补充苏卡拉莓(Euterpe edulis Mart.)对肥胖成年人单核细胞表观遗传标记的调节作用:一项双盲随机试验
发布时间：
2025-06-12 15:12
补充苏卡拉莓(Euterpe edulis Mart.)对肥胖成年人单核细胞表观遗传标记的调节作用:一项双盲随机试验
阿琳·博韦托·圣玛丽娜 、乔瓦娜·贾马尔 、莱伊斯·瓦莱斯·梅尼蒂 、海伦娜·德·卡西亚·塞萨尔 、 韦尔迪安娜·维拉·德·罗索 、何塞·罗尼·瓦斯康塞洛斯 、莉拉·米萨·大山 和卢西亚娜·佩莱格里尼·皮萨尼
1 圣保罗联邦大学健康科学跨学科研究生课程，巴西桑托斯 11015 - 020；alinesantamarina@gmail.com(A.B.S.)；gi.jamar@gmail.com(G.J.)；laisvmennitti@hotmail.com(L.V.M.)；helenacesarbr@gmail.com(H.d.C.C.)
2 圣保罗联邦大学生物科学系，巴西桑托斯 11015 - 020；veriderosso@yahoo.com(V.V.d.R.)；jrcvasconcelos@gmail.com(J.R.V.)
3 圣保罗联邦大学生理学系，巴西圣保罗 04023 - 062；lmoyama@gmail.com
4 圣保罗联邦大学健康与社会研究所生物科学系营养与内分泌生理学实验室(LaNFE)，巴西圣保罗州桑托斯市马蒂亚斯村席尔瓦·雅尔丁街136号一楼，邮编11015 - 020
* 通讯作者:lucianapisani@gmail.com；电话:+55 - 13 - 3878 - 3759
收稿日期:2018年10月3日；录用日期:2018年11月29日；发表日期:2018年12月3日
摘要:营养基因组学是肥胖研究领域的一个新兴方向，因为表观遗传标记可受包括饮食在内的环境因素影响而改变。鉴于苏卡拉莓富含花青素、单不饱和脂肪酸(MUFAs)和纤维，它具有表观遗传调节的潜力。我们评估了补充苏卡拉莓对成年肥胖人群血清脂肪酸谱和单核细胞表观遗传标记的调节作用。这是一项随机双盲对照试验，招募了27名年龄在31至59岁之间、体重指数在30.0至 之间的肥胖(男女皆有)参与者，将其分为苏卡拉莓组( 苏卡拉莓冻干果肉)或安慰剂组( 麦芽糊精)，干预周期为6周。在补充前后采集血样。将获得的血清和单核细胞进行培养，并用脂多糖作为促炎刺激物进行刺激。孵育 后，收集细胞和上清液并进行分析。苏卡拉莓改善了血清中不饱和脂肪酸的水平。治疗后，所评估的表观遗传标记得到改善。此外，治疗后甲基化DNA水平升高。我们发现补充苏卡拉莓可作为单核细胞中甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)的预测指标。综上所述，补充苏卡拉莓改善了血清脂肪酸谱，调节了肥胖个体单核细胞的表观遗传标记。
关键词:肥胖；表观遗传学；脂肪酸；单不饱和脂肪酸；苏卡拉莓；单核细胞
1. 引言
肥胖是一种多因素疾病，涉及遗传和环境因素[1]，易引发慢性非传染性疾病[2,3]。从这个意义上说，营养基因组学是一个新兴的研究领域，主要是因为表观遗传标记在整个生命过程中具有可塑性，即使程度不同，也可受包括饮食在内的环境因素影响而改变[4]。
表观遗传学基于基因表达的可逆变化，不涉及DNA核苷酸序列的改变。基因转录沉默和激活的主要表观遗传调控因素包括DNA甲基化的改变、 二核苷酸的胞嘧啶残基变化、组蛋白赖氨酸残基的共价修饰(甲基化和乙酰化)以及染色质结构的变化[5 - 7]。
转录沉默过程通过DNA甲基化调节基因表达，这需要招募DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3a和DNMT3b)、甲基CpG结合蛋白(MeCP)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)和组蛋白甲基转移酶(HMT)[8]。然而，关于肥胖患者单核细胞中DNA组蛋白甲基化的研究仍然有限[9 - 11]。有证据表明，趋化因子结合基因的启动子会有节律地将DNMT酶招募到单核细胞中，通过控制促炎单核细胞的数量使周期性基因沉默[12,13]。
近年来，越来越多的报告表明，植物化学物质(如花青素)可以通过调节特定的表观遗传成分(如DNA甲基转移酶(DNMTs)、组蛋白去乙酰化酶(HDACs)、组蛋白乙酰转移酶(HATs)和小的非编码RNA(miRNAs))来靶向表观遗传机制，从而发挥有益作用，调节肥胖患者的脂肪酸 氧化基因[14]。另一种能够调节表观遗传机制的营养素是脂肪酸。体内和体外研究表明，不饱和脂肪酸能够降低基因位点上促炎基因的活性，并提高线粒体能量消耗 。然而，这些机制在文献中仍鲜有阐述。
