脂氧素A4通过FPR2依赖的METTL3调节抑制缺血性中风中中性粒细胞胞外诱捕网的形成
发布时间：
2025-04-05 17:00
脑研究
简报研究报告
脂氧素A4通过FPR2依赖的METTL3调节抑制缺血性中风中中性粒细胞胞外诱捕网的形成
娜薇 ，谭璐 ，顾建邦 ，蔡欢
上海市第十人民医院崇明分院神经内科，上海市崇明路2866号，上海202157，中国
新乡医学院第一附属医院骨科，河南省卫辉市健康路88号，河南453100，中国
文章信息
关键词:
LXA4
METTL3
中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成
铁死亡
缺血性中风
摘 要
背景:本研究旨在阐明脂氧素A4(LXA4)的神经保护作用是否与靶向缺血性中风(IS)中的中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)有关。
方法:建立大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠模型以评估脑梗死、脑含水量和神经功能缺损情况。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测髓过氧化物酶(MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、基质金属蛋白酶-9(MMP - 9)的活性。进行实时定量聚合酶链反应(RT - qPCR)和蛋白质印迹法(western blot)分析分子表达。进行荧光素酶报告基因测定以测量早期生长反应蛋白1(EGR1)对甲基转移酶样蛋白3(METTL3)启动子的影响。分别使用免疫荧光染色和CCK8测定法评估NETs的形成和细胞活力。
结果:LXA4降低了MCAO大鼠的脑梗死面积和脑含水量，改善了神经功能缺损，并减少了NETs相关指标(MPO、NE)的释放。LXA4在体外减少了NETs的形成以及MPO和NE的水平。此外，LXA4降低了 水平，同时增加了谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)的蛋白表达，并提高了体外细胞活力，表明LXA4对铁死亡有抑制作用。值得注意的是，METTL3过表达产生了相反的效果。此外，LXA4处理部分逆转了METTL3过表达对NETs形成和铁死亡的影响。发现LXA4对METTL3的抑制依赖于甲酰肽受体2(FPR2)。体内实验证实，LXA4通过抑制METTL3来抑制NETs的形成，从而减轻脑损伤。
结论:本研究表明，LXA4通过FPR2依赖的METTL3调节抑制NETs的形成，从而减轻缺血性中风中的脑损伤。
1. 引言
缺血性中风(IS)被认为是全球第二大死因，也是全球最重要的致残原因(Herpich和Rincon，2020)，对人类健康构成严重威胁。目前，静脉溶栓和血管内血栓切除术被认为是缺血性中风的主要治疗方法(Campbell等人，2019)。然而，这些治疗的效果往往受到干预所需的关键时间窗的限制。值得注意的是，更好地了解缺血性中风的病理机制有助于开发更有效的靶向治疗方法。
在缺血性中风期间，神经元细胞死亡会启动免疫系统并引发大脑炎症。中性粒细胞是对缺血性中风做出第一反应的先天免疫细胞，在缺血性中风后会在大脑中被募集和激活(Gong等人，2023)。中性粒细胞的大量聚集和激活会导致中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成，这是一种由DNA、组蛋白和各种颗粒蛋白(如髓过氧化物酶(MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE))组成的网状结构(Li等人，2022)。NETs的释放会破坏血脑屏障并加重脑损伤(Mutua和Gershwin，2021；Wang等人，2021)。Denorme等人指出在缺血性中风患者的脑组织中存在NETs(Denorme等人，2022)。最近的研究总结表明，NETs通过多种机制参与中风的病理过程(Zhao等人，2023)。因此，NETs被认为是缺血性中风预后和治疗的关键靶点(Denorme，Portier，2022；Liaptsi等人，2023)。
