翻译后修饰对FTO去甲基化酶结构和活性的影响

米哈尔·马尔钦科夫斯基 、托马什·皮尔日斯 、达米安·加尔比茨 、扬·皮沃瓦尔斯基 、达米安·米莱茨基 、格热戈日·诺瓦茨基 。米哈尔·陶贝 、马切伊·吉尔尼克 (C)、马切伊·科扎克 (C)、玛丽亚·维尼耶夫斯卡 - 萨耶夫斯卡 (C)、埃娃·绍拉伊斯卡 D、扬努斯·德布斯基 、阿格涅什卡·M·马切耶夫斯卡 、卡娅·普日戈恩斯卡 、卡罗利娜·费伦茨 D、埃尔日别塔·格雷修克 和亚罗斯瓦夫·波兹南斯基

1 波兰科学院生物化学与生物物理研究所，帕维尼斯基街5a号，02 - 106华沙，波兰；mmarcinkowski@ibb.waw.pl(M.M.)；tpilzys@ibb.waw.pl(T.P.)；dgarbicz@ibb.waw.pl(D.G.)；piwo@ibb.waw.pl(J.P.)；damian@ibb.waw.pl(D.M.)；mwin@ibb.waw.pl(M.W.-S.)；ewasz@ibb.waw.pl(E.S.)；jasio.ibb@gmail.com(J.D.)；agnieszza@ibb.waw.pl(A.M.M.)；kaja.przygonska@gmail.com(K.P.)

2 亚当·密茨凯维奇大学纳米生物医学中心，皮亚斯托夫斯卡街3号，61 - 614波兹南，波兰；nowag@amu.edu.pl

亚当·密茨凯维奇大学物理学院高分子物理教研室，波兹南大学街2号，61 - 614波兹南，波兰；mtaube@amu.edu.pl(M.T.)；maciejgielnik@amu.edu.pl(M.G.)；mkozak@amu.edu.pl(M.K.)

4 波兰科学院国家同步辐射中心SOLARIS，雅盖隆大学，红苹果街98号，30 - 392克拉科夫，波兰

5 华沙生命科学大学兽医学院兽医研究中心，大型动物疾病与临床系，诺沃乌尔辛诺夫斯卡街100号，02 - 797华沙，波兰；karolina_ferenc@o2.pl

* 通信作者:elag@ibb.waw.pl(E.G.)；jarek@ibb.waw.pl(J.P.)

† 这些作者对本工作贡献相同。

摘要:FTO蛋白参与多种生理过程，包括脂肪生成和成骨作用。这种双结构域蛋白属于2-氧戊二酸(2-OG)和Fe(II)依赖性双加氧酶的AlkB家族，具有N6-甲基腺苷(N6 - mA)活性。本研究的目的是表征FTO的结构与活性之间的关系。使用生物物理方法(差示扫描荧光法、微量热泳动、小角X射线散射)和生化技术(尺寸排阻色谱、酶活性测定)，测定了不结合催化位点的辅因子(钙离子和2-OG)以及蛋白质浓度对在大肠杆菌或杆状病毒(BESFTO)系统中表达的FTO性质的影响。我们发现FTO携带三个磷酸化丝氨酸(S184、S256、S260)，而FTO中没有此类修饰。模拟S256磷酸化的S256D突变适度降低了FTO的催化活性。在钙离子存在的情况下，观察到FTO结构略有稳定，同时催化活性降低。尺寸排阻色谱和微量热泳动数据证实了来自两种表达系统的FTO形成同源二聚体的能力。微量热泳动测定的FTO同源二聚体解离常数与它们在人细胞中的体内形成一致。最后，基于小角X射线散射数据构建了FTO同源二聚体的低分辨率结构。

关键词:FTO；BESFTO；磷酸化；钙；二聚化；纳米差示扫描荧光法；微量热泳动；氢氘交换；小角X射线散射

1. 引言

2007年有报道称，人类FTO(脂肪量和肥胖相关)基因第一个内含子中的单核苷酸多态性(SNP)与体重指数(BMI)升高之间存在强烈关联[1,2,3]。这一发现促使人们对FTO编码蛋白的生物学功能进行了广泛研究[4]。后来的数据表明，上述SNP实际上并未影响FTO基因，而是改变了……

检查更新

引用:Marcinkowski, M.; Pilžys, T.; Garbicz, D.; Piwowarski, J.; Mielecki, D.; Nowaczyk, G.; Taube, M.; Gielnik, M.; Kozak, M.; Winiewska-Szajewska, M.; 等人。翻译后修饰对FTO去甲基化酶结构和活性的影响。国际分子科学杂志。2021年，22卷，4512期。https://doi.org/10.3390/ijms22094512

学术编辑:Christina Piperi

收到日期:2021年3月12日

接受日期:2021年4月22日

发表日期:2021年4月26日

出版商说明:MDPI对于已发表地图中的管辖权主张和机构隶属关系保持中立。

版权:作者所有。瑞士巴塞尔的MDPI出版社授权。本文是一篇开放获取文章，根据知识共享署名(CC BY)许可协议(https://creativecommons.org/licenses/by/ )发布。

另一个位于16号染色体上的肥胖相关基因IRX3的调控序列[5]。然而，对FTO蛋白的关注促使人们发现它参与了广泛的关键生理过程，如脂肪生成[6]、骨生成[7]、神经发育[8]、心脏重塑[9]和细胞周期进程[10]，如图1A所示。此外，FTO功能障碍会导致重大紊乱，如癌症[11 - 16]和大脑发育异常[17]。FTO的这些多种功能可能反映了它在不同细胞类型中的不同底物特异性。FTO是一种去甲基化酶，到目前为止，已被证明能从单链DNA或RNA中的以下修饰核苷上去除甲基:5-甲基胸苷[18]、5-甲基尿苷[19](图1B)、N6-甲基腺苷、N6，2’-O-二甲基腺苷[20]，最有效的是从mRNA帽中的m7G(3’-O)-甲基腺苷上去除甲基[21](图1C)。

图1. FTO的结构、特异性和功能。(A)受FTO影响的生理功能。绿色-生理过程。红色-FTO活性过高导致的缺陷。紫色-FTO活性不足导致的缺陷；(B)FTO进行的去甲基化反应；5-甲基-(文本中的首选FTO底物)；(D)FTO蛋白的结构域架构。

