我们进行了表达分析和功能验证。首先，qRT-PCR显示 在 灿烂弧菌感染过程中表达上调，该模式与AjULK表达趋势一致(图4a)。其次，转染AyYTHDF siRNA可分别显著降低AjYTHDF的mRNA和蛋白表达水平 (图4b, c)。在此条件下，AjULK蛋白水平显著下降(图4c)，而 的mRNA水平未发生变化(图4b)。同时AjBeclin-1和AjATG13表达显著下调，而Ajp62表达显著升高(图4c)。进一步通过RNA pull-down实验证实 修饰的 转录本可与AjYTHDF特异性结合，结果显示m6A标记的AjULK探针能富集AjYTHDF蛋白，而突变探针无此作用(图4d)。随后采用RIP-qPCR检测AjYTHDF是否能识别m6A修饰的 ，数据显示相比未处理IgG组，AjYTHDF抗体沉淀复合物中AjULK mRNA富集量更高(图4e)。当过表达AjMETTL3提高 的m6A水平时，AjYTHDF抗体富集的AjULK mRNA进一步增加；反之敲低AjMETTL3降低m6A修饰水平后，AjYTHDF与AjULK mRNA相互作用减弱(图4e)。体外RNA EMSA实验证实AjYTHDF蛋白能特异性结合m6A修饰的AjULK而非突变型 。超迁移实验表明AjYTHDF与该序列特异性结合，随着蛋白浓度增加，AjULK/AjYTHDF复合物浓度也升高，而突变m6A位点会消除这种相互作用(图4f)。
在探究AjYTHDF作为 阅读蛋白介导自噬的过程中，免疫荧光观察显示:在灿烂弧菌刺激条件下，敲低AjYTHDF可消除由AjMETTL3过表达引起的AjLC3荧光信号增强(图4g, h)。Western blot结果一致表明，在灿烂弧菌刺激下，OE-AjMETTL3+si-AjYTHDF组的AjULK及自噬流水平较OE-AjMETTL3组降低(图4I, j)。这些结果证明AjYTHDF作为 阅读蛋白，通过促进AjULK表达来介导自噬过程。
AjYTHDF通过m6A依赖性方式调控AjULK表达
在哺乳动物中，YTHDF1通过其YTH结构域中的m6A结合口袋与m6A位点结合，其中K395和Y397是YTHDF1与m6A修饰 结合的关键位点。在AjYTHDF中，K464和Y466位点分别与K395和Y397保守对应(附图3)。为探究AjYTHDF是否以m6A依赖方式调控AjULK表达，我们在AjYTHDF的YTH结构域引入了K464和Y466双位点突变(AjYTHDF-Mut)(图5a)。随后，将使用AjYTHDF野生型(AjYTHDF-WT)或突变型为模板转录的mRNA注射至 日本七鳃鳗体内以过表达不同AjYTHDF类型。过表达AjYTHDF-WT后，AjULK表达量上调，而AjYTHDF-Mut组则无变化(图5b)。RIP-qPCR检测显示，与未处理组相比，AjYTHDF-Mut组中 的富集度未增加(图5c)。双荧光素酶报告系统表明，过表达AjYTHDF能上调AjULK-WT-2组的荧光素酶活性，而AjULK-Mut-2组对AjYTHDF过表达无响应(图5d)。此外，在缺失AjMETTL3的体腔细胞中，过表达AjYTHDF无法上调AjULK表达(图5e)。所有结果证实AjYTHDF以m6A依赖方式调控AjULK表达。
图2 自噬起始因子AjULK是AjMETTL3的靶基因。a 热图显示响应灿烂弧菌感染的ATG基因m6A甲基化水平，颜色由绿至红表示m6A水平从低到高。b AjULK mRNA中m6A峰值的整合基因组浏览器图谱，蓝框表示外显子，蓝线表示内含子。 MeRIP-qPCR分析灿烂弧菌感染后AjULK的m6A水平，数据以柱状图表示均值 标准差( )，星号表示组间显著差异:*p < 0.05，**p < 0.01(学生t检验)。d, e 在AjMETTL3敲低条件下，刺参经1×107 CFU/mL灿烂弧菌感染或未感染24小时后，分别通过qRT-PCR和Western blot检测体腔细胞中AjULK及自噬相关蛋白的mRNA和蛋白水平。si-AjMETTL3组的AjULK蛋白水平较si-NC组显著下调，而mRNA水平无变化。灿烂弧菌感染条件下也观察到类似现象。数据以柱状图表示相对于si-NC组的均值±标准差(n=3)，星号表示组间显著差异: 和 (单因素方差分析)，n.s.表示不显著 。所示条带来自五张印迹膜，各泳道加载等量蛋白( )。f 双荧光素酶报告载体构建示意图。g AjMETTL3过表达细胞中AjULK-WT或AjULK-Mut荧光素酶报告基因的相对活性。AjMETTL3过表达显著上调AjULK-WT-2组的荧光素酶活性，而AjULK-WT-1、AjULK-MUT-1和AjULK-MUT-2组无变化。海肾荧光素酶活性经萤火虫荧光素酶标准化。数据以柱状图表示相对于OE-NC组的均值 标准差( )，星号表示两组间显著差异: 和 (双因素方差分析)，n.s.表示不显著 。误差条表示标准差。