脂氧素(LXs)是花生四烯酸在脂氧合酶的作用下通过跨细胞途径合成的内源性介质。作为脂氧素家族中最重要的成员之一，脂氧素A4(LXA4)由于具有高结合亲和力，通常被记录为与甲酰肽受体2/脂氧素A4受体(FPR2/ALX，一种G蛋白偶联受体)结合(Sanchez - Garcia等人，2023)。LXA4在解决炎症方面起着关键作用，并具有减少中性粒细胞释放NE的特性(Jones等人，2012)。Guo等人证明，外源性LXA4可减轻蛛网膜下腔出血中的脑水肿和血脑屏障破坏，改善神经功能，并抑制中性粒细胞浸润，但FPR2 siRNA可消除LXA4的这些作用(Guo等人，2016)，这表明FPR2受体可能参与了LXA4的神经保护作用。激活的FPR2/ALX被认为是解决炎症性疾病中炎症的关键中介(Yang等人，2023)。此外，靶向中性粒细胞FPR2/ALX已被提出作为脑缺血/再灌注损伤的治疗策略(Vital等人，2016)。然而，在缺血性中风期间，LXA4 - FPR2信号通路保护脑损伤的下游机制仍不清楚。
N6 - 甲基腺苷(m6A)甲基化作为一种转录后RNA修饰，已被报道可调节中性粒细胞的迁移和激活(Teng等人，2023)。甲基转移酶样3(METTL3)是甲基转移酶复合物的重要组成部分，众所周知它可催化m6A修饰。目前的证据强调了METTL3在中性粒细胞功能中的调节作用。Luo等人指出，METTL3是通过TLR4/Myd88/NF - B途径控制中性粒细胞激活的重要调节因子(Luo等人，2023)。然而，METTL3在缺血性中风期间对NETs调节的参与尚未得到广泛研究。
在此，本研究旨在阐明LXA4是否通过靶向NETs来保护脑损伤，并研究METTL3在缺血性中风期间LXA4神经保护作用中的作用。
2. 材料与方法
2.1. 大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型
本研究获得了上海市第十人民医院动物伦理委员会的批准(批准编号:SHDSYY - 2022 - 1231)。采用雄性Sprague - Dawley大鼠(体重约 )建立大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠模型，这些大鼠由查尔斯河实验动物有限公司(中国上海)提供。所有大鼠均饲养在可控条件下，可自由获取食物和水，湿度为 ，温度为 ，光照/黑暗周期为12小时。将大鼠随机分为以下几组:假手术组、模型组(即MCAO大鼠组)、LXA4组(用LXA4治疗的MCAO大鼠组)、 组。此外，将MCAO大鼠随机分为四组:Ctrl + NC组(阴性对照组)、LXA4 + NC组、Ctrl + METTL3组、LXA4 + METTL3组，每组n = 5只。通过尾静脉向MCAO大鼠注射LXA4或过表达METTL3的分化HL - 60(dHL - 60)细胞。
MCAO模型的建立方法如先前所述(Hawkins等人，2014)。简而言之，用1.5%异氟醚对大鼠进行全身麻醉，然后将其仰卧放置。在颈部正中做一个切口，暴露颈总动脉(CCA)及其分支。结扎颈总动脉近端，并在颈外动脉(ECA)处做一个 角的切口。将一根涂有硅胶的单丝通过颈外动脉小心插入颈内动脉(ICA)，以阻塞大脑中动脉。MCAO 后，拔出单丝以恢复血流(再灌注)。术后 ，使用 微量注射器向侧脑室注射LXA4(5 ，0.3 mmol/L)或生理盐水(5 )。排除脑血流量减少不充分、手术过程中出血过多或死亡、体重显著减轻以及术后抑郁的大鼠。
2.2. 氯化三苯基四氮唑(TTC)染色
通过TTC染色评估脑梗死情况。大鼠安乐死后，立即将取出的脑组织在 下冷冻 ，然后切成2毫米厚的切片。将切片在 下用TTC染色液孵育 ，并拍照。使用ImageJ软件计算梗死体积。梗死体积 (对侧体积 - 同侧非缺血体积) (对侧体积) 。
2.3. 脑含水量
我们测量了MCAO大鼠的脑含水量以评估脑水肿情况。再灌注 后，称量全脑组织的重量(作为脑组织湿重)。将脑组织在 下干燥 后，再次称量其重量(作为脑组织干重)。根据以下公式计算脑含水量的比例: (湿重 - 干重)/湿重 。
2.4. 神经功能缺损评分
使用Zea Longa评分系统评估MCAO大鼠的神经功能缺损情况:0分，无神经功能缺损(正常行走)；1分，轻度神经功能损伤(对侧前肢不能完全伸展)；2分，中度神经功能损伤(向对侧旋转)；3分，重度神经功能障碍(向对侧倾倒)；4分，意识丧失且无自发运动活动。
2.5. 酶联免疫吸附测定(ELISA)