FTO的催化中心位于N端双加氧酶结构域(第1至327位氨基酸残基)，在以Fe2+和抗坏血酸作为辅因子以及2-酮戊二酸(2-OG)作为共底物的情况下，甲基在此被去除(图1B)[18]。C端结构域(第328至505位氨基酸残基；图1D)的定位使催化结构域能够维持适当的结构，从而具备从5-甲基胸苷上去除甲基的能力[22]。综上所述，FTO从各种RNA类别(mRNA、tRNA、snRNA)中去除诸如m7G(3’-O)-甲基腺苷和m7G(2’-O)-甲基腺苷等化学修饰，影响RNA的稳定性、翻译效率、降解速率甚至可变剪接[20,23]。

尽管关于FTO参与代谢调节的研究众多，但有关FTO结构与功能关系的数据相对较少。已在FTO中鉴定出几种磷酸化氨基酸[24]，其磷酸化状态会影响蛋白质的命运。Tai及其同事报告称，蛋白激酶 对苏氨酸的磷酸化增加了FTO的半衰期[25]，而Faulds及其同事表明，在小鼠中，N端结构域中特定丝氨酸(S249和S253)的磷酸化会导致FTO降解[26]。Hirayama及其同事最近的一项研究表明，特定苏氨酸T150的磷酸化会影响FTO的细胞定位及其从特定转录本中去除 meA的能力[10]，从而调节FTO的底物特异性[20]。然而，只有后一项研究直接探讨了FTO磷酸化对其活性的影响，且仅研究了一个磷酸化位点，这表明该领域远未得到充分研究。此外，C端结构域的作用也鲜有探索。有研究指出它参与FTO的同二聚化[22]。最近一篇论文表明，FTO的功能受到其C端结构域与SFPQ蛋白相互作用的调节，这种相互作用使得SFPQ识别的特定转录本发生去甲基化[27]。最近大量论文表明RNA的各种甲基化修饰很重要[28]，再加上有充分文献记载FTO参与关键生理过程，因此详细了解FTO的作用模式及其调节机制具有重要意义。

在此，我们对FTO的结构与活性之间的关系以及各种调节因子的影响进行了全面分析。我们使用生物物理方法确定了FTO的磷酸化状态、小分子和离子对其性质的影响。为了确定翻译后修饰的影响，我们比较了从原核大肠杆菌(EC)表达系统获得的重组N端带His标签的人FTO与从真核杆状病毒表达系统(BES)获得的FTO的特性，在真核杆状病毒表达系统中有望模拟天然哺乳动物FTO中的翻译后修饰。

2. 结果

2.1. FTO的热稳定性取决于所用的表达系统

未修饰的FTO在大肠杆菌 中表达，而在真核杆状病毒表达系统(BESFTO)中获得了可能模拟天然哺乳动物蛋白质修饰方式的蛋白质。从这两个系统中都获得了高纯度的FTO制剂(图2A)，并且两者都能够以相似的效率进行 -meA去甲基化(分别见图2B的泳道1和2)。

在 FTO中发现了一个自发突变，导致S246G替换，然而计算机模拟计算表明，这种变化仅对蛋白质稳定性有轻微影响(约1.2千卡/摩尔，图S1A)。我们还通过实验证实， 的酶活性与野生型 接近(分别见图 的泳道1和2)。

随后，我们使用微量差示扫描荧光法(nanoDSF)分析了两种FTO制剂的脱辅基(无辅因子)形式和全酶(含 以及模拟 的 -非催化阳离子)形式的热解折叠过程(图2C)。热变性曲线显示出两个峰，这表明可能存在两个转变，分别代表N端和C端结构域的顺序解折叠，其中N端结构域包括1 - 327位残基，C端结构域包括328 - 505位残基。两种制剂的脱辅基形式的热稳定性几乎相同。全酶形式明显更稳定，并且在 FTO和 FTO之间，第一次解折叠温度 和 分别存在统计学上的显著差异 ，第二次转变的差异较小。综上所述，这些数据表明在所用的两种表达系统中，FTO的结构特性略有不同。

图2. FTO蛋白的纯化与表征。(A) FTO和 FTO纯化的SDS - PAGE分析。携带空pET - 28a(+)质粒的大肠杆菌BL21作为阴性对照。L—7.5 μL细胞裂解液，M—分子标志物，P—纯化的 FTO(42 )， FTO(17 )或阴性对照。(B) 基于化学发光测定法的 FTO、 FTO和 FTO 突变体的酶活性。 -meA用作底物。相对活性以 的 FTO的活性为参照(100%)。数据以点和均值表示， whiskers表示标准差。n—样本数量。** 。(C) 纯化的 FTO和 FTO在无(脱辅基)或有 和2 - OG(全酶)存在下的热稳定性的nanoDSF分析。左图和中图，发射率(粗线)和一阶导数(细线)曲线随温度的变化。所有四个蛋白质样品均显示出两个解折叠转变(红点):一个 在较低温度下不太明显，另一个 在较高温度下更清晰。右图，汇总数据以箱线图表示。箱体表示四分位间距。 whiskers表示最高和最低数据点。箱体内的水平线表示中位数。n—样本数量。** 。

由于全酶形式与脱辅基形式明显不同，我们分别监测了两种辅因子 和 的作用。它们都显著增加了 ，表明与FTO存在相互作用(图S2A、B)。在存在 的情况下，第一个转变向更高温度移动，而第二个转变不受影响。对于2-OG则观察到相反的效果，它仅影响高温转变。有趣的是，在全酶形式中，对于两种配体，低温转变发生的温度甚至比仅存在 时更高，而高温转变与仅存在2-OG时相同。所有这些观察结果表明，受影响更大的低温转变对应于 末端结构域的热变性，其催化活性状态包含两种辅因子。然而，必须指出的是，纳米差示扫描荧光法(nanoDSF)是在非生理温度下追踪配体结合的效果，此时蛋白质会展开。为避免这个问题，我们使用微量热泳动法(MST)在生理相关温度 下研究 和 的结合。在存在和不存在 的情况下，2-OG对FTO结合 的影响分别为轻微的 和 ，使用全局拟合估计的共识 值为 ；见图2C)，而2-OG仅在存在 时与FTO结合，在存在 时结合，在不存在时与 结合；见图2D)。

