一种影响全局转录以促进B族链球菌阴道定植的DNA胞嘧啶甲基转移酶的鉴定

海德尔·S·曼泽， 托尼亚·布鲁内蒂， 凯莉·S·多兰

作者单位 见第16页的单位列表。

摘要 B族链球菌(GBS)定植于女性生殖道(FRT)，并在垂直传播给胎儿或新生儿后导致不良妊娠结局和侵袭性疾病。尽管有如此重大的公共卫生负担，但GBS在FRT定植的机制仍未得到充分研究。最近的一项转座子测序筛选确定了有助于阴道定植和上行传播的GBS因子，包括一种假定的DNA胞嘧啶甲基转移酶(Dcm)。我们构建了一个 缺失菌株，并证实 有助于小鼠FRT定植。对 基因进化起源的研究表明，它在GBS中广泛分布，并作为前噬菌体基因组的一部分编码，该基因组显示出GBS菌株之间水平转移的证据。我们进一步表明，Dcm有助于 甲基化以及对参与碳水化合物代谢、转录调控以及GBS定植中涉及的已知粘附素和代谢因子的基因进行全局调控。有趣的是，在高度糖基化的阴道粘蛋白MUC5B存在下被诱导的GBS基因在 dcm突变体中显著下调。此外， dcm突变体与固定化粘蛋白的结合减少，并且在包括粘蛋白上发现的碳水化合物在内的多种碳源上生长的能力减弱。虽然 突变体在野生型小鼠的FRT中清除率增强，但在

• 小鼠中没有显著差异，这表明Dcm介导的调控需要MUC5B来促进GBS定植。这是第一份描述DNA甲基转移酶对GBS基因调控和FRT定植影响的报告。

重要性 B族链球菌(GBS)在三分之一的女性中定植于女性生殖道(FRT)，携带GBS会导致许多不良妊娠结局，包括胎膜早破、绒毛膜羊膜炎和死产。怀孕期间FRT中GBS的存在也是GBS传播和侵袭性新生儿疾病(包括肺炎、败血症和脑膜炎)的最大诱发因素。导致GBS定植的因素仍在阐明中。在这里，我们首次表明GBS转录受一种孤儿DNA胞嘧啶甲基转移酶(Dcm)调控。许多GBS因子受Dcm调控，尤其是那些参与碳水化合物运输和代谢的因子。我们表明GBS在FRT中的持续存在依赖于阴道粘蛋白MUC5B上发现的糖类的分解代谢。总的来说，这项工作突出了DNA甲基转移酶的调控重要性，并确定了GBS定植所需的宿主和细菌因子。

编辑 凯瑟琳·P·莱蒙，美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院

通信地址 致凯莉·S·多兰，

kelly.doran@cuanschutz.edu。

作者声明无利益冲突。

见第17页的资金表。

2023年8月29日收到

2023年9月25日接受

2023年10月31日发表

版权所有 © 2023曼泽等人。这是一篇根据知识共享署名4.0国际许可协议分发的开放获取文章。

关键词 B族链球菌；表观遗传学；Dcm；阴道定植；DNA甲基化；粘蛋白

B族链球菌(无乳链球菌[GBS])是一种机会致病菌，可在多达三分之一的健康女性的女性生殖道(FRT)中无症状定植并持续存在。GBS可垂直传播给GBS阳性母亲所生的约 的婴儿，其中 会发展为侵袭性疾病，这使得GBS成为全球新生儿败血症、肺炎和脑膜炎的主要病因(2,3)。尽管母体GBS在FRT中的定植通常无症状，但阴道中GBS的存在是许多不良妊娠结局的主要危险因素。例如，GBS导致全球所有死产的1%(4)，GBS阳性母亲在孕期发生胎膜早破的可能性是正常情况的3.6倍(5)。孕期GBS在FRT中的定植还与称为绒毛膜羊膜炎的子宫内结构炎症高度相关(6 - 8)。总体而言，GBS在FRT中的定植每年导致40.9万例婴儿疾病，在全球范围内导致14.7万例死产和婴儿死亡(3)。由于GBS在FRT中的定植是下游不良妊娠结局、传播给胎儿和新生儿以及新生儿侵袭性疾病的主要危险因素，因此更深入了解控制GBS定植和上行感染至子宫的机制对于开发新的治疗策略至关重要。

先前的研究试图确定促成GBS定植和上行感染的细菌和宿主因素。几种GBS表面黏附素已被证明可促进GBS对人阴道上皮细胞的黏附以及在小鼠阴道中的定植。这些包括富含丝氨酸的重复蛋白(Srr - 1、Srr - 2)、B族链球菌表面蛋白C(BspC)、菌毛岛2b(Pl - 2b)、纤溶酶原结合表面蛋白(PbsP)和BvaP，所有这些都已被证明在体内有助于与宿主细胞相互作用和定植(9 - 14)。其中许多已被证明可与宿主受体相互作用，如细胞外基质成分、细胞角蛋白，就 而言，还可与宿主黏蛋白相互作用(9 - 12,15,16)。有趣的是，当暴露于主要分泌性黏蛋白MUC5B时，GBS会上调PI - 2b位点中的菌毛蛋白基因(11)。促成GBS定植的其他重要调节机制包括双组分系统(TCS)，如碳代谢调节剂FspSR(17)，以及已知可调节毒素产生以减轻宿主炎症反应并促进GBS持续存在的CovRS(18)。我们还表明，Cas9全局调节GBS基因表达，包括CiaRS TCS，并且CiaR和Cas9都有助于GBS在阴道中的定植(19)。体内RNA测序还显示，TCS SaeRS在GBS小鼠阴道定植期间被诱导，它正向调节PbsP和BvaP(13, 14, 20)。然而，除TCS之外的调节机制在促进GBS定植方面的潜在作用尚未得到充分研究。