AjYTHDF介导的AjULK表达依赖于与AjEEF-1a的相互作用。为探究AjYTHDF促进AjULK转录物表达的机制，我们对体腔细胞进行AjYTHDF-GST pull-down实验并通过质谱鉴定结果。有趣的是，发现AjEEF-1 在蛋白中显著富集(图6a)。随后我们进一步使用纯化的AjYTHDF和AjEEF-1 蛋白进行GST
图3 m6A通过AjULK调控灿烂弧菌诱导的自噬。a、b 注射300 µg AjMETTL3 mRNA 24小时后，体腔细胞中AjMETTL3过表达效率及AjULK表达的qRT-PCR和Western blot分析。OE-AjMETTL3组的AjMETTL3 mRNA和蛋白水平较OE-NC组分别升高，同时AjULK蛋白水平在OE-AjMETTL3组中也出现上调，而AjULK mRNA水平无变化。数据以均值 标准差(相对于OE-NC组)表示，柱状图展示。星号表示组间显著性差异:* (学生t检验)，n.s.表示不显著 。所示条带来自三张印迹膜，每泳道加载等量蛋白 。 在刺参中同时过表达AjMETTL3、敲低AjULK并感染 灿烂弧菌 后，透射电镜显示体腔细胞中出现自噬体。OE-AjMETTL3组自噬体数量较OE-NC组显著增加，而AjULK敲低可逆转AjMETTL3过表达导致的自噬体增多。红色箭头指示自噬体。比例尺 。d 在刺参中同时过表达AjMETTL3、敲低AjULK并感染 CFU/mL灿烂弧菌 后，免疫荧光分析显示AjULK敲低能降低AjMETTL3过表达引起的AjLC3荧光强度增强。蓝、绿、红色信号分别代表细胞核、AjLC3和溶酶体。比例尺 。e 测定各组1000个细胞中AjLC3阳性率。数据以均值 标准差( )(相对于未处理组)表示，柱状图展示。星号表示组间显著性差异:* 和** (单因素方差分析)。f 在刺参中同时过表达AjMETTL3、敲低AjULK并感染1 ×107 CFU/mL灿烂弧菌24小时后，Western blot检测显示AjULK缺失可恢复AjMETTL3过表达体腔细胞中升高的AjLC3-II/1比值。所示条带来自同一印迹膜，每泳道加载等量蛋白(50μg)。g 使用ImageJ软件计算蛋白条带密度。数据以均值 标准差( )(相对于未处理组)表示，柱状图展示。星号表示组间显著性差异: 和 (单因素方差分析)。h, i 在刺参中同时过表达AjMETTL3、敲低AjULK、注射 灿烂弧菌(<b17></b7>) 后，平板计数法检测体腔细胞中细菌载量。结果显示AjMETTL3过表达导致的灿烂弧菌减少可被AjULK敲低逆转。比例尺 。数据以均值 (相对于未处理组)表示，柱状图展示。星号表示组间显著性差异: 和 (单因素方差分析)。误差棒代表标准差。下拉实验证实GST-AjYTHDF可富集His-AjEEF-1 ，表明两者存在直接相互作用(附图4)。共免疫沉淀与反向共免疫沉淀实验进一步验证AjYTHDF与AjEEF-1 呈剂量依赖性结合(图6b, c)。在研究AjEEF-1 是否介导AjULK表达时发现，敲低AjEEF-1 可消除AjMETTL3过表达条件下AjULK的表达上调(图6f, g)。此外，OE-AjMETTL3组中敲低AjEEF-1 会减弱AjLC3信号(图6d, e)，si-AjEEF-1 -AjMETTL3组的自噬流也较OE-AjMETTL3组降低(图6f, g)。这些结果表明AjYTHDF与AjEEF-1 的结合对促进m6A修饰的AjULK表达至关重要。
讨论