2.2. 翻译后修饰影响FTO的去甲基化活性

在杆状病毒系统中表达蛋白质会发生多种翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化和 -肉豆蔻酰化，这与在哺乳动物细胞中观察到的修饰类似。使用ProSite服务器[29]鉴定了许多可能被引入翻译后修饰的酶识别的FTO残基。其中有11个假定的磷酸化位点(T6、T32、S56、T105、T128、S256、S260、T320、S355、T393和T443)，4个N-肉豆蔻酰化位点(G100、G180、G182和G412)，以及2个 -糖基化位点(N200和N302)。在整合了低通量和高通量数据源的PhosphoSitePlus[30]数据库中鉴定出了更多潜在的磷酸化位点。其中S256出现频率最高，其次是T4、S260、T6、S184、S229、S173、Y199、T32、S55、Y106、Y108、T150、Y185、Y220、S355和S458[24]。这些位点大多数位于FTO的N端催化亚基中。

在计算机模拟分析之后，通过质谱法实验测定了FTO的实际磷酸化模式。在 FTO中鉴定出三个高度丰富的磷酸丝氨酸残基，即S184、S256和S260，而在 FTO中未鉴定到此类修饰(图S3)。有趣的是，这三个丝氨酸残基位于N端结构域的两个区域，在蛋白质数据库中可获得的所有FTO结构中，这两个区域都是无序的。分子模拟分析表明，位于覆盖残基164 - 188的大无序环N端部分的S184磷酸化，会增强其与近端碱性残基(K162和R178)的相互作用，从而稳定特定构象(图3)。此外，使用RaptorX服务器(http://raptorx.uchicago.edu；于2021年4月3日访问)[31]进行的计算机模拟分析表明，在蛋白质数据库的所有结构中均不可见的部分无序环(N164 - G187)，在模拟丝氨酸磷酸化的S184D/E替换后变得显著稳定(图S4)。因此，可以预期S184磷酸化会局部稳定蛋白质结构。在计算机模拟中，S256D/E和/或S260D/E替换并未影响无序环 EGPEEESEDDSHLEGRDPDI 的结构。

我们还使用热迁移分析实验研究了磷酸化对FTO稳定性的影响。在所需缓冲液中对BESFTO进行酶促去磷酸化，为避免影响蛋白质样品的额外操作，随后在相同缓冲液中进行纳米差示扫描荧光法(nanoDSF)测量。在这些条件下，在展开曲线中只能区分出一个转变，而不是之前确定的两个转变(图S5A)。BESFTO全酶形式的去磷酸化导致变性温度有小幅但具有统计学意义的降低( 与 相比)，而对于 FTO未观察到这种影响(图S5B)。由于用磷酸酶处理的两种FTO制剂具有相同的变性温度 ，可以推断 FTO和 FTO仅在磷酸化状态上有所不同。

图3. 在 FTO中鉴定出的磷酸丝氨酸的位置。修饰(绿色)仅位于N端结构域(蓝色)；C端结构域为橙色。FTO蛋白质结构基于PDB4IE5记录进行建模。

不幸的是，无法直接研究BESFTO去磷酸化对其去甲基酶活性的影响，因为即使在没有磷酸酶的情况下，在去磷酸化缓冲液中孵育也会使 和BESFTO样品的酶活性分别显著降低25%和80%(图S5C)。

为克服这个问题，我们对 FTO引入S256D替换以模拟最丰富的磷酸化。这导致催化活性有统计学意义的降低(约为 -值 ；图1B)。因此，可以预期S256(可能还有S260)的磷酸化会降低FTO的酶活性。值得注意的是，对 FTO和 FTO的比活性进行直接比较并未发现预期的差异，很可能是因为BESFTO的磷酸化水平较低。基于质谱数据，磷酸化程度估计为3%(对于S184)、37%(对于S256)和19%(对于S260)。

总之，这些结果表明，在杆状病毒系统中表达的FTO，可能还有天然的哺乳动物FTO，能够在三个丝氨酸残基处被磷酸化。这些修饰影响蛋白质稳定性，并且至少S256的磷酸化会导致去甲基酶活性降低。

2.3. 钙影响FTO稳定性

三个可磷酸化的丝氨酸残基中的两个(S256和S260)位于一个极酸性区域内，该区域位于一个溶剂暴露的环中，包含249 - 312位残基。包括磷酸丝氨酸在内，在一个19个氨基酸长的序列中有12个酸性残基。这个环被指出是一个假定的 结合位点，并且这个预测通过实验得到了验证。

使用带有SYPRO ORANGE探针的差示扫描荧光法(DSF)研究了FTO与钙 的相互作用(图4A)。在存在 的情况下， FTO的无辅基形式和全酶形式都显示出略微(分别为0.8和 )但显著 升高的转变温度(图 )。钙对FTO热稳定性的影响与 (全酶与无辅基)的存在无关，这表明 结合位点与 结合位点之间没有直接相互作用。我们进一步使用质谱监测的氢 - 氘交换(HDX - MS)来确定受 结合影响的区域。发现了两个在存在 时稳定的区域，分别包含120 - 155位残基和240 - 310位残基(图4B)。有趣的是，它们在蛋白质结构中彼此靠近(图4C)。第二个区域包含上述两个可磷酸化丝氨酸S256和S260所在的酸性区域。这证实了关于 环参与 结合的预测。然而， 的稳定作用相当小，这与该环的表面位置一致。值得注意的是，同样位于因钙存在而稳定的第二个区域中的H307，参与了去甲基酶活性所需的 离子的配位。因此，可以假设 可能通过与参与 结合的残基间接相互作用来调节FTO的酶活性。这个预测通过实验得到了验证。

图4. 对FTO参数的影响。(A) 在不存在(脱辅基)或存在 和2-酮戊二酸(全酶)的情况下， 对 FTO热稳定性影响的差示扫描荧光法(DSF)分析。左图，发射(粗线)和一阶导数(细线)曲线的比率显示为温度的函数。所有四个蛋白质样品均显示一个明显的解折叠转变(红点)。右侧收集的数据以箱线图表示。箱体表示四分位间距。须线表示最高和最低数据点。箱体内的水平线表示数据的中位数。n为样品数量。A.U.为任意单位。** 。(B) 在与重水孵育1小时后， 对 FTO溶剂可及性影响的氢氘交换(HDX)分析。显示了有钙和无钙样品中各个肽段(每个带须线的矩形代表一个肽段)交换水平之间的差异。肽段可及性的统计学显著差异 用紫色标记。 FTO的两个区域在存在 时更稳定，包括第120 - 155位和第240 - 310位残基。每个实验设置重复四次。(C) 根据HDX数据对FTO分子中 稳定区域进行定位，颜色编码。有显著交换的区域用红色和紫色标记；第一个区域的 结合部分用粉色标记。由 稳定的两个蛋白质区域在结构上彼此靠近。FTO蛋白质结构是基于PDB4IE5记录建模的。

