开放获取

编辑:

弗朗西斯科·阿尔塔米拉诺，美国得克萨斯大学西南医学中心

审阅:

贝沙伊·佐尔多基，美国明尼苏达大学；纳比尔·阿尔卡耶德，美国俄勒冈健康与科学大学；杨军，美国加利福尼亚大学戴维斯分校

*通信作者:

约翰·M·休伯特 jseubert@ualberta.ca

这些作者对本工作贡献相同

专题栏目:

本文已提交至《生理学前沿》杂志的综合生理学栏目

收稿日期:2019年11月4日

录用日期:2020年1月21日

发表日期:2020年2月7日

引用信息:

杰米森·K·L、凯沙瓦尔兹-巴哈格哈特·H、达尔韦什·A·M、索斯诺夫斯基·D·K和休伯特·J·M(2020年)可溶性环氧化物水解酶基因敲除小鼠心脏中的年龄和性别差异。《生理学前沿》11:48。doi: 10.3389/fphys.2020.00048

可溶性环氧化物水解酶基因敲除小鼠心脏中的年龄和性别差异

K.洛克哈特·贾米森(K. Lockhart Jamieson) ，赫迪耶·凯沙瓦尔兹 - 巴哈格伊哈特(Hedieh Keshavarz - Bahaghighat) ，艾哈迈德·M·达尔维什(Ahmed M. Darwesh) ，迪安娜·K·索斯诺夫斯基(Deanna K. Sosnowski) 和约翰·M·休伯特(John M. Seubert)

加拿大艾伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学药学院和制药科学学院 ，加拿大艾伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学医学与牙科学院药理学系

生物衰老作为生命中不可避免的一部分，数千年来一直引发人们的兴趣。生物系统的逐渐衰退会影响心脏功能，并增加对压力的易感性，导致老年个体发病和死亡。然而，我们对衰老的分子、生化和生理机制以及性别差异的理解仍然有限。越来越多的证据表明，CYP450环氧合酶介导的n - 3和n - 6多不饱和脂肪酸(PUFAs)代谢产物是调节心脏稳态的活性脂质介质。这些环氧代谢产物会被可溶性环氧化物水解酶(sEH)迅速水解并失活。本研究对年轻和老年sEH基因敲除小鼠与相应野生型(WT)小鼠的心脏功能进行了表征。除了老年雌性sEH基因敲除小鼠外，所有老年小鼠的心脏肥大均显著增加。通过超声心动图评估的心脏功能显示，老年WT小鼠明显下降，特别是两性的射血分数和缩短分数均显著降低。有趣的是，与老年WT小鼠相比，老年雌性sEH基因敲除小鼠保留了收缩功能，而老年雄性sEH基因敲除小鼠保留了舒张功能。对心脏线粒体的评估表明，老年WT雄性和雌性小鼠中乙酰锰 - SOD水平的表达增加，这与Sirt - 3活性降低相关。相反，与WT小鼠相比，老年sEH基因敲除小鼠保留了Sirt - 3活性，并且线粒体超微结构更好。与这些变化一致，WT动物中SOD的活性水平显著降低，但在老年sEH基因敲除动物中得以保留。氧化应激标志物显示，WT和sEH基因敲除雄性小鼠中蛋白质羰基水平随年龄增加。总之，这些数据突出了sEH基因敲除小鼠的新心脏表型，表明心脏衰老存在性别二态性模式。

关键词:衰老；线粒体；可溶性环氧化物水解酶；Sirt - 3；心脏功能；性别二态性

引言

随着全球人口老龄化，心血管疾病(CVD)的患病率显著增加(诺斯和辛克莱，2012年；本杰明等人，2019年)。导致心脏结构恶化和心脏功能逐渐衰退的重要年龄相关变化表现为左心室肥大、收缩和舒张功能障碍以及运动能力下降(乔和拉宾诺维奇，2015年)。尽管年龄对心脏的影响已有充分记录，但男性和女性心脏衰老的性别特异性模式却较少受到关注(默茨和程，2016年)。性别相关差异，例如男性阻塞性疾病的发病率高于女性微血管并发症，导致男女之间持续观察到的心脏结局存在差异(周和高，2010年；凯勒和豪利特，2016年)。早期关于这些性别相关心血管结局的许多研究都集中在内源性激素作为心血管保护介质的作用上(黄和卡利，2004年)。最近的数据表明，仅激素变化不足以完全解释这些差异，其他涉及的生物学机制仍然是一个持续争论的话题(雷吉茨 - 扎格罗塞克和卡拉里加斯，2016年)。

