组蛋白甲基转移酶SETD2调节HIV的表达和潜伏状态

卡梅隆·R·巴斯西 - 萨顿 ，艾尔莉·沃德 ，约书亚·A·福克斯 ，安妮 - 玛丽·W·特纳 ，杰克逊·J·彼得森 ，安·埃默里 ，阿图罗·R·朗oria ，伊斯梅尔·戈麦斯 - 马丁内斯 ，科尔宾·琼斯 ，奥斯汀·赫珀拉 ，大卫·M·马戈利斯 ，布莱恩·D·斯特拉尔 ，爱德华·P·布朗

1 美国北卡罗来纳大学教堂山分校生物化学系，2 美国北卡罗来纳大学教堂山分校医学系，3 美国北卡罗来纳大学教堂山分校HIV治愈中心，4 美国北卡罗来纳大学教堂山分校微生物学和免疫学系，5 美国北卡罗来纳大学教堂山分校林伯格综合癌症中心，6 美国北卡罗来纳大学教堂山分校遗传学系

* brian_strahl@med.unc.edu (BDS); epbrowne@email.unc.edu (EPB)

摘要

了解驱动HIV表达和潜伏的机制是实现治愈HIV的关键目标。在此，我们研究了沉积H3K36三甲基化(H3K36me3)的组蛋白甲基转移酶SETD2在HIV感染中的作用。我们发现，通过SETD2的强效选择性抑制剂(EPZ - 719)阻止H3K36me3会导致整合后病毒基因表达降低以及潜伏感染细胞加速出现。在原代CD4 T细胞中通过CRISPR/Cas9介导敲除SETD2证实了SETD2在HIV表达中的作用。对暴露于EPZ - 719的HIV感染细胞进行转录组分析确定了受EPZ - 719影响的众多途径。值得注意的是，感染前H3K36me3的缺失并未阻止HIV整合，但导致整合位点从高转录基因转移到静止染色质区域和多梳抑制区域。我们还观察到SETD2抑制并未明显影响HIV RNA水平，表明存在影响HIV表达的转录后机制。在EPZ - 719存在的情况下，病毒RNA剪接略有减少。有趣的是，暴露于EPZ - 719增强了潜伏HIV对HDAC抑制剂伏立诺他的反应性，表明H3K36me3可导致HIV基因座处的抑制性染色质状态。这些结果确定SETD2和H3K36me3是HIV整合、表达和潜伏的新型调节因子。

作者总结

在治疗期间，HIV通过进入潜伏状态而持续存在于人体内，此时病毒基因不表达。这种潜伏感染细胞库是治愈HIV的关键障碍。在本论文中，我们研究了细胞酶SETD2在HIV感染和表达中的作用。SETD2在与细胞DNA相关的组蛋白上产生H3K36me3修饰。我们发现感染期间整合的HIV基因组上大量存在H3K36me3修饰。我们观察到用化合物EPZ - 719抑制SETD2会导致HIV整合到人类基因组的不同区域并降低HIV表达。有趣的是，这也增加了潜伏HIV对组蛋白去乙酰化酶抑制剂重新激活的敏感性。EPZ - 719并未明显影响HIV RNA的转录，但影响了病毒RNA剪接成编码转录本的过程。总体而言，这些结果表明SETD2影响HIV的整合和表达。SETD2可能是在HIV感染者中重新激活HIV基因表达的一个有用的新靶点。

开放获取

引用: 巴斯西 - 萨顿CR, 沃德A, 福克斯JA, 特纳A - MW, 彼得森JJ, 埃默里A, 等. (2024) 组蛋白甲基转移酶SETD2调节HIV的表达和潜伏状态. PLoS Pathog 20(6): e1012281. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012281

编辑: 弗洛伦斯·马戈廷 - 戈盖, 法国国家健康与医学研究院U1016科钦研究所

收到日期: 2024年1月5日

接受日期: 2024年5月22日

发布时间:2024年6月7日

版权所有:© 2024 Bussey - Sutton等人。本文是一篇开放获取文章，根据知识共享署名许可协议发布，允许在任何媒介中不受限制地使用、分发和复制，但需注明原作者和来源。

数据可用性声明:基础数据和代码可无限制获取。https://doi.org/10.1519/S3/VX7G8A。

资助:本研究得到以下资助:EPB:R01AI143381，美国国家过敏和传染病研究所(https://www.niaid.nih.gov)。DMM:UM1AI164567美国国家过敏和传染病研究所(https://www.niaid.nih.gov)。AE:U54 - AI15047美国国家过敏和传染病研究所(https://www.niaid.nih.gov)。我们还感谢北卡罗来纳大学……中心

引言

针对关键HIV酶的抗逆转录病毒疗法(ART)在治疗HIV感染方面取得了巨大成功，使HIV感染者(PWH)能够过上相对正常的生活。然而，治愈HIV仍然难以实现，并且中断ART会导致病毒迅速反弹 。HIV在数十年治疗期间如何持续存在的细节尚不完全清楚，但可能涉及HIV进入记忆CD4 T细胞潜伏感染状态的能力。在这些细胞中，HIV表达沉默或降低，因此潜伏感染的细胞能够不被免疫系统检测到。此外，潜伏感染细胞池可通过克隆扩增来补充，以响应抗原刺激或稳态信号 [3 - 5]。

该领域的一个关键谜团是确定调节HIV表达的分子机制，并确定有助于维持潜伏状态的途径。长期存在的HIV储存库主要存在于静息CD4 T细胞中，这些细胞表现出低水平的关键激活转录因子(TFs)，如核因子 - B、激活蛋白 - 1(AP - 1)和促进延伸复合物P - TEFb [6 - 8]。此外，潜伏感染细胞中HIV的表达通过整合前病毒处异染色质的形成而受到抑制，这涉及一组特定的共价组蛋白修饰 [8 - 15]。HIV潜伏是一种稳定且可遗传的现象，这与调节HIV潜伏的表观遗传程序的概念一致 [16]。特别是，1类组蛋白去乙酰化酶(HDACs)去除激活标记如H3K9ac和H3K27ac，以及组蛋白甲基转移酶添加抑制性H3K9me3和H3K27me3标记，已被证明有助于HIV潜伏 [17 - 19]。ATACseq分析还表明，潜伏前病毒表现出“封闭”的染色质构象，这可能限制关键TFs和RNA聚合酶II(RNAPol2)的进入 [16]。

已经开发出了潜伏逆转剂(LRAs)，它们靶向各种HIV调节转录途径，包括HDAC抑制剂(HDACis)、蛋白激酶C(PKC)激动剂和非经典核因子 - B激动剂 [20]。一些化合物在动物模型和临床研究中已显示出重新激活潜伏HIV的潜力 [18,21 - 24]。然而，在HIV感染者中尚未有干预措施证明能够有效减少储存库大小。一个关键问题是，大多数LRAs只能重新激活一部分具有复制能力的储存库，这表明单一药物对潜伏的作用效率低下 [25]。这一观察结果可以用一个模型来解释，即潜伏被视为由多种重叠机制调节的一组复杂状态，并且可能需要同时靶向多个途径才能广泛重新激活储存库。因此，全面确定影响HIV表达的宿主途径集以及静息CD4 T细胞中限制途径的关键谱对于改善潜伏逆转策略至关重要。

SETD2是一种大型(约290千道尔顿)组蛋白甲基转移酶，对后生动物细胞中H3K36me3标记的产生至关重要[26]。该酶部分通过RNA聚合酶2 C端结构域上磷酸化的丝氨酸2被招募到活跃转录位点，并在基因体内共转录沉积H3K36me3标记[27]。这种组蛋白标记在基因表达中的精确分子功能一直是大量研究的主题。目前的数据表明，H3K36me3有助于防止基因内隐匿性转录起始[28]，并抑制诸如产生转录抑制性H3K27me3标记的多梳抑制复合物2(PRC2)等抑制性组蛋白甲基转移酶[29]。H3K36me3还调节DNA修复和转录剪接[30,31]。然而，SETD2和H3K36me3在HIV感染中的作用尚不清楚。值得注意的是，HIV整合酶与含有PWWP结构域的蛋白LEDGF相互作用，LEDGF是H3K36me3标记的识别蛋白，这增加了H3K36me3可能有助于HIV整合的可能性[32]。事实上，体外整合试验表明，H3K36me3修饰的组蛋白显著增强了HIV预整合复合物(PIC)与核小体底物的整合 。有趣的是，最近还表明，染色质绝缘子CTCF也可以介导HIV在小胶质细胞中的整合，并且在高H3K36me3区域附近富集[35]。鉴于这种联系，我们试图了解SETD2和/或H3K36me3是否通过选择性抑制该酶或通过CRISPR/Cas9介导的基因敲除来促进HIV感染。我们的结果表明，SETD2或H3K36me3对于HIV感染不是严格必需的，但会影响整合位点的位置，并在调节整合后HIV表达和潜伏期方面起关键作用。

艾滋病研究(P0 - AI50410)。本出版物中报道的研究部分得到了北卡罗来纳生物技术中心机构支持资助2012 - IDG - 1006。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决策或稿件准备过程中没有发挥任何作用。

利益冲突:BDS是EpiCypher的联合创始人兼董事会成员，并从该公司获得经济补偿。

结果

SETD2活性对于HIV感染不是必需的，但调节HIV表达和潜伏期

为了分析SETD2的作用，我们使用了高效且选择性的SETD2抑制剂EPZ - 719来研究H3K36me3缺失对HIV感染的影响[36]。我们在HIV感染的人Jurkat衍生的CD4 T细胞系(2D10细胞)中开展研究，观察到EPZ - 719的处理导致H3K36me3水平呈剂量依赖性降低，通过蛋白质免疫印迹法在 时可明显观察到降低，在 进行 处理后可进一步观察到降低(图S1，A组)。我们还通过在 暴露于EPZ - 719后每天采集蛋白质样本，研究了2D10细胞中H3K36me3缺失的动力学。我们观察到在EPZ - 719存在的情况下，H3K36me3随时间逐渐耗竭，到 时大部分该标记消失，到 时几乎完全耗竭(图S1，B组)。这些观察结果证实，2D10细胞在 暴露于EPZ - 719足以导致该细胞系中 水平的显著降低。