2.4. 影响FTO催化活性

尽管 的稳定作用相当小，但它影响了 FTO N端结构域中参与酶活性的区域。实际上，发现 会降低两种FTO制剂的活性(图5A、B)。尽管 对FTO稳定性的影响很小，但它显著降低了去甲基化酶活性，对于 FTO而言，降低幅度超过 。此外，在 FTO上观察到的更强效应与我们的计算机模拟预测以及氢氘交换质谱(HDX-MS)数据一致，即磷酸化丝氨酸256和260可能有助于 的结合。

图5. 通过化学发光测定法检测 对FTO酶活性的影响。相对活性以 FTO(A)或 FTO(B)(100%)的活性为参照。以 -甲基腺嘌呤( -meA)作为底物。数据以点和均值表示，须线表示样品标准差。n为样品数量。** 。

2.5. FTO通过其C端结构域形成同二聚体

我们还通过检测 FTO和 FTO在存在 和 的情况下形成同二聚体的能力，研究了磷酸化如何影响FTO蛋白-蛋白相互作用。两种辅因子均存在于实验溶液中，也存在于洗脱缓冲液中，以确保所研究的是FTO的全酶状态。对浓度约为 的蛋白质样品进行凝胶过滤时，两种制剂均以不对称峰洗脱，主峰大致对应于质量约80 kDa，在 处有一个肩峰(FTO的分子量为 )(图6)。这种洗脱曲线形状表明蛋白质的同二聚体和单体形式之间存在动态交换[32]，这导致FTO同二聚体的质量明显被低估(预期为 )。另一方面，FTO单体质量被低估与蛋白质的非球形细长形状一致(见图7)。

使用小角X射线散射(SAXS)研究了FTO同二聚体的结构(图7A、B)。拟合散射数据的低分辨率模型(近似分辨率12 - 20 Å)支持同二聚体的存在(图7A)——实验回转半径约为 ，而用Yasara Structure估计的单体值为 。从小角X射线散射数据(图 )估计的质量( )也超过了单体的质量( )，并且与凝胶过滤结果一致。通过分析用Symmdock服务器生成的100个 FTO同二聚体模型进行了进一步的结构优化。它们的理论散射曲线仅与其中两个模型的实验数据一致(图7B)(图7C、D)。在一个模型中，二聚化通过C末端结构域发生，而在另一个模型中则通过N末端结构域发生。然而，只有模型80的回转半径(37.8 Å；图7C)与实验值 一致。

图6. 在存在 和 的情况下， FTO(蓝色)和 FTO(橙色)的凝胶过滤色谱图。色谱图显示在与蛋白质的两种状态相对应的馏分中存在两种形式的FTO:一种明显是单体(在 附近的峰)，另一种(在 附近的峰)发生动态二聚体/单体平衡。

图7. FTO同二聚体的小角X射线散射结构分析。(A)BESFTO同二聚体的低分辨率( )模型及其从小角X射线散射数据获得的参数:MW - 分子分子量，Rg Guinier - 回转半径，Rg P(r) - 半径对距离分布，Dmax - 最大尺寸 (B)将散射数据拟合到由SymmDock服务器在计算机上生成的十个最佳二聚体结构。I - 散射强度，Q - 散射矢量。(C、D)FTO二聚体的两个最佳拟合模型，单体通过其C末端结构域(C)或N末端结构域(D)相互作用，由SymmDock服务器在计算机上生成(橙色 - 蓝色带状结构)叠加在低分辨率实验结构(浅蓝色)上。

我们利用质子-氘交换数据进一步评估这两个模型。氢氘交换质谱(HDX-MS)确定了FTO的两个最受保护的区域——第130 - 160位氨基酸残基和第330 - 420位氨基酸残基(图8A)。在单体中，第一个区域是位于N端结构域的一个埋藏的α-螺旋，第二个区域是C端结构域的一组表面暴露的残基。如在图7C中所示，后一个区域中显著降低的氢氘交换与它作为FTO二聚化的界面一致。因此，小角X射线散射(SAXS)和氢氘交换质谱(HDX-MS)数据都一致表明C端结构域负责FTO的二聚化。FTO二聚体的预测结构如图8B所示。

图8. 基于氢氘交换数据的FTO二聚体筛选。(A)在存在[具体物质1]和2-酮戊二酸(2-OG)的情况下FTO的氢氘交换图谱，显示了根据[具体时间2]后的氢交换程度进行颜色标记的肽段(矩形)。有两个区域比蛋白质的其余部分溶剂可及性显著更低，即第130 - 160位氨基酸残基和第330 - 420位氨基酸残基。(B)通过图7C中展示的C结构域连接的FTO同源二聚体模型，根据氢氘交换比率进行颜色标记。

使用微量热泳动(MST)法评估FTO二聚体的稳定性。我们在不存在或存在[具体物质1]和/或2-酮戊二酸(2-OG)的情况下，用未标记的FTO滴定荧光标记的FTO。在两种辅因子都存在的情况下，[具体物质3]的FTO二聚体的[解离常数4]为[具体数值5]，FTO显示出一个接近[具体物质3]的FTO所确定的值([具体数值5])(图9)。出乎意料的是，仅有一种辅因子，即[具体物质1]或[具体物质6]，或者在它们不存在的情况下，BESFTO二聚体更稳定([具体情况7]，详情见图[具体图编号8])。这表明辅因子的结合不仅影响位于N端结构域的FTO的活性位点，还会干扰涉及C端结构域的二聚化界面。[具体物质9]的FTO和[具体物质3]的FTO的全酶形式的[解离常数4]值与凝胶过滤实验结果一致，在该实验中分析了[具体蛋白质样品10]。在此浓度下，全酶蛋白的二聚体形式占主导(约70%)，但单体形式仍然相当丰富。微摩尔范围内的[解离常数4]值并不排除FTO二聚体在体内的存在。

图9. 在存在[具体物质2]和2-酮戊二酸(2-OG)的情况下，[具体物质0]的FTO(蓝色)和[具体物质1]的FTO(橙色)二聚化的微量热泳动(MST)分析。[具体物质0]的FTO和[具体物质1]的FTO之间的[解离常数3]值差异无统计学意义。该图表示每个单独样品(数据点)在给定FTO浓度下标记蛋白的二聚体水平以及单体和二聚体之间模拟平衡的情况(直线)。[解离常数3]显示为估计值[具体数值4]±标准差。n为重复次数。