线粒体功能障碍和氧化应激增加已被确定为心脏衰老和相关心血管疾病(CVD)的关键因素(Martín-Fernández和Gredilla，2016年)。沉默调节蛋白3(Sirt-3)是一种脱乙酰酶，主要定位于线粒体，通过对各种蛋白质进行脱乙酰化和激活来参与调节多种生理和病理生理过程，包括氧化还原稳态(Kong等人，2010年；Benigni等人，2016年)。Sirt-3直接激活主要的线粒体抗氧化酶锰超氧化物歧化酶(MnSOD)，后者可清除活性氧(ROS)(Sundaresan等人，2016年)。有证据表明，在心脏衰老过程中Sirt-3可能会下调，导致MnSOD活性受到抑制，从而使ROS水平升高(Kincaid和Bossy-Wetzel，2013年)。随后，升高的ROS水平可激活下游靶点，包括PI3K/Akt信号通路，进一步加剧与年龄相关的心脏肥厚反应(Kincaid和Bossy-Wetzel，2013年；Matsushima和Sadoshima，2015年；Pillai等人，2015年)。了解Sirt-3在衰老过程中的确切作用仍然是许多研究小组的重点，他们试图揭示治疗与年龄相关并发症的关键途径和治疗方法(Sundaresan等人，2009年；Hafner等人，2010年；Hebert等人，2013年；Porter等人，2014年)。

多不饱和脂肪酸(PUFAs)通过多种代谢途径进行代谢，包括环氧化酶、脂氧合酶和细胞色素P450(CYP)单加氧酶途径(Jamieson等人，2017a)。这些转化产生了大量具有多种生物学功能的脂质介质(Ai等人，2009年；Lee等人，2010年；Akhnokh等人，2016年)。PUFAs的氧化代谢可产生生物活性介质，称为氧化脂质，它们可被环氧化物水解酶家族(EH)进一步代谢为生物活性较低的二醇(Imig和Hammock，2009年；Nithipatikom等人，2014年)。主要位于胞质溶胶中的可溶性形式(sEH)与多种心血管疾病的进展有关，包括高血压和动脉粥样硬化(Harris和Hammock，2013年)。微粒体形式(mEH)也是一种公认的异源生物代谢酶，负责活性代谢物的生物转化(Marowsky等人，2016年)。虽然mEH能够水解PUFA衍生物，但已确定其在心脏代谢中的作用有限(Marowsky等人，2009年；Decker等人，2012年)。心脏sEH主要将氧化脂质介质代谢为活性较低的代谢物，这通常会导致心脏保护特性丧失(He等人，2016年)。sEH的基因缺失和药理学抑制均已证明可介导心脏保护、抗炎和抗高血压反应，并限制线粒体损伤(Jamieson等人，2017a、b；Darwesh等人，2019年)。在人类中，增加sEH活性的基因多态性与心脏和肾脏疾病的不良预后相关，尽管这似乎因人群而异(Fava等人，2010年；Zhu等人，2015年；Shuey等人，2017年)。许多动物研究已经证明了sEH在各种心血管疾病模型中的重要性；然而，关于其在全身性心脏衰老中的作用的信息有限(Seubert等人，2006年；Monti等人，2008年；Zhang等人，2008年；Akhnokh等人，2016年；Jamieson等人，2017b)。此外，关于心脏sEH随年龄的性别差异的信息有限(Pinot等人，1995年；Sinal等人，2000年)，因此本研究调查了sEH在年龄和性别依赖性心脏差异中的影响。

材料与方法

动物

在阿尔伯塔大学饲养着一群Ephx2基因靶向缺失的小鼠(sEH基因敲除小鼠)及其野生型同窝小鼠。小鼠维持在C57BL6背景下。所有实验均在2至4个月大(年轻)和15至18个月大(中年)的雄性和雌性小鼠身上进行。选择中年范围(以下简称“老年”)是为了在临床上代表人类心血管疾病(CVD)的表现，并避免虚弱带来的混杂效应，虚弱会极大地改变老年小鼠的心血管表型(怀特黑德等人，2014年)。在适当年龄，用戊巴比妥钠( )对小鼠实施安乐死后，取出心脏和肾脏。然后将心脏和肾脏在1X PBS中冲洗，在液氮中速冻，并储存在 以待分析。动物实验方案经阿尔伯塔大学健康科学福利委员会批准，并按照加拿大动物护理委员会制定的指南进行。

心脏功能

在动物安乐死1周前，使用经胸二维超声心动图进行心脏功能评估。动物用异氟烷(1 - 2%)麻醉，使用Vevo 3100高分辨率成像系统、 换能器(MX550S；Visual Sonics)进行记录。使用Visual Sonics VevoLab软件评估心脏图像。从乳头肌水平中部的m型图像确定左心室内容积和左心室内径(LVID)。左心室射血分数(%EF)使用公式% EF = [(左心室舒张末期容积 - 左心室收缩末期容积)/左心室舒张末期容积] × 100计算。左心室质量(校正后，mg)使用1.05 × [(LVID;d + 左心室后壁厚度;d + 室间隔厚度;d)3̂ - LVID;d3̂] × 0.8计算。通过脉冲波多普勒成像评估二尖瓣充盈模式以确定舒张功能。E/A比值代表二尖瓣早期血流波(E波)，随后是由于心房“收缩”产生的晚期充盈波(A波)。使用组织多普勒成像描述二尖瓣环的运动(E’和A’)。