使用以下试剂盒分析脑组织或分化的HL - 60(dHL - 60)细胞中的中性粒细胞相关因子(髓过氧化物酶(MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、基质金属蛋白酶9(MMP - 9))和 水平:MPO活性检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，中国武汉)、大鼠NE酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海羽博生物技术有限公司，中国上海)、人NE/ELA2 ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)、人MMP - 9 ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)和细胞亚铁离子比色检测试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)。使用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解脑组织并匀浆，然后收集上清液进行分析。
2.6. m6A RNA甲基化定量分析
按照制造商的说明，使用EpiQuik m6A RNA甲基化定量检测试剂盒(P - 9005，Epigentek公司)对总RNA中的整体m6A RNA甲基化水平进行定量分析。
2.7. 实时荧光定量聚合酶链反应(RT - qPCR)
简而言之，将TRIzol试剂(赛默飞世尔科技公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)加入组织匀浆或dHL - 60细胞中提取总RNA，使用分光光度计测定其浓度。使用反转录试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司，中国北京)转录合成互补DNA(cDNA)。最后，在ABI - 7500系统中使用 Sybr Green qPCR Mix(北京艾德莱生物科技有限公司)进行RT - qPCR。采用 方法计算相对基因表达量。
以下是引物序列列表(5’ - 3’):
甲基转移酶样蛋白3(METTL3)(大鼠) - 正向引物(F):CACACTCCTCGGGGTTTGAT
甲基转移酶样蛋白3(METTL3)(大鼠) - 反向引物(R):ACAGTTAGTGGCGTGAGAGC
-肌动蛋白(大鼠) - 正向引物(F):ACCGAGCATGGCTACAGCGTCACC
-肌动蛋白(大鼠) - 反向引物(R):GTGGCCATCTCTTGCTCGGAGTCT
甲基转移酶样蛋白3(METTL3)(人) - 正向引物(F):AGATGGGGTAGAAAGCCTCCT
甲基转移酶样蛋白3(METTL3)(人) - 反向引物(R):TGGTCAGCATAGGTTACAAGAGT
-肌动蛋白(人) - 正向引物(F):ACAGAGCCTCGCCTTTGCC
-肌动蛋白(人) - 反向引物(R):TGGCCATCTCTTGCTCGAAG
甲酰肽受体2(FPR2)(人) - 正向引物(F):AGTCTGCTGGCTACACTGTTC
甲酰肽受体2(FPR2)(人) - 反向引物(R):TGGTAATGTGGCCGTGAAAGA
早期生长反应蛋白1(人)-正向引物:CGGCAGAAGGACAAGAAAGC
早期生长反应蛋白1(人)-反向引物:GGAAGTGGGCAGAAAGGATT.
2.8. 蛋白质免疫印迹法(WB)
简而言之，用RIRA缓冲液裂解组织匀浆或dHL - 60细胞，提取总蛋白，并使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行定量。经过电泳分离后，将蛋白质样品转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并用脱脂牛奶封闭。将膜依次与一抗(抗甲基转移酶样蛋白3(1:1000，武汉三鹰生物技术有限公司)、抗早期生长反应蛋白1(1:800，武汉三鹰生物技术有限公司)、抗谷胱甘肽过氧化物酶4(1:1000，武汉三鹰生物技术有限公司)、抗溶质载体家族7成员11(1:1000，武汉三鹰生物技术有限公司))在 下孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗在室温下孵育 。使用化学发光底物(中国合肥博仕生物)使蛋白条带可视化，并使用化学发光成像系统捕获图像。最后，使用Image J软件对蛋白条带进行灰度半定量分析。
2.9. 细胞处理与转染