3. 讨论

FTO蛋白是ALKBH家族的成员之一，已被发现与肥胖以及其他诸如2型糖尿病和癌症等富贵病有关。分子研究表明，它是一种去甲基化酶，参与mRNA中 -meA修饰的逆转，从而在转录后水平调节新陈代谢[33]。考虑到FTO影响了众多关键过程，令人惊讶的是，关于其活性调节、确切的底物特异性以及FTO结构、活性和相互作用组之间的关系，我们所知甚少。在此，我们对在两种异源系统中表达的纯化FTO样品进行了详细的生物物理和生化表征，无论是否存在其已知或假定的辅因子。通过比较在细菌和真核表达系统中表达的FTO，我们能够确定最常见的真核蛋白修饰——磷酸化的影响。我们利用了BES已知可模拟哺乳动物细胞中蛋白质磷酸化这一事实[34]。基于这一假设，我们在 FTO中鉴定出三个磷酸丝氨酸残基，而在 FTO中未发现。所有三个修饰残基都位于溶剂暴露环中；其中两个，S256和S260，此前已有报道[26]，而位于FTO N端结构域的S184是新发现的。

在 FTO和 FTO之间未观察到酶活性的显著差异。然而，这三个丝氨酸的磷酸化程度远低于100%，实际上 FTO制剂可能是携带零个(根据质谱数据，这种形式占主导)到三个磷酸丝氨酸的多种形式的混合物。如果磷酸丝氨酸对酶活性的影响很小，那么在这样一个异质群体中，这很可能在实验误差范围内。另一方面，部分磷酸化足以显著降低FTO的整体稳定性， 和 的第一次热转变温度不同就证明了这一点。此外，在去磷酸化条件下孵育后， FTO的酶活性损失更高。在蛋白质的全酶形式中观察到了这两种FTO制剂之间的这些差异。综合这些结果表明，磷酸化可能在一定程度上影响FTO的性质。

磷酸化也有可能间接影响FTO的功能，例如，通过调节其细胞内定位[10]、与其他蛋白质的相互作用或对降解的敏感性[26]。也不能排除FTO磷酸化仅对其针对某些底物的去甲基化酶活性有选择性影响[20]。所有这些可能性都不会被一个缺少细胞背景的简单体外活性测试所发现。

为了确定 FTO和 FTO之间明显缺乏活性差异是源于前者的不完全磷酸化还是如上述推测的那样反映了磷酸化的背景依赖性效应，我们在 FTO中引入了模拟磷酸化的点突变S256D。这种方法令人信服地证明了该突变体的活性明显低于野生型 FTO。值得一提的是，人类FTO中与S256对应的丝氨酸上的小鼠磷酸化是导致FTO蛋白水解降解的级联反应的第一步[26]。综合这些事实表明了一系列事件，即磷酸化最初降低FTO活性，随后被细胞机制降解。

对N端附近两个相邻的磷酸化丝氨酸残基(S256和S260)附近的氨基酸序列进行检查，发现FTO表面一个无结构区域存在一个假定的钙结合位点，其晶体结构(pdb4IE5)中不存在该位点，有一个高度酸性的环(残基250 - 260)可能参与 结合 。理论上，S256和/或S260的磷酸化可能会进一步增强这种结合。如使用差示扫描荧光法(DSF)和氢氘交换法(HDX)所确定的， 对FTO有较小的稳定作用，远小于结合在催化中心的两个辅因子 和2 - 酮戊二酸(2-OG)所产生的作用。这与所提出的钙结合位点的外围位置一致，因为这两种技术主要检测蛋白质疏水核心(DSF)或二级结构(HDX)的变化[37,38]。与我们的预测相反， 对 FTO和 FTO的结构稳定作用相似，这与磷酸化丝氨酸在钙结合中起主要作用的观点相悖。

值得注意的是，钙信号传导也可能调节泛素化[39]。如前所述，小鼠中FTO的磷酸化导致了泛素化[26]，这表明 对FTO的影响值得进一步研究。

我们还发现 抑制了 FTO和 FTO的酶活性。已知许多代谢过程受钙调节，通常是通过[40]普遍存在的 结合蛋白钙调蛋白(CaM)，它是一种杂乱的相互作用因子[41]。

在表征FTO的生物物理性质时，我们还试图解决其寡聚化问题。早期研究表明FTO可以形成更高分子量的复合物。基于非变性电喷雾电离质谱和分析凝胶过滤，Church及其同事提出FTO通过其C端结构域形成同二聚体[22]。另一方面，Han及其同事获得了FTO三聚体形式的晶体结构，然而其存在归因于晶体堆积[18]。此外，早期研究表明双加氧酶有形成二聚体的倾向[42,43]。在这里，我们使用几种独立的方法(凝胶过滤、微量热泳动(MST)、小角X射线散射(SAXS))表明，在溶液中FTO倾向于二聚化，其二聚体解离常数在微摩尔范围内。FTO的这种浓度可能出现在特定的细胞区室如细胞核中。建模表明，二聚化最有可能通过C端结构域发生，如先前[22]所提出的。值得注意的是，磷酸化并没有显著影响二聚体的稳定性。

有趣的是， FTO二聚体的 对于无辅基形式比其催化活性的全酶形式更低。然而，由于N端和C端结构域之间的直接相互作用[22]，确定二聚化对FTO催化活性的确切影响并不容易。当在大肠杆菌中作为单独的多肽共表达时，这些结构域形成了稳定的复合物[18]。此外，Waheed及其同事的计算研究表明， - 和 -端结构域相对于彼此移动的方式可能对底物结合很重要[44]。因此，通过突变C端结构域中的氨基酸来测试二聚化对活性的影响是有问题的。这样的突变可能影响活性，不是通过阻止二聚化，而是通过改变N端和C端结构域之间的接触表面。此外，Han及其同事在评论Church及其同事的文章[22]时也提出了同样的观点。如果确实FTO二聚体的活性低于单体，那么在低FTO浓度下，二聚化可以帮助保持其活性恒定，尽管局部蛋白质丰度存在波动。有趣的是，FTO水平在头颈癌中高度升高并且与肿瘤发展相关[16]。这暗示了其在癌细胞中的特定作用，并增加了对FTO调节的关注。

