HDAC3抑制通过免疫调节改善脊髓损伤
发布时间：
2025-08-08 21:10
《科学报告》更正:作者更正 开放
HDAC3抑制通过免疫调节改善脊髓损伤
久保山智春 ，沙拉卡·瓦哈内 ，黄勇 ，周翔 ，杰米·K·王 ，安德鲁·凯梅特 - 考克斯 ，迈克尔·马蒂尼 ，罗兰·H·弗里德尔 与邹红艳
脊髓损伤(SCI)后，小胶质细胞和浸润性巨噬细胞的固有免疫反应清除细胞碎片并促进组织修复，但也会因炎症反应造成继发性损伤。旨在最大化固有免疫有益作用同时最小化其有害作用的免疫调节可能有助于SCI后的功能恢复。然而，对于固有免疫细胞中炎症基因网络全局重编程的细胞内驱动因素了解甚少。在这里，我们表明SCI导致损伤部位固有免疫细胞中组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)上调。值得注意的是，用选择性小分子抑制剂阻断HDAC3会使小胶质细胞/巨噬细胞反应转向炎症抑制，从而在SCI模型中产生神经保护表型并改善功能恢复。从机制上讲，HDAC3活性在很大程度上负责原代小胶质细胞对经典炎症刺激的组蛋白去乙酰化和炎症反应。我们的结果揭示了HDAC3抑制剂在通过抑制炎症细胞因子促进SCI后功能恢复方面的新功能，从而为SCI修复的免疫调节指明了新方向。
成年哺乳动物神经元在中枢神经系统损伤后功能恢复面临多种障碍。早期研究主要集中在髓磷脂碎片和星形胶质瘢痕的抑制分子 ；对于构成神经修复另一障碍的炎症免疫反应了解较少。脊髓损伤(SCI)引发多相免疫反应。损伤后不久，驻留的小胶质细胞被激活，而血源性单核细胞开始浸润损伤部位并分化为吞噬性巨噬细胞，从形态和细胞表面标志物来看，它们与激活的小胶质细胞基本无法区分 。它们共同构成清除细胞碎片的固有免疫 ，但也会释放炎症细胞因子、蛋白酶和自由基来加剧继发性损伤 。因此，小胶质细胞/巨噬细胞在SCI修复中起双重作用 。
巨噬细胞激活的一个普遍概念是所谓的沿M1(促炎)和M2(抗炎)谱系的巨噬细胞极化，这有助于简化损伤后固有免疫反应不同功能的概念化。M1/M2模型最初是基于将分离的巨噬细胞暴露于纯化刺激的体外研究而开发的:M1表型由经典炎症细胞因子干扰素 (IFN )与脂多糖(LPS，Toll样受体的激活剂)共同诱导；而M2表型由Th2细胞因子如白细胞介素4(IL - 4)和IL - 13诱导。然而，越来越多的证据表明M1/M2极化模型与巨噬细胞的体内功能脱节 。例如，最近的研究发现在SCI和创伤性脑损伤中诱导了M1和M2相关基因的组合 。此外，单细胞RNA测序分析表明，小胶质细胞在单细胞中经常同时共表达M1和M2的经典标志物，或者两者都不表达，并且极化标志物的表达并不能预测其他极化基因的表达 。因此，特定中枢神经系统损伤情况下小胶质细胞/巨噬细胞的体内基因特征仍有待阐明。相比之下，中枢神经系统损伤后控制小胶质细胞/巨噬细胞各种反应状态的背景因素越来越受到关注。例如，SCI后，经典炎症细胞因子IFN 上调，而Th2细胞因子IL - 4和IL - 13的水平仍然较低 。然而，对于负责调节SCI后小胶质细胞/巨噬细胞不同激活状态的不同基因网络以响应特定背景刺激的转录机制了解甚少。
收到日期:2016年11月21日
录用日期:2017年7月13日
在线发表时间:2017年8月17日
不同细胞类型的转录特征由独特的染色质景观塑造。由于巨噬细胞激活与基因表达的全局重编程相关，表观遗传因子调节的染色质结构改变将为转录因子以协调方式进入大量基因组位点奠定基础。与此观点一致，组蛋白乙酰化已被认为参与巨噬细胞反应的调节 。组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的相反活性调节。在四类HDACs中，I类HDACs(1、2、3和8)主要是核酶，在特定基因组位点作为转录共抑制因子起作用 。主要负责调节脊髓损伤后免疫反应的特定HDAC亚型尚不清楚。在这里，我们发现脊髓损伤后先天免疫细胞中HDAC3强烈上调。重要的是，给予特异性靶向HDAC3的小分子抑制剂RGFP966导致损伤环境中炎性细胞因子的全局抑制，从而产生神经保护表型并改善脊髓损伤后的功能恢复。
结果
脊髓损伤后，小胶质细胞/巨噬细胞会上调组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)。我们首先通过免疫组织化学(IHC)检测了脊髓损伤后I类组蛋白去乙酰化酶的表达动态。在两种已定义的脊髓损伤体内模型——背柱横断和挫伤损伤中，我们发现在损伤后7天(dpi)损伤中心HDAC3有强烈诱导(图1a和补充图1)。相比之下，HDAC2和8在损伤边界上调更为明显，而HDAC1在损伤核心和损伤周边(包括轴突束)均有诱导(补充图1)。时间分析表明，HDAC3上调在 时可检测到，在 时达到峰值，并在14天和 时持续但略有下降(图1b)。当与CD11b(中枢神经系统中小胶质细胞和单核细胞衍生的炎性巨噬细胞的细胞表面标志物)叠加时，只有HDAC3，而没有其他I类组蛋白去乙酰化酶在CD11b 细胞的细胞核中显著上调(图1c、d)。因此，脊髓损伤后不同的I类组蛋白去乙酰化酶在不同细胞类型中似乎受到不同的调节。HDAC3和Iba1(另一种已确立的活化小胶质细胞和巨噬细胞标志物)的共免疫染色证实了先天性免疫细胞中HDAC3的诱导，损伤部位的大多数Iba1 细胞显示出突出的核HDAC3免疫信号，类似于CD11b 细胞中的情况(图1c)。
