搜索历史清除全部记录

最多显示8条历史搜索记录噢~

全部

全部
产品管理
新闻资讯
介绍内容
企业网点
常见问题
企业视频
企业图册

昵称 | 退出

首页

发育性缺铁对大鼠海马体和小脑的TET活性及DNA羟甲基化的调节作用失调

发布时间：

2025-07-09 17:56

最终编辑版发表于:《发育神经科学》。2022年；44(2): 80 - 90。doi:10.1159/000521704。

发育性缺铁对大鼠海马体和小脑的TET活性及DNA羟甲基化的调节作用失调

阿曼达·巴克斯，蒙大拿·M·比森，蒂莫西·C·霍尔斯特伦，迈克尔·K·乔治耶夫，傅V·陈

美国明尼苏达大学儿科学系，明尼阿波利斯，MN

美国明尼苏达大学神经科学研究生项目，明尼阿波利斯，MN

摘要

神经发育过程中的缺铁(ID)与持续的认知和社会情感缺陷相关，并且在整个生命周期中患神经精神疾病的风险增加。这些神经表型变化的基础是大脑中的基因失调，这种失调在缺铁期之后仍然存在；然而，缺铁建立和维持基因表达变化的机制尚未完全了解。表观遗传修饰5 - 羟甲基胞嘧啶(5hmC)，即DNA羟甲基化，是一种候选机制，因为它依赖于含铁的TET酶。本研究的目的是确定胎儿 - 新生儿缺铁对发育中的大鼠海马体和小脑区域脑TET活性、Tet表达和5hmC的影响，并确定饮食中铁治疗是否能使这些变化逆转。对定时怀孕的斯普拉格 - 道利大鼠从妊娠第(G)2天开始喂食缺铁饮食(ID；4mg/kg铁)，以产生缺铁性贫血(IDA)后代。对照母鼠喂食铁充足饮食(IS；200mg/kg铁)。在出生后第(P)7天，将一部分喂食ID的幼崽随机分配到IS饮食组，产生经治疗的IDA(TIDA)后代。在P15时，分离出海马体和小脑用于后续分析。通过ELISA从核蛋白中定量TET活性。通过qPCR从总RNA中定量Tet1、Tet2和Tet3的表达。通过ELISA从基因组DNA中定量总体5hmC百分比。缺铁增加了DNA羟甲基化(p = 0.0105)，同时P15海马体中的TET活性和Tet3表达相应增加。相比之下，缺铁降低了P15小脑中的TET活性，对DNA羟甲基化的影响最小。新生儿饮食中铁治疗导致两个脑区的这些变化部分恢复正常。这些结果表明，TET/DNA羟甲基化系统在发育过程中因缺铁而以脑区特异性方式受到破坏。这种表观遗传系统的差异性区域破坏可能导致与发育性缺铁相关的持久神经回路功能障碍和神经行为功能障碍。

^[1]

关键词

缺铁；神经发育；海马体；小脑；表观遗传学

引言

胎儿期和出生后早期的缺铁(ID)对神经发育具有重大且可能长期持续的影响，包括认知、社会情感以及学习和记忆方面的缺陷，这些缺陷会持续到青春期和成年早期[1 - 3]。从流行病学角度来看，发育性缺铁还与长期心理健康风险相关，包括患神经精神疾病(如自闭症谱系障碍、注意力缺陷多动障碍和精神分裂症)的风险增加[4 - 6]。鉴于据估计缺铁影响着全球的孕妇和学龄前儿童[7,8]，这种极为常见的营养缺乏所产生的持久影响成为了一个重大的公共卫生问题。在临床前模型中，与胎儿 - 新生儿缺铁相关的神经表型变化伴随着整个中枢神经系统(CNS)[9]以及特定脑区[10,11]基因表达的显著失调。基因表达的变化不仅在缺铁期间急性出现，而且即使在缺铁得到治疗后仍会持续到成年期，从而将神经元功能障碍的可能性延续至成年期[12,13]。虽然急性和慢性基因表达变化的存在已得到证实，但缺铁建立并维持这些基因表达变化的机制仍未完全明了。

表观遗传修饰是诸如缺铁等环境影响因素能够对基因表达产生永久性改变的一种机制[14,15]。我们团队以及其他研究团队之前已经证明，两种主要的表观遗传修饰，即组蛋白甲基化和DNA甲基化，在胎儿 - 新生儿缺铁的情况下，发育中的海马体中都会发生改变。然而，鉴于表观基因组的复杂性，要全面理解缺铁如何重新编程基因表达，需要更全面地评估缺铁如何影响表观遗传密码的所有组成部分。