蛋白质表达与免疫印迹分析

采用蛋白质免疫印迹法(Western blot analysis)测定亚细胞线粒体、微粒体和胞质组分中的蛋白质表达。简要地说，将心脏和肾脏在冰冷的匀浆缓冲液( 蔗糖、 Tris-HCL、1 mM EDTA、1 mM原钒酸钠、1 mM氟化钠、 抑肽酶、 亮抑酶肽和 胃蛋白酶抑制剂)中匀浆，并在 下离心 。然后将上清液在 下离心 ，随后将含有线粒体的沉淀重悬于 匀浆缓冲液中。将所得上清液在 下离心 ，取上清液作为胞质组分，取沉淀并重悬作为微粒体组分。使用标准的考马斯亮蓝法(Bradford assay)对亚细胞组分中的蛋白质水平进行定量。将含有 蛋白质的样品加载到4-15%的TGX 凝胶(BioRad，加拿大)上，用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE gel electrophoresis)，然后转移到 聚偏二氟乙烯膜(PVDF membranes)上进行后续的蛋白质免疫印迹。使用针对可溶性环氧化物水解酶(sEH)(1:500，Elabscience；E-AB-60489)、总蛋白激酶B(total-Akt)(1:1000，Cell Signaling；CS9272S)、磷酸化蛋白激酶B(Ser473)(1:1000，Cell Signaling；CS5106S)、沉默调节蛋白3(Sirt- 3)(1:1000，Cell Signaling；CS5490S)、总锰超氧化物歧化酶(total MnSOD)(1:5000，Abcam；ab13533)、乙酰化锰超氧化物歧化酶(acetyl-MnSOD)(1:5000，Abcam；ab13707)、 微管蛋白(1:1000，Abcam，ab4074)、微粒体环氧化物水解酶(mEH)(1:200，Santa Cruz，sc135984)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(1:1000，Cell Signaling；CS2118S)和电压依赖性阴离子通道(VDAC)(1:1000，Abcam；ab14734)的一抗进行检测。用1X TBST洗涤后，将膜与相应的辣根过氧化物酶偶联二抗(1:5000)孵育，并用增强化学发光试剂(ECL reagent)进行显影。使用Image J软件(美国国立卫生研究院，NIH)基于相对条带强度进行光密度分析。

酶活性测定

根据制造商的说明，使用Sirt-3荧光检测试剂盒(BPS Bioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥)在分离的线粒体组分中检测Sirt-3活性。在该检测中，首先从年轻和老年雄性及雌性野生型(WT)和sEH基因敲除小鼠的心脏中分离线粒体。将线粒体组分与特定的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)荧光底物、牛血清白蛋白、 和检测缓冲液混合。样品中Sirt-3诱导的去乙酰化过程使HDAC底物敏感，因此随后用Sirt-3检测显色剂处理会产生一种荧光产物，使用荧光酶标仪在 激发/发射波长下进行测量。Sirt-3的活性以 蛋白质表示(Bochaton等人，2015年；Zhao等人，2019年)。

作为一种已确立的线粒体含量生物标志物，柠檬酸合酶活性采用分光光度法进行测定，方法如前所述(Akhnokh等人，2016年)。简要来说，将心脏组织在冰冷的匀浆缓冲液( Tris， ，匀浆当天添加 蔗糖)中研磨并匀浆，然后在 条件下离心 。用上清液按照先前描述的方法(Spinazzi等人，2012年)通过分光光度法评估酶活性。

超氧化物歧化酶(SOD)活性在胞质组分中采用基于分光光度法的检测方法进行测定，该方法依赖于细胞色素c和SOD对超氧阴离子 的竞争。该检测使用黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶作为 的主要来源。在该检测中，一个单位的SOD等于抑制细胞色素c还原速率 的酶量(Grapo等人，1978年；Beyer和Fridovich，1987年)。

基于与2,4 - 二硝基苯肼衍生化(DNPH)的反应，使用蛋白质羰基ELISA试剂盒(Abcam；Ab1238536)按照制造商说明书评估胞质组分中的蛋白质羰基含量。