脊髓损伤(SCI)后，CD11b 和Iba1 免疫细胞中HDAC3的核蓄积增加，这引发了一种诱人的可能性，即它可能作为脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞炎症反应的表观遗传调节因子发挥作用。我们用不同激活状态的巨噬细胞的著名细胞表面标志物进行了共免疫染色:用CD16/32来识别炎症状态的巨噬细胞，用CD206来识别抗炎/促修复状态的巨噬细胞 。免疫组化显示，HDAC3的诱导在CD16/32 巨噬细胞中比在CD206 巨噬细胞中更显著:在背柱横断术后7天，与 细胞的 相比，在接近 细胞的 中发现了核HDAC3表达(p = 0.024，参数裂区方差分析，图2a、b)。不同亚群中HDAC3诱导程度的差异不仅表明脊髓损伤中，小胶质细胞/巨噬细胞对激活刺激的反应存在异质性，还可能反映了先天免疫反应的动态过程，即巨噬细胞不断涌入，在不断变化的损伤微环境中的不同时间点到达并定居在不同的生态位。
先前的全基因组分析表明，HDAC3在靶基因处作为转录抑制复合物的一部分发挥作用，从组蛋白3赖氨酸9(H3K9Ac) 上去除乙酰基部分。因此，我们通过免疫组化比较了损伤部位不同小胶质细胞/巨噬细胞亚群中组蛋白乙酰化的整体水平。我们发现，CD16/32 免疫细胞中组蛋白H3和H4的乙酰化水平(AcH3和AcH4)低于CD206 细胞(图2c、d)。因此，在脊髓损伤的先天免疫反应中，炎症性CD16/32 细胞中HDAC3的上调与该亚群中组蛋白乙酰化的整体减少相关。
HDAC3抑制导致整体炎症抑制。为了直接验证HDAC3可能是脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞炎症反应驱动因素的假设(图3a)，我们利用了一种高度选择性的HDAC3抑制剂RGFP966，它对其他HDACs表现出 倍的选择性 。值得注意的是，RGFP966可以穿透血脑屏障(BBB)并在中枢神经系统(CNS) 中有效分布。在T8挫伤损伤后2、24和48小时，通过三次腹腔注射(i.p.)给动物施用RGFP966或赋形剂(图3b)。一项早期的药代动力学研究表明，腹腔注射后15分钟在中枢神经系统中观察到RGFP966的最大药物浓度，达到 的HDAC3 值的约110倍，并且在注射后 ，药物水平持续保持在HDAC3 值的8倍以上 。
我们首先证实了RGFP966对脊髓损伤(SCI)后组蛋白乙酰化整体水平的体内作用。我们在一个早期时间点 检查脊髓，以评估在横断性脊髓损伤后2、24和 给予RGFP966的即时作用。实际上，在接受RGFP966治疗的动物中，损伤部位的整体H3乙酰化水平高于对照组(图2c、d)，这与之前关于RGFP966有效穿透中枢神经系统的药代动力学数据以及已知的HDAC3 酶功能一致。为了聚焦于免疫细胞，我们在一个报告基因系INTACT(特定细胞类型中标记细胞核的分离)中测试了RGFP966对整体组蛋白乙酰化的作用，该系统能够实现Cre依赖的GFP标记核膜蛋白Sun- 的条件性表达(补充图2)。将INTACT小鼠与他莫昔芬诱导的、髓系特异性的Cx3cr1-CreER系 杂交。为了在损伤部位视觉识别先天免疫细胞，我们在脊髓损伤前3天和1天给予他莫昔芬以标记小胶质细胞和浸润的巨噬细胞(补充图2)。免疫组化图像和定量分析表明，RGFP966治疗导致 免疫细胞中平均H3乙酰化水平升高( ，曼-惠特尼检验，补充图2)。在脊髓损伤后10天，接受RGFP966治疗的Iba1 细胞中平均H3乙酰化水平持续呈上升趋势(补充图2)。值得注意的是，单个Ibal 细胞中的H3乙酰化水平存在异质性，这反映了多相免疫反应过程中巨噬细胞亚群的多样性。
图1. 脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞中HDAC3的上调。(a)代表性矢状面免疫组化图像和定量分析表明，在T8背柱横断(SCI-T)损伤后7天，损伤中心HDAC3(绿色)上调。DAPI核复染突出了损伤核心处细胞增多的情况。右侧显示了方框区域的放大图像。右侧显示了损伤部位HDAC3+细胞数量的定量分析:*p = 0.015，参数化狭缝图方差分析。检查了3对小鼠，每只动物定量分析3张代表性图像。(b)与假手术组相比，SCI-T后不同时间点HDAC3的代表性免疫组化图像。(c)共免疫标记的代表性免疫荧光图像显示，SCI-T后7天，损伤部位HDAC3+细胞(绿色)与CD11b+或Iba1+免疫细胞(红色)有大量重叠。右侧显示了方框区域的放大图像。(d) SCI-T后7天CD11b(红色)和不同I类HDAC(绿色)的免疫组化图像。未检测到这些HDAC与CD11b之间有明显重叠。方向:R:头侧，C:尾侧，D:背侧，V:腹侧。比例尺:
图2. HDAC3的上调与组蛋白乙酰化水平降低相关。(a, b) T8脊髓背柱横断(SCI-T)术后7天，损伤中心细胞表面标志物(红色)和HDAC3(绿色)共免疫标记的代表性图像及定量分析。下方展示了方框区域(i和ii)的放大图像。箭头指向细胞核HDAC3免疫反应性。*p = 0.024，参数化裂区方差分析，n = 3对小鼠，每只动物有三张代表性图像。(c, d) 共免疫标记的代表性图像及定量分析表明，CD206 + 巨噬细胞(红色)比CD16/32 + 巨噬细胞(红色)显示出更高水平的AcH3(绿色)，以及更高水平的AcH4(d)。对于AcH3水平，对来自3只动物的3029个CD16/32 + 细胞和6245个CD206 + 细胞进行了定量分析，每只动物有3张图像。对于AcH4，对来自3只动物的1687个CD16/32 + 细胞和2305个CD206 + 细胞进行了定量分析，每只动物有3张图像。**p ，曼-惠特尼检验。方向:R:头侧，C:尾侧，D:背侧，V:腹侧。比例尺: (a)， (插图i和ii)， (c)。
图3. HDAC3抑制改变先天免疫细胞的功能状态并导致脊髓损伤中全身炎症抑制。(a) 不同巨噬细胞反应的示意图及HDAC3的假定作用。M0:稳态巨噬细胞。(b) 脊髓损伤后HDAC3抑制剂治疗的实验方案。腹腔注射三次RGFP966。(c, d) 代表性免疫组化图像显示，T8脊髓背柱横断(SCI-T)术后 用RPGF966治疗后损伤部位AcH3水平升高。方框区域的放大图像见(d)。(e, f) 挫伤性损伤(SCI-C)后10天，损伤部位CD16/32免疫细胞(绿色)、CD206免疫细胞(红色)数量及两个亚群比例的代表性免疫荧光图像及定量分析。DAPI用于细胞核复染。箭头:双阳性细胞示例 。每组n 只小鼠，每只动物平均2 - 4张代表性图像。*p ，非配对学生t检验。(g) 挫伤性脊髓损伤后 ，使用来自溶剂对照组或RFGP966处理组动物的损伤脊髓裂解物通过细胞因子阵列测定的相对细胞因子/趋化因子水平。***p < 0.001，双向方差分析并进行Bonferroni事后校正(n = 4对小鼠)。方向:R:头侧，C:尾侧，D:背侧，V:腹侧。比例尺: ，和 。
然后，我们在 时间点进一步检查了脊髓，该时间点代表脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞吞噬活性的峰值。我们首先测试了RGFP966抑制HDAC3活性是否会导致脊髓损伤后巨噬细胞流入改变和先天免疫细胞增殖。我们比较了损伤部位 和 免疫细胞的数量和空间分布，但在横断或挫伤性脊髓损伤模型中，未发现载体处理组和RGFP966处理组之间有明显差异(补充图3)。这表明常驻小胶质细胞的增殖和单核细胞衍生巨噬细胞的流入并未受到HDAC3抑制的显著影响。接下来，我们通过共标记CD16/32和CD206来比较小胶质细胞/巨噬细胞亚群。在受损脊髓组织中存在一个显著的双阳性(CD16/32 CD206 )群体(图3e)，这与单细胞RNA测序分析结果一致，该分析显示创伤性中枢神经系统损伤后大脑巨噬细胞中同时表达M1和M2样特征 。随后，我们关注仅表达单一标志物的免疫细胞。我们发现，与对照组相比，RGFP966处理的动物在脊髓挫伤后10天损伤部位的CD CD 细胞数量显著减少(p = 0.025，图31)。相比之下，RGFP966组中CD200 CD10/32细胞数量有增加趋势(p )。因此，RGFP966抑制HDAC3导致损伤部位CD 细胞与CD 细胞的比例增加 。在背柱横断性脊髓损伤模型中，用RGFP966处理也观察到小胶质细胞/巨噬细胞两个亚群的数量和比例有类似变化(补充图3)，表明RGFP966在影响不同脊髓损伤模型中小胶质细胞/巨噬细胞反应方面具有广泛的有效性。
为了进一步测试HDAC3抑制可能改变损伤部位炎症环境的模型，我们使用细胞因子/趋化因子抗体阵列比较了脊髓组织中的细胞因子水平。令人惊讶的是，脊髓损伤后用RGFP966抑制HDAC3，在挫伤损伤后 检查时，导致细胞因子、趋化因子和急性期蛋白广泛受到抑制。具体而言，在测量的39种蛋白质中，有32种在RGFP966处理组中的水平降低(p < 0.001，双向方差分析)(图3g)，包括经典炎症细胞因子如肿瘤坏死因子 和干扰素 。四种细胞因子(IL-16、IL-12p70、IL-1β和IL-6)在两组之间未显示出可检测到的变化，而只有两种细胞因子，即IL-1ra(白细胞介素-1受体拮抗剂)和IL-1β，在RGFP966处理的动物中相对于对照组有适度增加。值得注意的是，IL-1ra是IL- 促炎作用的天然抑制剂。同样值得注意的是，许多与M2样表型相关的细胞因子/趋化因子，如IL-4、10和13，也受到抑制，这表明HDAC3抑制导致广泛的炎症抑制，不同于两种极化状态之间的简单转变。我们的结果进一步呼应了当前的观点，即不再遵循M1/M2极化的原则来表征小胶质细胞/巨噬细胞在体内的多种功能状态。
抑制组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)可改善脊髓损伤(SCI)后的功能恢复。由于小胶质细胞/巨噬细胞可发挥促修复功能 ，因此我们接下来通过行为学检测评估HDAC3抑制对挫伤性SCI模型功能恢复的影响。在SCI后2小时、24小时和48小时给予RGFP966，并每天使用巴索小鼠评分(BMS) 和富山小鼠评分(TMS) 测量运动功能恢复情况。0至8分的BMS评分可衡量后肢运动功能恢复情况，3分代表动物能够支撑自身体重的阈值，超过3分主要反映步频和协调性的改善。TMS是一种改良的评分系统，侧重于后肢身体躯干支撑。TMS考虑了踝关节运动以及膝关节、大腿和脚趾的运动，而这些在BMS中未被观察到。相对于BMS，TMS的变异性更低且敏感性更高 。