发育性缺铁中一种未被探索的表观遗传机制是修饰后的胞嘧啶碱基5 - 羟甲基胞嘧啶(5hmC)，即DNA羟甲基化。5hmC由TET甲基胞嘧啶双加氧酶生成，该酶将5 - 甲基胞嘧啶(5mC)酶促转化为 [18]。TET蛋白属于铁和α - 酮戊二酸(αKG)依赖性加氧酶类别，因此，它们的酶活性绝对需要铁。虽然TET蛋白对铁的依赖性已明确确立，但临床上相关程度的缺铁对中枢神经系统中TET蛋白活性以及随后的DNA羟甲基化的影响从未被评估过。

在中枢神经系统中的富集程度高于任何其他体细胞组织[20 - 22]。在神经发育过程中，中枢神经系统中建立了的富集，从神经祖细胞和未成熟神经元中的低水平发展到成熟神经元特有的高度富集状态[23 - 25]。这种富集尤其发生在对突触功能和神经发育至关重要的高转录基因的基因内区域。与此同时，产生的哺乳动物TET蛋白家族(TET1 - 3)在中枢神经系统中高水平表达，表达水平在神经发育期间达到峰值[25]。在功能上，在发育中的神经元中敲低Tet表达不仅会损害的发育积累，还会损害树突分支以及关键神经发育基因的表达[25]。综上所述，这些证据表明TET酶在中枢神经系统中高度活跃，特别是在神经发育期间，此时它们积极建立神经元一种稳定的表观遗传修饰，在中枢神经系统特异性基因表达的建立和调节中起关键作用。

这种表观遗传系统对铁的依赖性，以及其在神经发育过程中明显的重要性，可能使其容易受到缺铁的干扰，从而对神经发育产生重大影响。本研究的目的是确定胎儿 - 新生儿缺铁性贫血(IDA)对发育中大鼠中枢神经系统两个不同区域；海马体和小脑中TET酶活性及其酶促产物DNA羟甲基化建立的影响。此外，本研究旨在确定这种表观遗传系统的变化在早期缺铁治疗后是否可逆。

材料与方法

动物

定时怀孕的妊娠第2天斯普拉格-道利大鼠(SD-400，查尔斯河公司)在到达时被喂食缺铁(ID；铁，TD 80396，Envigo公司)或铁充足的对照饮食(IS；200毫克/千克铁，TD 09256，Envigo公司)。在出生后第7天(P7)，这是啮齿动物神经发育中的一个时间点，大约相当于人类足月出生时的神经发育阶段[27]，将一部分喂食ID饮食的窝仔随机改为IS饮食，形成一个经处理的缺铁性贫血(TIDA)实验组。其余喂食ID饮食的窝仔子集继续食用ID饮食直到P15。这个组被指定为IDA。每个实验组产生6 - 10窝仔，并且每个终点使用来自至少3窝的动物进行分析，以最小化潜在的窝特异性效应。

所有动物饲养在12小时光照 - 黑暗循环中，可自由获取食物和水，并根据明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)的动物使用政策和指南进行饲养。所有方案均经明尼苏达大学IACUC批准，并符合《实验动物饲养和使用指南》[28]。

组织采集

在P15时通过快速断头法对大鼠实施安乐死。在冰冷的金属块上显微解剖海马体和小脑，并在液氮中速冻。所有组织在下储存直至使用。

核蛋白分离

使用EpiQuik核提取试剂盒II(Epigentek公司)从每只大鼠的一半小脑或一个海马叶中分离无核酸的核蛋白。通过标准的考马斯亮蓝蛋白测定法对核蛋白浓度进行定量。

核酸分离

使用标准的苯酚 - 氯仿 - 异戊醇方案并经RNA酶A处理，从每只大鼠大约四分之一速冻的小脑或一半速冻的海马叶中分离总基因组DNA。使用RNAqueous RNA分离试剂盒(Ambion公司)从每只大鼠大约四分之一的小脑或一半海马叶中分离RNA。

cDNA合成和qRT - PCR

使用高容量RNA到cDNA试剂盒(应用生物系统公司)从每个样本的 RNA生成cDNA。对每个组织、每个实验组的雌雄大鼠进行5 - 8次生物学重复的qRT - PCR。样本量根据我们之前的报告选择。使用Luna通用探针qPCR主混合试剂(新英格兰生物实验室)和TaqMan基因表达分析试剂盒(Tfrc:Rn01474701_m1；Tet1:Rn01428192_m1；Tet2:Rn01522037_m1；Tet3:Rn01184937_g1；赛默飞世尔科技公司)在QuantStudio 3实时PCR系统(赛默飞世尔科技公司)上进行单重qPCR。所有样本均进行重复检测。使用TATA结合蛋白(Tbp:Rn01455646_m1)作为内参。使用标准的计算方法计算倍数变化。