茹萨拉莓(Euterpe edulis Mart.)——一种棕榈树的果实——常见于大西洋雨林。它是一种小而圆的果实，在成熟过程中颜色会从绿色变为黑色，与用于制作阿萨伊果的Euterpe oleracea果实类似。茹萨拉果肉最常被制成果汁饮用，后来也被用作许多食品(如冰淇淋、糖果或饮料)的原料[16]。
此外，最近的研究表明，茹萨拉莓具有很高的营养价值和健康益处，可能是一种有待开发的潜在表观遗传调节剂[17 - 21]。它富含植物化学物质，主要是花青素矢车菊素3 - 芸香糖苷和单不饱和脂肪酸(MUFA)，如油酸(C18:1n9)，以及膳食纤维。鉴于此，我们计划评估茹萨拉果肉对成年肥胖人群血清脂肪酸谱的影响，以及其调节单核细胞表观遗传标记的能力。
2. 材料与方法
2.1. 实验设计
这是一项随机双盲、安慰剂对照研究。临床研究开始后，方法学未作任何更改。随机化由软件(www.random.org)完成，对研究来说是一个盲点，志愿者在完成首次评估并同意参与研究时进行分组。
纳入的样本量是根据G*Power软件计算确定的[22]。根据用于评估主要结局统计参数的分析方法选择检验 族。我们将效应值设定为0.8，功效 、误差概率 设定为 ， 设定为0.05。计算后，增加了 的安全余量，最终样本量为28名志愿者。对于蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链反应(RT - PCR)分析，按照上述步骤计算子样本量，考虑先前报道的均值和均值标准误差 ——为获得可靠的统计结果，每组样本量至少为4。
2.2. 参与者
本研究纳入了27名肥胖个体(身体质量指数 - BMI )[29]，男女皆有，年龄在31至59岁之间。该临床试验已预先提交并获得圣保罗联邦大学伦理委员会 - 巴西平台数据库(CEP - UNIFESP nº 0319/2017)的批准。它也符合《赫尔辛基宣言》的指导原则，所有参与者均提供了书面知情同意书。
采用了以下排除标准:身体质量指数(BMI)超出建议范围；患有传染病和/或严重慢性病；使用会干扰炎症级联反应、脂质代谢和食物摄入的药物；有酗酒和/或药物滥用问题；怀孕或处于更年期。
2.3. 人体测量学测量
在为期6周的补充剂干预前后对人体测量学数据进行评估。为测量体重，受试者穿着轻便衣物且不穿鞋，站在精度为 的电子秤(托利多 ，巴西圣保罗)上称重。身高测量时，受试者直立，身体与测量尺接触，头部保持水平(即法兰克福平面)，使用标准壁挂式身高计(桑尼 ，标准型，巴西圣保罗)进行测量。腰围在自然呼气后测量，测量位置为髂嵴和最后一根肋骨之间的中点[30]，并参考国际糖尿病联合会(IDF)提出的临界值[31]。
计算身体质量指数(BMI)——体重(千克)/身高 ，并按照世界卫生组织的建议进行分类。还计算了腰高比(W/H)，临界值设定为0.5[32]。
2.4. 补充剂干预
补充剂干预持续6周，志愿者每周领取分装好的小袋，其中包含 的冻干巴西棕榈莓果肉或 的调味麦芽糊精(作为安慰剂)。志愿者被要求每天早上将一小袋补充剂加入日常早餐中食用。同时，要求参与者在补充剂干预期间保持相同的生活方式和饮食习惯。
每颗巴西棕榈莓重约 ，直径约为 。多汁的薄中果皮和外果皮可用于制取果肉。每天食用5克冻干巴西棕榈莓果肉相当于食用 的新鲜巴西棕榈莓果肉，其食用量相当于家庭中一个冰淇淋球的量[16]。
水果剂量的确定基于先前的研究，综合考虑了果肉中的花青素含量以及我们之前进行的剂量反应测试结果，以提供具有有益生理效应的摄入量[19 - 21, 33]。桑塔马里纳等人[21]先前已对巴西棕榈莓(Euterpe edulis Mart.)的成分进行了总结，具体内容见表1。
表1. 改编自桑塔马里纳等人[21]的巴西棕榈莓成分表。
| 朱萨拉棕榈果浆(Juçara Pulp) | 新鲜物质在 中的浓度 | 参考文献 | |
| 扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscope，S.E.M.) | |||
| 碳水化合物(克) | 28.3 | 3.5 | [18] |
| 蛋白质(克) | 6.0 | 0.3 | [18] |
| 脂质(克) | 29.2 | 0.9 | [18] |
| 棕榈酸(%) | 34.43 | 3.42 | [17] |
| 硬脂酸(%) | 3.01 | 0.30 | [17] |
| 饱和脂肪酸(%)(Saturated Fatty Acids，SAT) | 37.44 | [17] | |
| 棕榈油酸(%) | 2.61 | 0.26 | [17] |
| 油酸(%) | 35.96 | 3.08 | [17] |
表1. 续