为了确定H3K36me3缺失对HIV感染的影响，我们用EPZ - 719预处理Jurkat细胞三天(实验设计见图1A)。通过蛋白质免疫印迹分析确认这些细胞中的H3K36me3缺失后(图1B)，我们用表达绿色荧光蛋白的HIV克隆(HIV - dreGFP)感染经EPZ - 719处理的细胞(或经对照载体处理的细胞)。这个特定的克隆在包膜开放阅读框内含有一个半衰期短的绿色荧光蛋白(dreGFP)，可以对LTR驱动的HIV表达进行动态分析[37]。在感染后第3天通过流式细胞术测量有活性的HIV感染(%GFP +)，结果显示EPZ - 719处理的细胞和用对照载体(二甲基亚砜)处理的细胞的总体感染水平相似(分别为29%和26%)(图1C和1D)。这些结果表明，SETD2 / 对于 感染不是必需的。

接下来，我们研究了H3K36me3对HIV潜伏的影响。为此，我们将Jurkat细胞暴露于EPZ - 719三天，用HIV - dreGFP感染，然后在感染后第3天通过流式细胞术分选GFP +细胞以获得富集的活跃感染群体。然后我们在持续存在EPZ - 719或对照载体的情况下将这个感染群体再培养17天。在 进行此培养期间，然后在500 nM EPZ - 719或二甲基亚砜存在下再培养17天，并随时间通过流式细胞术测量潜伏感染群体(GFP -)的出现情况。(G)。CEM5.25细胞用EPZ - 719在 预处理或用对照(二甲基亚砜)处理三天，然后用具有复制能力的HIV毒株NL4 - 3感染。然后将感染的细胞在EPZ - 719或对照存在下再培养四天。在指定的时间点，通过流式细胞术测量感染细胞(GFP +)的比例。每个数据点代表三个重复样本的平均值。误差条表示平均值的标准偏差。星号表示P < 0.05的比较(t检验)。

图1. SETD2活性对于HIV感染不是必需的，但调节HIV表达。(A)。图B - F实验设计示意图。(B)。Jurkat细胞在 暴露于EPZ - 719三天，然后对总细胞蛋白裂解物进行H3K36me3和β - 微管蛋白的蛋白质免疫印迹分析。(C)。用EPZ - 719处理或对照(二甲基亚砜)处理的细胞(三天)用HIV - drEGFP感染，并在感染后第2天通过流式细胞术测量感染情况。(D)。EPZ - 719或二甲基亚砜处理的细胞的HIV感染柱状图。(E，F)。通过流式细胞术富集HIV - dreGFP感染细胞中的有活性感染细胞

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随着时间推移，一小部分被活跃感染的细胞失去了病毒基因表达，变为绿色荧光蛋白阴性(GFP-)，代表潜伏感染群体。有趣的是，我们观察到EPZ - 719处理显著影响了培养物中潜伏感染细胞的出现。对于对照处理的细胞，在感染后8天(dpi)，在对照载体存在下培养的感染细胞中有 为GFP-。相比之下，用EPZ - 719处理的培养物中显示出更大比例失去GFP表达的细胞(约30%)(图1E和1F)，表明培养物中潜伏感染细胞的频率增加。这种病毒基因表达的差异至少维持到实验结束时的20dpi。EPZ - 719对Jurkat细胞活力或生长没有任何明显影响(图S2)。我们还研究了EPZ - 719对具有复制能力的HIV毒株(NL4 - 3)传播感染的影响。为了研究传播感染，我们使用了CEM T细胞(5.25)的一个克隆，该克隆包含一个整合的LTR - GFP盒，并且由于Tat的病毒表达对报告盒的反式激活，在有效感染后变为GFP+[38]。CEM 5.25细胞用EPZ - 719预处理3天，然后用NL4 - 3感染。在用HIV的NL4 - 3毒株感染后，我们观察到病毒在整个细胞培养物中迅速传播，表现为GFP+水平上升至 ，随后随着感染饱和而下降。对于用EPZ - 719处理的细胞，病毒传播稍慢，在 和 时GFP+细胞水平降低，尽管最终病毒仍能够传播并占据培养物(图1G)。总之，这些数据与一个模型一致，即SETD2/H3K36me3对于HIV感染不是必需的，但调节整合后HIV的表达和潜伏期。

EPZ - 719对HIV表达的抑制作用是可逆的

由于H3K36me3与LEDGF(一种HIV整合酶相互作用因子)相关联，我们推测在缺乏H3K36me3的情况下，HIV整合后沉默的增加可能是由于整合位点的差异所致。如果真是这样，那么即使在病毒整合后去除药物，EPZ - 719对感染前治疗的HIV表达的影响也应该持续存在。同样，我们预测感染细胞中的HIV表达在整合后会对EPZ - 719产生抗性。因此，我们研究了HIV感染细胞中H3K36me3的缺失是否即使在抑制剂撤除后仍会诱导持续的转录抑制状态。为了验证这一假设，我们用二甲基亚砜(DMSO)对照或EPZ - 719预处理Jurkat细胞三天以耗尽H3K36me3，然后用HIV - dreGFP感染，之后对感染的(绿色荧光蛋白阳性)细胞进行分选。然后将感染的细胞在EPZ - 719或DMSO中维持两周，以使潜伏感染的(绿色荧光蛋白阴性)群体出现。正如预期的那样，暴露于EPZ - 719的细胞表现出更高比例的潜伏感染(绿色荧光蛋白阴性)细胞和降低的H3K36me3水平(图2A - 2C)。在感染后2周(wpi)，我们然后将培养物分开，并将EPZ - 719添加到先前仅暴露于DMSO的细胞中，并从暴露于该药物的细胞中去除EPZ - 719，用DMSO替代。然后将细胞在其新条件下维持1周，然后通过流式细胞术重新测量病毒基因表达(图2B和2C)。值得注意的是，当我们在这1周暴露后检查H3K36me3水平时，细胞已经改变了它们的H3K36me3水平以匹配它们的新条件 - 新暴露于EPZ - 719的细胞失去了H3K36me3，而去除了EPZ - 719的细胞恢复了H3K36me3水平。在这两种情况下，感染的细胞也改变了病毒基因表达以匹配新的暴露 - 从DMSO转换为EPZ - 719的细胞显示病毒表达降低和潜伏期延长，而从EPZ - 719转换为DMSO的细胞将病毒基因表达恢复到正常水平。因此，我们得出结论，EPZ - 719对HIV表达的抑制是可逆的，同时感染细胞内的H3K36me3水平也是可逆的。这一结论与整合抑制或整合位点位置改变导致EPZ - 719处理细胞中观察到的病毒抑制不一致。这些观察结果也排除了EPZ - 719中绿色荧光蛋白表达丧失是由于未整合病毒DNA随时间逐渐丧失的可能性，因为这种现象是不可逆的。

图2. EPZ - 719对HIV表达的抑制是可逆的。Jurkat细胞用EPZ - 719在 或DMSO预处理三天，然后用HIV - dreGFP感染。在感染后2天(dpi)，通过流式分选富集高效感染的细胞(绿色荧光蛋白阳性)，然后在EPZ - 719或DMSO中再培养两周。在感染后2周(wpi)，将培养物分开，并对一部分细胞逆转暴露条件，再培养一周。在感染后3周(wpi)，通过蛋白质免疫印迹法测量H3K36me3和总H3的水平(A)，并通过流式细胞术测量病毒基因表达(B，C)。每个数据点代表三个重复样品的平均值。误差条代表平均值的标准偏差。星号表示P < 0.05的比较(t检验)。

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H3K36me3修饰的组蛋白存在于整个HIV基因组中，并通过EPZ - 719处理而耗尽

尽管我们的数据表明EPZ-719会导致暴露细胞中H3K36me3的整体耗竭，但接下来我们研究了在HIV前病毒中是否能观察到H3K36me3，以及EPZ-719是否会影响与HIV相关的H3K36me3水平。我们首先用HIV-dreGFP感染Jurkat细胞，然后通过流式分选富集活跃感染(GFP+)的细胞，并将感染细胞暴露于EPZ-719中8天。正如预期的那样，EPZ-719导致感染细胞中H3K36me3的整体水平大幅降低(图3A)，与暴露于载体对照的细胞相比，HIV表达水平也降低了(图3B和3C)。为了检测HIV前病毒上的组蛋白修饰，我们随后使用了靶向切割并释放核酸酶(Cleavage Under Targets and Release using Nuclease)检测H3K36me3、H3K4me3和对照IgG。(C) 使用Integrative Genomics Viewer 2.17版本显示跨HIV参考基因组的测序读数的标准化覆盖度。https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012281.g003

图3. H3K36me3修饰的组蛋白存在于整个HIV前病毒基因组中，并因暴露于EPZ-719而耗竭。用HIV-dreGFP感染Jurkat细胞，然后进行分选以富集活跃感染(GFP+)的细胞。然后将感染细胞在EPZ-719存在下于 或对照载体(二甲基亚砜)中培养8天，然后通过蛋白质免疫印迹分析细胞蛋白丰度(A)，并通过流式细胞术测量病毒基因表达(B)。然后使用针对……的抗体，通过靶向切割并释放核酸酶(CUT&RUN)分析细胞(C)。

(CUT&RUN)[39]。该检测方法包括用针对主要靶点的抗体对染色质进行染色，然后用与微球菌核酸酶(MNase)融合的蛋白A进行二次染色，释放与抗体靶点近端的片段。然后可以使用这些片段的下一代测序来绘制全基因组的蛋白质/DNA相互作用图谱。从CUT&RUN测序数据与HIV基因组的比对中，我们观察到，在暴露于空载体(二甲基亚砜)的感染细胞中，H3K36me3大量存在于整个前病毒基因组中(图3D)。相比之下，通常标记活跃启动子的H3K4me3主要存在于病毒长末端重复序列(LTR)处。暴露于EPZ-719导致HIV上H3K36me3的占有率大幅降低，与其整体效应一致，而H3K4me3没有降低。总体而言，这些数据证实HIV前病毒在整个病毒基因组中与SETD2介导的H3K36me3标记直接相关，并且EPZ-719除了其整体效应外，还会使 前病毒处的 耗竭。