为了研究GBS定植所需的其他因素，我们最近使用血清型V、序列型1菌株CJB111进行了一项小鼠转座子测序(Tn - Seq)实验(20)。我们检查了与接种后1天和3天从小鼠采集的阴道拭子中的输入文库相比代表性不足的Tn突变体，以及接种后3天收获的阴道、子宫颈和子宫组织中的Tn突变体。该筛选确定锰稳态对于GBS定植至关重要，部分原因是其在减轻宿主钙卫蛋白的金属应激方面的作用(20)。对该Tn - seq数据集的进一步检查发现，在ID870_06215中插入Tn的突变体在阴道腔以及所有三个FRT组织中代表性不足。ID870_06215被注释为一种DNA 5 - 胞嘧啶甲基转移酶(MTase)，即Dcm。在此，我们研究这种假定的Dcm如何促成GBS在FRT中的定植。

结果

Dcm有助于阴道定植和上行感染

我们实验室之前发表的转座子测序(Tn-Seq)数据显示，ID870_06215基因中存在插入的转座子突变体显著减少(参考文献20)。进一步研究发现，ID870_06215是阴道组织中最显著的命中基因，其回收率下降了40倍，并且在感染后3天(d.p.i)收集的阴道腔以及宫颈和子宫组织中，在第1天和第3天也显著减少(图1A)。ID870_06215基因是一个预测的孤儿Dcm，这些数据强烈表明它在女性生殖道(FRT)中促进B族链球菌(GBS)适应性方面发挥作用。为了研究这一点，我们通过同源重组驱动，用壮观霉素盒替换整个基因，产生了一个 基因框内缺失的突变菌株。然后，我们使用我们的阴道定植小鼠模型，测量 突变体与野生型(WT)亲本菌株CJB111相比，在CD1小鼠的FRT中持续存在的能力。早在感染后7天，我们就观察到，在定植了 突变体的小鼠的阴道腔中回收的细菌载量显著降低(图1B)。此外，在实验终点，显著更多的小鼠清除了 突变体(图1C)，并且与WT菌株相比，从阴道、宫颈和子宫组织中回收的 突变体显著减少(图1D至F)。这些结果表明，dcm对定植和向子宫的上行都有贡献。我们还用C57/BL6小鼠重复了这个实验，在C57/BL6小鼠中CJB111表现出延长的定植，并观察到 突变体有类似的减弱(图S1A至D)。

Dcm对 甲基化的贡献

由于该基因被注释为DNA 5-胞嘧啶甲基转移酶，我们接下来试图确认其在DNA甲基化中的作用。我们首先使用AlphaFold2(参考文献21)预测Dcm结构，结果表明，与已发表的流感嗜血杆菌Dcm(Haelll)晶体结构相比，甲基化所需的DNA结合结构域和PCQ基序保存良好(图2A和B)(参考文献22)。接下来，我们使用针对 DNA修饰的酶联免疫吸附测定(ELISA)，比较了WT、 和互补菌株 pDC 之间的总基因组甲基化含量，以及WT和 菌株中仅载体(pDC)对照的总基因组甲基化含量。我们观察到，从 突变体中分离的基因组DNA的 甲基化在统计学上显著降低，而在互补菌株中恢复(图2C)。我们还对WT和Δdcm GBS进行了全基因组亚硫酸氢盐测序，使用NEB酶促甲基化测序试剂盒将甲基化的胞嘧啶转化，然后进行Illumina测序，并使用Bismark v0.22.3进行甲基化检测。全基因组亚硫酸氢盐测序允许以单碱基分辨率鉴定特定的 DNA甲基化(参考文献23)。原始读数可在生物项目登录号PRJNA993282下获得。与WT GBS相比，我们观察到 突变体中甲基化的胞嘧啶百分比降低了33%(表1；图2D)，尽管这种方法未能鉴定出与甲基化相关的特定基序。综上所述，这些数据表明Dcm确实会影响全基因组的 甲基化，尽管不是以序列特异性的方式。

图1 Dcm有助于B群链球菌阴道定植和上行感染。(A) 与输入相比，来自先前发表的(20) B群链球菌定植的Tn-seq数据的log2倍变化，该数据取自阴道拭子接种后1天和3天或接种后3天的FRT组织。(B-F) 将2 CFU的野生型或 dcm B群链球菌直接接种到CD-1小鼠的阴道中。显示每隔一天从阴道灌洗中回收的CFU计数(B)以及仍被每种菌株定植的小鼠百分比(C)。在第15天，对小鼠实施安乐死，并采集阴道(D)、子宫颈(E)和子宫(F)，匀浆并铺板以计数CFU。图A显示来自三个生物学重复的平均倍数变化。图B-F是来自两个独立实验的汇总数据。每个点代表一只单独的小鼠，水平线表示中位数。统计分析:图B:双向方差分析。图C:Mantel-Cox对数秩检验。图D-F:不成对 检验。

图2 Dcm DNA结合结构和5-甲基胞嘧啶甲基化是保守的。(A和B) 基于与DNA结合的流感嗜血杆菌Haelll Dcm的晶体结构(22)，使用Alphafold2(21)生成B群链球菌Dcm的预测模型。(A) 使用PyMOL(24)显示B群链球菌Dcm预测结构(绿色)与Haelll晶体结构(青色)的结构比对。(B) 将CJB111 Dcm与来自Haelll晶体结构的DNA叠加显示预测的DNA结合。5-甲基胞嘧啶甲基化所需的保守PCQ基序(25)以红色显示。(C) 通过ELISA测量显示野生型、Δdcm、野生型 + pDC、 pDC和 pDC 中5-甲基胞嘧啶甲基化的总DNA百分比。每个点代表独立实验中三个技术重复的平均值，条代表这些点的平均值，误差条代表SEM。(D) 酶促甲基测序用于将非5-甲基胞嘧啶甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶用于Illumina全基因组亚硫酸氢盐测序。使用Bismark鉴定 甲基化。将来自野生型B群链球菌基因组DNA的每个胞嘧啶位置具有阳性甲基化调用的读数百分比与 B群链球菌基因组DNA中相同胞嘧啶位置具有阳性甲基化调用的读数百分比作图。