TET活性

使用Epigenase 5mC - 羟化酶TET活性/抑制分析试剂盒(Epigentek公司)从核蛋白提取物中评估TET酶活性。将TET活性标准化为样本输入蛋白量，并在每个实验组的9 - 10个海马生物学重复和小脑生物学重复中进行定量。所有样本均进行重复检测，结果由重复检测的平均值计算得出。通过ROUT方法确定异常值。

5hmC定量

使用Quest 5-羟甲基胞嘧啶DNA ELISA试剂盒(Zymo Research公司)将DNA羟甲基化定量为。每个样本使用100 ng基因组DNA作为输入材料。在每个实验组的7 - 8个海马生物学重复样本(3 - 4个/性别)和18 - 20个小脑生物学重复样本( )中对进行定量。

统计分析

对于所有实验，结果首先通过双向方差分析(two-way ANOVA)和Tukey事后检验进行分析，其中两个因素是性别和实验组。显著性水平设定为p < 0.05。对于任何终点，双向方差分析均未发现性别具有显著性。随后将雄性和雌性合并，并通过单向方差分析(one-way ANOVA)和Tukey事后检验进行分析，且设定为。相关性和简单线性回归分析在p < 0.05的设定下进行。对于所有线性回归分析，铁状态(全身或组织水平)作为自变量，所有其他结果变量(TET活性、Tet表达、 )作为因变量。所有统计分析均使用Prism 8(GraphPad软件)进行。

结果

P15时全身和组织水平铁状态的评估

在P15时从外周血中定量测定血细胞比容以评估全身铁状态(如图1a所示)。相对于铁充足(IS)对照组，缺铁性贫血(IDA)幼崽的血细胞比容降低( 与相比)，表明它们患有贫血，这是严重或长期缺铁的常见终末期表现。从P7开始用铁充足饮食治疗TIDA组，相对于未治疗的IDA对应组，血细胞比容部分恢复( 与相比)。然而，相对于IS对照组，TIDA幼崽的血细胞比容仍然较低( )，表明它们在P15时全身铁状态仍在恢复中。如先前研究[29]所预期的，后代血细胞比容在P15时显著影响体重(如补充图1所示)，体重因实验组( )和血细胞比容( )而异。

为了评估脑组织水平的铁状态，从海马体和小脑中定量测定转铁蛋白受体-1(Transferrin Receptor-1，Tfrc)的mRNA表达。Tfr表达先前已被确定为组织铁状态的可靠反映指标[30,31]。相对于IS对照组，IDA幼崽在海马体(如图1b所示)和小脑中(如图1c所示)的Tfrc表达均增加( )，表明存在持续的脑铁缺乏。相对于IS对照组，TIDA幼崽海马体( )和小脑( )的Tfrc表达仍然增加，但相对于未治疗的IDA对应组有显著恢复(两者均为 )。

通过相关性分析对血细胞比容和海马体Tfrc表达进行分析，以确认全身铁状态与海马体组织铁状态之间的关系(如图1d所示)。如预期的那样，血细胞比容与表达( )之间存在负相关关系。

这些结果表明，相对于IS对照组，IDA幼崽在全身和组织水平均存在铁缺乏。到P15时，TIDA幼崽在全身和组织水平的铁状态均部分恢复，使其处于中间铁状态，表明它们对铁治疗有反应。最后，通过血细胞比容定量的全身铁状态与组织铁状态显著相关且反映了组织铁状态。

缺铁性贫血(IDA)小鼠在出生后第15天海马体中的TET活性及表达增加

在出生后第15天的海马体中评估发育性缺铁对TET酶活性的影响(如图2a所示)。相对于铁充足(IS)对照组，缺铁性贫血(IDA)小鼠的海马体TET活性增加。尽管进行了饮食补铁治疗，但缺铁性贫血(TIDA)小鼠的海马体TET活性相对于铁充足(IS)对照组仍持续增加。为了确定TET活性与铁状态是否存在连续的剂量依赖关系，针对血细胞比容进行了TET活性的回归分析。TET活性与铁状态呈负相关，即随着血细胞比容降低，TET活性增加(如图2b所示)。