线粒体超微结构

采用传统透射电子显微镜(TEM)评估线粒体超微结构。从左心室游离壁中层获取 心肌组织样本，在 条件下于 戊二醛和3%多聚甲醛中固定过夜。将1.5%亚铁氰化钾 和 四氧化锇 在 二甲胂酸盐缓冲液中的混合物用作后固定剂，随后用 醋酸铀(pH 5.2)进行整体染色 。组织在一系列连续的乙醇 中脱水，然后用丙酮脱水。通过丙酮与Spurr树脂的系列稀释液(2:1；1:1；2:1；纯Spurr树脂)进行树脂渗透。然后将样品在 条件下热聚合 ，接着使用超薄切片机(Leica UC7，Leica Microsystems Inc.，维也纳，奥地利)进行超薄切片(厚度70 nm)。样品用4%醋酸铀和雷诺兹柠檬酸铅复染30分钟，然后进行碳涂层(Leica EM ACE600，Leica Microsystems Inc.，维也纳，奥地利)。在复染后1周内，使用配备1600万像素EMCCD相机(XR111，Advanced Microscopy Technique，MA，美国)的透射电子显微镜(Hitachi H - 7650 TEM，Hitachi High - Technologies Canada，Inc)在 条件下对切片进行成像。

统计分析

数据以平均值±平均标准误差(SEM)表示。采用三因素方差分析及Tukey事后检验确定统计学显著性 。使用GraphPad Prism 8软件(美国加利福尼亚州圣地亚哥)进行统计分析。从三因素方差分析获得的比例方差 表示为1的因子，描绘年龄、性别或基因型对数据集变异性的贡献。方差及由此产生的相互作用的显著性设定为 。

结果

老年sEH基因敲除雌性小鼠可预防年龄相关的心脏肥大

在所有年龄段的雌雄小鼠及不同基因型小鼠中均观察到体重显著增加(图1A)。心脏重量(HW)与胫骨长度(TL)的比值用作心脏肥大的指标。年轻的野生型(WT)和sEH基因敲除动物，无论雌雄，心脏重量均无差异(图1B)。老年雄性和雌性WT小鼠以及雄性sEH基因敲除小鼠的HW:TL均显著增加；然而，老年雌性sEH基因敲除小鼠未观察到增加(图1B)。虽然Akt信号通路作为一条促生存信号通路发挥着重要作用，但研究表明，随着年龄增长Akt激活增加会导致年龄相关的心脏肥大和炎症(Hua等人，2011年；Chen等人，2017年)。与文献一致，免疫印迹结果表明老年小鼠胞质部分中pAkt水平显著升高(图1C)。

图1 | 年轻和老年WT及sEH基因敲除小鼠的生理参数。(A)小鼠体重(g)，(B)小鼠心脏重量(HW)与胫骨长度(TL)的比值HW:TL，(C)年轻和老年WT心脏及sEH基因敲除心脏中胞质磷酸化Akt和总Akt蛋白表达。数值表示平均值±SEM， 5 - 8， ，*与年轻对照组相比； 与雌性对照组相比。

sEH基因缺失可维持老年小鼠心脏功能

使用二维超声心动图对老年和性别相关的心脏功能及参数变化进行了表征。结果表明，各组之间心率无显著差异。然而，老年雄性和雌性WT小鼠以及sEH基因敲除雄性小鼠的射血分数(%EF)和缩短分数(%FS)，即收缩功能指标，显著降低(表1)。同样，老年雄性和雌性WT小鼠以及老年sEH基因敲除雄性小鼠的左心室舒张末期容积(LVEDV)、收缩末期容积(LVESV)和心腔内径(LVID)增加，表明收缩功能普遍下降(表1)。有趣的是，老年雌性sEH基因敲除小鼠与年轻小鼠无差异，表明收缩功能总体得以保留(表1)。各组之间等容收缩或舒张时间(IVCT或IVRT)无显著变化，但主动脉射血时间(AET)仅在老年雄性sEH基因敲除小鼠中得以保留。E/A比值是二尖瓣血流的一个指标，通常用作舒张功能的标志物。老年WT雄性和雌性小鼠的E/A比值均显著降低。有趣的是，老年雌性sEH基因敲除小鼠的E/A比值显著降低，而雄性则未降低(表1)。同样地， ，即左心室充盈压的一个标志物，在雌性小鼠中显著降低，而雄性小鼠中未降低。总之，这些数据表明sEH基因缺失具有不同的作用，老年雌性小鼠表现出保留的收缩功能，老年雄性小鼠表现出保留的舒张功能。

表1 | 通过二维超声心动图测量的心脏功能参数。

数据以平均值±标准误表示，P < 0.05，*与年轻对照组相比；#与野生型对照组相比；‡与雌性对照组相比。

衰老对环氧水解酶蛋白表达的影响

在基因敲除小鼠的年轻和老年心脏中均未检测到可溶性环氧水解酶(sEH)的表达，证实了基因缺失(图2A)。老年雄性野生型小鼠中sEH表达显著增加，但老年雌性小鼠中未增加(图2A)。有趣的是，我们的数据表明，老年野生型和sEH基因敲除雌性小鼠以及老年野生型雄性小鼠中微粒体环氧水解酶(mEH)表达均显著增加(图2B)。然而，在老年sEH基因敲除雄性小鼠中未观察到这种增加，与老年野生型雄性小鼠相比，其mEH表达显著降低(图2B)。环氧水解酶在肾脏环氧脂质代谢中起重要作用；由于肾功能对整体心血管健康很重要，我们评估了肾脏中sEH和mEH的变化(伊米格，2006年)。在sEH基因敲除小鼠的肾脏中未观察到sEH的表达(图2C)。与先前文献一致，野生型雄性小鼠肾脏中的sEH表达相比雌性显著增加，但年轻和老年小鼠之间没有差异(图2C；西纳尔等人，2000年)。任何组中肾脏mEH均无显著变化(图2D)。