在损伤后第1天(dpi)，接受RGFP966和赋形剂处理的SCI动物的BMS和TMS评分均较低，证实损伤程度相似(图4a)。随后，通过BMS和TMS评分，与赋形剂处理组相比，接受RGFP966处理的动物后肢运动功能恢复情况有所改善(p < 0.001，双向方差分析，图4a)。具体而言，在7 dpi时，接受RGFP966处理组的小鼠开始通过BMS评分显示后肢功能改善。在三项独立的队列研究中独立证实了RGFP966治疗对功能恢复的改善作用 (补充图4)。RGFP966的作用在30 dpi时持续存在，RGFP966组的BMS评分达到3至4分(承重)，而对照组的BMS评分仍低于2分(图4a)。未观察到RGFP966对动物健康(包括体重)有明显不良影响(补充图4)。值得注意的是，在本研究中，我们使用了相对严重的挫伤性SCI模型，导致BMS评分较低，这使我们无法通过网格行走或足迹测试来评估功能恢复情况。未来使用较轻挫伤模型的研究将有助于进一步评估RGFP966的疗效。
为了进一步研究RGFP966对SCI恢复有益作用的基础，我们通过比较挫伤性损伤后损伤核心区轴突纤维数量，评估HDAC3抑制的潜在神经保护表型。在SCI时 ，接受RGFP966处理的动物在损伤中心显示出比对照小鼠更高密度的神经丝(NF)- 轴突纤维，这一发现可能反映了轴突的保留而非新生轴突的生长。小胶质细胞/巨噬细胞也可影响成纤维细胞和神经胶质细胞的功能状态，例如通过基质降解酶MMP-13的表达调节瘢痕组成中的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG) 。因此，我们比较了损伤部位纤维胶质瘢痕的大小和组成。我们发现，在接受RGFP966处理的组中，CSPG表达式减少 (曼-惠特尼检验) ，而纤连蛋白水平的变化似乎较小，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)水平基本保持不变(图4c、d)。两个队列之间星形胶质瘢痕的相对大小也相当(图4e)。值得注意的是，通过这些测量方法，挫伤性损伤导致纤维胶质瘢痕存在很大变异性，从而影响统计值。
为了进一步了解RGFP966广泛抑制细胞因子谱的基础，我们研究了HDAC3抑制是否会影响炎症基因的转录。对脊髓损伤后不同时间点的全脊髓组织裂解物进行qRT-PCR分析，未发现两组之间有一致的变化，这可能反映了损伤部位细胞类型的多样性。为了特异性地探究损伤脊髓中的小胶质细胞/巨噬细胞群体，我们使用Cx3cr1-CreER; INTACT小鼠来标记巨噬细胞和小胶质细胞的细胞核。值得注意的是，小胶质细胞是一个自我更新的群体，更新速度较慢 ，而单核细胞和巨噬细胞的更新速度较快，并且不断由不表达 的骨髓前体细胞补充。为了我们的研究目的，我们在损伤周围期给予他莫昔芬以标记小胶质细胞和浸润的巨噬细胞(补充图5)。对从亲和纯化的 细胞核中提取的核RNA进行qRT-PCR，证实了小胶质细胞/巨噬细胞的富集(补充图5)。通过转录谱分析，我们发现HDAC3抑制导致免疫相关基因的广泛抑制(p < 0.01，双向方差分析，补充图5)。与细胞因子/趋化因子抗体阵列数据一致，与M1状态(如iNOS、Ciita(MHCII))和M2状态(Cd163、Arg1、Vim)相关的基因表达均出现抑制，进一步支持了广泛的炎症抑制。细胞表面标志物的表达总体上与免疫组化结果一致:例如，Itgam(CD11b)转录水平在RGFP966处理后未发生变化，这与两组损伤部位 免疫细胞丰度相等一致(见补充图3)。此外，与免疫组化结果一致，Fcgr2b(CD32)的转录水平降低，而 mRNA水平在RGFP966处理后未发生明显改变(补充图5)。
图4. HDAC3抑制改善脊髓损伤后的功能恢复并增强神经保护表型。(a) 行为学分析表明，在挫伤性损伤后长达30 dpi，BMS和TMS评分均显示功能恢复得到改善且持续。BMS评分中的蓝线表示负重阈值。重复测量，采用Bonferroni事后校正的双向方差分析。 代表载体组， 代表RGFP966组。(b) 代表性图像和定量分析显示，在挫伤性损伤(SCI-C)后10 dpi，损伤中心轴突纤维密度增加，通过NF-H免疫标记(绿色)鉴定。损伤边界用虚线表示。DAPI用于细胞核复染。下方显示了方框区域的放大图像。 只小鼠用于载体组，4只小鼠用于RGFP966组，每只动物平均有1 - 4张代表性图像。**p < 0.01，未配对学生t检验。(c - e) 挫伤后 脊髓损伤瘢痕成分的代表性图像和定量分析:CSPG(蓝色)、GFAP(红色)和纤连蛋白(绿色)。损伤边界用虚线表示。柱状图内显示了定量分析的动物数量，每只动物平均有2 - 5张代表性图像。定量分析显示，RGFP966处理后CSPG减少， ，曼-惠特尼检验，但GFAP无显著变化，纤连蛋白有减少趋势(未配对学生t检验)。星形胶质瘢痕大小也无显著变化(未配对学生t检验)。比例尺: ( 中的i和ii)，以及 (c)。