从上海雅吉生物科技有限公司购买的人早幼粒细胞白血病细胞(HL - 60)在含有20%胎牛血清的伊斯科夫改良杜尔贝科培养基(IMDM，普诺赛)中培养。HL - 60细胞通过与全反式维甲酸在 下孵育5天，分化为中性粒细胞样的dHL - 60细胞。对于脂氧素A4(LXA4)处理组，将LXA4(100 nM)加入dHL - 60细胞中。将佛波酯(PMA，100 ng/ml)加入dHL - 60细胞中 以诱导中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成。此外，使用依拉司亭 诱导dHL - 60细胞发生铁死亡。
为了过表达甲基转移酶样蛋白3(METTL3)或敲低甲酰肽受体2(FPR2)，使用脂质体转染试剂2000(赛默飞世尔科技)将METTL3过表达质粒和靶向FPR2的小干扰RNA(北京奥科鼎盛生物科技有限公司)转染到dHL - 60细胞中。
2.10. 免疫荧光染色
使用髓过氧化物酶(MPO)和弹性蛋白酶的免疫荧光染色对NETs的形成进行定量。经PMA刺激后，用4%多聚甲醛固定dHL - 60细胞，并用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭。然后加入MPO和弹性蛋白酶抗体，在 下避光孵育过夜。第二天，将细胞与Alexa - Fluor 594偶联的二抗在 下共孵育 ，并用SYTOX Green对DNA进行染色。使用共聚焦显微镜捕获染色图像。
2.11. 细胞计数试剂盒 - 8(CCK8)
通过CCK8法检测细胞活力。将dHL - 60细胞接种到96孔板中。当细胞密度达到 时，向每孔加入CCK8(10 ，上海碧云天生物技术有限公司)，并在暗处孵育 。使用酶标仪(美国MD公司SpectraMax i3x)在 处测定吸光值。
2.12. 荧光素酶报告基因检测
扩增METTL3启动子区域，并将其克隆到荧光素酶报告基因载体(普洛麦格公司)中。将上述荧光素酶报告基因载体与EGR1过表达质粒或EGR1小干扰RNA共转染到HEK293T细胞中。 后，使用双荧光素酶报告基因检测系统(普洛麦格公司)评估相对荧光素酶活性。
2.13. 统计分析
所有统计分析均使用GraphPad Prism 8软件进行，数据以均值 标准差(SD)表示。两组间或多组间的比较采用Student’s t检验或单因素方差分析(One - way ANOVA)。当 时，表示差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1. 脂氧素A4(LXA4)对大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠的保护作用
在本研究中，在MCAO大鼠模型中采用注射方式给予LXA4。观察发现，LXA4显著减少了脑梗死面积和脑含水量，改善了MCAO大鼠的神经功能缺损(图1A - C)，这表明LXA4对MCAO大鼠具有神经保护作用。随后，还评估了中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的特异性指标(髓过氧化物酶(MPO)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE))。结果显示，LXA4处理后，MCAO引起的MPO和NE活性升高显著降低(图1D、E)，提示LXA4对中性粒细胞有影响。
3.2. LXA4下调甲基转移酶样蛋白3(METTL3)的表达以影响中性粒细胞
鉴于LXA4对中性粒细胞的影响，本研究采用类中性粒细胞的分化型HL - 60(dHL - 60)细胞进行体外研究。首先，我们发现LXA4明显下调了dHL - 60细胞中的整体N6 - 甲基腺苷(m6A)水平和METTL3的表达(图2A - C)。然后，通过过表达METTL3来验证METTL3是否参与了LXA4对dHL - 60细胞的影响。酶联免疫吸附测定(ELISA)数据显示，METTL3过表达导致dHL - 60细胞中基质金属蛋白酶 - 9(MMP - 9)和NE的活性增加，但LXA4处理产生了相反的效果。值得注意的是，LXA4处理部分消除了METTL3过表达对MMP - 9和NE释放的影响(图2D、E)。总体而言，这些结果表明LXA4通过下调METTL3的表达来影响中性粒细胞。
3.3. LXA4对中性粒细胞中METTL3的调节依赖于甲酰肽受体2(FPR2)
接下来，我们旨在研究LXA4对METTL3的调节是否依赖于FPR2受体。为此，合成了三条FPR2小干扰RNA(si - FPR2)序列以敲低FPR2受体，并通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT - qPCR)检测其干扰效率。选择干扰效率最显著的si - FPR2 - 3转染dHL - 60细胞(图3A)。如图3B - C所示，LXA4明显下调了METTL3和早期生长反应蛋白1(EGR1)的表达，而si - FPR2部分逆转了这种下调作用。此外，荧光素酶报告基因检测数据表明，EGR1增强了METTL3启动子的活性(图3D、E)。因此，上述数据表明LXA4对METTL3的调节依赖于FPR2。