老年sEH基因敲除雌性小鼠中Sirt-3活性和乙酰化锰超氧化物歧化酶保持不变

已发现主要的线粒体脱乙酰酶Sirt-3随着衰老而下调，并与活性氧水平升高相关，这与心脏功能下降有关(布朗等人，2013年；曾等人，2014年)。在本研究中，任何组中线粒体Sirt-3蛋白表达均未观察到差异(图3A)。然而，老年野生型雌性小鼠心脏中的Sirt-3活性显著降低，雄性有类似趋势 。有趣的是，与年轻对照组相比，老年sEH基因敲除小鼠中Sirt-3活性保持不变，并且老年sEH基因敲除雌性小鼠的Sirt-3活性显著高于同龄野生型雌性小鼠(图3B)。Sirt-3随年龄的变化导致活化的锰超氧化物歧化酶(MnSOD)水平降低，从而导致氧化应激增加(华等人，2011年)。与先前研究一致，野生型雄性和雌性心脏中乙酰化锰超氧化物歧化酶(AcMnSOD)的表达水平均以年龄依赖性方式显著增加(图3C)。有趣的是，与野生型对应物相比，sEH基因敲除小鼠中AcMnSOD表达较低(图3C)。老年雄性和雌性sEH基因敲除小鼠的AcMnSOD水平均升高，但显著低于相应的老年野生型小鼠(图3C)。与文献一致，野生型老年雄性和雌性动物的心脏超氧化物歧化酶(SOD)活性均显著降低(图3D)。与年轻基因敲除小鼠相比，老年sEH基因敲除动物的SOD活性保持不变(图3D)。这些数据表明，sEH基因缺失通过保持Sirt3活性赋予抗氧化应激保护作用，这将降低AcMnSOD水平，从而维持SOD活性。通过评估作为氧化应激生物标志物的蛋白质羰基化(费多罗娃等人，2014年)，这得到了部分支持，其中仅在老年雄性动物中观察到蛋白质羰基水平升高，无论其基因型如何，老年雌性心脏中未观察到(图3E)。随着年龄增长，所有组中肾脏AcMnSOD和Sirt-3表达均保持不变(图4A、B)。

图2 | 野生型和sEH基因敲除小鼠中环氧水解酶的蛋白表达。心脏可溶性环氧水解酶(sEH，A)和微粒体环氧水解酶(mEH，B)的代表性免疫印迹和定量分析。肾脏sEH(C)和mEH(D)的代表性免疫印迹。sEH的蛋白表达以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行标准化。mEH的蛋白表达以α-微管蛋白进行标准化。数据以平均值±标准误表示， = 4 - 5， 0.05， 与年轻对照组相比；‡与雌性组相比。

图3 | 年轻和老年野生型及可溶性环氧化物水解酶(sEH)基因敲除小鼠中的沉默调节蛋白3(Sirtuin-3)和超氧化物歧化酶(SOD)。(A)年轻和老年野生型及sEH基因敲除小鼠心脏中Sirt-3蛋白表达。(B)在年轻和老年野生型及sEH基因敲除小鼠的线粒体组分中测定Sirt-3活性。(C)在年轻和老年野生型心脏及sEH基因敲除心脏中，乙酰化锰超氧化物歧化酶(AcMnSOD)相对于总锰超氧化物歧化酶(total MnSOD)的相对蛋白表达。(D)在年轻和老年野生型及sEH基因敲除心脏的胞质组分中评估超氧化物歧化酶(SOD)活性。(E)在年轻和老年野生型及sEH基因敲除心脏的心脏胞质组分中评估蛋白质羰基化水平。数据表示为平均值±标准误，*与年轻组相比；#与野生型组相比；#与雌性组相比。

图4 | 与电压依赖性阴离子通道(VDAC)相比，线粒体Sirt-3在肾脏中的表达(A)，以及与总锰超氧化物歧化酶相比，乙酰化锰超氧化物歧化酶(Acetylated MnSOD)在肾脏中的表达(B)。数据表示为平均值±标准误。