图5. HDAC3抑制不影响轴突生长潜能。(a) 剂量反应神经突生长试验表明，用RGFP966处理培养的背根神经节 (DRG) 神经元 ，最长轴突的平均长度并未增加。 ，Kruskal-Walis检验。(b, c) 体内RGFP966处理后进行DRG培养的示意图 (b)。两组之间的平均轴突长度未观察到显著变化 (c)。非配对学生t检验。n.s. 无统计学意义。每个柱状图内显示了定量的DRG神经元数量。
HDAC3活性并不直接影响DRG神经元的轴突生长潜能。我们接下来想要解决的问题是，在RGFP966处理组的损伤部位轴突密度增加是否可能源于对神经元轴突生长的直接影响。我们首先用半纯化的成年DRG神经元进行了体外神经突生长试验，但未发现证据表明，暴露于剂量不断增加的RGFP966 会使轴突长度增加 (图5a)。事实上，在最高剂量 时，暴露于RGFP966会导致神经突长度有轻微下降趋势 (图5a)。我们还对从接受RGFP966或赋形剂注射的动物中分离出的成年DRG神经元进行了进一步的神经突生长试验。同样，体内RGFP966处理并未显著增加轴突长度 (图5b, c)。综上所述，我们的结果表明，脊髓损伤后HDAC3抑制的再生作用不太可能源于对神经元轴突生长潜能的直接作用。
HDAC3活性在炎症刺激下调节原代小胶质细胞中的组蛋白去乙酰化。接下来，我们探究了HDAC3抑制对小胶质细胞对经典炎症刺激反应的影响。将原代小胶质细胞培养至相对纯的状态，然后用脂多糖 (LPS) 或白细胞介素-4 (IL-4) 刺激以诱导不同的表型。首先，我们发现LPS刺激导致AcH3的整体水平降低，在暴露于LPS后 明显可见 (图6a - c)，这表明对LPS的反应中组蛋白迅速去乙酰化。然而，预先暴露于RGFP966可逆转这些变化 (图6a - c)。有趣的是，预先暴露于RGFP966时，LPS会使平均AcH3免疫强度略有增加；可以想象，LPS刺激可能同时增加了HDAC3和组蛋白乙酰转移酶 (HAT) 的活性，后者在HDAC3抑制时被揭示出来，导致AcH3水平升高。
接下来，我们发现RGFP966确实改变了小胶质细胞对脂多糖(LPS)刺激的炎症反应。具体而言，在溶剂对照组中，LPS刺激导致CD206 iNOS 细胞减少(表明抗炎反应) ，以及 群体增加的趋势(表明炎症表型)(p ，图6d - f)。预先暴露于RGFP966可逆转LPS刺激后的这些变化，导致CD206 iNOS 群体增加(p )，iNOS CD206 群体减少(p ，图6d - f)。与乙酰化组蛋白H3(AcH3)的研究结果类似，RGFP966逆转LPS诱导变化的现象可能意味着LPS同时诱导了HDAC3和组蛋白乙酰转移酶(HAT)的活性，而后者在HDAC3受到抑制时得以显现。同样值得注意的是，高达20%的小胶质细胞共表达iNOS和CD206(图6e)，这表明这些典型的极化标志物并非特定激活状态所独有。总之，我们的数据直接支持了HDAC3在调节组蛋白去乙酰化过程中的核心作用，而组蛋白去乙酰化能够使小胶质细胞发生LPS诱导的炎症激活。RGFP966并未进一步增强白细胞介素 - 4(IL - 4)诱导的CD206表达(数据未显示)，这可能是由于IL - 4刺激已经抑制了HDAC3的活性。为了进一步确定HDAC3是介导炎症性小胶质细胞激活的主要HDAC亚型，我们在原代小胶质细胞中通过小干扰RNA(siRNA)敲低HDAC3，结果导致超过50%的细胞显示出HDAC3敲低(图6g - h)。相对细胞表面标志物表达显示，HDAC3的siRNA抑制了原代小胶质细胞LPS诱导的炎症激活(图6i)。
图6. HDAC3活性促成小胶质细胞的炎症激活。(a - c)实验方案、免疫细胞化学代表性图像及定量分析表明，LPS刺激导致原代小胶质细胞中AcH3水平降低 。预先暴露于RGFP966可逆转LPS引发的AcH3降低。柱状图内的数字表示每个实验条件下从九张照片中定量的细胞数量。曼 - 惠特尼检验。**p = 0.0079，***p < 0.001。(d - f)实验方案、免疫细胞化学代表性图像及定量分析表明，LPS刺激减少了CD206+群体(绿色)，并使iNOS+群体(红色)有增加趋势。RGFP966预处理逆转了LPS诱导的偏差，导致CD206+群体增加，iNOS+群体减少。用4′,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚(DAPI)进行核复染。箭头:双阳性(iNOS+ CD206+)细胞示例。柱状图内的数字表示定量的图像数量。分别为曼 - 惠特尼检验和非配对学生t检验。(g - i)实验方案及定量分析表明在原代小胶质细胞中通过siRNA敲低HDAC3(非配对学生t检验)。HDAC3敲低消除了小胶质细胞对LPS刺激的极化反应。柱状图内的数字表示通过曼 - 惠特尼检验定量的图像数量。标尺: (a)和 (e)。
讨论
脊髓损伤(SCI)后的再生失败既归因于成熟中枢神经系统(CNS)神经元内在轴突生长潜力的减弱，也归因于富含髓磷脂相关抑制分子的不利环境，这种环境阻碍了修复进程。解决内在或外在障碍都仅带来了有限的功能恢复，因此需要基于不同机制的新策略。在这里，我们首次揭示了SCI后HDAC3介导的小胶质细胞/巨噬细胞中炎症基因网络的表观遗传调控。我们证明，通过选择性抑制剂RGFP966抑制HDAC3活性，能够在损伤环境中抑制炎症，从而实现神经元保护/轴突保存，并改善SCI后的功能恢复。