| 朱丽娜棕榈果肉(Juçara Pulp) | 新鲜物质在 中的浓度 | 参考文献 | ||
| 扫描电子显微镜(Scanning Electron Microscopy，S.E.M.) | ||||
| 单不饱和脂肪酸(MUFA，%) | 38.57 | [17] | ||
| 亚油酸(%) | 19.18 | 1.89 | [17] | |
| 亚麻酸(%) | 0.91 | 0.20 | [17] | |
| 多不饱和脂肪酸(PUFA，%) | 20.08 | [17] | ||
| 纤维(克) | 28.3 | 0.3 | [18] | |
| 灰分(克) | 8.8 | 0.8 | [18] | |
| 能量值(千卡) | 400.0 | 23.9 | [18] | |
| 矢车菊素 -3- 芸香糖苷(毫克) | 191.0 | 6.5 | [34] | |
| 矢车菊素 -3- 葡萄糖苷(毫克) | 71.4 | 2.1 | [34] | |
| 总花青素(毫克) | 262.4 | 8.6 | [34] | |
| 总酚类化合物(毫克) | 415.1 | 22.3 | [18] | |
SFA:膳食饱和脂肪酸总量；MUFA:膳食单不饱和脂肪酸总量；PUFA:膳食多不饱和脂肪酸总量。
2.5. 膳食摄入
在补充期前后，通过自我报告的3天膳食记录来评估膳食摄入量。为了解参与者的饮食习惯，3天膳食记录中包含一天周末的自我报告。对获得的数据进行调整，并使用特定软件Avanutri 4.0 Revolution(Avanutri & Nutrition Services and Informatics Inc.，巴西里约热内卢州特雷斯里奥斯市)分析这些记录的平均值。
2.6. 样本采集
在补充期前后，于 禁食后，从肘前静脉采集血样(25mL)，置于含125国际单位肝素钠的试管中。将 的血液在 条件下以 的转速离心 以获得血清，其余 用于分离单核细胞。外周血单核细胞(PBMCs)是在室温下用组织分离液1077和组织分离液1119以 的转速离心 获得的。为了从淋巴细胞中分离出单核细胞，进行了细胞培养。孵育后，单核细胞附着在细胞培养板上，而淋巴细胞分散在细胞培养基中，将其弃去。将附着的单核细胞在含或不含脂多糖(LPS)的RPMI - 1640培养基中于 条件下孵育，该培养基添加了胎牛血清和抗生素 链霉素和 青霉素)。孵育24小时后，收集上清液和单核细胞以进行下一步实验分析。本研究的任何分析均未采用样本合并的方法。
2.7. 采用气相色谱/火焰离子化检测法分析血清脂肪酸
采用气相色谱仪(瓦里安GC 3900)结合火焰离子化检测(FID)和CP - 8410自动进样器(美国加利福尼亚州核桃溪市)分析血清游离脂肪酸谱。使用乙酰氯(甲醇中含5%盐酸)制备脂肪酸甲酯(FAMEs)[35]。样品在毛细管柱(CP Wax 52 CB，瓦里安，美国加利福尼亚州森林湖市；厚度0.25μm，内径 ，长度 )上进行分析。以氢气作为载气，线速度为 。温度程序为在 保持 ，然后以 的速率升温至 ，最后保持 。进样口和FID的温度分别为250和 。通过与已知的FAMEs标准品(Supelco，37种成分；Sigma - Aldrich；混合物，Me93，Larodan和Qualmix，PUFA鱼M，鲱鱼油，Larodan)的保留时间进行比较来鉴定脂肪酸。数据以总脂肪酸的百分比表示。
2.8. 总DNA甲基化和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)酶活性
使用EpiQuik细胞核提取试剂盒(可进行100次检测)提取单核细胞的细胞核。使用MethylFlash甲基化DNA 5 - 甲基胞嘧啶定量试剂盒(比色法)和Epigenase组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性/抑制直接检测试剂盒(比色法，可进行96次检测，美国EPIGENTEK公司)，分别对单核细胞的核提取物进行全基因组DNA甲基化和HDAC酶活性的重复分析。对于这两种试剂盒，所有步骤均遵循产品附带方案中制造商的建议。
2.9. RNA提取和逆转录 - 聚合酶链反应(RT - PCR)
按照制造商的建议，使用Trizol试剂 (美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司)提取单核细胞的总RNA。使用NanoDrop ND - 2000(美国特拉华州威尔明顿市NanoDrop技术公司)测量RNA浓度。通过 比值评估RNA纯度，其值在1.8至2.0之间。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司)将2微克总RNA样本进行逆转录，以合成互补DNA(cDNA)。所用的特异性引物见表2。