H3K36me3耗竭抑制原代CD4 T细胞中的HIV表达

尽管Jurkat细胞是研究HIV感染的重要模型，但HIV的天然靶细胞是原代CD4 T细胞，原代CD4 T细胞与克隆永生化 细胞系之间存在一些差异。因此，我们研究了在Jurkat细胞中观察到的关于EPZ - 719和H3K36me3缺失的影响是否也适用于原代CD4 T细胞。我们首先检测了原代CD4 T细胞暴露于EPZ - 719后是否会导致H3K36me3缺失。值得注意的是，即使在暴露于EPZ - 719 4天后(96小时)，我们也未观察到静息CD4 T细胞中H3K36me3水平有显著降低(图4A)。这表明，在静息CD4 T细胞中，在这段时间内维持H3K36me3不需要SETD2活性，这可能是由于该标记的去除率较低和/或稀释它所需的细胞分裂水平较低。相比之下，当我们将EPZ - 719添加到最近激活的原代CD4 T细胞中时，我们观察到 迅速丧失，到 时明显减少，暴露48小时后H3K36me3几乎完全丧失(图4B)。静息和原代CD4 T细胞中EPZ - 719效力的这种差异可能是由于激活细胞中H3K36me3的去除更快以及细胞分裂水平更高，因此需要SETD2活性来维持H3K36me3水平。因此，我们重点研究了EPZ - 719对激活的原代CD4 T细胞中HIV感染的影响。为了研究SETD2/H3K36me3在激活的原代CD4 T细胞中的作用，我们使用了我们之前建立的HIV感染和潜伏的原代CD4 T细胞模型(图4C)[16,37,40]。在这个模型中，原代CD4 T细胞先激活两天，然后感染HIV - dreGFP。然后在感染后第2天通过流式分选富集活跃感染的细胞(GFP +)，并长时间培养。随着感染细胞恢复到静息状态，HIV表达逐渐降低，潜伏感染的细胞(GFP -)在几天内出现。当我们将这个模型与暴露于EPZ - 719或对照载体(DMSO)相结合时，我们观察到在感染后第8天，与对照细胞相比，暴露于EPZ - 719的细胞中GFP +细胞的百分比显著降低(22% GFP +对40% GFP +)(图4D和4E)。这种变化与EPZ - 719对激活标记(CD38、HLA - DR)表达的影响无关(图S3)。这些数据表明，EPZ - 719的影响以及SETD2在HIV表达中的作用在原代CD4 T细胞中是保守的。一些先前的数据表明，SETD2可以通过阻止产生H3K27me3组蛋白标记的多梳抑制复合物2(PRC2)的沉默来促进基因表达[41]。为了研究这种可能性，我们同时检测了PRC2的催化亚基EZH2的抑制剂(UNC1999)，并将其与EPZ - 719联合使用，发现UNC1999没有影响

图4. 原代CD4 T细胞中HIV表达需要SETD2活性。将500nM EPZ - 719添加到静息(A)或激活(B)的CD4 T细胞中，持续所示时间。然后收集总蛋白提取物，进行蛋白质免疫印迹检测H3K36me3和总组蛋白H3。(C)HIV潜伏原代细胞模型的示意图概述。CD4 T细胞激活2天，然后在感染HIV - dreGFP之前再暴露于EPZ - 719或DMSO 2天。在感染后第2天，通过流式分选GFP +细胞，并在存在EPZ - 719(500nM)、UNC1999(1μM)、EPZ - 719 + UNC1999或DMSO的情况下再培养8天。然后通过流式细胞术测量病毒基因表达，并计算有活跃表达(GFP +)的细胞百分比(D，E)。每个数据点代表三个重复样本的平均值。误差条表示平均值的标准偏差。星号表示 的比较(t检验)。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012281.g004关于HIV表达或EPZ - 719对HIV的抑制作用。因此，EPZ - 719对HIV表达的抑制不依赖于EZH2/PRC2活性。

SETD2表达是原代CD4 T细胞中HIV表达所必需的

为了进一步证实SETD2在原代CD4细胞中HIV表达中的作用，我们在HIV感染的细胞中进行了CRISPR/Cas9介导的SETD2基因敲除。为此，在2dpi时，将由靶向SETD2、病毒转录调节因子Tat或非靶向(NT)对照的Cas9和crRNAs组成的核糖核蛋白(RNP)复合物转染到活化的HIV - dreGFP感染的原代CD4 T细胞中(图5A)。蛋白质免疫印迹法证实细胞中SETD2表达缺失且H3K36me3水平降低(图5B)。当我们在 检测病毒基因表达时，与用非靶向对照RNP转染的细胞相比，我们观察到靶向SETD2的细胞中GFP +细胞水平显著降低。重要的是，靶向Tat导致病毒基因表达大幅降低，证实这种方法可以检测HIV表达的调节因子(图5C和5D)。总体而言，这些数据进一步证实SETD2是原代CD4 T细胞中HIV表达的重要调节因子，并且SETD2活性是维持CD4 T细胞中活跃HIV基因表达所必需的。

图5. 原代CD4 T细胞中SETD2基因敲除降低HIV表达。(A). 原代CD4 T细胞中SETD2基因敲除的示意图。CD4 T细胞被激活2天，然后感染HIV - dreGFP。在2dpi时，用靶向SETD2、Tat或非靶向(NT)对照的核糖核蛋白(RNP)转染细胞。在靶向转染后8天，提取总细胞蛋白裂解物，并用蛋白质免疫印迹法检测SETD2、H3K36me3、总组蛋白H3和 -微管蛋白(B)。还显示了未感染细胞和感染但未转染的细胞(“未电击”)。通过流式细胞术测量病毒基因表达(C，D)。每个数据点代表三个重复样本的平均值。误差条表示平均值的标准偏差。星号表示 的比较(t检验)。

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H3K36me3缺失影响细胞基因表达但不改变HIV RNA水平

为了进一步了解SETD2在HIV表达调控中的作用，我们对在EPZ - 719或对照载体(DMSO)存在下培养的HIV - dreGFP感染的Jurkat细胞进行了RNA测序。有趣的是，我们观察到两种条件之间有许多差异表达基因(DEG)，总共4833个基因(p值 )，其中2310个基因上调，2523个基因下调(图6A，S1表)。然而，这些变化大多幅度较小，只有34个上调的DEG和38个下调的DEG变化幅度大于 。尽管如此，我们在转录组变化中观察到了一些有趣的模式。当我们使用Enrichr [42]检查上调基因与特定染色质特征的富集情况时，我们观察到与E2F结合相关的基因有很强的富集(图6B，上图，S2表)。相比之下，下调基因与Myc结合峰高度相关(图6B下图，S3表)。值得注意的是，暴露于EPZ - 719后Myc表达本身降低，这与Myc依赖性基因表达的总体降低一致。我们还对上调或下调的前500个基因进行了基因本体(GO)分析[43]，并观察到上调的DEG高度富集于染色质的结构成分(GO:0030527)( )，而下调基因高度富集于RNApol2特异性DNA结合转录因子活性(GO:0003700， )(S4 - S7表)。这些观察结果是

图6. EPZ - 719影响细胞基因表达，但不影响HIV RNA水平。在感染前3天和感染后8天，用EPZ - 719(500 nM)或二甲基亚砜(DMSO)处理HIV - dreGFP感染的Jurkat细胞，然后通过批量RNA测序进行分析。(A)差异表达基因(DEG)的火山图，显著下调的 基因用蓝色表示，上调基因用红色表示。标记了三个上调和下调最显著的基因。无显著差异 = 无显著差异(灰色)。(B)使用Enrich分析上调和下调的基因，以在基因集中找到来自ENCODE数据库的已知蛋白质/DNA结合位点的富集情况。(C)计算数据集中独特病毒读数占总独特读数的百分比(左图)，并通过定量PCR检测Gag病毒RNA(Gag - vRNA)的丰度(右图，任意单位)。对生物学重复样本进行分析。误差条表示平均值的标准偏差。NS = 无显著差异，t检验(P>0.05)。

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012281.g006与EPZ - 719对细胞染色质和RNA聚合酶2驱动的转录具有广泛影响一致。

我们还在RNA测序数据集中检测了几种已知的HIV转录调节因子的表达。我们之前鉴定出染色质绝缘子CTCF在感染细胞中抑制HIV表达[16]，并且暴露于EPZ - 719后CTCF表达上调。在暴露于EPZ - 719的细胞中，多梳抑制复合物2(PRC2)的催化亚基EZH2的表达也增加。有趣的是，我们在暴露于EPZ - 719的细胞中观察到一些先天免疫激活的证据——干扰素调节基因IRF1、IRF4、MX2、IFIT3和IFIT2的表达均上调。此外，细胞因子信号转导介质STAT4和STAT2在对EPZ - 719的反应中均上调。我们还在数据集中检测了HIV限制因子的表达，并观察到不同的结果。在存在EPZ - 719的情况下，载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3F(APOBEC3F)、载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3D(APOBEC3D)以及载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样2(APOBEC2)均上调。相比之下，骨髓基质细胞抗原2(BST2)、丝氨酸整合素1(SERINC1)、丝氨酸整合素2(SERINC2)和丝氨酸整合素5(SERINC5)下调。总体而言，这些数据表明H3K36me3缺失影响大量细胞基因，包括一些可能对HIV表达有直接或间接影响的基因。

为了研究H3K36me3缺失是否会影响HIV RNA表达水平，我们还比较了暴露于EPZ-719的细胞与对照细胞中HIV定位读数的总体比例。有趣的是，两种条件下HIV读数的丰度相似，表明EPZ-719对总体HIV RNA水平没有影响(图6C，左图)。此外，对整个病毒基因组的HIV定位读数进行可视化分析，结果显示两种条件下的总体分布水平相似(补充图4)。为了证实这一观察结果，我们对在EPZ-719或二甲基亚砜(DMSO)存在下培养8天的HIV-dreGFP感染的Jurkat细胞中的Gag RNA水平进行了定量实时PCR分析(图6C右图)。与RNA测序结果相似，我们发现暴露于EPZ-719后Gag RNA水平没有显著差异，尽管我们确实观察到相对于暴露于对照的细胞，暴露于EPZ-719的细胞中Gag RNA有增加的趋势。这一观察结果表明，EPZ-719不会降低HIV转录和RNA丰度的总体水平，而是可能影响HIV表达的转录后步骤。我们通过使用5-乙炔基尿苷标记，然后进行生物素化，并从暴露于DMSO或EPZ-719 8天的细胞中分离标记的RNA，来量化感染细胞中新生病毒RNA的丰度，进一步检验了这一假设。与我们之前的结果一致，我们观察到在存在EPZ-719的情况下，总RNA中的病毒RNA水平没有变化(补充图5，A图)。当我们检查新生HIV转录本时，我们没有观察到丰度有明显变化(补充图5，B图)。我们还研究了EPZ-719对暴露于EPZ-719或DMSO 7天的HIV-dreGFP感染的原代CD4 T细胞中Gag RNA水平的影响，并未观察到两种条件之间存在差异(补充图5，C图)。这些数据共同表明了一个模型，即EPZ-719在转录后步骤抑制HIV表达。然而，EPZ-719仍有可能影响这些检测未测量的HIV转录的某个方面。