作为最普遍的RNA修饰之一，在调控mRNA稳定性和翻译过程中起重要作用，并参与多种生物过程 。m6A RNA甲基化能改变自噬相关基因(ATGs)表达，影响自噬功能 。我们前期研究发现，感染 splendidus的 japonicus存在 水平异常和自噬紊乱 。但m6A能否通过调控自噬抵抗 splendidus感染尚不明确。本研究表明，敲低AjMETTL3会显著抑制自噬活性，导致 splendidus感染期间 japonicus细胞内病原菌载量增加。进一步研究发现AjMETTL3通过靶向调控AjULK表达来调节自噬。机制上，m6A修饰的AjULK被AjYTHDF识别，后者以m6A依赖性方式调控AjULK表达。此外，AjYTHDF与AjEEF- 的相互作用对促进AjULK表达至关重要(图7)。本研究填补了m6A调控自噬抵抗病原体感染在 japonicus中的研究空白。
自噬是一种可通过多种途径调控的细胞内清除机制 。越来越多研究表明m6A在自噬调控中起关键作用，可在多种生理病理过程中促进或抑制自噬 。本研究发现m6A对 splendidus诱导的A. japonicus自噬起正向调控作用。多数情况下，m6A修饰主要通过影响自噬相关基因(ATGs)表达来介导自噬 。在脂肪生成中，m6A可通过靶向ATG5和ATG7调控自噬 ；METTL3介导的m6A修饰会降低ATG7 mRNA稳定性从而抑制骨关节炎进程中的自噬 。本研究鉴定出 是m6A介导体腔细胞自噬抵抗 splendidus感染的关键基因。进一步证实缺失AjULK会消除m6A介导的V. splendidus诱导自噬调控。前期研究已确认AjULK是自噬起始因子 ，因此本研究结果证实m6A通过AjULK介导 japonicus的自噬起始。
在智人(Homo sapiens)中，研究者还发现ULK转录本会被 修饰，且较低的 水平有利于促进 的表达 。有趣的是，我们的研究发现刺参中存在相反现象——AjMETTL3通过提高 的m6A修饰水平来促进其表达。类似现象也出现在ATG5基因上，m6A修饰的转录本在不同物种或生物过程中呈现差异化命运。在 的精原细胞瘤中，METTL3上调会增加ATG5转录本的m6A水平，从而提升ATG5表达 ；而在猪胚胎中，METTL3以m6A依赖的方式负调控ATG5 mRNA表达 。此外在脂肪生成过程中，FTO通过降低ATG5的m6A水平促进其表达 。这种现象可解释为:不同阅读蛋白对m6A修饰转录本的识别决定了其最终命运 。在智人体内， 修饰的 被YTHDF2识别并加速ULK mRNA降解；而本研究表明，刺参中m6A修饰的AjULK转录本被与YTHDF1同源性最高的AjYTHDF识别。大量研究证实YTHDF1主要功能是促进m6A修饰mRNA的表达，其生物学功能与YTHDF2相反 。YTHDF1能提升m6A修饰的Traf6转录本翻译效率，从而调控肠道对细菌感染的免疫应答 ；在肺动脉高压血管重塑过程中，YTHDF1通过增强黑色素瘤相关抗原D1表达促进病情发展 。本研究发现AjYTHDF可促进m6A修饰的 表达来介导自噬，这与高等动物中YTHDF1的功能相似。
YTHDF1的YTH结构域含有m6A结合口袋，其中K395和Y397是其结合m6A甲基化mRNA的关键位点 。这两个位点突变会完全破坏YTHDF1与mRNA的结合能力 。在AjYTHDF中，K464和Y466是类似的关键位点，当这两个位点发生突变时，AjYTHDF与AjULK mRNA结合并促进AjULK表达的能力将完全丧失。
图4 AjYTHDF是调控AjULK表达的阅读蛋白。a 采用qRT-PCR分析刺参体腔细胞中AjYTHDF在灿烂弧菌感染期间的表达模式。数据以均值±标准差形式呈现，相对值为 ，柱状图显示。星号表示与 和 相比具有显著差异(单因素方差分析)。 在AjYTHDF敲低条件下，刺参感染或未感染 CFU/mL灿烂弧菌 后，分别通过qRT-PCR和Western blot检测体腔细胞中AjYTHDF及自噬相关蛋白的mRNA和蛋白水平。si-AjYTHDF组的AjULK蛋白水平较si-NC组显著下调，而mRNA水平无变化。灿烂弧菌感染条件下观察到类似现象。数据以均值±标准差( )形式呈现，相对si-NC组，柱状图显示。星号表示组间差异显著性:*p < 0.05，**p < 0.01(单因素方差分析)。n.s.表示无显著性差异 。所示条带来自六张印迹膜，每泳道加载等量蛋白 。