表2. 用于RT - PCR的引物序列。
| 靶基因 | 序列 |
| DNA甲基转移酶1(DNMT1) | -TCCTACGCCATGCCCAGTTTG- (正义链) -GAAGATGGGCGTCTCATCATCG- (反义链) |
| DNA甲基转移酶3a(DNMT3a) | -GCCCATTCGATCTGGTGATTG- (正义链) |
| -TCGTAAAGTCCCTTGCGGGC- (反义链) | |
| DNA甲基转移酶3b(DNMT3b) | -TGTGCAGAGTCCATTGCTGTAGGA- (正义链) |
| -GCTTCCGCCAATCACCAAGTCAAA- (反义链) | |
| 甲基CpG结合蛋白2(MeCP2) | 5’-CAGCTCCAACAGGATTCCATGGT-3’ (正义链) |
| -TGATGTCTCTGCTTTGCCTGCCT- (反义链) | |
| 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT) | -CCCTGGCGTCGTGATTAGTG- (正义链) -TCGAGCAAGACGTTCAGTCC- (反义链) |
使用QuantStudioTM 7 Flex(赛默飞世尔科技公司)中的SYBR green PCR预混液，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)对相对信使核糖核酸(mRNA)水平进行双份测定。以次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因水平作为内参。使用序列检测软件(赛默飞世尔科技公司)获取结果，并采用Livak和Schmittgen先前描述的 方法以相对增加量表示结果[36]。
2.10. 蛋白质免疫印迹法(Western Blotting)
将单核细胞沉淀洗脱，并在特定裂解缓冲液中孵育 。将样品在 条件下离心 ，温度为 ，然后收集上清液。使用布拉德福德试剂(巴西圣保罗州科蒂亚市的LGC实验室公司)对总蛋白浓度进行双份测定，并将每个样品的蛋白浓度归一化至 。进行 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - PAGE)以分离蛋白质样品，然后将其转移至硝酸纤维素膜(美国伯乐公司)上。将膜在室温下用1%牛血清白蛋白溶液封闭过夜。将膜与以下一抗孵育过夜:DNA甲基转移酶3a(DNMT3a，sc - 20703)；DNA甲基转移酶3b(DNMT3b，sc - 20704)(美国加利福尼亚州圣克鲁斯市的圣克鲁斯生物技术公司)；DNA甲基转移酶1(DNMT1，ab13537)；甲基CpG结合蛋白2(MeCP2，ab2829)(英国剑桥市的艾博抗公司)。以 -肌动蛋白(ab6276；英国剑桥市的艾博抗公司)作为内参。将特异性辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育 。加入增强化学发光试剂(美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市的伯乐公司)后，使用Alliance 4.7设备(英国剑桥市)扫描，通过增强化学发光法使条带可视化。使用Scion Image软件(Scion Image - Release Beta 3b；美国马里兰州弗雷德里克市的美国国立卫生研究院)对条带强度进行定量分析。
2.11. 统计分析
将获得的数据进行格鲁布斯(Grubb)检验以检测离群值。使用夏皮罗 - 威尔克(Shapiro - Wilk)检验进行正态性检验，使用莱文(Levene)检验进行方差齐性检验。对于参数变量，采用双向方差分析(ANOVA)，随后进行邦费罗尼(Bonferroni)事后检验以比较各组。使用皮尔逊(Pearson)相关性分析来验证变量之间的关联。应用多元线性回归来确定表观遗传标志物的预测因子。所有统计检验均在PASW Statistics 22.0版本软件中进行。结果以均值 均值标准误(S.E.M.)表示，采用的显著性水平为 。
3. 结果
3.1. 饮食摄入和人体测量指标
通过分析志愿者为期3天的自我报告饮食记录，可以获得志愿者在补充期开始时和结束后的能量摄入以及所摄入宏量营养素的比例值。无论是实验组之间还是评估期间，饮食摄入均无差异(表3)。
表3. 6周治疗期前后的饮食摄入情况。
| 安慰剂 | 茹萨拉果 | ||||
| 初始 | 最终 | 初始 | 最终 | ||