SETD2/H3K36me3影响HIV RNA剪接

接下来，我们考虑了EPZ-719可能影响HIV表达的转录后机制。已有研究表明，H3K36me3通过METTL3调节RNA的m6A修饰[44]，并且m6A RNA甲基化显著影响HIV表达和复制[45 - 48]。因此，我们在HIV-dreGFP感染的细胞暴露于EPZ-719 13天后，检测了细胞RNA中的总细胞m6A水平(补充图6，A图)。经过这段培养期后，如预期的那样，暴露于EPZ-719的细胞中HIV表达降低。然而，尽管培养物中HIV表达和潜伏感染(GFP-)细胞的丰度存在明显差异(补充图6，B图)，但与暴露于DMSO对照的细胞相比，我们观察到总m6A丰度没有变化(补充图6，C图)。为了检测HIV转录本内的m6A RNA修饰，我们还对感染细胞中的m6A RNA进行了免疫沉淀，然后对Env/Rev编码序列内已被证明大量被m6A修饰的HIV区域进行定量实时PCR[46,47]。如预期的那样，m6A特异性下拉显著富集了该RNA序列，超过了对照IgG，但我们观察到暴露于EPZ-719的细胞与对照(DMSO)暴露的细胞之间在丰度上没有差异(补充图6，D图)。因此，我们得出结论，EPZ-719可能不会通过影响病毒或细胞RNA的m6A修饰来影响HIV表达。

接下来，我们研究了SETD2是否会影响HIV转录本的剪接。全长HIV基因组转录本可以通过四个剪接供体位点(D1、D2、D3、D4)和十个不同的剪接受体位点(A1、A2、A3、A4a、A4b、A4c、A4d、A5、A5b、A7)进行广泛剪接，从而产生多达50种不同的RNA形式(图7A)。为了研究这一点，我们使用了一种最近开发的检测方法，在 条件下，将感染HIV-dreGFP的细胞暴露于EPZ-719 13天后，对单个HIV RNA种类进行定量分析[49]。该检测方法首先使用一个随机的独特分子标识符进行逆转录反应，该标识符同时作为引物来捕获所有HIV RNA种类——未剪接的、4kb和1.8kb的。在逆转录过程中，随机的独特分子标识符被添加到cDNA中，从而在后续的PCR扩增和Illumina测序后，能够对原始文库中的每个分子进行准确定量。进行此分析后，我们观察到，在经EPZ-719处理的细胞中，显示出一小部分完全剪接的vRNA(1.8kb)。(D)。显示了使用不同初始受体的剪接转录本的比例。(E)。显示了使用不同最终受体的剪接转录本的比例。每个柱代表三个独立生物学重复的平均值。误差条代表平均值的标准偏差。星号表示显著差异(P<0.05，学生t检验)。

图7. EPZ-719影响HIV RNA剪接。通过一种方法对HIV RNA剪接进行定量分析，该方法使用包含随机核苷酸条形码序列的引物，对暴露于EPZ-719或二甲基亚砜(DMSO)的感染HIV-dreGFP的Jurkat细胞中的RNA进行逆转录，随后对病毒RNA的主要4kb和1.8kb种类进行PCR扩增，并进行Illumina测序。(A)。引物结合位点以及HIV剪接供体(D1-D4)和受体(A1-A7)位点在HIV基因组图谱上的位置显示。(B)。显示了剪接的vRNA的比例。(C)。

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但与对照细胞相比，剪接转录本的比例总体上有显著降低(59%对69%)(图7B)。此外，对于经EPZ-719处理的细胞，作为剪接转录本一部分的 转录本的百分比略有降低(图7C)。此外，当我们检查剪接转录本中剪接供体和受体的使用情况时，我们注意到A1初始受体的使用略有增加，而A5初始受体的使用减少(图7D)。然而，当我们比较最终受体的使用情况时，两种条件之间没有显著差异(图7E)。为了在原代CD4 T细胞中证实这些结果，我们用HIV-dreGFP感染活化的原代CD4 T细胞，然后在 条件下于EPZ-719存在的情况下培养八天，然后使用我们用于Jurkat细胞的基于测序的相同检测方法分析HIV转录本剪接。与我们在Jurkat细胞中观察到的情况类似，我们观察到在EPZ-719存在的情况下，剪接的HIV RNA的总体百分比显著降低(S7图，A组)，而完全剪接的剪接病毒RNA的百分比没有变化，并且所使用的初始或最终剪接受体位点也没有明显变化(S7图，B-D组)。我们还使用我们从暴露于EPZ-719的感染HIV的Jurkat细胞中生成的RNAseq数据集，研究了EPZ-719对细胞转录本剪接的影响。我们观察到在EPZ-719存在的情况下，有1399个细胞基因存在外显子使用差异(S8图，S8表)。总体而言，这些观察结果表明，H3K36me3的缺失可以改变感染细胞中的病毒和细胞剪接，并导致剪接的病毒RNA适度但显著减少。这种对病毒剪接的影响可能有助于EPZ-719对病毒表达的总体抑制作用。

EPZ-719对HIV整合位点的影响

为了进一步研究靶细胞中的SETD2活性或H3K36me3水平是否会影响HIV整合，我们从Jurkat细胞中提取了细胞基因组DNA，这些细胞已暴露于EPZ - 719或对照(二甲基亚砜)3天，然后用HIV - dreGFP感染。然后通过从HIV长末端重复序列(LTR)进行线性扩增，接着进行巢式PCR和对扩增产物进行长读长测序，来确定每种条件下的整合位点[50]。使用这种方法，我们从处于二甲基亚砜或EPZ - 719条件下的细胞中回收了HIV整合位点(分别为1421个和2531个)。对全基因组整合位点分布的检查表明，与之前的报告一致[51]，整合位点在染色体上的分布是非随机的，某些染色体如19号染色体(Ch19)的整合位点富集丰度升高(图8A)。当我们比较在EPZ - 719存在下感染的细胞与在二甲基亚砜存在下感染的细胞之间的整合位点时，我们观察到染色体上的总体分布相似，只有微小差异(图8A)。一些染色体如16号染色体(Ch16)在EPZ - 719处理的细胞中整合子比例表现出明显差异(二甲基亚砜处理的细胞为12.0%，EPZ - 719处理的细胞为8.9%)。这种差异的意义尚不清楚。然后我们检查了整合位点与基因的关联。正如预期的那样，对于在二甲基亚砜存在下感染的细胞，大多数HIV整合位点(80%)与基因相关，而不是基因间区域 (图8B)。对于暴露于EPZ - 719的细胞也是如此，71%的整合位点与基因相关，29%在基因间区域，尽管数据表明在EPZ - 719存在下，整合从基因区域向非基因区域有适度的转移。我们由此得出结论，HIV整合与基因的关联并不需要SETD2活性或H3K36甲基化，但SETD2活性确实会影响整合位点的分布。(D)。(E)。使用ChromHMM将每个整合位点注释为属于15种不同染色质/转录环境之一。

图8. EPZ - 719存在下HIV整合位点的分析。使用在EPZ - 719(500nM)或对照(二甲基亚砜)存在下感染HIV - dreGFP的Jurka细胞衍生的基因组DNA，分别鉴定出2531个和1421个整合位点。对于这些整合位点，我们比较了它们的染色体分布(A)、与基因的关联(B)、在EPZ - 719或二甲基亚砜对照存在下感染的与HIV整合位点相关的细胞基因的标准化表达水平(C)，以及……之间的斯皮尔曼相关性

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012281.g008 不需要SETD2活性或H3K36甲基化，但SETD2活性确实会影响整合位点的分布。

由于H3K36me3是在转录过程中由SETD2沉积的，并且与活跃表达的基因相关联，我们还使用我们的RNA测序数据集，检测了在存在EPZ - 719或二甲基亚砜(DMSO)对照的情况下，与HIV整合位点相关的基因的表达水平。在这两种情况下，HIV整合在感染细胞中高表达的基因中富集——所有基因的平均标准化转录本读数为2890，而在EPZ - 719或DMSO处理的细胞中，与HIV整合位点相关的基因的平均表达水平分别为11337和9739(图8C)。因此，EPZ - 719处理和H3K36me3缺失并未阻止HIV整合与高表达基因的关联。此外，我们检测了每条染色体上整合位点的数量与该染色体上基因数量之间的相关性。我们观察到染色体上基因的数量与整合位点的数量之间存在很强的正相关。这种观察结果在对照细胞和EPZ - 719处理的细胞中均成立(分别为 和 )(图8D)。我们还检测了整合位点(IS)基因是否在我们的RNA测序数据集中的差异表达基因(DEG)中富集。我们观察到，与二甲基亚砜和EPZ - 719条件下的IS基因集相比，差异表达基因在细胞基因总体比例中所占比例更高(35%)，而细胞基因中差异表达基因的总体比例为17%(补充图9，A图)，这表明整合位点在差异表达基因中富集。当我们比较也是差异表达基因的IS基因的基因表达变化倍数和变化方向时，我们观察到二甲基亚砜和EPZ - 719处理的细胞中的IS基因与差异表达基因的总体集均表现出相似的差异基因表达分布(补充图9，B图)。