d RNA pull-down实验后的免疫印迹分析显示AjYTHDF特异性结合m6A修饰的AjULK探针。e 在AjMETTL3敲低或过表达条件下，通过RIP qPCR分析体腔细胞中AjYTHDF与AjULK转录本的相互作用。当通过AjMETTL3过表达提高AjULK的m6A水平时，AjYTHDF富集的AjULK mRNA增加；反之，AjMETTL3敲低导致的m6A水平下降使两者互作减弱。数据以均值±标准差(n=3)形式呈现，相对IgG组，柱状图显示。星号表示组间差异显著性:* 和* (双因素方差分析)。 RNA EMSA显示纯化的GST-AjYTHDF与m6A标记的AjULK结合能力。 在AjMETTL3过表达且AjYHTHDF敲低条件下感染灿烂弧菌后，免疫荧光检测体腔细胞中AjLC3荧光强度，发现敲低AjYTHDF消除了METTL3过表达引起的AjLC3荧光信号增强。蓝、绿、红色信号分别代表细胞核、AjLC3和溶酶体。比例尺 。每组1000个细胞的相对AjLC3阳性率统计显示，数据以均值±标准差 形式呈现，相对未处理组，柱状图显示。星号表示组间差异显著性: <0.05和 <0.01(单因素方差分析)。I 在AjMETTL3过表达且AjYHTHDF敲低条件下感染灿烂弧菌后，Western blot检测显示敲低AjYTHDF消除了METTL3过表达引起的AjULK表达上调和AjLC3-II/I比值变化。所示条带来自同一印迹膜，每泳道加载等量蛋白(50 µg)。j 使用ImageJ软件计算蛋白条带密度。数据以均值±标准差( )形式呈现，相对未处理组，柱状图显示。星号表示组间差异显著性:*p<0.05，**p<0.01(单因素方差分析)。误差线代表标准差。结果表明AjYTHDF以m6A依赖方式调控AjULK，这与其它物种的YTHDF1功能一致。在哺乳动物中，YTHDF1通过招募翻译起始因子复合体3(eIF3)调控mRNA翻译，促进 修饰mRNA与多核糖体结合以加速翻译限速步骤 。但我们在AjYTHDF的pull-down蛋白中未检测到eIF3。值得注意的是，AjYTHDF可与AjEEF-1 相互作用，这对 促进AjULK表达至关重要。EEF-1 催化氨酰-tRNA(aa-tRNA)依赖GTP与核糖体结合，调控翻译过程中多肽链延伸的保真度和速率 。在乳腺癌肺转移和上皮-间质转化研究中，学者发现YTHDF通过与EEF互作促进m6A修饰转录本表达，与本研究结果相似 。因此我们推测AjYTHDF识别并结合 的 修饰位点，招募 加速aa-tRNA递送以促进AjULK表达，但该复合体调控AjULK表达的具体机制有待进一步研究。
我们的研究揭示了m6A修饰机制在刺参免疫中的重要性，并阐明了刺参自噬的分子机制。但由于刺参细胞系的局限性，部分载体表达实验(如mRFP-GFP-LC3检测、双荧光素酶报告实验等)未能开展或仅能借助高等动物细胞系完成。此外，刺参自噬体的结构和数量可能与高等动物存在差异。因此免疫荧光实验中仅观察到自噬荧光信号增强，而未检测到自噬荧光斑点信号。总之， 与自噬在 刺参免疫中的作用仍需进一步探究。
研究方法
实验动物与伦理声明。本研究所用刺参 购自大连太平洋水产公司，实验前在海水(盐度 、温度 、pH )中暂养3天。所有实验均遵循美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行，实验方案经中国宁波大学研究动物伦理委员会批准。
攻毒实验。攻毒实验参照Lv等 的方法进行。灿烂弧菌在2216E培养基(温度 ，振荡速度 )中培养至光密度 ，经 离心 收集菌体。将刺参分为三组(每组三头)，通过浸泡感染终浓度为 的灿烂弧菌。抑制处理组向半数 刺参体内注射 巴佛洛霉素A1(Baf-A1)，未处理组作为对照。处理 后，用灭菌剪刀解剖 刺参体腔获取体腔液，经200目滤网过滤后 离心 收集体腔细胞，用无菌等渗缓冲液(含 乙二胺四乙酸、 及pH7.6的 Tris-HCl)洗涤两次，最终用于透射电镜(TEM)和免疫荧光分析中的RNA及蛋白水平检测。