对TET1 - 3 mRNA的表达进行定量，以确定TET活性的增加是反映酶功能化增加还是Tet表达增加(如图3a所示)。与铁充足(IS)对照组相比，缺铁性贫血(IDA)和缺铁性贫血治疗后(TIDA)小鼠海马体中的Tet1和Tet2表达没有变化。相比之下，缺铁性贫血(IDA) 和缺铁性贫血治疗后(TIDA) 小鼠海马体中的Tet3表达上调。回归分析表明，Tet2和Tet3的表达均与海马体转铁蛋白受体(Tfrc)表达呈剂量依赖性相关(如图3b所示；Tet2: ；Tet3: ，。

这些结果表明，发育性缺铁导致TET活性增加，并且在本研究的发育时间范围内，饮食补铁不足以使TET活性恢复正常。Tet表达分析表明，Tet3表达增加可能是导致TET活性增加的原因，而不是酶功能化增加。

缺铁性贫血(IDA)导致出生后第15天小脑的TET活性降低

在出生后第15天的小脑中也评估了发育性缺铁对TET酶活性的影响(如图4a所示)。与海马体相反，相对于铁充足(IS)对照组，缺铁性贫血(IDA)小鼠小脑的TET活性降低。从出生后第7天开始进行饮食补铁，导致相对于未治疗的缺铁性贫血(IDA)小鼠，TET活性恢复正常，与铁充足(IS)对照组水平无差异。进行回归分析以确定小脑组织铁状态(由Tfrc表达指示)与TET活性之间是否存在连续的剂量依赖关系。Tfrc表达与TET活性呈负相关(如图4b所示；，。

对TET1 - 3 mRNA的表达进行定量，以确定TET活性降低是反映表达减少还是酶功能化减少。与铁充足(IS)对照组相比，在缺铁性贫血(IDA)或缺铁性贫血治疗后(TIDA)小鼠小脑中未发现Tet1、Tet2或Tet3表达有显著变化(如图4c所示)。

总之，这些数据表明，发育性缺铁导致出生后第15天小脑的TET活性降低。在全身和组织水平铁状态恢复正常之前，饮食补铁在这个发育时间范围内恢复了TET活性。Tet表达未改变表明，TET活性降低反映了TET酶功能化真正的铁依赖性降低。

发育性缺铁以组织特异性方向改变DNA羟甲基化

为了确定P15海马体和小脑中TET活性改变的功能影响，从基因组DNA中定量测定了5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)占总核苷酸的百分比。与铁充足(IS)对照组相比，缺铁性贫血(IDA)组海马体中的升高(如图5a所示； )，同时TET活性增加。相比之下，虽然TIDA海马体中的TET活性仍然升高，但随着饮食中铁的补充，恢复到IS对照组水平。回归分析表明，海马体中的与全身铁状态相关， )，其中的增加与血细胞比容的降低相关(如图5b所示)。

在P15小脑中，与铁充足(IS)对照组相比，TIDA组的整体降低，而IDA组则没有降低(如图6a所示)。回归分析表明，全身铁状态与之间存在适度关系，血细胞比容降低与降低相关(如图6b所示)。

这些结果表明，IDA诱导的TET活性变化导致酶产物建立过程中的功能变化。未经治疗的IDA对的特定影响具有组织特异性，的变化方向在很大程度上与TET活性改变的组织特异性方向平行。铁补充对的影响也具有组织特异性。虽然饮食中铁补充后海马体中的可迅速恢复，但在这个发育时间范围内，小脑中的并未恢复。

讨论

本研究提供了证据，表明发育性缺铁显著改变了大鼠海马体和小脑中TET/ 表观遗传系统，且具有组织特异性。此外，在所研究的发育时间范围内，这些变化通过饮食中铁补充并不能完全逆转。总之，这些结果为越来越多的证据提供了补充，即胎儿-新生儿缺铁会改变发育中中枢神经系统的表观基因组。

在发育的关键时期对表观基因组进行编程，提供了一种机制，通过这种机制，诸如缺铁等环境暴露可以对健康和疾病产生长期影响，包括神经认知和神经精神健康与疾病。本研究提供了证据，表明在发育性缺铁的海马体和小脑中，DNA羟甲基化通过干扰将甲基胞嘧啶羟基化以产生DNA羟甲基化的铁依赖性TET酶而发生显著改变。虽然已经确定TETs的酶活性绝对需要铁作为辅因子[18]，但从未评估过临床上相关的铁底物缺失对TETs的影响。先前对人类新生儿的研究表明，发育性缺铁的大脑中脑组织铁含量降低了40%[32]，这里使用的啮齿动物模型再现了这种缺铁程度[29]。本研究结果具有创新性，因为它们表明这种生理性缺铁水平(铁的缺失并非绝对)足以改变TET酶功能以及随后的DNA羟甲基化。