为了研究Dcm是否可能影响其他甲基化类型，我们通过PacBio进行了单分子实时(SMRT)测序。尽管PacBio SMRT测序目前无法检测 甲基化，但它能可靠地检测 和 甲基化。我们对 菌株的基因组DNA进行了测序，并将其与我们最近提交的野生型CJB111的SMRT测序结果(生物项目登录号PRJNA977207)进行比较，以评估甲基化模式的差异(H. S. Manzer和K. S. Doran，已提交发表)。这种方法没有揭示野生型和 B群链球菌之间甲基化率的任何差异，也没有识别出在野生型CJB111中始终甲基化而在 突变体中未甲基化的任何特定基序，证实Dcm不会影响 或 甲基化(图S2A和B)。

Dcm调节B群链球菌转录

尽管 的甲基化识别位点尚不清楚，但我们推测 可能仍参与表观遗传调控。为了鉴定可能在 突变体中差异表达的基因，我们在两个生长阶段对野生型CJB111和 突变体进行了RNA测序的转录组分析。在OD 600为0.4时采集RNA以代表指数生长中期，在OD 600为1时采集RNA以代表早期稳定期。在指数期，与野生型相比， 突变体中有14个基因上调，46个基因下调，表达倍数变化为 ， 值为 (图3A)。在早期稳定期有更多变化，378个基因上调，405个基因下调，表达倍数变化为 ， 值为 (图3B)。对 中表达改变的直系同源基因簇(COG)进行分析发现，指数期改变基因数量最多的COG是碳水化合物运输和代谢(图3C)。在早期稳定期，改变基因数量最多的COG是翻译以及核糖体结构与生物发生，其次是涉及碳水化合物运输的基因的COG(图3D)。表2显示了一些失调的选定基因，包括黏附素、毒力因子、转录因子以及参与金属稳态和碳水化合物代谢的基因(完整数据集见表S1，原始读数可在生物项目登录号PRJNA993282下获取)。有趣的是，一些已知参与阴道定植的GBS基因在 突变体中下调，包括锰运输系统(ID870_02010-ID870_02020)和黏附素PbsP(ID870_07365)(14, 20)。失调最严重的基因是那些参与糖代谢或运输的基因，包括treP/C(ID870_08455，ID870_08450)、dhaK/L/M(ID870_01490-ID870_01480)、IrgA/B(ID870_08490，ID870_08485)、IacA/B(ID870_00285，

表1 全基因组亚硫酸氢盐测序 亚硫酸氢盐甲基化报告

2023年11月/12月 第14卷 第6期 ID870_00290)、argF(ID870_10075)、arcC(ID870_10080)，以及多个属于磷酸转移酶系统糖转运蛋白的基因。在稳定期早期， 突变体中上调最显著的基因是碳饥饿蛋白cstA(ID870_04305)。采用qRT PCR验证选定基因的RNA测序结果(图S3A至D)。有趣的是，一些通常被认为是管家基因的基因，如rpoB(ID870_08620)、rpsL(ID870_00815)和gyrA(ID870_04630)，在稳定期早期的 突变体中也有显著的表达失调，但在指数期没有。因此，16S被用作这些研究的管家基因，因为它在细菌生长过程中保持不变。

图3野生型和Δdcm B族链球菌的RNA测序。(A)火山图显示了与野生型B族链球菌相比， dcm突变体在指数期(EXP)生长期间转录改变的基因。(B)火山图显示了与野生型B族链球菌相比， 突变体在稳定期早期(ES)转录改变的基因。在EXP(C)和ES(D)生长阶段失调基因的数量按其COG类别分组显示，并按每个基因的log2倍数变化着色。

由于参与碳水化合物代谢的基因转录在 突变体中变化最为显著，我们接下来试图确定这些变化对B族链球菌利用各种碳水化合物能力的功能影响。我们使用Biolog表型微阵列来测量 突变体与野生型相比在Biolog PM1和PM2A平板上190种碳源上的生长差异(表S2)。我们对野生型B族链球菌的结果与之前对该菌株的观察结果非常相似，每种碳源上都观察到了相似的生长情况(17)。然而，该实验揭示了野生型和 B族链球菌在以某些碳水化合物作为主要碳源时生长能力的显著差异(图4A)。例如， 突变体在葡萄糖、果糖、

表2与野生型相比， 突变体中失调的基因 -乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和 -唾液酸(NeuAc)与野生型B族链球菌相比(图4B至E)。重要的是，这些是在女性生殖道中发现的主要分泌粘蛋白之一MUC5B上发现的常见碳水化合物部分(11、26、27)。我们之前进行了RNA测序以研究MUC5B对B族链球菌基因表达的影响(11)。我们比较了这些数据集，发现大多数在MUC5B存在时上调的B族链球菌基因也受Dcm调控(图5A)。京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析表明，在MUC5B暴露期间，属于磷酸戊糖途径和抗坏血酸降解的基因显著上调，而这些相同的基因在 突变体中下调(图5B)。这些数据表明，Dcm可能调节B族链球菌对阴道粘蛋白上发现的糖类的代谢途径。