RNA干扰实验。RNA干扰实验参照Sun等人的方法进行 。针对AjMETTL3、AjULK 和 的特异性siRNA由吉玛合成公司合成，并用无RNA酶 稀释至 作为母液(附表1)。阴性对照(si-NC)不靶向 日本刺参转录组中任何注释基因。进行RNA干扰时，将 siRNA、10μL转染试剂(碧云天生物技术，北京)与 磷酸盐缓冲液(PBS)混合 制备工作液。每只日本刺参注射 工作液。干扰 后，收集体腔细胞进行定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)、蛋白质印迹、透射电镜分析和免疫荧光分析。每组设三个重复。
RNA过表达实验。RNA过表达检测参照Yang等人和Chen等人的方法 。简言之，使用附表1中的引物扩增AjMETTL3、AjYTHDF和AjEEF-1 开放阅读框序列(NCBI登录号:AjMETTL3:OQ863733；AjYTHDF:OQ401099；AjEEF-1α:OQ401098)，并插入含有T7启动子的pET-28a 载体。随后以重组质粒为模板，按照说明书使用T7高效转录试剂盒(北京全式金)转录单链加帽的AjMETTL3和AjYTHDF mRNA。空载pET- 质粒的His标签mRNA作为过表达阴性对照(OE-NC)。每只日本刺参注射 mRNA。过表达效率通过注射后 的qRT-PCR和蛋白质印迹检测。随后加入 灿烂弧菌至终浓度 ，继续培养 。最后按上述方法收集体腔细胞用于后续研究。实验重复三次。
图5 AjYTHDF以m6A依赖性方式调控AjULK翻译。a AjYTHDF-WT和AjYTHDF-Mut构建体示意图。 过表达AjYTHDF-WT或AjYTHDF-Mut的体腔细胞中AjULK蛋白水平的Western印迹分析。AjYTHDF-WT组中观察到AjULK表达上调，而AjYTHDF-Mut组中AjULK表达无变化。所示条带来自两张印迹膜，每泳道加载等量蛋白(50μg)。c 过表达AjYTHDF-WT或AjYTHDF-Mut后，RIP qPCR分析显示体腔细胞中AjYTHDF与AjULK转录本的相互作用。与未处理组相比，AjYTHDF-Mut组中AjYTHDF对AjULK mRNA的富集未增加。数据以均值 标准差(n )表示，相对于IgG组并以柱状图展示。星号表示组间显著差异:* 和* (双向方差分析)。n.s.表示不显著( )。d AjULK-WT-2或AjULK-Mut-2荧光素酶报告基因在AjYTHDF过表达细胞中的相对活性。AjYTHDF过表达显著上调AjULK-WT-2组的报告基因活性，而AjULK-MUT-2组的活性无变化。海肾荧光素酶活性经测量后以萤火虫荧光素酶活性标准化。数据以均值 标准差( )表示，相对于OE-NC组并以柱状图展示。星号表示组间显著差异: 和 (双向方差分析)。e 同时过表达AjYTHDF与si-NC或si-AjMETTL3的体腔细胞中AjULK表达的Western印迹分析。在缺乏AjMETTL3的体腔细胞中，AjYTHDF过表达无法上调AjULK表达。所示条带来自两张印迹膜，每泳道加载等量蛋白 。误差条表示标准差。
透射电镜。透射电镜检测参照Meng等 的方法进行。按上述方法获取体腔细胞，离心收集沉淀。沉淀用2.5%戊二醛(PBS配制)于 固定 后，用 PBS洗涤一次。随后用 四氧化锇固定 ，经乙醇梯度脱水后包埋于Epon树脂。样品经超薄切片机切片后，用3%醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，于透射电镜(日本日立)下观察。
免疫荧光分析。免疫荧光分析参照Zhao等< b0></b0>的方法进行。体腔细胞用L-15培养基重悬为细胞悬液后，以约 个细胞 的密度加入含有玻璃腔室载玻片的细胞培养板中，于 孵育 。随后弃去L-15培养基，用PBS洗涤玻璃腔室载玻片两次。接着用4%多聚甲醛固定载玻片上的体腔细胞 ，并用 Triton X-100(美国Sigma公司)透化处理 。之后用PBS洗涤细胞三次，室温下用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭 。弃封闭液后，体腔细胞与一抗(抗LC3抗体、抗溶酶体相关膜蛋白(LAMP)抗体，1:500稀释)于 孵育过夜。PBST洗涤三次后，室温下与二抗(异硫氰酸荧光素标记的山羊抗小鼠IgG和Cy3标记的山羊抗兔IgG，1:1000稀释)孵育 。PBST洗涤三次后，用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(1:10000稀释，北京碧云天生物技术)染核。最终洗涤三次后，用抗荧光淬灭封片剂封片，采用激光扫描共聚焦显微镜(德国ZEISS)观察。