值得注意的是，铁缺乏(ID)对TET/5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)表观遗传系统的影响在脑区具有特异性。这种对铁缺乏反应的区域差异表明，由于神经发育的不均匀性，发育暴露的影响在不同脑区可能是不一致的。在啮齿动物海马体中，大部分神经元在出生前的和之间进入有丝分裂后期。相比之下，小脑神经发生从胚胎期12天(G12)持续到出生后15天(P15)，这主要是由于小脑颗粒细胞的神经发生期延长。因此，在出生后15天，海马体和小脑处于神经发育的显著不同阶段，所以对暴露的反应也会有所不同。通过研究在其他发育时间点铁缺乏对不同脑区的影响，未来的研究或许能够阐明铁缺乏与神经发育时间之间的相互作用如何塑造铁缺乏对表观基因组的确切影响。

在研究营养对表观基因组的影响时，一个关键问题是观察到的表观基因组变化在营养扰动处理后是否可逆。本文提供的数据表明，TET活性相对具有可塑性，并且在铁缺乏处理后是可逆的。在铁缺乏性小脑发育不全(TIDA)的小脑中，出生后15天的TET活性与铁充足对照无差异，这表明在开始铁治疗后，TET能迅速恢复其铁辅因子和酶活性。在TIDA海马体中，出生后15天TET活性并未完全恢复。然而，同时期的Tet表达数据表明，这可能是由于Tet的持续上调。成年TIDA海马体的RNA测序表明，Tet上调不会长期持续[12]。因此，通过及时且持续的饮食铁补充，TET活性也有可能恢复。此外，出生后15天海马体中铁状态增加与TET活性增加之间的显著相关性表明，随着全身和组织铁状态的持续恢复，TET活性可能也会恢复。

根据目前的数据解释变化的可逆性更为复杂，因为的整体测量是相对不敏感的指标。在这里，在整体水平上对进行定量，以确定铁缺乏对TETs是否存在机制性影响。基于这些的整体测量，似乎铁补充后海马体中的迅速恢复，而小脑中的则没有。然而，正如在TIDA海马体中观察到的，整体没有变化，并不能排除在单个基因座水平上可能存在变化的可能性。我们之前已经表明，尽管DNA甲基化在整体上没有增加或减少，但在出生后15天的TIDA海马体中，映射到108个基因的229个个体CpG位点发生了差异DNA甲基化[17]。同样，在发育性铁缺乏的猪模型中，在缺铁的海马体中鉴定出了数百个差异甲基化位点，而DNA甲基化在整体上没有任何变化[11]。对于DNA羟甲基化情况可能也是如此，未来需要在碱基对分辨率下对进行研究，以确定哪些个体基因座存在差异羟甲基化，以及这些基因座特异性变化在发育性铁缺乏治疗后是否持续存在。

ID对表观基因组的失调是一个重大问题，因为表观基因组在基因表达调控中发挥着重要作用。在神经发育过程中，基因表达的精确时序调控对于各个脑区的正常结构和功能发育以及大脑中整合电路的形成至关重要，通过干扰表观基因组而导致的基因表达失调可能会对大脑结构和功能产生重大影响。DNA羟甲基化似乎在神经元基因表达的精确时序中起着特别重要的作用，因为它在整个神经元成熟过程中在关键的神经发育基因处富集。此外，建立过程的破坏会导致神经发育基因表达受损和树突分支异常[25]，这表明破坏这种表观遗传系统会产生功能性后果。已知发育性ID会在ID期间急性地以及在成年期慢性地导致广泛的中枢神经系统基因失调[10 - 13]，以及海马神经元的树突分支受损，这两者都与TET/5hmC表观遗传系统的破坏一致。未来关于位点特异性差异羟甲基化与基因表达之间关系的研究对于确定ID对TET/ 破坏的功能后果以及它们如何可能导致发育性ID的表型至关重要。