| 能量(千卡) | 0.947 | ||||
| 碳水化合物(克) | 0.740 | ||||
| 碳水化合物(%) | 0.301 | ||||
| 蛋白质(克) | 0.710 | ||||
| 蛋白质(%) | 0.172 | ||||
| 脂质(克) | 0.908 | ||||
| 脂质(%) | 0.912 | ||||
| 饱和脂肪酸(SFA) | 0.544 | ||||
| 单不饱和脂肪酸(MUFA) | 0.912 | ||||
| 多不饱和脂肪酸(PUFA) | 0.337 | ||||
饱和脂肪酸总量(SFA):膳食饱和脂肪酸总量；单不饱和脂肪酸总量(MUFA):膳食单不饱和脂肪酸总量；多不饱和脂肪酸总量(PUFA):膳食多不饱和脂肪酸总量。通过双向方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验对这些变量进行比较。
在随机分组中，干预前后人体测量指标(体重和腰围)均无变化。同样，在补充期前后，各组之间的身体质量指数(BMI)和腰高比也没有差异。这些人体测量学变量也表明，如表4所示，两组的肥胖程度相似。
表4. 样本描述性特征。
| 安慰剂 | 茹萨拉果 | ||||
| 初始 | 最终 | 初始 | 最终 | ||
| 男/女 | 06/08 | 05/08 | - | ||
| 年龄(岁) | - | ||||
| 身高(米) | - | ||||
| 体重(千克) | 0.700 | ||||
| 0.440 | |||||
| 腰围(厘米) | 0.608 | ||||
| 腰高比 | 0.809 | ||||
WC:腰围；W/H:腰高比。这些变量通过双向方差分析(ANOVA)和Bonferroni事后检验进行比较。
3.2. 血清脂肪酸谱
评估志愿者在补充期前后的血清脂肪酸谱时，值得注意的是，巴西棕榈莓组的脂肪酸谱有所改善。与安慰剂组相比，补充后巴西棕榈莓组血清中检测到的ΣSFA(饱和脂肪酸总和)有所降低 。
补充期后，与安慰剂组 相比，巴西棕榈莓组样本中检测到的 MUFA(单不饱和脂肪酸总和)有所增加。这种变化主要与摄入巴西棕榈莓后C16:1n7和C18:1n9脂肪酸的增加 有关。补充巴西棕榈莓后， PUFA (多不饱和 脂肪酸总和)有所增加 。此外，与治疗前的基线测量值 相比，治疗后巴西棕榈莓组的 水平升高， 比值也有所改善。这些结果见表5。
表5. 实验组补充6周前后的血清脂肪酸谱。
| 脂肪酸(占总鉴定量的百分比) | 安慰剂 | 茹萨纳棕榈果 | |||
| 初始 | 最终 | 初始 | 最终 | ||
| 饱和脂肪酸总量(ΣSFA) | 0.032 | ||||
| C14:0 | 0.604 | ||||
| C16:0 | 0.494 | ||||
| C17:0 | 0.985 | ||||
| C18:0 | 0.680 | ||||
| C20:0 | 0.193 | ||||
| C24:0 | 0.223 | ||||
| 单不饱和脂肪酸总量(ΣMUFA) | 0.034 | ||||
| 十六碳一烯酸(C16:1n7) | 0.031 | ||||
| 油酸(C18:1n9) | 0.049 | ||||
| 反式-11-十八碳一烯酸(C18:1n7) | 0.359 | ||||
| 多不饱和脂肪酸总量(ΣPUFA) | 0.834 | ||||
| 亚油酸(C18:2n6) | 0.831 | ||||
| γ-亚麻酸(C18:3n6) | 0.658 | ||||
| 十八碳三烯酸(C18:3n4) | 0.652 | ||||
| 十八碳四烯酸(C18:4n3) | 0.783 | ||||
| 二十碳二烯酸(C20:2n6) | 0.427 | ||||
| 双高-γ-亚麻酸(C20:3n6) | 0.466 | ||||
| 花生四烯酸(C20:4n6) | 0.356 | ||||
| 二十碳三烯酸(C20:3n3) | 0.552 | ||||
| 二十碳四烯酸(C20:4n3) | 0.982 | ||||
| 二十碳五烯酸(C20:5n3) | 0.496 | ||||
| 二十一碳五烯酸(C21:5n3) | 0.858 | ||||
| 二十二碳四烯酸(C22:4n6) | 0.259 | ||||
| 二十二碳五烯酸(C22:5n3) | 0.815 | ||||
| 二十二碳六烯酸(C22:6n3) | 0.537 | ||||
| ω-3多不饱和脂肪酸总量(ΣPUFA w-3) | 0.044 | ||||
| ω-6多不饱和脂肪酸总量(ΣPUFA w-6) | 0.532 | ||||
| ω-6/ω-3 | 0.036 | ||||