RNA提取与qRT-PCR。收集的体腔细胞经溶解后，采用RNAiso Plus(日本TaKaRa)提取RNA。使用PrimeScript RT试剂盒配合gDNA Eraser(日本TaKaRa)将RNA逆转录为cDNA。采用Applied Biosystem 7500实时定量PCR系统(美国Thermo Fisher Scientific)和TB Green Fast qPCR Mix(日本TaKaRa)分析各基因mRNA相对表达量。每反应体系 含 cDNA(1:50稀释)、 各引物 ROXII及 TB Green PCR预混液(日本TaKaRa)。扩增程序为: 变性 ，随后进行40个循环的 退火 和 延伸 。循环结束后进行熔解曲线分析。每组
图6 AjYTHDF与AjEEF-1 结合促进AjULK表达。a GST pull-down实验从体腔细胞中鉴定出AjYTHDF的相互作用蛋白。b、c 免疫共沉淀实验证实体腔细胞中AjYTHDF与AjEEF-1α的相互作用。图中条带来自五张印迹膜，每泳道上样等量蛋白(50µg)。d 在过表达AjMETTL3和敲低AjEEF-1α条件下感染灿烂弧菌后，体腔细胞中AjLC3荧光强度的免疫荧光分析显示，敲低AjEEF-1a消除了AjMETTL3过表达导致的AjLC3荧光强度增强。蓝色与绿色信号分别代表细胞核和AjLC3。比例尺 。e 测定各样本1000个细胞中AjLC3阳性率。数据以柱状图表示，为相对于未处理组的均值 标准差( )。星号表示组间显著性差异:* 和** (单因素方差分析)。 在过表达AjMETTL3和敲低AjEEF-1a条件下感染灿烂弧菌后，Western blot分析体腔细胞中AjULK表达及AjLC3-II/I比值。敲低AjEEF-1α消除了AjMETTL3过表达导致的AjULK及AjLC3-II/I比值升高。所示条带来自同一印迹膜，每泳道上样等量蛋白(50μg)。g 使用ImageJ软件计算蛋白条带密度。数据以柱状图表示，为相对于未处理组的均值 标准差( )。星号表示组间显著性差异:*p < 0.05和**p < 0.01(单因素方差分析)。误差线代表标准差。
实验设置三个平行反应并重复三次。引物序列见附表1。采用 法分析各基因表达水平， 法完整计算公式如下:
Western blot分析。使用细胞裂解液(碧云天，北京)制备体腔细胞或免疫沉淀样本的蛋白提取物，浓度通过BCA蛋白检测试剂盒(康为世纪，北京)测定。各样本总蛋白 经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，转印至 聚偏二氟乙烯膜(Millipore,美国)。室温下用 脱脂牛奶封闭膜 。随后膜与一抗(5%BSA溶液1:500稀释)在 孵育过夜。TBST缓冲液(20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.05% Tween-20; pH=7.6)洗涤三次后，与二抗(5%BSA溶液1:5000稀释)室温孵育 。最后洗涤四次，使用Western Lightning ECL底物(Bio-Rad,美国)孵育，通过Omega Lum C成像系统(Aplegen,美国)显影。本研究使用抗体见附表2。
甲基化RNA(MeRIP)-qPCR检测。采用EpiQuik CUT&RUN m6A RNA富集试剂盒(美国Epigentek)按说明书进行操作。首先从各样本体腔细胞中提取 总RNA，将 总RNA留作输入对照，其余用于免疫沉淀。用洗涤缓冲液预洗Protein A/G磁珠三次后，与 抗 抗体(1:10稀释)或兔 在 振荡孵育 。随后，携带m6A抗体的Protein A/G磁珠经洗涤缓冲液清洗三次，与总RNA在免疫沉淀缓冲液中 孵育 。接着用洗涤缓冲液清洗携带 抗体和甲基化mRNA的蛋白 磁珠三次，并用洗脱缓冲液洗脱。洗脱液中的mRNA与 糖原及十分之一体积的 醋酸钠在2.5倍体积 乙醇中 沉淀 。最终通过qRT-PCR定量沉淀RNA，并标准化至输入值计算各样本m6A富集度。