3.4. LXA4对NETs形成的影响
考虑到LXA4对MCAO大鼠中NETs特异性指标的影响，进一步在体外研究了LXA4对NETs形成的影响。免疫荧光染色结果表明，在佛波酯(PMA)刺激的dHL - 60细胞中，LXA4处理抑制了NETs的形成，而METTL3过表达则促进了NETs的形成。此外，LXA4处理后，METTL3过表达引起的NETs形成增加被减弱(图4)。此外，在NETs相关蛋白酶(MPO和弹性蛋白酶)方面也观察到了类似的结果(图5)。总体而言，这些数据表明LXA4通过调节METTL3的表达来抑制NETs的形成。
3.5. LXA4对中性粒细胞铁死亡的影响
随后，还探究了LXA4对中性粒细胞铁死亡的影响。在依拉司丁(erastin)诱导的dHL - 60细胞中，LXA4处理可下调 水平，而METTL3过表达则上调该水平。此外，METTL3过表达诱导的 水平上调在LXA4处理后被下调(图6A)。另外，LXA4处理可增强依拉司丁诱导的dHL - 60细胞的活力，并增加谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)蛋白的表达。相反，METTL3过表达会削弱依拉司丁诱导的dHL - 60细胞的活力，并降低GPX4、SLC7A11蛋白的表达，然而，LXA4处理可消除METTL3过表达诱导的这些效应(图6B、C)。因此，这些发现揭示了LXA4通过调节来抑制中性粒细胞铁死亡
图1. LXA4对大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠的保护作用。建立MCAO大鼠模型以研究LXA4在缺血性中风中的作用。(A)测量MCAO大鼠的脑梗死体积。(B)通过测定脑含水量评估脑水肿情况。(C)评估神经功能缺损评分。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)法对梗死组织中髓过氧化物酶(MPO)(D)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)(E)的水平进行定量分析。与假手术组相比，**P < 0.01，***P < 0.001；与MCAO组相比，#P < 0.05，###P < 0.001。
图2. LXA4下调METTL3表达以影响中性粒细胞。从HL - 60细胞分化出类似中性粒细胞的dHL - 60细胞，然后用LXA4(100 nM)进行处理。(A)分析dHL - 60细胞中的总m6A水平。使用实时定量聚合酶链反应(RT - qPCR)(B)和蛋白质印迹法(WB)(C)检测METTL3的表达。使用ELISA法对基质金属蛋白酶9(MMP - 9)(D)和NE(E)的含量进行定量分析。与对照组或对照+阴性对照(Ctrl + NC)组相比，**P < 0.01，***P < 0.001；与对照+METTL3组相比，##P < 0.01，###P < 0.001。
图3. LXA4对中性粒细胞中METTL3的调节依赖于甲酰肽受体2(FPR2)。(A)使用RT - qPCR检测三种针对FPR2的干扰序列(si - FPR2)的干扰效率。在LXA4处理后，将si - FPR2转染到dHL - 60细胞中。使用RT - qPCR(B)和WB(C)检测METTL3和早期生长反应蛋白1(EGR1)的表达。(D、E)使用荧光素酶报告基因检测法确定EGR1对METTL3启动子的影响。与对照+阴性对照小干扰RNA(Ctrl + si - NC)组相比，**P < 0.01，***P < 0.001；与LXA4 + si - NC组相比，##P ，###P ；与载体组相比，$$$P ；与si - NC组相比，&&&P 。
图4. LXA4对中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成的影响。使用佛波酯(PMA)诱导dHL - 60细胞中NETs的形成。(A)采用共聚焦显微镜观察免疫荧光染色情况。(B)免疫荧光的平均强度。与Ctrl + NC组相比，***P < 0.001；与Ctrl + METTL3组相比，###P < 0.001。
3.6. LXA4的神经保护作用是通过靶向METTL3在体内抑制NETs形成来实现的