环境因素是中枢神经系统损伤后小胶质细胞/巨噬细胞呈现多种反应状态的驱动力。在脊髓损伤(SCI)后，经典炎性细胞因子IFNγ占主导地位，超过Th2细胞因子IL-4和IL-13 ，小胶质细胞和巨噬细胞表现出持续的炎症反应，导致继发性损伤、神经毒性和轴突再生受损 。相比之下，抑制HDAC3导致IFN 和TNF 减少，以及对其他细胞因子/趋化因子/急性期蛋白的广泛抑制，从而改变先天免疫功能，有利于脊髓损伤后的组织修复。
HDAC3抑制在脊髓损伤情况下导致对炎症和急性期反应广泛抑制的确切机制仍有待确定。在中枢神经系统以外的损伤模型中，HDAC3已被证明是炎症相关基因程序的表观遗传调节因子 。缺乏HDAC3的巨噬细胞对IL-4高度敏感，但对IFN 刺激 的反应较弱。这与我们的研究结果一致，即培养的原代小胶质细胞在抑制HDAC3后对LPS刺激的炎症激活不再有反应。未来的研究需要确定小胶质细胞/巨噬细胞中受HDAC3直接调控的特定基因位点，特别是炎症基因上的残基特异性组蛋白乙酰化，如H3K9ac(标记活跃转录基因的启动子)和H3K27ac(标记功能上参与基因转录的增强子)。RGFP966也可能影响其他神经细胞类型的功能。此外，尽管早期的药代动力学研究表明RGFP966有足够的血脑屏障穿透性 ，但RGFP966在中枢神经系统中对HDAC3的体内疗效和特异性仍需进一步验证。使用基于免疫沉淀的荧光HDAC3活性测定法，我们在单次注射RGFP966(10mg/kg，腹腔注射)1小时后检测到脑组织中HDAC3活性抑制高达50%；然而，HDAC3存在于包括其他HDAC在内的大蛋白复合物中，而且，RGFP966是HDAC3的竞争性、可逆抑制剂，这可能会限制基于免疫沉淀测定法的检测灵敏度。未来使用小胶质细胞和巨噬细胞中HDAC3条件性敲除的研究将提供遗传学证据，并阐明HDAC3在脊髓损伤背景下的细胞类型特异性功能。此外，小胶质细胞和外周来源的巨噬细胞可能发挥略有不同的功能。最近的研究表明它们有不同的空间分布，脊髓损伤( )后小胶质细胞围绕损伤中心，巨噬细胞集中在损伤核心。HDAC3在这两种细胞群体中是否发挥不同作用有待未来研究。
据推测，与非中枢神经系统损伤不同，脊髓损伤后先天免疫反应的一个主要有害方面是持续的炎症表型，不会向促修复状态转变。在我们目前的研究中，RGFP966在脊髓损伤后的急性期给药；因此，小胶质细胞和巨噬细胞从早期时间点就暴露于RGFP966，从而从损伤后一开始就影响损伤环境。损伤环境的早期变化可能会影响后期免疫细胞的功能状态，即使RGFP966浓度可能已经下降。在未来的研究中确定后期抑制HDAC3是否会在已建立的损伤部位导致局部细胞因子谱的类似变化将非常有趣。同样值得注意的是，脊髓损伤导致血脑屏障(BBB)破坏，与未损伤的中枢神经系统组织相比，这可能会促进损伤部位RGFP966浓度升高。同样值得注意的是，在多相免疫反应过程中，损伤环境具有高度动态性，免疫细胞群体不断变化，细胞因子谱也在变化。例如，早期研究表明，脊髓损伤后1至第14天，CD16/32 巨噬细胞数量增加，达到巨噬细胞总数的 ，而 细胞的比例在巨噬细胞总数的 时达到峰值，并在 时下降到 。因此，浸润的巨噬细胞根据其到达时间和在损伤微环境中特定位置的定居情况处于各种反应状态。
全面抑制炎症和急性期反应对细胞及行为结果的影响，其全部含义仍需进一步阐明。小胶质细胞/巨噬细胞的促修复功能可能是多因素的，包括通过分泌基质金属蛋白酶(MMP )减少瘢痕形成、通过促进少突胶质细胞分化( )增加髓鞘再生，或产生神经营养作用( )。此外，巨噬细胞还可能通过分泌促进生长的因子或减少诸如硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)等抑制性分子来促进轴突再生/出芽。值得探讨的是，在本研究中，在损伤中心轴突密度增加是在脊髓损伤(SCI)后相对较早的时间点，即10天损伤后(dpi)观察到的，因此这可能反映的是组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)抑制的神经保护作用，而不是轴突的从头再生本身作用。这一点得到了进一步支持，即改善的Basso小鼠运动评分(BMS)在 时就已经很明显，而此时新再生的纤维不太可能已经到达靶点并整合到神经回路中。事实上，神经元保护和轴突保存/出芽可能主要影响局部中间神经元，这可以诱导微回路重建并改善功能恢复( )。此外，确定在HDAC3抑制情况下小胶质细胞/巨噬细胞分泌的关键神经调节因子将进一步阐明这一问题。我们的结果扩展了HDAC3在介导组织稳态和疾病进展方面的关键功能( )。当前研究聚焦于HDAC3的组蛋白去乙酰化酶功能。组蛋白去乙酰化酶(HDACs)也可以使非组蛋白靶点去乙酰化并发挥非酶依赖性作用( )，因此可以想象，HDAC3抑制所观察到的一些效应可能独立于组蛋白去乙酰化作用。
我们的数据还突出了M1/M2极化模型与中枢神经系统损伤后先天免疫细胞的体内基因特征和功能状态之间新出现的脱节。在损伤的脊髓中，我们发现单个细胞中CD16/32和CD206的同时表达经常被检测到。同样，培养的小胶质细胞中含有高达 的诱导型一氧化氮合酶(iNOS) 双阳性细胞。因此，这些典型的极化标志物并非特定激活状态所独有，因此对先天免疫细胞不同功能状态的概念化需要彻底更新。