(接下页)

表2 突变体中相对于野生型(WT)表达失调的基因(续)

Dcm调控促进B族链球菌与黏蛋白的相互作用

我们之前已经表明，B族链球菌(GBS)直接与黏蛋白相互作用(参考文献11)。为了从功能上研究依赖Dcm的基因调控对这种相互作用的影响，我们首先测量了野生型(WT)或 结合黏蛋白的能力，发现 突变体结合黏蛋白的能力显著降低(图5C)。我们观察到野生型和 突变体对人阴道上皮细胞的黏附和侵袭没有差异(图S4A和B)。接下来，我们通过用野生型或 GBS阴道定植野生型和MUC5B 同窝小鼠，研究MUC5B是否导致之前观察到的 突变体在体内定植缺陷(图1B)。我们再次观察到，在野生型小鼠中， 突变体在阴道腔定植的能力显著降低(图5D)。有趣的是，与野生型小鼠相比，在19天感染后， 小鼠中野生型CJB111和 的细菌载量均显著降低，但在 小鼠中，两种菌株的细菌载量或清除率没有显著差异，这表明黏蛋白的存在影响了体内Dcm介导的表型。总的来说，这些数据表明，Dcm通过调控参与黏蛋白相互作用的基因来促进GBS定植，这支持了我们之前的发现，即黏蛋白的存在对GBS的最佳定植很重要(参考文献11)。

Dcm是一种噬菌体编码基因，与典型的DNA 5-甲基胞嘧啶甲基转移酶不同

据我们所知，这是第一篇描述甲基转移酶在GBS定植中作用的报告。因此，我们研究了dcm基因在GBS菌株中的分布。Dcm被预测属于pfam00145，是一种假定的C-5胞嘧啶特异性DNA甲基转移酶。因此，我们研究了每一个目前可用的与pfam00145相关的GBS基因。在联合基因组研究所目前可用的653个GBS基因组中，475个(约73%)编码一个与pfam00145相关的基因。其中一些基因组编码多个pfam00145基因，总共917个GBS基因。这些基因被比对并用于生成系统发育树，该树揭示了GBS dcm基因进化聚类为三个主要分支(图6A)。多个菌株在一个基因组中编码多个不同的pfam00145基因。有趣的是，CJB111 dcm与91个基因相同，与233个基因高度相似( 序列同一性和覆盖率)，这些基因总共约占GBS中所有pfam00145基因的35%。对这些保守基因的进一步研究表明，它们被编码为几乎相同的前噬菌体基因组的一部分(图6B；图S5)。此外，一些克隆菌株在 内也显示出移码突变，导致在165个氨基酸后出现提前终止密码子(图S5)。为了确定这些假定的 基因的总体分布是克隆性的还是在进化上遥远的谱系中，我们基于目前通过NCBI可获得的所有166个完整GBS基因组的核心基因组构建了系统发育树。虽然一些含有dcm的基因组似乎来自一个共同的祖先菌株，但许多含有 的基因组不连续地分布在系统发育树上(图6C)。此外，虽然通过Fisher精确检验，对于血清型和序列类型分布，拥有与CJB111 dcm相同基因的菌株的血清型和序列类型分布显著偏向血清型V ST-1菌株 ，但拥有与CJB111 dcm高度相似但不相同基因的菌株在特定血清型或序列类型的流行率上没有增加的趋势(图6D和E)。总的来说，这些证据强烈表明，前噬菌体编码的 基因在GBS菌株之间水平转移。

图4野生型与 B族链球菌的Biolog生长情况。(A)野生型和 B族链球菌在Biolog PM1和PM2平板上生长。计算每条生长曲线下的面积。任意选择曲线下面积(AUC)为15,000或更大作为截止值，以筛选数据，仅保留野生型或 B族链球菌显示出显著生长的碳源。仅显示B族链球菌在野生型和 之间生长存在显著差异的碳源。显示了Biolog生长试验中葡萄糖(B)、果糖(C)、N-乙酰葡糖胺(D)和N-乙酰神经氨酸(E)的个体生长曲线。所有数据均来自三个独立实验。统计分析:A图:多个不成对 检验。B - E图:双向方差分析。

图5 Dcm调节MUC5B代谢所需的基因。(A)维恩图显示了在早期稳定期由Dcm调节的基因与先前确定在MUC5B存在下GBS菌株COH1生长期间上调的基因的同源物的重叠情况(11)。(B)比较先前发表的(11)在MUC5B存在下孵育时属于磷酸戊糖途径(上)和抗坏血酸降解途径(下)的基因的倍数变化，以及 突变体在早期稳定生长期间属于相同途径的基因的倍数变化。(C)野生型或 B族链球菌与来自牛颌下腺的粘蛋白结合相对于与培养基对照孔结合的倍数变化。每个点代表独立实验中三个技术重复的平均值，条代表这些点的平均值，误差条代表标准误。(D)将 CFU的野生型或 B族链球菌直接接种到野生型或MUC5B C57BL/6小鼠的阴道中。显示每隔一天从灌洗液中回收的CFU计数。数据来自三个独立实验。每个点代表一只单独的小鼠，水平条表示培养基。统计分析:C图:不成对t检验。D图:双向方差分析。