此处呈现的数据补充了一系列研究成果，这些研究表明发育性ID会显著改变发育中大脑的表观基因组。先前的研究已经证明，通过差异DNA甲基化[11,17]和组蛋白甲基化[16]，基因表达会发生显著的短期和长期重编程。本研究在此基础上又增加了第三种被发育性ID改变的表观遗传修饰——DNA羟甲基化。在考虑这些表观遗传变化如何影响短期和长期基因表达时，同样重要的是要考虑表观基因组作为一个整体是如何发挥作用的。每种表观遗传修饰对基因表达都有典型的影响，改变这种表观遗传修饰可能会预期影响基因按照该修饰的典型功能进行表达的方式。然而，在发育性ID这样的营养缺乏范例中，多种同时发生的表观遗传修饰会发生改变。因此，在考虑营养暴露对基因表达的影响时，不仅必须考虑单个修饰对基因表达的贡献，还必须总体考虑多种同时发生的修饰的变化如何可能相互累积作用以影响基因调控。展望未来，这项研究的一个更广泛目标是了解表观基因组各组成部分的贡献以及表观基因组的各个组成部分如何相互作用，以塑造在ID期间急性观察到的以及恢复后慢性观察到的基因表达变化。

补充材料

补充材料请参考PubMed Central上的网络版本。

资金来源

本研究得到了美国国立卫生研究院(NIH)授予PVT的R01NS099178研究基金以及授予AB的NIH F30HD093285研究基金的支持。

数据可用性声明

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在本文中。如需进一步咨询，请联系通讯作者。

参考文献

1. Fretham SJB, Carlson ES, Georgieff MK. The role of iron in learning and memory. Adv Nutr. 2011 Mar;2(2):112-21. [PubMed: 22332040]

2. Lukowski AF, Koss M, Burden MJ, Jonides J, Nelson CA, Kaciroti N, et al. Iron deficiency in infancy and neurocognitive functioning at 19 years: evidence of long-term deficits in executive function and recognition memory. Nutr Neurosci. 2010 Apr;13(2):54-70. [PubMed: 20406573]

3. Lozoff B, Smith JB, Kaciroti N, Clark KM, Guevara S, Jimenez E. Functional Significance of Early-Life Iron Deficiency: Outcomes at 25 Years. J Pediatr. 2013;163(5):1260-6. [PubMed: 23827739]

4. Schmidt RJ, Tancredi DJ, Krakowiak P, Hansen RL, Ozonoff S. Maternal intake of supplemental iron and risk of autism spectrum disorder. Am J Epidemiol. 2014 Nov;180(9):890-900. [PubMed: 25249546]

5. Insel BJ, Schaefer CA, McKeague IW, Susser ES, Brown AS. Maternal iron deficiency and the risk of schizophrenia in offspring. Arch Gen Psychiatry. 2008 Oct;65(10):1136-44. [PubMed: 18838630]

6. Wiegersma AM, Dalman C, Lee BK, Karlsson H, Gardner RM. Association of Prenatal Maternal Anemia With Neurodevelopmental Disorders. JAMA Psychiatry. 2019 Sep;1.

7. McLean E, Cogswell M, Egli I, Wojdyla D, de Benoist B. Worldwide prevalence of anaemia, WHO Vitamin and Mineral Nutrition Information System, 1993-2005. Public Health Nutr. 2009 Apr;12(4):444-54. [PubMed: 18498676]

8. Yip R Iron deficiency: contemporary scientific issues and international programmatic approaches. J Nutr. 1994 Aug;124(8 Suppl):1479S-1490S. [PubMed: 8064407]

9. Clardy SL, Wang X, Zhao W, Liu W, Chase GA, Beard JL, et al. Acute and chronic effects of developmental iron deficiency on mRNA expression patterns in the brain. Oxidative Stress and Neuroprotection. Vienna: Springer Vienna; 2006; pp 173-96.

10. Carlson ES, Stead JDH, Neal CR, Petryk A, Georgieff MK. Perinatal iron deficiency results in altered developmental expression of genes mediating energy metabolism and neuronal morphogenesis in hippocampus. Hippocampus. 2007 Jan;17(8):679-91. [PubMed: 17546681]

11. Schachtschneider KM, Liu Y, Rund LA, Madsen O, Johnson RW, Groenen MAM, et al. Impact of neonatal iron deficiency on hippocampal DNA methylation and gene transcription in a porcine biomedical model of cognitive development. BMC Genomics. 2016 Dec;17(1):856. [PubMed: 27809765]

12. Tran PV, Kennedy BC, Pisansky MT, Won K-J, Gewirtz JC, Simmons RA, et al. Prenatal Choline Supplementation Diminishes Early-Life Iron Deficiency-Induced Reprogramming of Molecular Networks Associated with Behavioral Abnormalities in the Adult Rat Hippocampus. J Nutr. 2016 Mar;146(3):484-93. [PubMed: 26865644]

13. Barks A, Fretham SJ, Georgieff MK, Tran PV. Early-life neuronal-specific iron deficiency alters the adult mouse hippocampal transcriptome. J Nutr. 2018 Oct;In Press(10):1521-8. [PubMed: 30169712]

14. Feil R. Environmental and nutritional effects on the epigenetic regulation of genes. Mutat Res Mol Mech Mutagen. 2006 Aug;600(1-2):46-57.