老年雌性sEH基因敲除小鼠的心脏线粒体超微结构得以保留

为了估计心脏线粒体含量，我们测量了柠檬酸合酶的活性，柠檬酸合酶是参与线粒体氧化代谢的限速酶(Larsen等人，2012年)。任何组中的柠檬酸合酶活性均无差异，这表明整体线粒体含量没有显著改变(图5A)。采用传统透射电子显微镜(TEM)评估年轻和老年小鼠左心室游离壁的线粒体超微结构。在老年雄性和雌性野生型心脏中均观察到线粒体超微结构的明显改变，表现为嵴密度降低、肌原纤维间隙排列紊乱和尺寸增大(图5B - E)。在sEH基因敲除动物中未观察到与年龄相关的线粒体形态变化(图5F - I)。

年龄是心脏功能和氧化应激反应中的关键变量

来自三因素方差分析(年龄×基因型×性别)的方差及相应的显著性分别列于表2、表3中。在本研究评估的三个变量中，年龄对评估的大多数参数表现出最大的显著影响(表2、表3)。性别也是心脏收缩功能、Sirt-3活性和环氧化物水解酶表达中观察到的影响的重要因素(表2、表3)。基因型对心脏重量、心脏Sirt-3活性、SOD活性和心脏舒张功能表现出显著影响(表2、表3)。交互作用效应描述了一个变量(如年龄)对另一个变量(如基因型)对任何相关参数影响的作用。当给定参数的交互作用显著时，表明这种影响取决于另一个因素的存在。表2、表3中描述了年龄、基因型和性别之间重要的交互作用效应。所有三个变量之间对任何因素均无交互作用(数据未显示)。这些数据支持了证明年龄和性别在心脏功能中重要性的证据。

讨论

生物衰老 是一个自然过程，会导致个体应对压力的能力发生显著变化，进而使诸如心血管疾病(CVD)风险增加等不良后果恶化(帕内尼等人，2017年)。尽管心脏衰老背后的潜在机制仍不明确，但线粒体功能障碍被认为是一个主要因素(乔杜里等人，2011年)。特别是，与年龄相关的线粒体损伤会导致活性氧(ROS)生成增加，从而损害线粒体DNA和蛋白质，并影响质量控制过程，最终导致心脏功能下降(波尔萨克和米利萨夫，2013年；乔和拉宾诺维奇，2015年；斯特曼和兰德，2017年)。重要的是，已知随着个体年龄增长，性别差异会影响心血管疾病的病因、表现和预后(肖等人，2009年；帕克等人，2010年；温格，2012年)。女性特有的心血管疾病风险包括月经初潮停止(绝经)、先兆子痫、妊娠期糖尿病以及某些自身免疫性炎症性疾病，如系统性红斑狼疮(阿加瓦尔等人，2018年)。虽然男性平均患心血管疾病的年龄较轻，但有证据表明，高血压和糖尿病等心血管疾病风险因素在女性疾病进展中起更大作用(程等人，2010年)。进一步了解和描述导致心脏衰老的潜在性别特异性机制，可能为与年龄相关的心血管疾病的最佳预防和管理提供新的见解。与文献一致，我们报告了在与年龄相关的心肌肥大发展和心脏功能恶化方面的性别差异；然而，我们展示了新的数据，突出了删除可溶性环氧化物水解酶(sEH)的有益效果。

图5 | 年轻和老年野生型(WT)及可溶性环氧化物水解酶(sEH)基因敲除小鼠心脏中的线粒体含量和超微结构。(A)通过分光光度法测定年轻和老年野生型及可溶性环氧化物水解酶基因敲除小鼠中线粒体含量的生物标志物柠檬酸合酶活性水平，数据表示为平均值±标准误，每组n = 。野生型(B - E)和可溶性环氧化物水解酶基因敲除(F - I)小鼠在两种放大倍数下(3000倍，左图；7000倍，右图)的代表性透射电子显微镜图像，每组n = 。

表2 | 通过三因素方差分析评估的年龄、基因型和性别的比例方差值。

方差以1的分数形式报告。加粗值表示方差对总变异性的贡献达到统计学显著水平，P 0.05。

在人类中，心脏衰老的性别差异表明，男性平均表现出更严重的收缩功能受损，同时伴有心室壁厚度增加、腔径增大和左心室质量增加(Merz和Cheng，2016年)。相反，女性表现出更严重的舒张功能受损，同时伴有向心性重塑增加，收缩功能受损比男性出现得更晚(Krumholz等人，1993年；Cheng等人，2010年)。小鼠模型无法复制心血管疾病患者中常见的血压和血液胆固醇变化；然而，它们是一个有用的模型，可以概括许多与人类年龄相关的心脏结构和功能变化，如左心室质量增加、舒张充盈率降低和缩短分数降低(Dai和Rabinovitch，2009年)。在本研究中，我们观察到老年雄性和雌性野生型小鼠的收缩和舒张参数显著下降，同时左心室质量显著增加。这些数据与衰老人类的临床观察结果一致。有趣的是，老年雌性可溶性环氧化物水解酶基因敲除小鼠表现出保留的收缩功能和左心室质量，但存在舒张功能障碍。相反，老年雄性可溶性环氧化物水解酶基因敲除小鼠表现出收缩功能显著降低，但舒张参数无显著变化。此前，我们证明了老年可溶性环氧化物水解酶基因敲除小鼠在心肌梗死后具有心脏保护作用(Jamieson等人，2017b)。之前的这项研究使用了雄性和雌性小鼠，并非旨在评估性别差异，而是在损伤模型中概括衰老效应。目前的数据表明，在没有任何明确疾病状态的情况下，可溶性环氧化物水解酶基因缺失后心脏衰老存在重要的性别特异性差异。