免疫调节可以与增强内在轴突生长潜力的策略相结合，以在脊髓损伤中实现最佳功能恢复。在这种情况下，值得一提的是，我们之前研究揭示了MS275(一种HDAC1抑制剂)对通过整体提高乙酰化组蛋白H4(AcH4)水平和诱导多个再生相关基因(RAGs) 来增强背根神经节(DRG)神经元内在再生能力的促进作用。有趣的是，不同的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)可能在脊髓损伤的不同细胞类型中发挥不同的功能。因此，对特定HDAC亚型的联合调控可能以细胞类型特异性的方式导致有利的染色质状态，从而在脊髓损伤后实现最大功能恢复。
材料与方法
脊髓损伤。所有动物实验均按照西奈山伊坎医学院机构动物护理与使用委员会批准的指南和方案进行，并获得批准。选用5至7周龄的C57BL/6J雌性小鼠(杰克逊实验室)建立脊髓损伤模型。对于背柱横断模型，在T8椎板切除术后，如前所述，使用虹膜显微剪刀(精细科学工具公司)双侧横断背柱 。对于挫伤损伤，在T8椎板切除术后，使用无限视野撞击器(IH - 0400，精密系统与仪器公司)施加 的力。RGFP966(10毫克/千克，赛莱默公司)或赋形剂按所述 配制，并在脊髓损伤后2小时、24小时和48小时通过腹腔注射给药。使用西格玛公司(产品目录编号EP1013)和BPS生物科学公司(产品目录编号50073)的试剂盒进行荧光法HDAC3活性测定。在挫伤损伤后，每天以盲法通过巴索小鼠评分(BMS)(0 - 8分) 和远山小鼠评分(TMS)(0 - 30分) 测量每个后肢的运动功能。一只小鼠在损伤后1天的BMS评分为3分，因此被排除；而其余小鼠在挫伤损伤后的BMS评分均在0 - 2分之间。在手术后的第一周，所有动物每天接受皮下注射 的生理盐水、 的拜有利和 的丁丙诺啡。
免疫组织化学。脊髓用4%多聚甲醛(PFA)固定，在 蔗糖中进行冷冻保护，包埋于OCT中，并矢状切片 。切片用0.3% Triton - X - PBS中的5%正常驴血清或5%正常山羊血清封闭，并针对CD11b(1:300，MBS420973，MyBioSource公司，或1:500，14 - 0112，Affymetrix公司)、Ibal(1:150，NB100 - 1028，Novus公司)、组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1，1:500，ab19845，Abcam公司)、HDAC2(1:500，ab16032，Abcam公司)、HDAC3(1:100，sc - 11417，圣克鲁斯生物技术公司)、HDAC8(1:50，sc - 11405，圣克鲁斯生物技术公司)、CD16/32(1:50，553142，BD Pharmingen公司)、CD206(1:500，AF2535，R&D Systems公司)、乙酰化组蛋白3(AcH3，1:500，06 - 599，密理博公司)、乙酰化组蛋白4(AcH4，1:1000，06 - 866，密理博公司)、神经丝-H(NF - H，1:1000，AB5539，密理博公司)、硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG，1:100，克隆CS56，C8035，西格玛公司)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP，1:1000，克隆GA5，MAB360，密理博公司)和纤连蛋白(1:80，ab2033，密理博公司)进行免疫染色。随后，使用AlexaFluor 488、AlexaFluor 594和/或DyLight 405偶联的二抗(1:300，杰克逊免疫研究公司或英杰公司)。使用DAPI进行复染。使用蔡司显微镜(AxioCamMRc或Axiocam 503 mono)采集图像。在每个切片中采集损伤中心周围的几张图像，并使用Photoshop(Adobe公司)或Zen(蔡司公司)软件自动合并。每根脊髓采集靠近中线的1至4个切片。使用MetaMorph(分子器件公司)或ImageJ(美国国立卫生研究院)对图像进行分析，并对每只小鼠的结果进行平均。
小胶质细胞培养。小胶质细胞的培养方法如前所述 ，但有一些修改。取出生后第2天(P2)的C57BL/6小鼠的大脑皮层，用0.25%的胰蛋白酶(英杰公司)在 处理30分钟。用 胎牛血清(FBS)-DMEM/F-12(英杰公司)洗涤后，细胞用 DNA酶和 胰蛋白酶抑制剂(英杰公司)在 处理 。用 牛血清白蛋白垫层通过离心去除碎片。细胞在涂有 聚-D-赖氨酸(PDL)的 培养皿上培养 周。达到汇合后4天，细胞用在DMEM/F-12中1:3稀释的0.25%胰蛋白酶在 处理 。洗涤培养皿后，只有小胶质细胞仍附着在培养皿上。用0.25%的胰蛋白酶将细胞分离下来，重新接种到涂有 PDL的8孔载玻片(法尔肯公司)上。细胞用 RGFP966处理 ，随后用 脂多糖(LPS，西格玛公司)处理4或24小时。为了进行敲低，将100 nM的HDAC3 siRNA(ON-TARGETplus SMARTpool siRNA，J-043553-05、J-043553-06、J-043553-08、J-043553-17，达摩康公司)或对照siRNA用DharmaFECT 4(达摩康公司)转染到细胞中。转染54小时后，细胞用 LPS处理，并在24小时后进行检测。