为了更详细地检测EPZ - 719对HIV整合位点的影响，接下来我们使用ChromHMM对每个整合位点的染色质“邻域”进行注释[52]。这种方法使用隐马尔可夫模型，根据已知的染色质标记集的丰度对特定基因组位置进行分类。具体而言，我们将每个整合位点定义为属于15种不同染色质/转录状态之一。正如预期的那样，在与活跃转录基因相关的染色质结构域中观察到很大一部分HIV整合位点，对于对照(DMSO)处理的细胞，定义为具有弱转录或强转录特征的区域占位点的55%。增强子区域也有很高的占比(图8E，左图)。值得注意的是，强烈转录的基因区域表现出高水平的H3K36me3修饰[52]。此外，在DMSO条件下，18%的整合发生在被归类为“静止”的区域，这些区域几乎没有组蛋白修饰。在EPZ - 719处理的细胞中，这些趋势也存在，但我们观察到某些类别的占比发生了变化(图8E，右图)。有趣的是，我们观察到EPZ - 719导致HIV整合与高转录基因区域的关联减少(18.3%对30.8%)，而整合到弱转录基因区域则不受影响。相应地，在EPZ - 719处理的细胞中，我们观察到在被归类为静止(26.3%对18.3%)、增强子(17.6%对11.7%)或弱多梳抑制区域(4.4%对2.0%)的基因组区域中，整合位点有所增加。总体而言，这些结果表明，在没有H3K36me3的情况下，HIV仍然能够整合到宿主细胞基因组中，并保持对活跃转录基因的偏好，但表现出从高转录染色质区域重新分布到静止区域、增强子区域和多梳抑制区域的趋势。

LEDGF以不依赖H3K36me3的方式与细胞染色质结合

H3K36me3修饰的组蛋白在体外介导HIV整合[53]，且体内HIV整合位点在H3K36me3丰富区域富集[54]。然而，我们的数据表明HIV整合独立于H3K36me3。HIV整合前复合物已被证明通过H3K36me3结合蛋白LEDGF与染色质相互作用[55]。因此，我们推测在缺乏H3K36me3的情况下，依赖LEDGF的整合仍可通过LEDGF的替代结合伴侣发生。例如，LEDGF已被证明与H3K36me2相互作用[56]。为了探究这一想法，我们检测了在有或没有H3K36me3的情况下LEDGF与细胞染色质的关联。我们将2D10细胞暴露于EPZ - 719三天，然后将细胞分离为可溶性和与染色质相关的蛋白质组分，之后进行蛋白质免疫印迹检测LEDGF以及H3K36me3、H3K36me2、SETD2、总组蛋白H3和α - 微管蛋白。正如预期，H3K36me3和H3K36me2主要存在于染色质组分中，而α - 微管蛋白主要存在于细胞质中(图9)。与我们之前的观察结果一致，EPZ - 719导致总细胞裂解物和与染色质相关的蛋白质中 显著耗竭。值得注意的是，在存在EPZ - 719的情况下，LEDGF和H3K36me2仍大量与染色质相关联。这些结果表明LEDGF与染色质的关联不依赖于H3K36me3，并且在缺乏H3K36me3的情况下，另一种机制，如可能是H3K36me2，介导LEDGF与染色质的结合。

图9. LEDGF以不依赖H3K36me3的方式与细胞染色质相关联。将2D10细胞在 浓度下暴露于EPZ - 719或对照载体(二甲基亚砜)三天，然后分离为总细胞裂解物、可溶性裂解物和与染色质相关的蛋白质。然后通过蛋白质免疫印迹分析蛋白质样品中的指定靶标。

^[1]

缺失增强潜伏 对HDAC抑制剂重新激活的敏感性

潜伏前病毒的存在是治愈艾滋病病毒的关键障碍，但潜伏前病毒的重新激活通常效率低下。接下来，我们决定研究从受感染细胞中耗尽H3K36me3是否会影响使用潜伏期逆转剂(LRA)对潜伏性艾滋病病毒的重新激活。为了验证这一假设，我们将Jurkat细胞暴露于EPZ-719中3天以耗尽H3K36me3，然后用HIV-dreGFP感染这些细胞。然后通过流式分选在 富集GFP+的活跃感染细胞，然后将感染的细胞在连续的二甲基亚砜(DMSO)或EPZ-719中再培养20天。经过这段培养期后，出现了潜伏(GFP-)群体，这些潜伏感染的细胞通过流式分选GFP-细胞进一步富集。因此，我们获得了一个富含潜伏感染细胞的Jurkat细胞多克隆群体(图10A)。然而，在这个群体中，一部分细胞(28%)仍然表现出低水平的背景艾滋病病毒表达(图10B)。在没有刺激的情况下，暴露于EPZ-719的细胞表现出略低水平的基线艾滋病病毒表达(22% GFP+)。然后，我们用两种作用机制不同的LRA刺激潜伏感染群体:伏立诺他——一种1类组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，和前列腺素——一种蛋白激酶C激动剂。正如预期的那样，在刺激后24小时，两种LRA都重新激活了一部分潜伏感染的细胞，这表现为GFP+细胞百分比的增加(图10B和10C)，伏立诺他使GFP+细胞平均增加 ，前列腺素使GFP+细胞增加 。有趣的是，虽然暴露于DMSO的细胞和暴露于EPZ-719的细胞对前列腺素的反应相似，但暴露于EPZ-719的细胞对伏立诺他的重新激活反应明显更强(暴露于EPZ-719的细胞中GFP+细胞增加44%，而暴露于DMSO的细胞中为22%)。为了进一步研究在没有 的情况下，这种病毒对伏立诺他反应的增加是否与组蛋白乙酰化方面对伏立诺他的整体反应性升高有关，我们通过蛋白质免疫印迹法测量了每种条件下感染细胞群体中总的H3K9和H3K27乙酰化水平(图10D)。正如预期的那样，暴露于伏立诺他后，整体H3K9ac和H3K27ac显著增加。值得注意的是，这种增加在暴露于EPZ-719的细胞和暴露于DMSO的细胞中相似，这表明EPZ-719不会影响对1类HDAC抑制剂的整体反应性，而是可能影响包括艾滋病病毒在内的一组特定基因。在一些实验中，我们还观察到单独存在EPZ-719时H3K9ac水平有小幅下降，但并非始终如此。EPZ-719对伏立诺他而非前列腺素诱导的潜伏期逆转产生影响的原因尚不清楚，但这表明H3K36me3调节了一组特定的转录控制步骤，这些步骤与某些LRA相关，但与其他LRA无关。

接下来，我们在另一种HIV潜伏模型中研究了H3K36me3缺失对潜伏期逆转的影响。2D10细胞含有HIV基因组的潜伏整合拷贝，该拷贝编码一种不稳定的GFP蛋白[57]。在基线条件下，这些细胞不表达HIV基因产物，但可被多种潜伏期逆转剂重新激活。为了确定 缺失如何影响这些细胞对潜伏期逆转剂(LRA)的反应性，我们将2D10细胞单独暴露于EPZ - 719或对照载体(二甲基亚砜)，或与不同的LRA联合使用。正如我们之前从Jurkat细胞的初次感染中观察到的那样，EPZ - 719导致HIV的基线病毒表达出现轻微但可重复的下降，并且EPZ - 719本身没有LRA二甲基亚砜的作用。刺激后24小时，通过流式细胞术测量潜伏感染群体的重新激活情况。(B，C)。响应伏立诺他(VOR)或原锥虫素的HIV - dreGFP重新激活的流式细胞术和柱状图。(D)。分离刺激细胞和对照细胞的蛋白质提取物，并通过蛋白质免疫印迹法测量每个群体的组蛋白乙酰化(H3K9ac和H3K27ac)以及H3K36me3。每个数据点代表三个重复样品的平均值。误差条表示平均值的标准偏差。星号表示P<0.05的比较(t检验)。

图10. H3K36me3缺失增强潜伏HIV对HDAC抑制剂重新激活的敏感性。(A)。实验设计的示意图概述。将Jurkat细胞暴露于EPZ - 719(500nM)或二甲基亚砜三天，然后用HIV - dreGFP感染。在感染后48小时，通过流式分选分离出有效感染的细胞，然后在EPZ - 719(500nM)或二甲基亚砜中再培养两周。然后通过流式分选富集潜伏感染的细胞(GFP - )，并在EPZ - 719(500nM)存在的情况下用伏立诺他(VOR)(500nM)或原锥虫素(500nM)刺激或

https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1012281.g010活性。当我们将EPZ - 719与溴结构域抑制剂iBET151或非经典NF - B激动剂AZD5582联合使用时，这两种LRA最近已被证明可协同重新激活潜伏的HIV[58]，我们观察到EPZ - 719对单独或联合使用的每种LRA的病毒重新激活几乎没有影响(图11A)。相比之下，当我们将EPZ - 719与伏立诺他和H3K27me3结合蛋白EED的抑制剂(EED226)联合使用时，我们观察到伏立诺他/EED226组合显著增强了潜伏期逆转(图11B)。与我们在HIV感染细胞的多克隆群体中的观察结果相似，在EPZ - 719存在的情况下，2D10细胞对伏立诺他介导的重新激活的敏感性增强与伏立诺他暴露后总体更高水平的组蛋白乙酰化无关(图11C)。由于这些观察结果依赖于通过流式细胞术检测病毒蛋白表达，我们还检查了在病毒RNA水平上是否可以观察到2D10细胞中伏立诺他/EED226介导的潜伏期逆转增强。当我们通过定量PCR检查HIV Gag病毒RNA(vRNA)的表达时，我们观察到EPZ - 719强烈增强了对伏立诺他/EED226组合的vRNA上调，表明这种作用是在转录水平介导的(图11D)。总之，这些发现支持这样一种观点，即HIV感染细胞中的SETD2/H3K36me3水平可以调节潜伏前病毒对某些LRA的敏感性，特别是对伏立诺他或伏立诺他/EEDi组合。

讨论

确定调控HIV表达的宿主因子集对于开发广泛重新激活潜伏HIV储存库的方法至关重要。研究表明，HIV表达受一系列宿主细胞转录复合物和染色质修饰酶( )调控。奇怪的是，尽管HIV主要整合到活跃转录的宿主基因中，但潜伏的HIV前病毒仍保留转录抑制性异染色质区域的特征。由于许多这些染色质特征可在细胞分裂过程中垂直传递，潜伏期可能代表一种稳定且可遗传的表观遗传状态。因此，潜伏期相关染色质除了对细胞内HIV表达的直接抑制很重要外，还可能通过在HIV感染者受感染细胞的克隆扩增过程中传递潜伏状态，在储存库持久性中起关键作用[10,14,16,61]。已研究组蛋白修饰酶在HIV潜伏期和重新激活中的特定作用，发现各种复合物在HIV表达中起正向或负向作用。特别是，组蛋白去乙酰化酶(HDACs)在潜伏期的建立和维持中的作用是众所周知的，HDAC抑制剂在基于细胞的模型系统和HIV感染者(PWH)中均可逆转并预防HIV潜伏期[18,22,37,62 - 64]。组蛋白甲基转移酶EZH2是多梳抑制复合物2(PRC2)的催化亚基，也可能在HIV沉默中起作用[11,65 - 67]。最近，HMTs SMYD2和SMYD5与HIV表达和潜伏期有关。已证明SMYD5是高HIV表达所必需的，它通过与TAR RNA结合并介导Tat的甲基化来促进HIV转录( )。