15. Dolinoy DC, Jirtle RL. Environmental epigenomics in human health and disease. Environ Mol Mutagen. 2008 Jan;49(1):4-8. [PubMed: 18172876]

16. Tran PV, Kennedy BC, Lien Y-C, Simmons RA, Georgieff MK. Fetal iron deficiency induces chromatin remodeling at the Bdnf locus in adult rat hippocampus. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2015 Feb;308(4):R276-82. [PubMed: 25519736]

17. Lien Y-C, Condon DE, Georgieff MK, Simmons RA, Tran PV, Lien Y-C, et al. Dysregulation of Neuronal Genes by Fetal-Neonatal Iron Deficiency Anemia Is Associated with Altered DNA Methylation in the Rat Hippocampus. Nutrients. 2019 May;11(5):1191.

18. Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, Pastor WA, Bandukwala H, Brudno Y, et al. Conversion of 5- methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 2009 May;324(5929):930-5. [PubMed: 19372391]

19. Salminen A, Kauppinen A, Kaarniranta K. 2-Oxoglutarate-dependent dioxygenases are sensors of energy metabolism, oxygen availability, and iron homeostasis: potential role in the regulation of aging process. Cell Mol Life Sci. 2015 Oct;72(20):3897-914. [PubMed: 26118662]

20. Kriaucionis S, Heintz N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science (80- ). 2009;324(5929):929-30.

21. Lister R, Mukamel EA, Nery JR, Urich M, Puddifoot CA, Johnson ND, et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 2013 Aug;341(6146):1237905. [PubMed: 23828890]

22. Münzel M, Globisch D, Brückl T, Wagner M, Welzmiller V, Michalakis S, et al. Quantification of the Sixth DNA Base Hydroxymethylcytosine in the Brain. Angew Chemie Int Ed. 2010 Jun;49(31):5375-7.

23. Hahn MA, Qiu R, Wu X, Li AX, Zhang H, Wang J, et al. Dynamics of 5-Hydroxymethylcytosine and Chromatin Marks in Mammalian Neurogenesis. Cell Rep. 2013;3(2):291-300. [PubMed: 23403289]

24. Szulwach KE, Li X, Li Y, Song CX, Wu H, Dai Q, et al. 5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging. Nat Neurosci. 2011 Oct;14(12):1607-16. [PubMed: 22037496]

25. Zhu X, Girardo D, Govek E-E, John K, Mellén M, Tamayo P, et al. Role of Tet1/3 Genes and Chromatin Remodeling Genes in Cerebellar Circuit Formation. Neuron. 2016;89(1):100-12. [PubMed: 26711116]

26. Khare T, Pai S, Koncevicius K, Pal M, Kriukiene E, Liutkeviciute Z, et al. 5-hmC in the brain is abundant in synaptic genes and shows differences at the exon-intron boundary. Nat Struct Mol Biol. 2012 Sep;19(10):1037-43. [PubMed: 22961382]

27. Semple BD, Blomgren K, Gimlin K, Ferriero DM, Noble-Haeusslein LJ. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 2013;106-107:1-16.

28. National Research Council (U.S.). Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals., Institute for Laboratory Animal Research (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. National Academies Press; 2011.

29. Jorgenson LA, Wobken JD, Georgieff MK. Perinatal iron deficiency alters apical dendritic growth in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Dev Neurosci. 2003;25(6):412-20. [PubMed: 14966382]

30. Carlson ES, Tkac I, Magid R, O’Connor MB, Andrews NC, Schallert T, et al. Iron is essential for neuron development and memory function in mouse hippocampus. J Nutr. 2009 May;139(4):672- 9. [PubMed: 19211831]

31. Wallin DJ, Tkac I, Stucker S, Ennis KM, Sola-Visner M, Rao R, et al. Phlebotomyinduced anemia alters hippocampal neurochemistry in neonatal mice. Pediatr Res. 2015;77(6). DOI: 10.1038/ pr.2015.41