4. 材料与方法

4.1. cDNA克隆与质粒构建

编码N端带有His标签的全长人FTO的cDNA的质粒pET-28a(+)由Arne Klungland教授(挪威奥斯陆大学医院，奥斯陆)慷慨提供。

为用于杆状病毒表达系统(BES)，用合适的引物(表S1)通过PCR扩增编码序列，并插入到Xbal和HindIII位点之间的pENTRY-IBA5供体载体中。然后将插入片段转移到pLSG-IBA35目的载体(StarGate克隆系统，德国哥廷根IBA生命科学公司)。

4.2. 定点诱变

定点诱变(SDM)在SDM1缓冲液(所有缓冲液的组成见表1)中进行。突变质粒在Eppendorf Mastercycler中按照以下程序扩增:95℃ 2分钟，然后进行18个循环，95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟，最后72℃ 5分钟。用于SDM的引物见表S1。通过与DpnI孵育去除未突变的质粒:将1 μl样品与2 μl 10×Tango缓冲液和1 μl DpnI(10 U/μl，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司，#ER1701)混合，并在37℃以500 rpm振荡孵育1小时。在65℃孵育20分钟终止反应。然后，将1 μl反应混合物加入到50 μl感受态大肠杆菌DH5α细菌悬液中，在冰上孵育30分钟，在42℃热激30秒，然后加入250 μl SOC缓冲液，并将细菌悬液在37℃孵育1小时。将细菌接种在LB琼脂平板上，在37℃过夜培养。单个菌落在液体LB中于37℃过夜培养。然后收获细菌，并用GeneJET质粒小提试剂盒(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司，#K0503)分离质粒。所有质粒均通过测序验证。

表1. 缓冲液组成。

表1. 续

4.3. 大肠杆菌中FTO的表达与纯化

将携带编码N端带有His标签的全长人FTO或其突变变体S246G或S256D的cDNA的质粒导入大肠杆菌BL21。细菌在补充有卡那霉素( )和氯霉素 的 的 中于 至 培养，用 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，在 培养 ，收获，重悬于PRP1裂解缓冲液中并在室温下孵育30分钟。在 离心后，带有His标签的蛋白质通过三个步骤进行纯化。首先，将样品与 的带正电荷的树脂悬浮液(Profinity IMAC镍带电树脂，伯乐公司，美国加利福尼亚州赫尔克里士，#156 - 0133)在 过夜孵育。未结合的部分通过用裂解缓冲液洗涤三次除去。接下来，用PRP2缓冲液进行洗脱；释放的蛋白质在SEC650(ENrich SEC 650，伯乐公司，美国加利福尼亚州赫尔克里士，#780 - 1650)柱上进行尺寸排阻色谱，最后在PRP3缓冲液中透析过夜。通过SDS - PAGE验证蛋白质纯度。纯化的蛋白质在液氮中速冻并储存在 。

4.4. 杆状病毒表达系统(BES)中蛋白质的表达与纯化

按照制造商的方案(FlashBAC™系统，牛津表达技术公司，英国牛津)，通过将含有人FTO编码序列的质粒与FlashBacUltra病毒DNA共转染，直接在Sf21昆虫细胞中产生重组杆状病毒。昆虫细胞以 的感染复数用重组杆状病毒感染。在 后，收获细胞，重悬于PRP4裂解缓冲液中并匀浆。在 离心后，N端带有His标签的蛋白质进行纯化，通过尺寸排阻和SDS - PAGE验证，并如前所述储存。

4.5. 蛋白质样品的制备

纯化的蛋白质在冰上解冻，在 离心，向上清液中加入EDTA(pH 8.0)至 并在冰上孵育 。通过在 处测量吸光度来测定FTO浓度(假设 和 的 )。使用盐析柱(Zeba Spin脱盐柱7K MWCO，赛默飞世尔科技公司 ，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，#89882)将蛋白质转移到合适的目标缓冲液中。

4.6. 分子建模

由于蛋白质数据库中所有沉积的FTO结构中，环序列 DAVPLCMSAD-FPRVGMGSSYNG 和 GPEEESEDDSH 是无序的，因此使用Yasara Structure软件包(版本19.5.5；https://www.yasara.com；于2021年2月1日访问)中实现的BuildLoop算法 [45] 重建了它们的坐标。使用FoldX软件 [46] 评估了S184、S246、Ser256和S260的取代对FTO蛋白稳定性的热力学影响。后一种计算包括S246G替换的贡献以及实验确定的S184、S256和S260的磷酸化。

4.7. 酶活性测定

使用FTO化学发光检测试剂盒(BPS Bioscience)测定FTO活性。在反应前，将从 . 大肠杆菌或BES中纯化的FTO样品与 EDTA孵育 ，然后进行以下两种操作之一:在盐析柱(Zeba 旋转脱盐柱， 分子量截留值， ，赛默飞世尔科技 ，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，#89882)上进行缓冲液交换或过夜透析。根据制造商的方案，以含有 -meA(试剂盒中提供)的RNA作为底物进行测量。使用Synergy HT(美国Bio Tek公司，威努斯基)酶标仪测量化学发光，积分时间为 ，板移动后延迟 。根据以下公式估算给定FTO样品的脱甲基酶活性，并进一步根据蛋白质浓度进行调整。

其中 和 分别是含有蛋白质样品的反应和缓冲液背景的化学发光强度， 是含有 纯化 的参考样品的平均信号强度，并针对2 - 3个独立制剂进行测定。

4.8. 配体结合筛选

在存在各种配体/辅因子组合的情况下，通过差示扫描荧光法(DSF；4.8.1)或微量差示扫描荧光法(nanoDSF；4.8.2)跟踪蛋白质的热稳定性: . 在属于AlkB家族的铁依赖性双加氧酶的结构研究中常用作无活性的铁模拟二价金属 [47 - 49]。根据蛋白质数据库数据， 仅结合在FTO蛋白的催化中心(4qkn，4zs2， )，而 与N端His标签的可能结合 [50] 不应干扰蛋白质稳定性。重要的是，在所用的实验条件下， 不会像 在没有抗坏血酸的情况下那样发生自发氧化。我们仅在基于紫外检测的实验中使用 ，其中抗坏血酸的存在会干扰紫外检测(即无标记nanoDSF和排阻色谱)。

4.8.1. 差示扫描荧光法

基于SYPRO 橙荧光发射的差示扫描荧光法(DSF)在 处进行监测(激发波长为 )，温度范围为 。实验在配备384孔板的LightCycler480仪器(德国上巴伐利亚州彭茨贝格市罗氏公司)上进行。将蛋白储备液在单独的TSA1或TSA3实验缓冲液中或添加了 的情况下(分别为TSA2或TSA4)稀释至最终浓度 。始终使用存在 和 的相同蛋白溶液作为对照。