图6 dcm是噬菌体编码的，并在GBS分离株之间水平转移。(A)所有917个具有pfam00145注释的测序GBS基因使用MUSCLE进行比对，然后用于构建邻接系统发育树。与CJB111 dcm相同的基因的节点用绿色突出显示，密切相关的基因(>85%序列同一性和覆盖率)用蓝色突出显示。(B)显示了来自CJB111的代表性 编码前噬菌体基因组。未标记的基因注释为假设基因。(C)使用Harvest Suite和Parsnp从NCBI上目前可用的166个完整GBS基因组生成核心基因组比对和系统发育树，以CJB111作为参考基因组。包含与CJB111 dcm相同基因的基因组用绿色突出显示，包含密切相关基因(>85%序列同一性和覆盖率)的基因组用蓝色突出显示。显示了C图中具有与CJB111 dcm相同或密切相关基因的菌株的血清型(D)和序列类型(E)分布。

讨论

在此，我们首次表明一种甲基转移酶Dcm有助于B族链球菌在女性生殖道(FRT)中的定殖和上行感染。作为一种孤儿甲基转移酶，Dcm不与同源限制酶相关联，但可调控许多B族链球菌因子，包括参与碳水化合物运输和代谢的因子。虽然细菌中DNA甲基化的作用一直与限制修饰系统紧密相关，但真核生物中的DNA甲基化更常与转录调控相关，这在人类癌症研究中得到了最充分的研究(28)。越来越多的文献表明，这种调控方式在细菌中是保守的，尤其是对于孤儿甲基转移酶(29 - 34)。有趣的是，我们发现这种B族链球菌甲基转移酶编码于一个原噬菌体中，该原噬菌体似乎在菌株间发生了水平转移。由于Dcm调控了B族链球菌转录组的很大一部分，包括许多有助于人类定殖和致病的基因，噬菌体介导的这种调控机制传递可能使B族链球菌适应了人类宿主。这种噬菌体的起源以及像Dcm这样的全局调节因子插入B族链球菌基因组的影响值得进一步研究。此外，观察到的移码突变表明，可能存在一些环境，在这些环境中Dcm介导的调控对B族链球菌的适应性有害。甲基转移酶基因的移码突变已被证明通过相变有助于肺炎链球菌和其他病原体适应宿主生态位(30, 35 - 40)。这种Dcm中的移码突变是否作为B族链球菌相变的类似可逆调节因子尚不清楚。

DNA甲基化在细菌中具有多种功能后果，包括对生物膜形成、黏附以及侵入各种组织、抗生素抗性和毒力的影响(29 - 34)。虽然真核生物中最常见的DNA甲基化形式是 ，但在细菌中却是最不常见的(28, 29, 32, 33, 41, 42)。因此， 甲基化在细菌中的功能影响是一个研究不足的领域。尽管我们表明Dcm甲基化通过调控转录组有助于B族链球菌定殖，但我们无法确定Dcm特异性靶向的DNA识别基序。 ELISA和全基因组亚硫酸氢盐测序都证实了Dcm依赖性 DNA甲基化，也间接证实了Dcm与DNA的相互作用，正如AlphaFold2 Dcm结构模型所预测的那样。因此，Dcm也可能作为一种转录因子，对这一假设的确认研究正在进行中。

在 突变体中，许多基因的转录发生了显著改变，包括分泌系统、黏附素、调节因子等毒力因子，以及众多参与碳水化合物运输和代谢的基因。多个编码转录因子和双组分信号转导系统(TCS)调节因子的基因也发生了改变，这可能解释了观察到的广泛失调现象。例如，两个注释为DeoR/GlpR转录调节因子的基因在 突变体中显著下调，在稳定期早期的倍数变化分别为-8.3(ID870_00260)和-7.3(ID870_02905)。DeoR/GlpR转录调节因子通常作为糖代谢的全局阻遏物发挥作用；然而，有报道称DeoR/GlpR在某些物种中作为激活剂发挥作用(43 - 45)，这与在B族链球菌(GBS) 突变体中观察到的糖代谢普遍抑制更为一致。DeoR/GlpR转录调节因子在GBS中尚未得到表征，是Dcm与糖代谢转录调节之间的潜在中介。与CJB111的DhaKLM操纵子相关的DeoR/TetR样转录因子分别称为DhaS(ID870_01495)和DhaQ(ID870_01500)。这两个基因的表达均无显著变化，这使得DhaKLM操纵子表达的显著变化尤其令人感兴趣。虽然野生型GBS在以二羟基丙酮(dha)作为唯一碳源时生长有限，但 突变体在以dha作为唯一碳源时的生长仅为野生型的一半(表S2)。DhaKLM是Dha激酶的亚基，Dha激酶是将Dha磷酸化为磷酸二羟基丙酮所必需的，磷酸二羟基丙酮在糖酵解过程中会进一步被利用。这表明Dha代谢也可能对 突变体表现出的生长和定植缺陷有很大影响，应进一步研究。虽然我们关注的是 突变体表现出生长缺陷的碳源，但也有多种碳源， 突变体在这些碳源上的生长明显优于野生型。这些碳源包括6 - 磷酸葡萄糖、腺苷、肌苷、乙酰乙酸、半乳糖酸-γ-内酯、半乳糖醛酸和精氨酸。精氨酸代谢基因argF和arcC是 突变体在稳定期早期上调程度第二和第三高的基因，因此精氨酸特别值得关注。精氨酸代谢与细菌致病性有关，因为精氨酸是一氧化氮合酶的底物，精氨酸代谢是一种减少宿主抗菌性一氧化氮产生的机制(46,47)。精氨酸代谢也可能通过精氨酸脱氨酶途径使GBS受益，通过该途径精氨酸被转化为鸟氨酸，同时产生氨、二氧化碳和ATP(47)。除了产生额外的ATP用于能量目的这一明显益处外，氨转化为 还可能有助于增加 并保护GBS免受阴道酸性环境的影响(48)。因此， 也有可能用于根据这些额外的宿主防御来微调基因调控。