最后，用LXA4(脂氧素A4)和过表达METTL3(甲基转移酶样蛋白3)的分化型HL - 60细胞处理大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠，以验证LXA4在体内对中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成的调节作用。给予过表达METTL3的分化型HL - 60细胞后，我们观察到MCAO大鼠的梗死体积、脑含水量、神经功能缺损评分以及与NETs相关的蛋白酶(髓过氧化物酶MPO和中性粒细胞弹性蛋白酶NE)均增加。更重要的是，LXA4处理可部分逆转这些改变(图7)。综上所述，上述研究结果表明，LXA4通过抑制METTL3来抑制NETs的形成，从而减轻脑损伤。
4. 讨论
本研究的新颖之处在于发现LXA4通过靶向NETs的形成和中性粒细胞铁死亡发挥缺血性卒中(IS)神经保护作用；LXA4对中性粒细胞的作用是通过甲酰肽受体2(FPR2)/早期生长反应蛋白1(EGR1)下调METTL3实现的。
越来越多的研究证实了LXA4在缺血性卒中中的神经保护作用。先前的一项动物研究证实，急性缺血性卒中后注射LXA4可减少炎症因子的释放，显著减轻神经损伤、梗死体积和血脑屏障通透性(Tulowiecka等人，2021)。Li等人(2021)发现，LXA4通过Notch信号通路调节小胶质细胞极化来减轻脑缺血再灌注损伤。在本研究中，我们的主要发现是LXA4治疗可减少MCAO大鼠的脑梗死面积、脑含水量，并改善神经功能缺损，这与先前的研究结果一致(Li，Ding，2021；Wu等人，2012)。此外，LXA4治疗下调了MCAO大鼠中与NETs相关指标(MPO、NE)的水平，这表明LXA4在缺血性卒中中的神经保护作用可能与其抑制NETs有关。
随后，使用分化型HL - 60细胞来探索LXA4对中性粒细胞的影响。我们的体外实验表明，LXA4处理降低了分化型HL - 60细胞中的m6A(N6 - 甲基腺苷)水平和METTL3表达。最近的文献表明，包括METTL3在内的一些m6A相关调节剂与缺血性卒中中中性粒细胞的丰度密切相关(Zhao等人，2024)。本研究的进一步调查显示，METTL3过表达增强了基质金属蛋白酶 - 9(MMP - 9)和NE的活性，而LXA4处理可部分消除这种增强作用。总体而言，上述数据表明LXA4对中性粒细胞的影响可能与METTL3的下调有关。
图5. LXA4对分化型HL - 60细胞中MPO和弹性蛋白酶的影响。用佛波酯(PMA)诱导分化型HL - 60细胞形成NETs。对MPO(A)和弹性蛋白酶(B)进行免疫荧光染色。
图6. LXA4对中性粒细胞铁死亡的影响。用依拉司亭(erastin)处理分化型HL - 60细胞以诱导铁死亡。(A)使用酶联免疫吸附测定(ELISA)定量 水平。(B)使用细胞计数试剂盒 - 8(CCK8)测定法测量细胞活力。(C)使用蛋白质免疫印迹法(WB)评估谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)蛋白的表达。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，与对照组 + 阴性对照(Ctrl+NC)组相比；##P < 0.01，###P < 0.001，与对照组 + 过表达METTL3(Ctrl+METTL3)组相比。
LXA4(脂氧素A4)调节中性粒细胞中METTL3(甲基转移酶样蛋白3)表达的潜在机制尚需进一步研究。FPR2/ALX受体通常与内源性配体如LXA4和ANXA1(膜联蛋白A1)结合(Sanchez - Garcia, Jaen, 2023)，其激活可介导下游信号传导(Xu等，2021)。Brennan等人(2018)的研究表明，LXA4在EGR1(早期生长反应蛋白1)网络中发挥调节作用。EGR1作为一种转录因子，通常通过与靶基因的启动子结合来增强其转录。现有研究表明，EGR1可在转录水平上调节METTL3(Wang等，2023)。在我们的研究中，使用FPR2小干扰RNA(siRNA)来沉默FPR2/ALX受体。结果表明，LXA4对EGR1和METTL3的表达均有抑制作用，而si - FPR2可部分逆转这种抑制作用。此外，我们的结果证实EGR1可以激活METTL3的转录活性。综上所述，这些发现表明LXA4对中性粒细胞中METTL3表达的抑制依赖于FPR2。