值得注意的是，SETD2在HIV感染中的作用此前尚未被研究。SETD2是一种大型(288kDa)蛋白质，在哺乳动物细胞中大量表达，并且是唯一负责产生H3K36me3的蛋白[27,70]。H3K36me3在转录和基因表达中的功能作用似乎很复杂。H3K36me3在活跃转录基因的基因体中高度富集，并且已证明它通过招募HDACs和其他抑制性修饰(包括DNA甲基化)来抑制基因内的隐秘转录起始位点[28,71,72]。其他数据表明，H3K36me3除了调节包括RNA加工和RNA的m6A甲基化在内的转录后事件外，还限制抑制性H3K27me3标记在活跃表达基因内的扩散[73]。值得注意的是，已证明SETD2在病毒复制中起作用。SARS - Cov2蛋白NSP9通过靶向SETD2抑制干扰素反应途径[74]，并且SETD2也与人类乳头瘤病毒(HPV)的转录调控有关[75,76]。因此，在本手稿中，我们研究了SETD2在HIV基因表达和潜伏期中的作用。

图11. EPZ - 719增强vorinostat/EEDi组合在2D10细胞中的潜伏期逆转。在使用所示小分子(EED226 = EED抑制剂，AZD5582 = 非经典NF - B激动剂，iBET151 = BRD4抑制剂，VOR = vorinostat/HDAC抑制剂)刺激前，将2D10细胞与 EPZ - 719孵育三天。然后通过流式细胞术分析潜伏HIV的重新激活情况(A，B)。(C)通过蛋白质免疫印迹法测定细胞组蛋白修饰的丰度。(D)通过实时PCR定量HIV Gag RNA。突出显示统计学上的显著差异(P<0.05，单因素方差分析)。

^[2]

我们在这项研究中发现，SETD2的表达及其活性对于促进受感染细胞中高水平的HIV表达以及限制潜伏感染细胞群体的出现至关重要。通过使用SETD2的选择性抑制剂或通过CRISPR介导的SETD2基因敲除，我们发现SETD2和H3K36me3的缺失与HIV表达显著降低以及具有潜伏病毒表型的细胞比例增加有关。这一发现已在Jurkat细胞和HIV感染的原代细胞模型中得到证实。值得注意的是，在向靶细胞添加HIV病毒颗粒后，H3K36me3的缺失对感染细胞的总数没有影响，这表明SETD2和H3K36me3对于HIV感染和整合不是必需的，但会影响病毒基因表达的整合后阶段。我们观察到，无论是否存在H3K36me3，HIV整合位点在染色体分布和对高转录基因的偏好方面基本相似。然而，在不存在 的情况下，我们确实观察到整合位点一致地向非基因区域转移，并且从活跃转录区域重新分布到静止和多梳抑制染色质区域。鉴于NSD酶产生的H3K36me2标记也被预测可招募LEDGF，我们推测H3K36me2在SETD2/H3K36me3缺失的情况下发挥补偿作用。与这一假设一致的是，在存在SETD2抑制剂的情况下，LEDGF和H3K36me2都仍然与染色质相关联。

基于我们的研究结果，我们提出SETD2对HIV表达的影响至少部分是在转录后水平。尽管在暴露于EPZ - 719或SETD2缺失的细胞中，HIV蛋白水平发生了显著变化，但我们在RNA测序数据或病毒RNA的qPCR中均未观察到HIV RNA总体水平的变化。先前的研究表明SETD2会影响转录后RNA加工的多个方面。特别是，SETD2被证明是细胞RNA的m6A甲基化所必需的，并且这种RNA修饰已知会强烈影响基因表达。其他实验室先前也表明HIV RNA被广泛甲基化有m6A [45 - 48]。然而，在我们的研究中，我们没有观察到SETD2对总HIV m6A RNA甲基化或HIV m6A RNA甲基化有任何影响。SETD2仍有可能影响一种不同的、特征不太明确的RNA修饰形式，而这种修饰形式是高效HIV表达所必需的。

我们还研究了HIV RNA转录本的剪接，发现SETD2抑制适度影响了剪接转录本的比例。具体而言，在存在EPZ - 719的情况下，总体HIV剪接减少。此外，在剪接转录本中，供体/受体使用方面也观察到了一些适度的差异。这些数据表明，转录过程中HIV原病毒相关组蛋白上SETD2和H3K36me3的存在会影响病毒RNA的转录后成熟。在没有SETD2活性的情况下，HIV转录本剪接模式的改变可能导致病毒基因表达总体水平降低。然而，其他转录后机制也有可能对SETD2在HIV表达中的作用有贡献。

SETD2也有可能对HIV表达产生间接影响。实际上，对暴露于EPZ - 719的细胞进行的全转录组分析表明，许多细胞基因的表达发生了改变。有趣的是，当SETD2活性受到抑制时，观察到几个干扰素敏感基因(ISG)的表达增加，这表明诱导了一种总体抗病毒状态，可能有助于抑制HIV表达。值得注意的是，先前的研究已将SETD2与先天免疫系统联系起来。具体而言，SETD2已被证明通过甲基化STAT1来放大干扰素(IFN)信号[77]。需要注意的是，有人提出SETD2除了甲基化H3K36外，还会甲基化细胞靶点，这可能对HIV的调控很重要。例如，除了STAT1外，有人提出SETD2还会在K68位点对肌动蛋白进行三甲基化[78]。

有趣的是， 的缺失也增加了潜伏前病毒对组蛋白脱乙酰酶抑制剂伏立诺他重新激活的敏感性。这种现象背后的机制尚不清楚，但先前的研究表明，抑制组蛋白甲基转移酶EZH2也可以增强潜伏前病毒对伏立诺他的反应性 [66]。H3K36me3抑制基因体内的转录起始，但在受感染的细胞中，H3K36me3也可能存在于病毒长末端重复序列(LTR)中，这可能有助于抑制HIV转录。事实上，我们的实验揭示了前病毒基因组中广泛存在H3K36me3，包括在LTR处。虽然我们发现单独抑制SETD2不会影响HIV转录，但去除与LTR相关的H3K36me3除了产生转录后效应外，还可能使一部分病毒启动子处于对HDAC抑制有反应的准备状态。用EPZ-719消耗H3K36me3也可能有助于提高临床病毒库对伏立诺他的反应性。然而，这种方法的一个障碍是EPZ-719在静息CD4 T细胞中的疗效明显有限。这种低活性可能是由于静息CD4 T细胞中H3K36me3的周转缓慢，增强该残基的去甲基化可能产生与抑制SETD2类似的效果。

最后，我们的研究结果提出的一个关键问题是，SETD2活性的丧失或H3K36me3的消耗是否与临床病毒库的形成或维持有关。SETD2表达或活性的变化和/或H3K36me3的丰度可能会影响给定的受感染细胞是采用潜伏感染还是活跃感染表型。需要进一步的研究来证明SETD2在调节临床病毒库中的作用及其作为体内增强潜伏期逆转靶点的潜力。

方法和材料

细胞系

HEK293T细胞在含有10%胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养。Jurkat细胞、CEM5.25细胞和原代CD4 T细胞在含有10% FBS、青霉素/链霉素，并补充有谷氨酰胺、HEPES和丙酮酸钠的RPMI培养基中培养。2D10细胞由Jonathan Karn博士馈赠。CEM5.25细胞由Dan Littman博士提供。293T细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。

病毒感染

使用Mirus LT1试剂(Mirus Bio LLC，麦迪逊，威斯康星州)将病毒质粒DNA转染HEK293T细胞来产生HIV颗粒。在24小时时，用新鲜的RPMI培养基替换上清液以收集病毒。在48小时时，收集病毒上清液。首先通过低速离心(300g，5分钟)去除细胞碎片，然后通过 过滤器过滤。然后将澄清的上清液分装冷冻，并通过用一系列稀释的病毒上清液感染Jurkat细胞，然后在48小时时通过流式细胞术检测GFP+细胞来测定滴度。对于HIV-dreGFP病毒(NL4-3-D6-dreGFP/Thy1.2)，病毒骨架质粒与两个包装质粒-PAX2(编码HIV GagPol)和MD2-VSVG(编码VSV-G糖蛋白)共转染。NL4-3-D6-dreGFP/Thy1.2是从R Siliciano博士提供的亲本质粒修饰而来。具有复制能力的NL4-3菌株克隆购自Aidsreagent.org。

流式细胞术和细胞分选

使用Fortessa流式细胞仪(贝克顿·迪金森公司)分析感染细胞的样本。在分析之前，使用活/死染料-Zombie Violet(Biolegend)对活细胞进行染色以区分活细胞。使用前向散射和侧向散射排除双联体细胞。为了基于GFP表达富集细胞进行流式分选，在二级生物安全防护增强(BSL2+)设施中使用FACSAria仪器(贝克顿·迪金森公司)。

HIV潜伏的原代细胞模型

人全血取自StemCell公司(温哥华)，使用阴性选择CD4 T细胞富集试剂盒(StemCell)分离出总CD4 T细胞。将CD4 T细胞的等分试样冷冻并保存在90%胎牛血清(FBS)和10%二甲基亚砜(DMSO)中。然后将冷冻细胞的等分试样解冻，并用抗CD3/CD28磁珠激活48小时(赛默飞世尔科技公司)。然后将激活的CD4 T细胞与HIV-dreGFP病毒上清液以600g离心2小时，再接种于含有白细胞介素-2(IL-2，100U/mL)和白细胞介素-7(IL-7，5ng/mL)的RPMI培养基中。在感染后 通过流式细胞术测量感染情况。每2至3天更换一次细胞培养基，细胞维持在每 100万至200万的密度。在一些实验中，在感染后48小时使用FACSAria流式细胞分选仪(贝克顿·迪金森公司)对GFP+细胞进行分选，以富集活跃感染的细胞。