表3 | 数据集变异性的三因素方差分析统计分析的P值。

加粗值表示对相关参数产生统计学显著影响的变量，P 0.05。

在年轻啮齿动物模型的肾脏、肝脏和心血管系统中，已记录到可溶性环氧化物水解酶(sEH)表达和活性的性别二态性(皮诺等人，1995年；西纳尔等人，2000年；张等人，2013年；秦等人，2016年；杨等人，2018年)，但这些差异背后的确切机制仍然未知。最近的研究表明，雌激素/雌激素受体介导的sEH启动子区域甲基化导致雌性啮齿动物基因沉默(杨等人，2018年)。sEH表达的这种表观遗传沉默可能是年轻动物模型中观察到的一些性别二态性的原因，尽管在老年动物中是否发生尚不清楚。在本研究中，我们观察到老年野生型(WT)雄性小鼠中sEH表达增加，而野生型雌性小鼠中未出现这种情况。此外，野生型小鼠和sEH基因敲除雌性小鼠中mEH表达随年龄增加，而sEH基因敲除雄性小鼠中未出现这种情况。雌性小鼠中mEH表达增加可能是对sEH缺失的一种代偿反应，但尚不清楚为什么老年sEH基因敲除雄性小鼠中未出现这种情况。mEH在心脏类花生酸代谢中的作用直到最近才在体内进行研究。早期数据表明，与mEH相比，sEH具有更高的催化能力，并且在环氧脂质代谢中起主要作用(斯佩克特和诺里斯，2007年；马罗夫斯基等人，2009年；哈里斯和汉莫克，2013年)。相比之下，mEH一直被认为是异源物质代谢的重要介质，对心脏环氧脂质代谢的贡献有限(马罗夫斯基等人，2009年)。埃丁等人最近的数据表明，在基础条件下，驱动环氧脂质代谢的是底物可用性而非催化活性(埃丁等人，2018年)。由缺血等应激源引起的细胞损伤可促进游离花生四烯酸的释放，其中sEH在环氧脂质代谢中起主导作用。相反，在基础或生理条件下，mEH可能作为一种“首过”水解酶，去除产生的少量内源性环氧脂质(埃丁等人，2018年)。此外，他们认为，虽然 与微粒体的结合可能会阻碍其从细胞质中清除环氧脂质的能力，但结合在微粒体中的环氧脂质将非常接近。有趣的是，本研究表明，老年野生型雄性小鼠中mEH和sEH均显著增加，但老年野生型和sEH基因敲除雌性小鼠中只有mEH增加。这些与年龄和性别相关的差异是否与环氧脂质形成的变化、环氧脂质储存的改变或酶催化活性的改变有关仍然未知，并且是正在进行的研究的主题。有趣的是，雌性sEH基因敲除小鼠可免受年龄依赖性肥大的发展影响，并保留心脏收缩功能，而老年sEH基因敲除雄性小鼠虽未免受肥大影响，但表现出保留的舒张功能。