4.8.2. 无标记纳米差示扫描荧光法

无标记纳米差示扫描荧光法实验在Prometheus NT.48仪器(德国慕尼黑市NanoTemper Technologies GmbH公司)上进行，该仪器配备了一个可并行测量48个样品的样品架。在单独的DSF1实验缓冲液中或添加了 (DSF2)或1 mM 2-酮戊二酸(DSF3)或两者(DSF4)的情况下，于 至 的温度范围内监测蛋白在330和 处(激发波长为 )的天然荧光比值。经过去磷酸化处理的FTO样品在单独的DSF5实验缓冲液中稀释至浓度 作为对照，或添加 的λ蛋白磷酸酶(DSF6)。始终使用存在 和 的相同蛋白溶液作为对照。

所有测量均根据信噪比重复进行2至4次。使用R 3.3.3软件，通过sm.spline函数 [51] 对实验数据进行分析。将信号一阶导数最大值的位置解释为热解折叠的中点温度 。

4.9. 微量热泳动法(MST)

按照制造商的方案，使用Nanotemper 染料NT-647-NHS(赖氨酸标记)对蛋白质进行标记，并利用其荧光监测热泳效应。每次标记使用1纳摩尔蛋白质( 的 溶液)和2.5纳摩尔染料。标记效率根据制造商的方案确定。仅使用标记效率在65 - 90%范围内的样品进行进一步实验，以确保在大多数情况下只有一个染料分子会附着在蛋白质上。标记后，将蛋白质转移到单独的实验缓冲液MST1中，或补充 (MST2)、1 mM 2-OG(MST3)或两者(MST4)。在配备允许并行测量16个置于毛细管中的样品的支架的Monolith NT.115 RED/BLUE设备(德国慕尼黑NanoTemper Technologies GmbH)上进行伪滴定实验。在室温下，于 监测染料的发射(通过LED激光在 激发)。根据标记效率，针对每个系统分别优化LED激光功率和MST功率。当配体结合导致荧光变化时，根据制造商的方案，使用“稳定荧光模式”而非热泳效应。

必须注意的是，在用荧光探针对FTO进行标记的过程中，其二聚体形式占主导地位，保护了二聚体界面处(推测为 、 和 )的赖氨酸残基不被修饰，因此标记蛋白质样品所测定的 值可被认为不受标记过程的干扰。

根据描述标记蛋白质的未结合形式和结合形式之间1:1平衡的标准双态模型，使用R 3.3.3软件[52]对数据进行分析[53]。

4.10. FTO氨基酸序列的计算机分析

对人类FTO的氨基酸序列进行分析，以确定可能影响FTO功能的调控元件，所使用的软件包括:ProSite(https://prosite.expasy.org/；于2021年2月1日访问)、PhosphoSitePlus(https://www.phosphosite.org/；于2021年2月2日访问)、MyHits(https://www.expasy.org/resources/myhits；于2021年2月3日访问)、蛋白质-配体相互作用分析器(https://projects.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip；于2021年2月4日访问)、COFACTOR(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/COFACTOR/；于2021年2月5日访问)和IonCom(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/IonCom/；于2021年2月8日访问)。

4.11. FTO磷酸化位点的鉴定

蛋白质样品进行标准的溶液内消化。纯化后的蛋白质用二硫苏糖醇(DTT，在 下为 )还原，用碘乙酰胺(在室温黑暗条件下反应15分钟)烷基化，然后用胰蛋白酶(测序级修饰胰蛋白酶 - Promega V5111)消化过夜。所得肽混合物通过液相色谱 - 串联质谱(LC-MS-MS/MS)进行分析，使用纳升高效液相色谱系统(Nano-Acquity LC system，美国沃特世公司，马萨诸塞州米尔福德)和轨道阱精英质谱仪(Thermo Electron Corp.，加利福尼亚州圣何塞)。对于磷酸化位点分析，样品分成两部分——约20%直接进行LC/MS用于标准肽鉴定，其余80%按照先前描述的方法[54]在二氧化钛上进行磷酸化肽富集。简要地说，肽在80%乙腈(ACN)、5%三氟乙酸(TFA)、1 M邻苯二甲酸中稀释，并与二氧化钛珠(GL Sciences，日本东京)孵育。非磷酸化肽用80% ACN、0.1% TFA洗去，然后通过用氢氧化铵碱化至pH 10.5最终洗脱磷酸化肽。

肽混合物以含0.1% TFA的水作为流动相应用于RP - 18预柱(纳升高效液相色谱对称C18 - Waters 186003514)，然后使用ACN梯度(在180分钟内从0% - 35%乙腈)在0.05%甲酸中以 的流速转移至纳升高效液相色谱RP - 18柱(纳升高效液相色谱BEH C18 - Waters 186003545)。柱出口直接连接到在数据依赖的MS到MS/MS切换模式下工作的质谱仪的离子源。每次分析前进行一次空白运行以确保无前一个样品的交叉污染。

采集的原始数据先用Mascot Distiller处理，然后用Mascot(Matrix Science，英国伦敦，现场许可证)针对UniProt数据库进行数据库搜索，限于人类序列。前体离子和产物离子质量容差的搜索参数分别为 和 ，酶特异性:半胰蛋白酶，允许的漏切位点:1，半胱氨酸的固定修饰为氨基甲酰甲基化，甲硫氨酸氧化以及丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化的可变修饰。Mascot得分超过Mascot计算的鉴定阈值的肽被认为是阳性鉴定。最后，所有鉴定为磷酸化的肽都进行人工检查。

4.12.FTO去磷酸化

蛋白质样品与含有 Lambda蛋白磷酸酶(#P0753S，美国新英格兰生物实验室，马萨诸塞州伊普斯威奇)的实验缓冲液DEP1混合至浓度为 ，终体积为 ，并在 下以600转/分钟振荡孵育 。

4.13. 氢 - 氘交换(HDX)

BESFTO样品( )在HDX1孵育缓冲液中单独或补充有 (HDX2)的情况下于 孵育 。然后将样品用HDX3反应缓冲液(在 中制备)稀释10倍。氢-氘交换在以下时间终止: 和 。通过用HDX4终止缓冲液将 降低至约2-3来终止交换，并且样品立即在液氮中冷冻。使用nanoACQUITY UPLC系统(美国马萨诸塞州米尔福德市沃特世公司)测定氢-氘交换的程度。在胰蛋白酶柱上进行初始蛋白质消化后，通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析样品。每个实验重复四次。使用DynamX HDX数据分析软件3.0(美国马萨诸塞州米尔福德市沃特世公司)分析数据。