具有统计学意义的比较通过表格中添加的符号表示:# 基线与治疗后； 安慰剂组与巴西莓(juçara)组。这些变量通过双向方差分析(ANOVA)和 Bonferroni 事后检验进行比较。
3.3. 表观遗传标记物基因表达
安慰剂组 + 脂多糖(LPS)在 治疗前和 治疗后，DNA 甲基转移酶 1(DNMT1)的信使核糖核酸(mRNA)水平均降低。治疗前，未添加 LPS 的巴西莓组与安慰剂组 相比，DNMT1 mRNA 水平较低。此外，未添加 LPS 的安慰剂组治疗后与治疗前水平 相比，DNMT1 水平降低。如图 1A 所示，治疗后，巴西莓组 + LPS 与安慰剂组( )相比，DNMT1 mRNA 水平升高。
图 1. 补充前后各组单核细胞表观遗传标记物基因表达:(A)DNMT1；(B)DNMT3a；(C)DNMT3b；(D)甲基 CpG 结合蛋白 2(MeCP2)。所有分析使用的内参基因为次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因表达。* 未添加 LPS 与添加 LPS；# 基线与治疗后； 安慰剂组与巴西莓组。( 每组)。
治疗前，安慰剂组中 DNMT3a mRNA 水平受 LPS 刺激 而降低，治疗前，未添加 LPS 的巴西莓组与安慰剂组 相比，DNMT3a 水平也降低。治疗后，巴西莓 + LPS 组高于安慰剂 + LPS 组 。治疗后，未添加 LPS 的安慰剂组与基线相比，DNMT3a mRNA 水平降低 。相反，治疗后，巴西莓组与治疗前测量值 相比，DNMT3a 水平升高，如图 1B 所示。
治疗前，添加 LPS 的安慰剂组与未添加 LPS 的安慰剂组 相比，DNMT3b mRNA 水平降低。此外，治疗前，未添加 LPS 的巴西莓组 DNMT3b mRNA 水平较低( )。治疗后，未添加 LPS 的安慰剂组与基线相比，DNMT3b 水平降低 ，治疗后，LPS 刺激与未添加 LPS 的安慰剂组相比，该基因水平升高 。与治疗前测量值相比，无论是否添加 LPS，补充巴西莓均使 DNMT3b mRNA 水平升高(两组均为 )。具体而言，治疗后，巴西莓组 + LPS 与未添加 的巴西莓组相比，水平较低；然而，巴西莓 + LPS 组的 DNMT3b 水平高于安慰剂 + LPS 组( ；图 1C)。
与未添加脂多糖(LPS)的安慰剂组相比，添加LPS的安慰剂组在预处理时甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)的信使核糖核酸(mRNA)水平更低 。此外，与未受LPS刺激的安慰剂组相比，预处理时紫莓(juçara)组的MeCP2水平更低( )。补充紫莓后，未添加LPS的安慰剂组的MeCP2水平与基线相比有所降低 。与预处理测量值相比，补充紫莓后，两个紫莓组(添加和未添加LPS)的MeCP2 mRNA水平均更高(分别为 和 )。尽管如此，补充紫莓并添加LPS的处理组在处理后的MeCP2水平高于其安慰剂组 ；此外，如图1D所示，补充紫莓并添加LPS的处理组的MeCP2水平低于未添加LPS的紫莓组( )。
3.4. 表观遗传标记物的蛋白表达
与基线水平相比，补充紫莓并添加LPS的处理组在处理后DNA甲基转移酶3a(DNMT3a)的蛋白表达增加( ；图2B)。此外，补充紫莓后，两个紫莓组(添加和未添加LPS)的MeCP2表达均高于预处理评估值( ，无论是否添加LPS)。此外，如图2D所示，补充紫莓后，两个紫莓组(未添加和添加LPS)的MeCP2表达均高于各自的安慰剂组(分别为 和 )。DNA甲基转移酶1(DNMT1)和DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)的蛋白表达在处理前后的各实验组之间均无差异(图2A、C)。
图2. 补充前后各组单核细胞表观遗传标记物的蛋白表达:(A)DNMT1；(B)DNMT3a；(C)DNMT3b；(D)MeCP2。所有分析均以 -肌动蛋白的蛋白表达作为内参。# 基线与处理后比较； 安慰剂组与紫莓组比较。(每组 )。
3.5. 组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性和总DNA甲基化
处理后，如图3A所示，补充紫莓并添加LPS的处理组的总组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性与其预处理水平相比有所增加( )，并且与处理后的添加LPS的安慰剂组相比也有所增加( )。同样，补充紫莓并添加LPS的处理组在处理后的DNA甲基化水平与预处理相比有所增加( )(图3B)。