虽然在 突变体中失调的大多数基因都参与碳水化合物的运输和代谢，但其他有趣的发现还包括已知可促进阴道定植的毒力因子。例如，与野生型B族链球菌(WT GBS)相比，VII型分泌系统基因和PbsP黏附素在 突变体中表达下调。有趣的是，在稳定期早期，菌毛岛1(PI-1)和菌毛岛2a(PI-2a)在 突变体中的表达均显著上调(表2；表S1)。虽然PI-2b已被证明与B族链球菌黏附并侵入上皮细胞和内皮细胞有关(49)，但PI-1菌毛并不影响其对肺、阴道或宫颈上皮细胞的黏附，反而起到减少巨噬细胞对B族链球菌杀伤的作用(50)。然而，PI-2a已被证明有助于B族链球菌的黏附和生物膜形成(51, 52)。尽管尚未研究PI-2a在与黏蛋白相互作用中的作用，但我们观察到 突变体中菌毛表达增加但黏蛋白结合减少，这值得进一步研究。有趣的是，pbsP可能是在 突变体中显著下调的唯一黏附素编码基因，与野生型GBS相比，其表达下降了3.8倍。已证明pbsP通过结合细胞外基质成分(如纤溶酶原和纤维蛋白原)以及黏附上皮细胞和内皮细胞，从而有助于B族链球菌的阴道定植、脑膜炎和糖尿病伤口感染，PI-2b也是如此(14, 53 - 57)。因此，pbsP与黏蛋白之间的潜在相互作用可能解释了在 突变体中观察到的黏蛋白结合表型，值得进一步研究。 突变体中变化最显著的基因之一是ID870_00925，与野生型相比，在稳定期早期，该基因在 突变体中的表达下降了65倍(表2)。该基因被注释为I类依赖S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基转移酶。虽然Dcm使DNA甲基化，但含有Rossman折叠的I类甲基转移酶主要参与天然产物的合成，天然产物是一类小分子，因其作为抗菌治疗剂的潜力而受到广泛研究(58)。这种类型的甲基转移酶在B族链球菌中尚未得到研究，值得进行调查。

在女性生殖道(FRT)中，MUC1和MUC4是主要的细胞表面相关黏蛋白，而MUC5AC和MUC5B是主要的分泌型凝胶形成黏蛋白(11, 26, 27)。分泌型凝胶形成黏蛋白质量的高达 由通过 -糖基化修饰黏蛋白的各种碳水化合物组成(26)。黏液层提供了一个物理屏障，阻碍细菌与宿主细胞相互作用，同时也促进病原体的清除。然而，微生物也进化出了许多应对这种宿主防御的方法。黏蛋白的高度糖基化性质促使我们研究B族链球菌(GBS)是否将分泌的阴道MUC5B用作碳源。Biolog实验表明， 突变体在MUC5B上发现的多种糖类(包括NeuAc)上生长的能力较弱。通常，微生物分别使用岩藻糖苷酶和唾液酸酶来消化常见的帽聚糖岩藻糖或NeuAc(59,60)。有趣的是，GBS不编码功能性的岩藻糖苷酶或唾液酸酶，因此不能利用黏蛋白生长(11)。虽然肺炎链球菌编码唾液酸酶NanA，但GBS的NanA同源物在进化过程中已失去活性，因此被注释为“NonA”(61)。GBS中似乎也不存在编码岩藻糖苷酶的基因。这表明GBS自身无法降解黏蛋白用作碳源。然而，因为我们在体内观察到了依赖MUC5B的表型，我们推测GBS可能能够利用已经被常驻阴道微生物群消化/释放的MUC5B糖类，这种现象在黏膜微生物群落中很常见(59)。我们实验室之前已经表明嗜黏蛋白阿克曼氏菌会增加GBS在阴道的持久性(62)。嗜黏蛋白阿克曼氏菌通过多种岩藻糖苷酶和一种唾液酸酶很容易消化黏蛋白(59, ，因此，黏膜中 嗜黏蛋白阿克曼氏菌的存在可能会释放其他无法直接利用它们的生物体生长所需的与黏蛋白相关的糖类，GBS就是这种情况。总的来说，这可能意味着GBS依赖微生物群来利用黏蛋白作为碳源。此外，许多覆盖MUC5B的碳水化合物也存在于其他阴道黏蛋白MUC1、MUC4和MUC5AC上(26, 27)。我们的Biolog数据表明，GBS在MUC5B上存在的碳水化合物上的dcm依赖性生长是由于这些单个碳水化合物代谢的差异。因此，尽管我们在这里关注的是MUC5B，但 突变体在FRT中发现的其他黏蛋白的代谢中可能也会表现出类似的缺陷。事实上，这可能适用于GBS在所有黏膜层的相互作用。例如，MUC5B也在经常发现GBS的其他宿主生态位中表达，包括肺和肠道(26,65)。由于GBS也会导致新生儿肺炎并且已知会在胃肠道定植(1 - 3)， 对GBS肺炎和肠道定植的潜在贡献也值得进一步研究。

总体而言，我们首次展示了DNA甲基化在GBS中的调节作用。我们已经描述了这种调节在代谢方面对FRT定植的影响，但Dcm调节子的广泛性质意味着它可能也有助于GBS在其他生态位中的毒力。此外，DNA甲基转移酶在所有生命王国中几乎普遍存在，这表明这种调节方法可能是所有病原体用于定植和引起人类疾病的一种重要但研究不足的机制。