图7 刺参响应灿烂弧菌感染时m6A调控自噬的机制模型。 灿烂弧菌感染后，自噬起始因子AjULK的mRNA在细胞核内被AjMETTL3甲基化，随后转运至胞质。m6A修饰的AjULK被保守阅读蛋白AjYTHDF识别结合，进而与AjEF-1α互作招募氨酰-tRNA促进AjULK蛋白表达，从而激活自噬途径降解胞内 灿烂弧菌。
位点突变。使用定点突变试剂盒(生工生物，上海)按说明书操作。首先合成含中心突变位点的互补突变引物(附表1)，以插入AjULK开放阅读框序列(NCBI登录号:MH807452)的 载体和 为模板，用引物扩增整个目标载体。PCR产物经Dpn I限制性内切酶消化残留甲基化模板和半甲基化DNA后，将含目标突变位点的 产物转化至感受态细胞 中测序，提取质粒用于后续实验。
双荧光素酶报告基因检测。双荧光素酶实验参照Song等人 的方法进行。将 的m6A序列及其突变体连接至psiCHECK-2载体，突变序列通过快速突变系统(Transgene，北京)获得。同时将AjMETTL3和 序列连接至pCMV-Flag 2 C载体。鲤上皮瘤细胞(斑马鱼资源中心，武汉)在96孔板中培养 过夜后，用Lipofectamine 6000(碧云天生物技术，北京)将重组质粒(每孔 )转染至细胞。空载pCMV-Flag 2 C作为过表达阴性对照。转染 后弃培养基，每孔用 PBS洗涤两次，加入 Passive Lysis Buffer室温孵育 。随后加入 Luciferase Assay Reagent II，立即通过GloMax 96/20/20化学发光仪(Promega，美国)检测萤火虫荧光素酶活性。检测完毕后加入 Stop & Reagent检测海肾荧光素酶活性。所有数据均来自三次生物学重复。
RNA Pull Down实验。由生工生物(上海)合成含甲基化/非甲基化腺苷的生物素标记AjULK RNA。RNA Pull Down实验参照Pierce磁珠法RNA-蛋白互作试剂盒(Thermo Scientific，美国)说明书进行。简要流程:将50 pmol RNA与 链霉亲和素磁珠(生工生物，上海) 孵育过夜，新鲜体腔细胞裂解液加入含RNase抑制剂及蛋白酶/磷酸酶抑制剂的结合反应体系孵育 。随后洗脱磁珠结合蛋白并进行Western blot分析。探针序列见附表2。
RNA免疫共沉淀(RIP)。使用RNA免疫沉淀试剂盒(晶赛生物，广州)按说明书操作:收集的体腔细胞经 RIP裂解液裂解后，保留 裂解液作为Input对照。将包被 特异性抗体及 、 抗体的磁珠与裂解液 孵育过夜。洗涤RNA-蛋白复合物三次后，用蛋白酶 消化缓冲液解离免疫沉淀RNA。通过qRT-PCR定量分析AjULK mRNA与靶蛋白的相对互作水平。
RNA电泳迁移率变动分析(EMSA)。我们委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成了含有甲基化或未甲基化腺苷的生物素标记AjULK RNA。RNA EMSA实验采用LightShift化学发光RNA EMSA试剂盒(Thermo Fisher Scientific,美国)按说明书操作。首先将生物素标记的寡核苷酸探针(含甲基化/未甲基化腺苷的AjULK RNA)与纯化的AjYTHDF蛋白( )在结合缓冲液中室温孵育 。超迁移实验中，纯化的AjYTHDF蛋白需先与AjYTHDF抗体冰上预孵育 ，再与生物素标记探针室温孵育 。随后，RNA-蛋白复合物与 上样缓冲液混合，在 Tris-硼酸-EDTA缓冲液中通过 非变性聚丙烯酰胺凝胶 电泳 分离。凝胶中的蛋白与RNA在 Tris-硼酸-EDTA缓冲液中 转印至尼龙膜(Solarbio,北京) 。膜经254nm紫外交联 后，室温封闭缓冲液封闭 。继而与辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(1:200稀释液)室温孵育 。最后用ECL发光底物(Bio-Rad,美国)孵育，通过Omega Lum C成像系统(Aplegen,美国)显影。探针序列见附表1。