图7. LXA4的神经保护作用是通过靶向METTL3来抑制体内中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成实现的。向注射了过表达METTL3的分化型HL - 60细胞的大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠给予LXA4。(A)测量MCAO大鼠的脑梗死体积。(B)评估脑含水量。(C)评估神经功能缺损评分。使用酶联免疫吸附测定(ELISA)定量检测梗死组织中髓过氧化物酶(MPO)(D)和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)(E)的水平。*P < 0.05，** ，** ，与对照组+阴性对照(Ctrl+NC)组相比；#P ，##P ，###P < 0.001，与对照组+过表达METTL3(Ctrl+METTL3)组相比。
由于METTL3可调节炎症细胞的功能，它被认为是炎症相关疾病的治疗靶点(Song等，2023)。Jia等人(2022)的研究表明，LXA4通过抑制METTL3来激活信号转导和转录激活因子6(STAT6)，从而促进前列腺癌中M2型巨噬细胞的极化。现有研究已证实METTL3在骨髓中性粒细胞的释放和激活中起调节作用(Luo等，2023)。我们的体外实验结果显示，METTL3过表达促进了NETs的形成和中性粒细胞铁死亡。近期研究表明，将NETs抑制剂递送至脑组织作为中风的治疗策略，可有效减少NETs的形成，从而减轻脑损伤后的神经炎症(Mu等，2024)。越来越多的证据表明NETs与铁死亡之间存在密切联系(Chen等，2023；Zhang等，2022)。铁死亡是一种以铁依赖性脂质过氧化为特征的新型细胞死亡形式。系统 -(由溶质载体家族3成员2(SLC3A2)和溶质载体家族7成员11(SLC7A11)组成)作为谷氨酸和半胱氨酸的转运体，与谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的生成密切相关(Xu等，2023；Zhang等，2021)。在本研究中，体外实验证实了LXA4通过下调METTL3来抑制NETs形成和中性粒细胞铁死亡的假设。这一假设得到了以下观察结果的证实:LXA4处理可部分逆转METTL3过表达的影响。为了进一步验证LXA4的神经保护作用与通过下调METTL3靶向中性粒细胞有关，通过尾静脉向MCAO大鼠注射过表达METTL3的分化型HL - 60细胞，随后进行LXA4处理。我们的体内实验结果表明，过表达METTL3的分化型HL - 60细胞促进了NETs的形成并加重了脑损伤，MCAO大鼠的梗死体积增加、脑含水量升高和神经功能缺损加重均证明了这一点。相比之下，LXA4处理减轻了这些损伤，这与介导METTL3下调有关。尽管本研究阐明了LXA4对缺血性中风(IS)中中性粒细胞功能的调节作用，但METTL3调节NETs和铁死亡的潜在机制在我们未来的研究中还需要更多的探索。
5. 结论
综上所述，我们证实了脂氧素A4(LXA4)通过抑制大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)的形成发挥神经保护作用。LXA4的神经保护作用是通过甲酰肽受体2(FPR2)/早期生长反应蛋白1(EGR1)/甲基转移酶样蛋白3(METTL3)轴实现的。本研究进一步加深了对LXA4减轻缺血性卒中(IS)脑损伤潜在机制的理解，为LXA4作为治疗IS的新型治疗剂提供了理论依据。
资金支持
本研究得到了上海崇明可持续发展科技项目(编号:CKY2022 - 41)以及新乡医学院第三附属医院开放项目的资金支持。
贡献者角色声明(CRediT)
顾建邦:软件、资源、调查、数据整理。谭璐:写作 - 审核与编辑、项目管理、方法学、调查、资金获取。魏娜:写作 - 初稿、方法学、调查、正式分析、概念化。蔡欢:可视化、验证、调查。
利益冲突声明
作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
不适用。
附录A. 支持信息
与本文相关的补充数据可在在线版本中找到，doi:10.1016/j.brainresbull.2024.111178。
数据可用性
数据将根据要求提供。
参考文献
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* 通信作者。
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脂氧素A4,LXA4
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