图3. (A)单核细胞的总HDAC活性和(B)甲基化DNA水平。# 基线与处理后比较； 安慰剂组与紫莓组比较。(每组 )。
3.6. 血清脂肪酸谱可预测表观遗传标记物的基因表达
在对所有评估的脂肪酸和表观遗传标记物进行皮尔逊相关性检验后，我们选择了DNMT3a、MeCP2、单不饱和脂肪酸总和(ΣMUFA)、棕榈油酸(C16:1n7)和油酸(C18:1n9)这些变量来应用回归模型。多元线性回归分析确定，紫莓处理( )以及血清中油酸(C18:1n9)的浓度是MeCP2 mRNA水平的预测因子( )，如表6所示。
表6. 单核细胞MeCP2 mRNA水平与紫莓处理及血清中油酸浓度的多元线性回归分析。
| 甲基-CpG结合蛋白2信使核糖核酸(MeCP2 mRNA) | |||||
| 3 | p | 95%置信区间(95% CL) | 病毒感染因子(VIF) | ||
| 含茹卡刺葵提取物(Jucara S) | 0.362 | 0.602 | 0.014 | 0.178至1.304 | 1.000 |
| 油酸(C18:1n9) | 0.410 | 0.640 | 0.008 | 0.013至0.071 | 1.000 |
CL:置信区间；数据为；对性别、年龄和治疗等混杂因素进行校正后的数据。 茹卡拉(Juçara)是一个分类变量；VIF:方差膨胀因子。
4. 讨论
我们的研究结果表明，补充茹卡拉(Juçara)果肉能够提高血清中单不饱和脂肪酸(MUFA)的水平，这预示着从肥胖成年人中分离出的单核细胞会发生表观遗传调控。这表明血清脂肪酸谱的改变可能会调节表观遗传标记物的表达，并能调节肥胖成年人的炎症和代谢途径。脂质摄入和血液中脂肪酸谱与代谢性疾病的发展密切相关 。我们的研究结果显示，在样本初始采集期间，血清脂肪酸的组成没有统计学差异，这表明所选分组随机化之间具有比例相似性。补充期结束后，可以观察到茹卡拉组中饱和脂肪酸(SFA)的减少。治疗后，循环中总单不饱和脂肪酸也有所增加，这主要归因于棕榈油酸(C16:1n7)和油酸(C18:1n9)。这些血清脂肪酸的增加直接反映了茹卡拉果肉的特性，因为所鉴定出的脂肪酸与果肉成分中发现的脂肪酸一致 [17]。尽管多不饱和脂肪酸(PUFA)的总水平没有变化，但 多不饱和脂肪酸的含量增加了，并且食用茹卡拉果肉后 比值有所改善。最近，饮食中 比值对心血管疾病和炎症性疾病的影响已被讨论。随着食品工业化的发展， 脂肪酸的消费量增加，而 脂肪酸的摄入量减少。这一过程使通常的摄入比值从大约 1:1 到 2:1 变为近期西方饮食模式中的 15:1 到 40:1。目前，一些研究提出最佳的 -6/ -3 比值可达 4:1；然而，关于摄入量的建议尚未达成共识 [39]。 比值的重要性基于 去饱和酶的竞争作用。高剂量的亚油酸(C18:2n6)会降低 -亚麻酸(C18:3n3)向二十碳五烯酸(EPA C20:5n3)和二十二碳六烯酸(DHA C22:6n3)的酶促转化，从而有利于花生四烯酸(C20:4n6)的增加 [40]。从这个意义上说，补充后 比值的改善可能是由于茹卡拉脂质的组成，并且可能减少了花生四烯酸产生的炎症标记物。
这些结果表明，补充剂能够改善血清中循环脂肪酸的谱，主要是通过增加 多不饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸。单不饱和脂肪酸最常见的来源是橄榄油。然而，一些坚果和水果也是 脂肪酸的来源。众所周知，食用富含 脂肪酸(占饮食摄入量的 3 - 23%)的饮食对减少肥胖和心血管风险以及改善血清参数(如高密度脂蛋白胆固醇(HDL - c)和低密度脂蛋白胆固醇/高密度脂蛋白胆固醇(LDL - c/HDL - c)比值)具有积极作用 [41 - 44]。
即使单不饱和脂肪酸(MUFA)的摄入量不同，无论其摄入或补充是否遵循用于均衡饮食的膳食参考摄入量(DRI)，单不饱和(MUFA)脂肪酸都能够发挥积极作用[45]。与此同时，关于单不饱和脂肪酸调节肥胖个体免疫系统的作用，目前讨论较少。从这个意义上说，摄入如油酸(C18:1n9)这类单不饱和(MUFA)脂肪酸可能会发挥抗炎作用，并改善胰岛素敏感性。在人类和动物肥胖模型中，摄入单不饱和脂肪酸与抗炎细胞因子生成增加和促炎标志物减少有关[46 - 48]。即使在高脂饮食的情况下，补充富含单不饱和脂肪酸的食物也与减少脂肪组织中M1型巨噬细胞(促炎性)和CD8(+) T细胞的浸润有关[46]。最近的研究还表明，G蛋白偶联受体(GPR)家族，如GPR120，可以被单不饱和(MUFA)(C18:1n9)和多不饱和(PUFA)(C18:3n3、C20:5n3和C22:6n3)的异构体激活。这些受体的激活除了能启动抗炎机制信号外，还可能刺激胰高血糖素样肽 - 1(GLP - 1)的产生[49,50]。