材料与方法

细菌菌株和生长条件

大多数实验使用了B群链球菌临床分离株CJB111(血清型V)(66)及其同基因 突变体，并在 的条件下于托德-休伊特肉汤(THB)中静置培养。如前所述(67)，通过用壮观霉素抗性盒进行框内等位基因替换，经同源重组产生了 突变体。使用 侧翼正向引物、与壮观霉素盒重叠的 侧翼反向引物、壮观霉素正向引物、壮观霉素反向引物、与壮观霉素盒重叠的 侧翼正向引物和 侧翼反向引物，通过吉布森组装法生成敲除构建体。在吉布森组装到敲除载体之前，使用与pHY304具有序列重叠的巢式引物，通过巢式正向引物和巢式反向引物进行扩增。所有引物序列见表S3。用于扩增壮观霉素抗性盒的引物如前所述(68)。本研究中生成了所有其他克隆引物。将完整的敲除载体转化到大肠杆菌DH5α中进行扩增，然后转化到野生型CJB111中。通过PCR和桑格测序确认敲除构建体的整合和载体的去除。

使用互补正向引物和互补反向引物(表S3)从野生型CJB111扩增dcm基因以及上游约250 bp以包含天然启动子序列。使用吉布森组装法将该序列整合到pDCErm表达载体(称为“pDC”)中，然后将其转化到大肠杆菌DH5α中进行扩增，再转化到CJB111 Δdcm菌株中，并通过PCR和桑格测序进行确认。通过将pDC直接转化到野生型CJB111和Δdcm菌株中生成空载体对照，并通过PCR进行确认。对于大肠杆菌，使用 红霉素(西格玛)维持pDC，对于B群链球菌，使用 红霉素(西格玛)维持pDC。

细胞培养和基于细胞的检测

从美国典型培养物保藏中心(ATCC CRL - 2616)获得了表征良好的代表阴道上皮细胞的永生化人类细胞系(VK2/E6E7)(69)，并在补充有 人重组表皮生长因子和 牛垂体提取物的角质形成细胞无血清培养基(KSFM)(Gibco)中培养。细胞在 条件下、 环境中生长。

按照先前描述(67)的方法进行测定细胞表面黏附细菌总数的检测。简要地说，将细菌培养至对数中期，以感染复数为1接种到细胞单层上 。孵育30分钟后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS) 洗涤细胞以去除未黏附的细菌。用0.25%胰蛋白酶 - EDTA溶液使细胞脱离，然后通过剧烈吹打用0.025% Triton X - 100裂解细胞。然后将裂解物进行系列稀释，并接种到THB琼脂平板上以计数细菌CFU。测定侵入宿主细胞的细菌总数的检测方法类似，只是感染后的孵育时间为2小时，之后用PBS洗涤细胞一次，并加入含有 庆大霉素(西格玛 - 奥德里奇)和 青霉素(西格玛 - 奥德里奇)的新鲜培养基。加入抗生素后继续孵育两小时，然后使细胞脱离、裂解并接种平板以计数CFU，方法与黏附检测相同。

下一代测序

使用Qiagen Gentra Puregene酵母/细菌DNA提取试剂盒从野生型(WT)和 中制备基因组DNA。对于Illumina全基因组亚硫酸氢盐测序，根据制造商的说明，使用带有Covaris剪切的NEBNext酶促甲基化测序试剂盒生成文库。使用NovaSeq 6000和v1.5化学试剂对 碱基对的reads进行测序。然后使用FastQC、TrimGalore和Cutadapt对双端reads进行质量过滤和修剪。使用Bismark v0.22.3将reads比对到参考基因组，并进行重复数据删除和甲基化调用。

对于PacBio SMRT测序，使用SMRTbell文库制备试剂盒3.0制备文库。使用SMRT Cell 8M、PacBio Sequel II测序仪和SMRTLink v.11进行带有动力学数据的HiFi测序，并进行引物修剪和多路分解。使用SMRTLink v.12将reads比对到参考基因组，并进行甲基化碱基调用。

5-甲基胞嘧啶酶联免疫吸附测定

使用Qiagen Gentra Puregene酵母/细菌DNA提取试剂盒从野生型(WT)、 和 B族链球菌(GBS)中制备基因组DNA，并根据制造商的说明，使用Epigentek MethylFlash全球DNA甲基化(5-甲基胞嘧啶)比色法酶联免疫吸附测定试剂盒对DNA甲基化进行定量。

RNA测序与分析

使用野生型(WT)和 GBS的单个菌落接种过夜培养物，将其在试管中于 静止培养。然后使用过夜培养物以OD 600为0.05接种到烧瓶中的 THB中，并在 静止培养。每个菌株的三份重复培养物培养至OD 600为0.4，另外三份培养物培养至OD 600为1，使用赛默飞世尔科技Genesys 30分光光度计通过比色皿测量。根据制造商的说明，使用Machery-Nagel NucleoSpin RNA分离试剂盒制备RNA，然后送至SEQCENTER进行rRNA去除测序，每个样品至少测序深度为 RNA reads。将reads比对到CJB111基因组(CP063198)，生成表达值，然后使用Geneious Prime中的DESeq2计算差异表达。使用qRT-PCR评估特定基因的转录本丰度。所有引物序列见表S3。 、gyrA、tkt、rpoB和rpsL的引物均如前所述使用(70)。

阴道定植和上行感染的小鼠模型

我们利用已建立的GBS阴道定植小鼠模型(12,71 - 74)。对于各种实验，使用来自查尔斯河实验室的7 - 10周龄雌性CD - 1小鼠或来自杰克逊实验室的C57BL/6小鼠。如前所述(11,65)，培育并饲养7 - 12周龄的雌性C57BL/6 Muc5B 或野生型同窝对照用于实验。通过腹腔注射(1, P) 溶解于芝麻油中的 -雌二醇使小鼠的发情周期同步。第二天，将 野生型或 GBS溶于 PBS中直接接种到小鼠的阴道腔内。然后在将小鼠接种到GBS显色琼脂平板上进行CFU计数之前，用无菌超细拭子擦拭小鼠或用PBS冲洗。在实验终点(如图所示)，对小鼠实施安乐死，将其阴道、子宫颈和子宫匀浆，并接种到GBS显色琼脂平板上进行组织CFU计数。