CRISPR-Cas9基因敲除

使用CRISPick [79]设计针对SETD2的CRISPR RNA靶向序列(crRNA)，而针对Tat的靶向和非靶向对照序列则来自先前的文献 。通过将crRNA靶向序列与tracrRNA(IDT公司)以1:1混合至最终浓度为 来制备CRISPR-Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)，并在PCR热循环仪中加热至 然后缓慢冷却至室温，在双链缓冲液(IDT公司)中退火。在转染前立即通过混合 的Cas9酶( 浓度， 总量，IDT公司的ALT-R)、 的聚谷氨酸(平均聚合物大小15kDa， 浓度，阿拉曼达实验室)和 的退火双链crRNA:tracrRNA(最终摩尔比约为2:1 RNA:Cas9酶时为100pMol)来生成RNP复合物。对于靶向SETD2，将三种crRNA进行多重化以更有效地敲除靶点。如上述方法分离、激活和感染原代CD4 T细胞。激活后六天(感染后4天)，将每种条件下的 个细胞以 离心10分钟，用PBS洗涤，然后以每 个细胞每 个反应体积重悬于原代细胞转染缓冲液P3(龙沙公司)中。然后将细胞悬液加入RNP复合物中，并使用CM137方案(龙沙4D转染仪)进行转染。转染后的细胞立即重悬于预热的RPMI培养基中，并在 孵育 ，然后以每 个细胞每 重悬于含有IL-2和IL-7的完全RPMI培养基中。

使用的特定crRNA序列如下:

SETD2

AltR1/rGrG rArGrU rCrGrA rGrUrC rUrArC rCrUrG rArArG rGrUrU rUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrC rU/AltR2/

/AltR1/rGrC rUrCrA rArGrG rUrGrA rArArU rArGrC rArUrG rGrUrU rUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrC rU/AltR2/

/AltR1/rArU rGrArA rCrUrG rGrGrA rUrUrC rCrGrA rCrGrA rGrUrU rUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrC rU/AltR2/

非靶向(NT)/AlTR1/rArCrGrGrArGrGrCrUrArArGrCrGrUrCrGrCrArArGrUr-UrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AlTR2/

反式激活转录蛋白

/AlTR1/rCrCrUrUrArGrGrCrArUrCrUrCrCrUrArUrGrGrCrGrUrUrUrUrArGrArGr-CrUrArUrGrCrU/AlTR2/

细胞分级分离与蛋白质免疫印迹法

为制备蛋白质裂解物，通过离心( )收集细胞沉淀，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，再用补充了蛋白酶抑制剂(罗氏公司)的RIPA缓冲液(赛默飞世尔科技公司)裂解。细胞蛋白质裂解物通过考马斯亮蓝法(赛默飞世尔科技公司)进行定量，然后通过Tris - 甘氨酸SDS - PAGE分离，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)或硝酸纤维素膜上。印迹膜用含5%脱脂奶粉的Tris缓冲盐水(TBS)封闭，然后与在含5%牛血清白蛋白(BSA)或5%脱脂奶粉的TBS中稀释的一抗孵育过夜，并用含0.1%吐温20的TBS(TBST)洗涤。然后将膜与与辣根过氧化物酶偶联的二抗(1:10,000)在室温下孵育 ，并用TBST洗涤三次，随后通过增强化学发光法(赛默飞世尔科技公司)进行检测。

RNA测序

使用RNEasy试剂盒(Qiagen)从200 - 300万个感染HIV - dreGFP的Jurkat细胞的三份重复培养物中收获总RNA，这些细胞分别暴露于EPZ - 719(500 nM)或对照(二甲基亚砜)。然后分别通过微量分光光度计和安捷伦生物分析仪(Agilent)分析RNA的数量和质量。RNA完整性数值(RIN)分数在9.9至10.0之间。然后使用KAPA总RNA文库制备试剂盒制备RNA测序文库，随后在Next - seq2000 P2流动槽上进行50 bp双端测序。每个样品获得7000 - 9000万条读数。为分析数据，首先通过FastQC和CutAdapt过滤原始读数以去除低质量读数。然后使用RNAStar将读数与Hg38(补丁17)比对，随后使用featurecounts对转录本进行定量。然后通过DESeq2 [82]鉴定差异表达基因。

染色质靶向切割与释放测序

染色质靶向切割与释放测序(CUT&RUN)按照先前描述的方法[19]进行，使用Epicypher公司的商业试剂盒。对感染的Jurkat细胞进行三份重复分析，先洗涤并与伴刀豆球蛋白A包被的珠子偶联，然后在含有针对 的靶向抗体或对照 的含洋地黄皂苷(0.01%)的缓冲液中孵育过夜。然后用通透缓冲液洗涤细胞，并在室温下与pAG - MNase孵育15分钟。经过额外洗涤后，加入 以启动在 对与抗体结合的染色质进行 的切割。然后洗脱释放的DNA，与 大肠杆菌DNA掺入物合并，并使用Epicypher文库制备试剂盒(Epicypher)构建条形码文库。使用Illumina Novaseq测序仪对文库进行测序。为分析数据，首先使用CutAdapt修剪fastq文件以去除接头序列，然后使用Bowtie2 [83]将其与组合的人类(Hg38)、大肠杆菌和HIV参考基因组比对。使用MACS2 [84]鉴定H3K36me3富集区域的峰。为了可视化，将bigwig文件进行缩放以标准化到大肠杆菌掺入DNA。

定量聚合酶链反应

如前所述[40]，对HIV Gag未剪接RNA和β-肌动蛋白RNA进行了定量分析。简要来说，细胞先用PBS洗涤，然后在含有1%β-巯基乙醇的RLTplus缓冲液(Qiagen公司)中裂解。接着使用RNEasy plus试剂盒(Qiagen公司)分离RNA，并洗脱到无核酸酶水中。通过微量分光光度计对RNA样品进行定量，然后取 的RNA，使用Fastvirus(赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)和针对HIV Gag RNA的引物组(GAG-F:ATCAAGCAGCCATGCAAATGTT，GAG-R:CTGAAGGGTACTAGTAGTTCCTGCTATGTC，GAG-Probe:FAM/ZEN-ACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGGGA-IBFQ)以及β-肌动蛋白(BAC-F:TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA，BAC-R:CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG，BAC-Probe:HEX-ATGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCGT-IBFQ)进行逆转录和扩增。反应板在QS3(应用生物系统公司，加利福尼亚州福斯特城)实时热循环仪上运行，在 进行5分钟的逆转录步骤，随后进行40个循环的 (3秒)、 (30秒)。

细胞核转录分析

为了标记和分离新合成的RNA转录本，我们采用了一种最近描述的用于新生RNA捕获的方法[85]，使用Click-iT新生RNA捕获试剂盒(赛默飞世尔科技公司)。将感染的细胞与细胞可渗透的尿苷类似物5-乙炔基尿苷(EU)在 孵育一小时，然后使用RNEasy试剂盒(Qiagen公司)进行裂解和RNA提取。然后在体外将生物素与标记的RNA偶联，接着使用糖原、乙酸铵和乙醇将RNA沉淀过夜。然后使用链霉亲和素T1磁珠(赛默飞世尔科技公司)从总样品中分离生物素化的RNA。然后立即使用Superscript VILO逆转录试剂盒在磁珠上进行逆转录。洗脱cDNA，并如上所述使用qPCR对靶标进行定量。

HIV剪接定量分析

HIV-1转录本的定量分析方法与[49]中所述类似，但进行了调整以使用随机14碱基cDNA引物并结合Illumina/MiSeq平台序列。简要来说，随机反向引物用作独特的分子标识符，并且还能引发所有病毒RNA以及所有细胞RNA的逆转录。使用位于主要HIV-1剪接供体D1上游的引物对HIV-1特异性RNA进行聚合酶链反应(PCR)扩增，该引物还添加了Illumina平台序列，以及与随机反向引物5’端共同序列互补的下游引物。所得文库使用Illumina双端300碱基读取进行测序。使用内部脚本(可从北卡罗来纳大学教堂山分校的Swanstrom实验室获得)分析测序数据，该脚本结合正向和反向读取的信息来识别和定量在D1处保持未剪接或剪接到特定受体的转录本。对于足够长度的读取，也可以定量在D4处剪接或未剪接(完全或不完全剪接)的转录本。

整合位点分析

使用DNeasy Blood and Tissue试剂盒(Qiagen)按照制造商的方案分离基因组DNA。使用从[50]中最初描述的方法改编的线性扩增介导的PCR方案确定整合位点。对重复的PCR反应gDNA使用生物素化引物am948(序列如下)进行线性扩增。将得到的线性扩增产物合并，并使用NucleoSpin Gel和PCR纯化试剂盒(Takara)按照用于单链DNA的修改方案(1:2 NTI缓冲液稀释)进行纯化。所有回收的材料按照制造商的方案使用Dynabeads kilobaseBINDER试剂盒(ThermoFisher)进行链霉亲和素免疫沉淀，使用 珠子回收生物素化的线性扩增产物，洗涤，然后按照[50]中所述在珠子上使用Klenow(New England Biolabs，NEB)进行第二链合成。在所有酶促反应后，将结合DNA的珠子在吐温洗涤缓冲液(5mM Tris pH8， EDTA，0.05%吐温-20)中洗涤两次，并在 Tris pH8中洗涤一次。用三种平端切割酶(SspI-HF、StuI和HincII)(NEB)的混合物消化珠子上的双链DNA以产生平端DNA。基于[50]中的序列通过退火两个寡核苷酸产生平端双链衔接子，一个是具有5’未配对区域的有义链，另一个是具有3’封闭末端的反义链。使用NEB Quick Ligation试剂盒将衔接子连接到消化后的DNA上。使用引物am954/956对材料进行珠子上PCR，使用Platinum SuperFi II Mastermix(ThermoFisher/Life Technologies)进行15个循环。然后将第一轮PCR的 使用am950/955进行巢式PCR 30个循环，使用SuperFi II。按照制造商的方案使用Takara Nucleospin试剂盒清理PCR产物，并使用D5000 Screentape(Agilent)评估浓度和大小范围。每个样品200fmol进行条形码标记，并按照制造商的说明使用具有V14化学的Native Barcoding Ligation试剂盒(SQK-NBD-114-24)进行文库制备。将20fmol合并的、带条形码的文库加载到MIN114流动槽上，并在Nanopore Mk1C上运行。使用Dorado(Oxford Nanopore)的超高精度模型对得到的FAST5或POD5文件进行碱基识别和解复用。使用Cutadapt修剪方案中连接的定制衔接子序列，并使用带有定制衔接子列表的FastQC在修剪前后确认成功修剪。最初使用minimap2将得到的读数与参考HIV基因组比对，并丢弃未比对的读数。然后使用minimap2将读数重新比对到HIV-hg38杂交基因组，将-Y选项设置为比对嵌合读数。使用SAMtools [86]根据比对质量(-min-MQ 20)、错配率(-e (NM]/length(seq) ’)和SA标签过滤读数。还去除具有多个SA比对的读数以及未比对到参考的前1-10个碱基的病毒读数。使用BEDTools merge [87]合并重叠读数。使用带有-d 10和-c选项的SAMtools bedcov将合并特征的读数深度合并到BED文件中。使用与UCSC Genome Table Browser中hg38的knowntoRefSeq轨道交叉引用的hg.knowncanonical轨道生成参考BED文件，并过滤重复注释。使用BEDTools intersect注释杂交比对的BED文件，并过滤以产生具有至少10个纳米孔读数深度的基因组区域列表。为了注释染色质状态，我们将最终注释的BED文件与Roadmaps Epigenomics Project为样本E043生成的核心15状态ChromHMM模型进行比较，样本E043定义为CD4阳性、CD25阴性辅助性T细胞(https://egg2.wustl.edu/roadmap/ web_portal/meta.html)。下载核心15状态模型的E043 lift-over hg38文件，并使用BEDtools intersect注释整合位点位置。