如花色苷等多酚类物质和不饱和脂肪酸对健康有益，可降低患代谢性疾病的风险。这些营养素具有广泛的生物活性，如抗氧化、清除自由基、抗炎、抗癌、抗病毒、抗菌、抗血栓形成和抗动脉粥样硬化等活性[50]。疾病中表观遗传修饰的复杂性和可逆性为膳食营养素干预提供了有前景的靶点[4]。考虑到肥胖的多因素特征，了解它们在表观遗传修饰中的调节作用可能有助于预防和治疗相关的代谢性疾病。
花色苷是众所周知的活性氧(ROS)抗氧化剂。具体而言，矢车菊素 - 3 - 糖苷(juçara果实中的主要花色苷)具有很强的吸收氧自由基的能力，从而能够抵御氧化应激。研究还表明，花色苷可通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和环氧合酶(COX)途径，通过DNA甲基化组的改变来抑制核因子κB(NF B)的激活。花色苷的这些生物活性与慢性病的发病率密切相关，可降低心血管疾病的风险因素、减轻体重并改善胰岛素抵抗[51 - 55]。
有证据表明，从瘦女性和严重肥胖女性样本中获取的、参与脂肪酸β - 氧化的基因，在接触脂质后呈现出不同的甲基化模式。由于DNA甲基转移酶(DNMTs)促进的基因甲基化模式不同，过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPAR - δ)在肥胖中受到不同的调控。此外，另一个受到表观遗传调控的基因是肉碱棕榈酰转移酶1B(CPT - 1B)。CPT - 1B是一种负责将长链脂肪酸转运过线粒体外膜的蛋白质，这是由于接触油酸后，DNA甲基化和组蛋白乙酰化所导致的[56]。尽管这些发现支持了我们的假设，即表观遗传修饰与肥胖之间的联系可能受到来自juçara的单不饱和脂肪酸和多酚的影响，但这一机制尚未得到证实。
人类基因组编码五种不同的DNA甲基转移酶(DNMTs):DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L。特别是DNMT1、DNMT3a和DNMT3b以催化向基因组DNA添加甲基化标记而闻名。文献表明，DNMT1与胎儿发育过程中发生的表观遗传印记的维持有关。DNMT3a和DNMT3b与从头甲基化过程有关，该过程在成年期更频繁发生，导致对预先存在的表观遗传模式进行修饰[57]。有趣的是，DNMTs表达的更显著变化与补充juçara有关。特别是，负责启动从头甲基化过程的酶会招募DNA甲基转移酶(DNMTs)来启动DNA甲基化的变化。
这些结果使我们认为，食用巴西棕榈果(juçara)可能通过表观遗传机制调节脂质代谢，因为在补充巴西棕榈果后，表观遗传标记发生了变化。为了验证血清酸谱的变化(主要是治疗后血清单不饱和脂肪酸(MUFAs)增加)与所发现的表观遗传修饰之间的关联，进行了回归分析。可以注意到，补充巴西棕榈果导致血清中C18:1n9水平升高，这似乎是肥胖成年单核细胞中甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)激活增加的一个预测指标。血液中每增加 的油酸，MeCP2水平就会升高64%。
5. 结论
总之，可以看出，补充巴西棕榈果调节了血清脂肪酸谱，并可能通过对肥胖个体单核细胞的表观遗传调节，有助于降低代谢性疾病的风险，因为单不饱和脂肪酸(MUFAs)可预测甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)对DNA甲基化启动子蛋白的作用。此外，有必要进一步分析表观遗传机制，以明确调节机制，并促进通过表观遗传学制定治疗和预防肥胖及其并发症的策略。
作者贡献:L.P.P.、V.V.R、J.R.V.和L.M.O.设计了研究方案；A.B.S.、G.J.、L.V.M.和H.d.C.C.进行了实验并分析了数据。L.P.P.和A.B.S.对文章的重要知识内容进行了严格修订；L.P.P.和A.B.S.参与了论文的撰写。
资金支持:本研究得到了圣保罗州研究资助基金会(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo)的支持(项目编号:2016/14133 - 0；2015/13875 - 0)。LPP和LMO获得了巴西国家科学技术发展委员会(Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico，CNPq)的奖学金。
致谢:作者感谢Dylbert Fragoso Silvestre在英语方面提供的技术支持。
利益冲突:作者声明不存在利益冲突。References
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