4.14.凝胶过滤色谱法

蛋白质样品: 的 或 的 在最终体积为 的SEC1缓冲液中于 孵育 ，并加载到用SEC1缓冲液平衡和洗脱的SEC650柱上。使用NGC系统ChromLab (美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市伯乐公司)在215、260和280nm处监测洗脱液。通过相同方法分析用于校准的蛋白质标准品(#1511901，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市伯乐公司)。由于使用紫外线检测而非铁检测，我们使用了不需要抗坏血酸存在的锰。

4.15.小角X射线散射(SAXS)

BESFTO(26μM)在SAXS1缓冲液中孵育 ，然后加载到低噪声液体样品池中(法国格勒诺布尔市Xenocs公司)。使用XEUSS 2.0 SAXS/WAXS系统(法国格勒诺布尔市Xenocs公司)测量样品，该系统使用由MetalJet D2微聚焦发生器(瑞典基斯塔市Excillum AB公司)产生的X射线辐射(镓 发射的 )。对于每个样品，使用PILATUS3 1M探测器(瑞士巴登-戴特维尔市DECTRIS有限公司)记录5-10个独立的帧(每帧曝光时间600秒)。使用Foxtrot [55]对散射数据进行积分。使用SCATTER软件(http://www.bioisis.net/；于2020年2月1日访问)分析数据，并使用ATSAS软件包中的PRIMUS程序进行曲线拟合。使用ATSAS软件包中的GNOM程序[56]估计结构参数( Guinier半径Rg和p(r)半径Rg)。使用DAMMIN程序[57]生成低分辨率珠子模型。通过使用SymmDock服务器(http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/SymmDock/；于2020年2月1日访问)[58]生成的模型获得FTO同二聚体结构的集合。

5.结论

我们使用细菌和杆状病毒这两种不同的FTO表达系统，在 FTO蛋白中鉴定出三个磷酸化丝氨酸，均位于N端结构域。其中两个是已知的(S256和S260)，另一个是新鉴定的(S184)。我们无法明确确定这些磷酸化是否会影响FTO的催化活性；但模拟磷酸化的替代物S256D的活性明显降低。

我们证实了FTO通过其C端结构域二聚化的能力，并且二聚体解离常数足够低，足以使FTO在细胞中发生二聚化。

我们发现来自两种表达系统的FTO在生物物理性质上存在差异，尽管具有统计学意义，但差异太小，这表明它们可能在生物学上不相关。综上所述，对于仅涉及FTO蛋白的实验，两种表达系统可以互换使用。

补充材料:以下内容可在https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms22094512/s1上在线获取。

作者贡献:调查，M.M.、T.P.、D.G.、J.P.(扬·皮沃瓦尔斯基)、G.N.、M.T.、M.G.、M.W.-S.、J.D.、A.M.M.、K.P.和K.F.；方法学，M.M.、J.P.(扬·皮沃瓦尔斯基)、G.N.、M.T.、M.G.、M.K.、M.W.-S.、E.S.、J.D.和K.P.；可视化，M.M.、M.T.和M.G.；数据管理，M.M.、J.D.和K.P.；形式分析，M.M.和K.P.；撰写原始草案，M.M.、J.P.(雅罗斯瓦夫·波兹南斯基)和E.G.；撰写评审和编辑，T.P.、D.G.、D.M.、M.T.、M.K.、K.F.、J.P.(雅罗斯瓦夫·波兹南斯基)和E.G.；概念化，J.P.(雅罗斯瓦夫·波兹南斯基)和E.G.；监督，J.P.(雅罗斯瓦夫·波兹南斯基)和E.G.；项目管理，J.P.(雅罗斯瓦夫·波兹南斯基)、J.P.(扬·皮沃瓦尔斯基)和E.G.；资源，E.G.；资金获取，E.G.。所有作者都已阅读并同意发表的手稿版本。

资金:这项工作得到了波兰 - 挪威研究基金资助POL - NOR/196258/59/2013，以及波兰国家研究委员会(NCN)的资助，项目编号为UMO - 2017/25/B/NZ4/02668。

机构审查委员会声明:不适用。

知情同意声明:不适用。

数据可用性声明:本研究中提供的数据可应相应作者的要求提供。

致谢:我们感谢扬·弗龙克编辑手稿，以及阿恩·克伦格兰德(挪威奥斯陆大学医院)提供携带编码His标签的全长人FTO cDNA的质粒pET - 28a(+)。作者还感谢学生阿德里安娜·达布罗夫斯卡和米哈利娜·达尼尔协助进行一些实验。该设备部分由临床前研究与技术中心(CePT)赞助，CePT是一个由欧洲区域发展基金和波兰国家凝聚力战略创新经济共同赞助的项目。

利益冲突:作者声明无利益冲突。

缩写

2 - OG 2 - 氧代戊二酸

ACN 乙腈

ALKBH AlkB同源物

BES 杆状病毒表达系统

体重指数(BMI，Body mass index)

钙调蛋白(CaM，Calmodulin)

差示扫描荧光法(DSF，Differential Scanning Fluorimetry)

解离常数(Dissociation constant)

脂肪量和肥胖相关蛋白(FTO，FaT mass and Obesity-associated)

杆状病毒表达系统中表达的FTO蛋白(BESFTO，FTO protein expressed in baculovirus expression system)

大肠杆菌中表达的FTO蛋白(FTO protein expressed in E. coli)References

氢氘交换质谱联用(HDX-MS，Hydrogen-deuterium exchange monitored with MS)；易洛魁族同源异型域蛋白(IRX3，Iroquois-class homeodomain protein)；液相色谱-串联质谱联用(LC-MS-MS/MS，Liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry)；微量差示扫描荧光法(nanoDSF，Low-volume Differential Scanning Fluorimetry)；微量热泳动(MST，Microscale Thermophoresis)； -O-二甲基腺苷(-O-dimethyladenosine)； -甲基腺苷(-meA， -methyladenosine)；单核苷酸多态性(SNPs，Single Nucleotide Polymorphisms)

定点诱变(SDM，Site directed mutagenesis)；小角X射线散射(SAXS，Small-angle X-ray scattering)；富含脯氨酸和谷氨酰胺的剪接因子(SFPQ，Splicing factor proline and glutamine rich)；三氟乙酸(TFA，Trifluoroacetic acid)

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