LPS处理后，细胞用补充有4%蔗糖的4%多聚甲醛固定，用0.3% Triton-X-PBS中的3%牛血清白蛋白和1%正常驴血清封闭，并用乙酰化H3(1:500)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS，1:100，610328，BD生物科学公司)、CD206和HDAC3进行免疫染色。随后，使用AlexaFluor 488和AlexaFluor 594偶联的二抗。用DAPI进行复染。每种处理采集10张图像，并用MetaMorph进行分析。
背根神经节神经元培养。背根神经节(DRG)神经元的培养方法如前所述 。用递增剂量的RGFP966处理DRG神经元 ，然后固定并用抗β-微管蛋白III(1:500，克隆TUJ1，MAB1195，R&D系统公司)进行免疫染色，并用DAPI进行复染。用ImageJ测量每个神经元最长轴突的长度并求平均值。还从在细胞培养前指定天数经腹腔注射RGFP966 或赋形剂处理的成年小鼠中分离DRG神经元，并在培养 后固定。
细胞因子阵列。挫伤损伤后10天，收集损伤区域并用Illustra triplePrep试剂盒(通用电气医疗集团)提取蛋白质。 的蛋白质裂解物用于细胞因子阵列(蛋白质组分析抗体检测 - 小鼠细胞因子阵列A组，R&D系统公司)。用Gel Doc XR系统(伯乐公司)采集图像，并用ImageJ进行分析。
统计分析。对于每个实验，每个队列中使用的小鼠数量以及从每只动物分析的图像数量列于图注和补充表1中。对于每个数据集，进行了Shapiro-Wilk检验(IBM SPSS统计软件，版本23)以确定参数样本(p > 0.05)与非参数样本(Shapiro-Wilk检验中p )。对于参数数据，进行F检验以比较方差(Prism 5，GraphPad软件，加利福尼亚州拉霍亚)。对于方差相似的样本(F检验中p > 0.05)，使用未配对t检验(Prism 5)。对于方差有显著差异的样本(F检验中p < 0.05)，进行带有Welch校正的未配对t检验(Prism 5)。对于非参数与参数数据集之间或两个非参数数据集之间的统计比较，进行Mann-Whitney检验，该检验不需要正态分布假设(Prism 5)。对于多个非参数数据集之间的统计比较，进行Kruskal-Walis检验。对于重复测量的研究，进行双向方差分析重复测量(RM)，随后进行事后Bonferroni检验。尽可能进行基于聚类的汇总统计，使用受试者内平均值，并对小样本量的嵌套数据进行多水平分析时进行裂区方差分析。根据Grubbs异常值检验(Graphpad， )排除异常值。平均值与作为误差线的平均标准误差(SEM)一起呈现。References
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我们感谢西奈山伊坎医学院的朱云娇博士帮助建立挫伤性脊髓损伤模型，感谢日本富山大学统计与临床流行病学系的折笠秀树博士提供统计分析建议。感谢约翰霍普金斯大学的杰里米·内森斯博士提供INTACT试剂和方案，以及邹实验室的成员参与讨论。显微镜检查和图像分析在西奈山伊坎医学院的显微镜核心实验室进行。这项工作得到了扶轮国际扶轮基金会全球赠款奖学金对T.K.的支持，以及美国国立卫生研究院(R01 NS073596)、纽约州脊髓损伤研究委员会(DOH01-CARTID-2015-00065)和纽约州脊髓损伤机构支持(DOH01-C30832GG-3450000)对H.Z.的资助。
作者贡献
T.K.进行了这项研究。S.W.参与了免疫组化实验。Y.H.协助进行qRT-PCR、细胞因子分析和行为测试。X.Z.协助动物手术。J.W.进行了初步研究。A.K.参与了手术操作和行为测试。M.M.参与了数据量化。R.H.F.提供了广泛的技术支持。H.Z.设计了项目、分析了数据并撰写了论文。所有作者都参与了讨论并协助准备了这份手稿。
附加信息
本文的补充信息见doi:10.1038/s41598-017-08535-4
利益冲突:作者声明他们没有利益冲突。
出版商说明:施普林格·自然对于已发表地图中的管辖权主张和机构隶属关系保持中立。
美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院弗里德曼脑研究所神经科学系Fishberg(Fishberg系)，邮编10029。 美国纽约州纽约市西奈山伊坎医学院弗里德曼脑研究所神经外科系，邮编10029。 日本富山县富山大学自然医学研究所神经医学科学部，邮编930 - 0194。 现地址:美国纽约州纽约市纽约 Tisch MS研究中心，邮编10019。 现地址:美国纽约州纽约市阿尔茨海默病药物发现基金会，邮编10019。 如需通信及索取材料，请寄至H.Z.(电子邮件:hongyan.zou@mssm.edu) ↑
巨噬细胞,组蛋白去乙酰化酶3,HDAC3,RGFP966
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