谷胱甘肽-S-转移酶(GST) pull-down实验。参照Gao等 的方法进行GST pull-down实验筛选AjYTHDF互作蛋白。将AjYTHDF开放阅读框序列插入pgex4T-2载体，转化 大肠杆菌Rosseta表达GST标签AjYTHDF蛋白(GST-AjYTHDF)。使用GST Sefinose 树脂(生工生物,上海)通过亲和层析固定GST-AjYTHDF，加入 日本刺参体腔细胞总蛋白，与制备好的GST Sefinose 树脂于 孵育过夜。树脂经GST洗涤缓冲液(生工生物,上海)清洗三次去除杂蛋白，最后用GST洗脱缓冲液(生工生物,上海)洗脱获得蛋白复合物，进行SDS-PAGE和液相色谱-串联质谱(MS)分析。
蛋白质共免疫沉淀(co-IP)实验。参照Ma等人的方法进行共免疫沉淀 。取 蛋白 磁珠(碧云天生物技术，北京)用TBS缓冲液(20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，pH=7.6)洗涤三次后，与 抗体工作液 在 条件下孵育 。各处理组体腔细胞用RIPA裂解液(碧云天生物技术，北京)冰上裂解 。随后将 上清液与处理好的蛋白 磁珠在 条件下共孵育过夜。复合物经TBS洗涤三次后，用 SDS-PAGE缓冲液洗脱进行Western blot检测。
胞内细菌载量检测。参照Li和Liu等人的方法测定胞内细菌丰度 。简言之，将 灿烂弧菌 分别注射入未处理组、si-NC组、si-AjMETTL3组、OE-AjMETTL3组、OE-NC组及OE-AjMETTL3+si-AjULK组的 日本刺参体内。感染 后收集各组体腔细胞，PBS洗涤三次，重悬于 PBS中。将 稀释液均匀涂布于 琼脂平板， 培养 后采用平板计数法进行细菌定量。实验设三个独立重复。
统计学与可重复性。所有统计分析与图表制作均使用GraphPad Prism 8软件。数据以均值 表示(相对于未处理组)，采用柱状图展示。误差线代表标准差。图中数据点表示三次生物学重复。两组间显著性采用Student t检验，三组及以上比较采用单因素或双因素方差分析。
报告摘要。研究设计的更多信息详见本文关联的《自然》期刊报告摘要。
数据可用性
本研究所有数据详见本文方法部分和/或补充材料。NCBI登录号:AjMETTL3: OQ863733；AjULK: MH807452；AjYTHDF: OQ401099；AjEEF-1 : OQ401098。m6A-seq结果已上传至PRJNA774950。图7使用FigDraw(www.figdraw.com/，ID: OTARUffa00)绘制。未裁剪Western blot原图见补充图5-19。所有统计源数据见补充数据1。
收稿日期:2023年1月28日；录用日期:2023年5月11日；
在线发布日期:2023年5月20日
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致谢
本研究由国家自然科学基金(项目编号32073003、42176102)、浙江省自然科学基金(项目编号LZ19C190001)和宁波大学王宽诚教育基金资助。
作者贡献
J.Q.L.、Y.N.S.和C.H.L.提出研究构想并设计项目。J.Q.L.完成全部实验并撰写初稿。Y.N.S.、D.D.L.和C.H.L.参与文稿修订。所有作者均阅读并认可最终稿。
利益竞争
作者声明无利益竞争关系
补充信息
在线版本包含补充材料，详见https://doi.org/10.1038/s42003-023-04929-5
材料索取及通信请联系李成华
同行评审信息:Communications Biology感谢李华冰及其他匿名审稿人对本研究的评审贡献。责任编辑:George Inglis。审稿记录文件可查阅。
转载许可信息见http://www.nature.com/reprints
出版方声明:Springer Nature对出版地图中的司法管辖主张及机构从属关系保持中立
农产品质量安全国家重点实验室(宁波大学)，中国宁波。 海洋渔业科学与食品生产加工过程实验室(青岛海洋科学与技术试点国家实验室)，中国青岛。 电子邮件:lichenghua@nbu.edu.cn ↑
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