生长测定

使用配备PM1和PM2A平板的Biolog表型分析方法，测定了野生型(WT)和 无乳链球菌(GBS)在190种独特碳源上的生长情况。Biolog分析所用的生长培养基使用储备溶液A(488毫克 和 溶于 去离子水)、B(7.2毫克L-胱氨酸溶于 pH值为 的水中)，以及 硫辛酰胺、 酵母提取物和 吐温-80溶于 去离子水。根据链球菌化学限定培养基配方，还制备了 氨基酸、 碱基和 维生素储备液(75)。每次分析前，通过将 的 的 的 的 氨基酸储备液、 的 碱基储备液、 的 维生素储备液、 的去离子水和 的Biolog染料混合物 加入到 的Biolog IFOa中，新鲜制备完整的Biolog生长培养基。野生型或 无乳链球菌在THB中过夜培养，用PBS洗涤一次，然后重悬于Biolog IFOa中，使其OD600为0.3，然后将 的细菌悬液加入到完整的Biolog生长培养基中。每孔Biolog PM1或PM2A平板加入总共 的这种悬液。平板用DiversifiedBiotech透气密封膜密封，然后使用TECAN酶标仪测量生长情况，每次读数前在 下孵育并振荡5秒。使用GraphPad Prism分析数据，以测量每条生长曲线下的面积(AUC)。通过使用多重非配对Welch’s 检验和Benjamini、Krieger和Yekutieli两阶段逐步增加错误发现方法，确定野生型和 之间生长的统计学显著差异，期望错误发现率为5%。

黏蛋白结合测定

黏蛋白结合的测定方法如前所述(11)。简要地说，将组织培养板用KSFM对照或KSFM加1%牛颌下腺黏蛋白(赛默飞世尔科技)包被。野生型或 无乳链球菌的过夜培养物重悬于KSFM中，用于接种包被的平板，并孵育2.5小时，然后用PBS洗涤一次，再用 结晶紫染色15分钟。然后去除结晶紫，每孔用PBS洗涤两次，干燥，然后用95%乙醇溶解。在使用TECAN酶标仪测量OD595之前，将平板振荡15秒。

致谢

我们感谢科罗拉多大学安舒茨医学校区的Chris Evans博士提供Muc5B 繁殖对，感谢Jose Fernando Lopez Fernandez和Austin McKenna博士在NGS数据的生物信息学分析方面提供的帮助，以及感谢Brady Spencer博士对手稿的严格审阅。

这项工作得到了美国国立卫生研究院/国家过敏和传染病研究所R01 AI153332资助、美国国立卫生研究院/国家神经疾病和中风研究所R01NS116716资助(授予K.S.D.)以及F31 AI164674 - 01资助(授予H.S.M.)。

作者单位

美国科罗拉多州奥罗拉市科罗拉多大学安舒茨医学校区免疫与微生物学系

作者ORCID编号

海德尔·S·曼泽 [1] http://orcid.org/0000-0002-2864-6212

凯利·S·多兰 & http://orcid.org/0000-0003-4232-6837

资金支持

作者贡献

海德尔·S·曼泽，概念化、数据管理、形式分析、资金获取、调查、方法学、项目管理、软件、可视化、写作 - 原始草案、写作 - 审阅与编辑 | 托尼亚·布鲁内蒂，软件、验证、可视化 | 凯莉·S·多兰，资金获取、项目管理、资源、监督、写作 - 原始草案、写作 - 审阅与编辑

• 原始草案，写作 - 审阅与编辑 | 托尼亚·布鲁内蒂，软件、验证、可视化 | 凯莉·S·多兰，资金获取、项目管理、资源、监督、写作 - 原始草案，写作 - 审阅与编辑

直接贡献

本文由美国微生物科学院院士凯莉·S·多兰直接提供，她安排并确保了纽约州立大学宾厄姆顿分校的劳拉·库克和南佛罗里达大学圣彼得斯堡分校的塔拉·兰迪斯进行审阅。

数据可用性

RNA测序和全基因组亚硫酸氢盐测序的原始读数可在生物项目登录号PRJNA993282下获取。

伦理批准

动物实验已获得科罗拉多大学医学院动物使用与护理委员会的批准，批准号为#00316，并按照公认的兽医标准进行。科罗拉多大学医学院获得了AAALAC认证，其设施符合并遵守《实验动物饲养与使用指南》中的标准。

附加文件

以下材料可在网上获取。Supplemental Material

Fig. S1 (mBio02306-23-S0001.tif). Dcm colonization phenotype is independent of mouse background.

Fig. S2 (mBio02306-23-S0002.tif). Dcm does not impact 6mA or 4mC methylation.

Fig. S3 (mBio02306-23-S0003.tif). qPCR validation of RNA-Seq.

Fig. S4 (mBio02306-23-S0004.tif). Dcm does not impact GBS adherence or invasion to vaginal epithelial cells.

Fig. S5 (mBio02306-23-S0005.tif). Alignment of dcm-encoding prophage genomes.

Supplemental Legends (mBio02306-23-S0006.docx). Fig. S1-S5 and Table S1-S3 legends.

Table S1 (mBio02306-23-S0007.xlsx). RNA-Seq full data set.

Table S2 (mBio02306-23-S0008.xlsx). Biolog growth area under the curve full data set.

Table S3 (mBio02306-23-S0009.xlsx). Primers used in this study. REFERENCES

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