RNA甲基化分析

为了测量细胞中m6A RNA的总丰度，按照制造商的方案，使用m6A RNA甲基化定量试剂盒(Epigentek)对300ng总RNA进行分析。该试剂盒采用比色酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测m6A。使用SpectraMax M3酶标仪(Molecular Devices)在 处读取ELISA板。样品一式三份进行检测，并与m6A标准曲线进行比较。丰度以总RNA质量的百分比计算。为了测量HIV RNA的m6A修饰，使用EpiQuik CUT&RUN m6A RNA富集(MeRIP)试剂盒(Epigentek)，每个条件下输入 的总RNA，并使用 特异性抗体或对照IgG。然后使用定量PCR分析法对Env/Rev编码序列内HIV RNA的富含m6A区域的洗脱RNA进行分析。使用Applied Biosystems QS3进行qPCR。所用引物组为:正向:GCC CGA AGG AAT AGA AGA AGA AGA A，反向:GAT CGT CCC AGA TAA GTG CTA AG，探针:56-FAM/TG GAG AGA G/ZEN/ A GAC AGA GAC AGA TCC A/3IABkFQ。

支持信息

S1图。EPZ-719降低人T细胞系中的H3K36me3水平。(A)。将2D10细胞暴露于一系列浓度的EPZ-719中 。然后提取全细胞蛋白裂解物，通过蛋白质免疫印迹法检测H3K36me3、SETD2和总组蛋白3(H3)以及 -微管蛋白。(B)。将2D10细胞暴露于 EPZ-719中，并在所示时间提取总细胞蛋白。然后对提取物进行蛋白质免疫印迹法检测H3K36me3、H3K36me2和总组蛋白3(H3)。

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S2图。EPZ-719不抑制Jurkat细胞生长。将Jurkat细胞以每毫升250,000个细胞的密度接种于RPMI中，并在存在 EPZ-719或DMSO的条件下孵育4天。在所示时间测量细胞密度。每个数据点代表三个重复孔的平均值。误差条表示平均值的标准偏差。(TIFF)

S3图。EPZ-719对原代T细胞活化标志物无影响。使用抗CD3/CD28磁珠激活原代CD4 T细胞 ，然后在存在EPZ-719(500nM)或DMSO的条件下培养八天。然后对细胞进行T细胞活化标志物CD38和HLA-DR染色。(A)。柱状图显示三个生物学重复中双阳性细胞(CD38 HLA-DR+)的平均百分比。误差条表示平均值的标准偏差。显示了 无显著性差异 的情况。

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S4图。HIV映射RNAseq读数分布。使用Integrative Genomics Viewer(IGV)可视化来自500nM EPZ-719或DMSO处理的HIV-dreGFP感染的Jurkat细胞的RNAseq数据中的HIV映射读数(来自图7数据集)。(TIFF)

S5图。EPZ - 719不影响Jurkat细胞中新生病毒RNA水平或HIV感染的原代CD4 T细胞中的病毒RNA水平。(A, B)用HIV - dreGFP感染的Jurkat细胞暴露于EPZ - 719(500 nM)或对照载体(DMSO) 8天，然后用5 - 乙炔基尿苷(EU)脉冲标记1小时。然后提取RNA并在体外将EU标记的RNA生物素化，接着使用链霉亲和素包被的珠子富集生物素化的RNA。然后通过实时PCR定量初始RNA样品(A)和富集的新生RNA池中Gag病毒RNA的存在情况。数据表示三个生物学重复的平均值。(C)用抗CD3/CD28珠子激活原代CD4 T细胞三天，然后用HIV - dreGFP感染。从感染后48小时起，将感染的细胞在EPZ - 719(500 nM)或对照载体(DMSO)存在下培养7天。提取RNA并通过实时PCR定量Gag RNA。柱形图表示四个生物学重复的平均值。误差条表示平均值的标准偏差。NS = 不显著(学生t检验)。(TIFF)

S6图。EPZ - 719不影响RNA的整体或HIV特异性m6A修饰。(A).实验设计示意图。EPZ - 719在 浓度下使用。(B).通过流式细胞术测量药物暴露13天后培养物中潜伏感染(GFP -)Jurkat细胞的丰度。(C).通过基于平板的酶联免疫吸附测定(ELISA)测量来自DMSO或EPZ - 719处理细胞的总RNA中m6A RNA的丰度。(D).检测HIV RNA的m6A修饰。用m6A特异性抗体或对照IgG免疫沉淀细胞RNA，然后对Env/Rev区域内的HIV区域进行定量RT - PCR。每个柱形图表示生物学重复三次的平均值。误差条表示平均值的标准偏差。 不显著， 检验。(TIFF)

S7图。EPZ - 719影响感染的原代CD4 T细胞中的HIV剪接。用抗CD3/CD28珠子激活原代CD4 T细胞，然后用HIV - drEGFP感染2天。然后将细胞在EPZ - 719(500 nM)或DMSO中再培养8天，然后收获RNA。然后使用图7中描述的相同方法定量HIV转录本剪接变体。(A).显示每种条件下剪接的HIV转录本的总体百分比。(B).显示每种条件下完全剪接的剪接病毒转录本的比例。(C).显示每种条件下使用不同初始病毒剪接受体位点(A1 - A5)的剪接病毒RNA的比例。(D).显示每种条件下使用不同最终剪接受体位点的剪接病毒RNA的比例。每个柱形图表示四个生物学重复的平均值。误差条表示平均值的标准偏差。突出显示显著差异(t检验)。NS = 不显著(P>0.05)。(TIFF)

S8图。EPZ - 719影响细胞转录本的剪接。使用DEXseq [88]分析来自500 nM EPZ - 719或对照(DMSO)处理的HIV感染细胞在 时的RNAseq数据中的差异剪接。外显子使用有显著差异的基因用红色突出显示(p值 )。(TIFF)

S9图。整合位点基因集中差异表达基因的分析。(A)

显示注释的人类基因总数中差异表达基因(DEGs - Lo 倍变化 ，p值 )的比例，以及对照(DMSO)或EPZ - 719处理细胞中具有HIV整合位点的基因集。(B)显示对照(DMSO)和EPZ - 719处理条件下也是DEGs的所有整合位点基因的倍变化。每种条件的平均值显示为水平条。(TIFF)

S1表。EPZ - 719暴露后差异表达基因。(XLSX) S2表。上调差异表达基因的富集分析。(XLSX)

S3表。下调差异表达基因的富集分析。(XLSX)

S4表。上调基因的基因本体(GO)分析 - 生物学过程。(XLSX)

S5表。上调基因的基因本体(GO)分析 - 分子功能。(XLSX)

S6表。下调基因的基因本体(GO)分析 - 生物学过程。(XLSX)

S7表。下调基因的基因本体(GO)分析 - 分子功能。(XLSX)

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S8表。DEXseq分析。

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致谢

我们感谢北卡罗来纳大学流式细胞术核心设施。北卡罗来纳大学流式细胞术核心设施(RRID:SCR_019170)部分得到了美国国立癌症研究所授予北卡罗来纳大学林伯格综合癌症中心的P30 CA016086癌症中心核心支持资助(https://www.cancer.gov)。

作者贡献

概念构思:布莱恩·D·斯特拉尔、爱德华·P·布朗。

形式分析:杰克逊·J·彼得森、伊斯梅尔·戈麦斯 - 马丁内斯、科尔宾·琼斯、奥斯汀·赫珀拉、爱德华·P·布朗。

调查:卡梅隆·R·布斯西 - 萨顿、艾尔利·沃德、约书亚·A·福克斯、安妮 - 玛丽·W·特纳、安·埃默里、阿图罗·R·朗oria、大卫·M·马戈利斯、爱德华·P·布朗。

撰写 - 初稿:卡梅隆·R·布斯西 - 萨顿、艾尔利·沃德、约书亚·A·福克斯、安妮玛丽·W·特纳、杰克逊·J·彼得森、安·埃默里、阿图罗·R·朗oria、伊斯梅尔·戈麦斯 - 马丁内斯、科尔宾·琼斯、奥斯汀·赫珀拉、大卫·M·马戈利斯、布莱恩·D·斯特拉尔、爱德华·P·布朗。

撰写 - 审阅与编辑:卡梅隆·R·布斯西 - 萨顿、艾尔利·沃德、约书亚·A·福克斯、安妮玛丽·W·特纳、杰克逊·J·彼得森、安·埃默里、阿图罗·R·朗oria、伊斯梅尔·戈麦斯 - 马丁内斯、科尔宾·琼斯、奥斯汀·赫珀拉、大卫·M·马戈利斯、布莱恩·D·斯特拉尔、爱德华·P·布朗。References

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