32. Petry CD, Eaton MA, Wobken JD, Mills MM, Johnson DE, Georgieff MK. Iron deficiency of liver, heart, and brain in newborn infants of diabetic mothers. J Pediatr. 1992 Jul;121(1):109-14. [PubMed: 1625067]

33. Khalaf-Nazzal R, Francis F. Hippocampal development - Old and new findings. Neuroscience. 2013;248:225-42. [PubMed: 23756184]

34. Workman AD, Charvet CJ, Clancy B, Darlington RB, Finlay BL. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 2013;33(17):7368-83. [PubMed: 23616543]

35. Sathyanesan A, Zhou J, Scafidi J, Heck DH, Sillitoe RV., Gallo V. Emerging connections between cerebellar development, behaviour and complex brain disorders. Nat Rev Neurosci. 2019 May;20(5):298-313. [PubMed: 30923348]

36. Rahimi-Balaei M, Bergen H, Kong J, Marzban H. Neuronal Migration During Development of the Cerebellum. Front Cell Neurosci. 2018 Dec;12:484. [PubMed: 30618631]

37. Brunette KE, Tran PV, Wobken JD, Carlson ES, Georgieff MK. Gestational and neonatal iron deficiency alters apical dendrite structure of CA1 pyramidal neurons in adult rat hippocampus. Dev Neurosci. 2010 Aug;32(3):238-48. [PubMed: 20689287]

38. Bastian TW, von Hohenberg WC, Mickelson DJ, Lanier LM, Georgieff MK. Iron Deficiency Impairs Developing Hippocampal Neuron Gene Expression, Energy Metabolism, and Dendrite Complexity. Dev Neurosci. 2016 Sep;38(4):264-76. [PubMed: 27669335]

图1。

P15大鼠铁状态的特征。(a) 胎儿 - 新生儿期饮食缺铁后，P15时全身铁状态降低，表现为血细胞比容降低。未治疗的缺铁性贫血(IDA)组血细胞比容降低最为明显。饮食补铁导致血细胞比容部分恢复。(b) P15海马组织铁状态降低，表现为转铁蛋白受体(Tfrc)mRNA表达降低。饮食补铁治疗导致组织铁状态显著但不完全恢复。(c) P15小脑组织铁状态降低，表现为转铁蛋白受体(Tfric)mRNA表达降低。饮食补铁治疗导致组织铁状态显著但不完全恢复。(d) 组织铁状态(如P15海马)与全身铁状态显著相关。

误差线表示标准差；虚线表示95%置信区间；*表示p<0.05；***表示p<0.001；****表示p<0.0001

图2。

发育性缺铁性贫血会增加海马体中的TET活性。(a) 从全核蛋白提取物中定量得出的TET活性，在缺铁性贫血(IDA)和缺铁性贫血伴缺铁性甲状腺功能减退(TIDA)的海马体中有所增加。膳食补铁并不能使TIDA海马体中的TET活性恢复正常。(b) 将TET活性作为全身铁状态的一个因素进行回归分析(以血细胞比容表示)。在所有三个实验组中，TET活性与血细胞比容呈显著负相关，表明全身铁状态的降低与TET活性的增加有关。

误差线表示标准差；虚线表示95%置信区间；*表示p<0.05；***表示p<0.0001

图3。

发育性缺铁性贫血会增加海马体中Tet的表达。(a) Tet3 mRNA在IDA海马体中的表达增加。与未治疗的IDA组相比，膳食补铁显著降低了Tet3的表达，但未降至对照水平。Tet1和Tet2 mRNA的表达不受缺铁或其治疗的显著影响。(b) 将Tet mRNA表达作为海马体组织铁状态的函数进行回归分析(以转铁蛋白受体(Tfrc)表达表示)。Tet2和Tet3的表达均与Tfrc mRNA表达呈显著正相关，表明Tet mRNA表达随组织铁状态的降低而增加。

误差线表示标准差；虚线表示95%置信区间；*表示p<0.05；***表示

p<0.0001

图4。

发育性缺铁性贫血会降低小脑的TET活性。(a) 从全核蛋白提取物中定量得出的TET活性，在IDA小脑组中降低，但在TIDA小脑组中未降低。(b) 将TET活性作为小脑铁状态的一个因素进行回归分析(以Tfrc表达表示)。TET活性与Tfrc表达呈显著负相关。(c) IDA或其治疗对小脑Tet mRNA表达没有影响。误差线表示标准差；虚线表示95%置信区间；**表示p<0.01；***表示p<0.0001