线粒体是强大的细胞器，对于通过氧化磷酸化和三磷酸腺苷(ATP)生成来维持心脏功能至关重要；然而，它们也是活性氧(ROS)产生的主要部位(Chen和Zweier，2014年；Siasos等人，2018年)。在小鼠和人类的衰老过程中，心脏ROS的产生超过了线粒体的清除能力，这与功能下降相关(Panth等人，2016年；Brown等人，2017年)。在健康和患病状态下，均已观察到线粒体功能和形态存在性别特异性差异的证据，但潜在的分子机制仍知之甚少(Justo等人，2005年)。例如，已发现雌性大鼠的心肌细胞线粒体含量较低，但与雄性相比，其线粒体效率更高(Colom等人，2007年)。此外，雌性大鼠肝脏和大脑中的线粒体过氧化氢水平较低(Borrás等人，2003年)。在本研究中，观察到雄性中蛋白质羰基化水平随年龄增长而增加，表明心脏氧化应激显著增加。锰超氧化物歧化酶(MnSOD)是主要的线粒体抗氧化酶，有助于维持线粒体功能；此外，小鼠中MnSOD基因的失活会导致新生儿死亡(Li等人，1995年；Brown等人，2007年)。在大鼠大脑和肝脏中，雌性中MnSOD的较高表达和活性与较低的氧化损伤相关(Borrás等人，2003年)。MnSOD的激活主要通过其经由Sirt-3的去乙酰化来调节，Sirt-3是主要的线粒体去乙酰化酶(Parodi-Rullán等人，2018年)。Sirt-3缺陷小鼠表现出线粒体功能障碍、ROS过度产生以及心脏纤维化和肥大(Sundaresan等人，2016年；Wei等人，2017年)。据报道，随着衰老，包括MnSOD在内的线粒体蛋白的过度乙酰化和失活与Sirt-3活性下降有关(Parodi-Rullán等人，2018年)。在老年野生型(WT)动物中，Sirt-3活性下降以及乙酰化MnSOD(AcMnSOD)表达显著增加与文献报道一致。重要的是，我们的数据表明，在老年小鼠中，可溶性环氧化物水解酶(sEH)缺失可保留Sirt-3活性，并与AcMnSOD表达降低相关。此外，WT小鼠中的超氧化物歧化酶(SOD)活性显著降低，但在sEH基因敲除小鼠中未降低。重要的是，在sEH基因敲除小鼠中观察到的线粒体SOD抗氧化活性增加与更好的线粒体超微结构相关。最近的证据表明，Sirt-3可能在限制心脏肥大中起作用，因为在小鼠肥大心脏中发现其表达下调(Chen等人，2015年；Koentges等人，2016年)。有人提出，Sirt-3介导的MnSOD激活以及随后的ROS清除可抑制肥大信号传导，如磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)途径(Pillai等人，2014年)。有趣的是，在所有老年小鼠中观察到的心脏磷酸化蛋白激酶B(pAkt)表达增加与老年小鼠中观察到的氧化应激或肥大反应无关。因此，这些数据表明，sEH的基因缺失使心脏线粒体具有更好的能力来限制潜在的与年龄相关的损伤，这与Akt途径无关。

许多归因于可溶性环氧化物水解酶(sEH)基因缺失的保护作用都与环氧脂质水平升高有关，比如环氧三烯酸(EETs)水平的升高。过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1 )已知可介导线粒体功能、氧化应激和Sirt-3表达(Kong等人，2010年)。在肥胖模型中，EETs已被证明可激活PGC-1 ，从而使与Sirt-3表达保留相关的线粒体结构和功能蛋白得以保留(Singh等人，2016年)。在本研究中，虽然我们观察到Sirt-3表达没有变化，但我们观察到Sirt-3活性得以保留。这些数据表明，可能存在与sEH基因缺失以及随后环氧脂质代谢改变相关的Sirt-3翻译后修饰，这些修饰独立于通过PGC-1 介导的效应。Pillai等人报告说，生物酚类化合物厚朴酚能够穿过线粒体膜直接结合Sirt-3，提高Sirt-3的结合亲和力和 的利用率，最终保留其去乙酰化酶活性(Singh等人，2016年；Ansari等人，2017年)。此前尚未报道在sEH基因敲除小鼠中观察到的Sirt-3活性保留情况。虽然sEH基因敲除小鼠中观察到的与年龄相关的Sirt-3活性保留的机制尚不清楚，但我们认为环氧脂质代谢产物的增加在衰老过程中对保留Sirt-3的去乙酰化酶活性起到了作用。

在本研究中，我们描述了sEH缺失在心脏衰老中的作用和性别差异。数据表明，与野生型(WT)小鼠相比，衰老的sEH基因敲除小鼠保留了Sirt-3活性，降低了乙酰化锰超氧化物歧化酶(AcMnSOD)水平，并且线粒体超微结构更好。有趣的是，sEH基因敲除的雌性小鼠保留了收缩功能且没有心脏肥大，而sEH基因敲除的雄性小鼠保留了舒张功能。在WT雄性小鼠中观察到sEH表达增加，并且在两种基因型中均发现中链环氧水解酶(mEH)表达显著增加。虽然需要进一步研究来阐明这些效应背后的机制，但这些数据突出了心脏衰老新的性别差异模式。

数据可用性声明

本研究生成的数据集可应对应作者的要求提供。REFERENCES

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伦理声明

动物研究经过了阿尔伯塔大学健康科学学院研究伦理、动物护理和使用委员会的审查和批准。

作者贡献

KLJ和HK-B是共同第一作者，参与了研究设计、数据采集与分析以及论文撰写。AD和DS进行了关键的个体实验并协助撰写论文。JS是首席研究员，参与了研究设计、数据分析和论文撰写。

资金支持

本研究得到了心脏与中风基金会授予JS的一项资助。KLJ通过阿尔伯塔创新 - 健康解决方案提供的研究生奖学金获得支持。HK-B由 Lois Hole 妇女医院的慷慨支持者通过妇女和儿童健康研究所提供资金。AD由阿尔伯塔创新研究生奖学金(AI - GSS)计划提供支持。

致谢

作者们要感谢阿尔伯塔大学医学与牙科学院细胞成像中心的Woo Jung Cho在本研究的透射电子显微镜部分提供的宝贵帮助。

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