银纳米颗粒诱导乳腺癌小鼠模型中DNA甲基化和组蛋白H3甲基化的变化
发布时间：
2025-11-04 20:37
银纳米颗粒诱导乳腺癌小鼠模型中DNA甲基化和组蛋白H3甲基化的变化
卡米尔·布热什卡 D，芭芭拉·索查诺维茨 ，马尔戈扎塔·什奇吉特 D，阿格涅什卡·德拉特 ，马尔蒂娜·斯涅戈茨卡 D，多米妮卡·米哈尔奇克-韦图拉 ，马尔蒂娜·埃拉斯 D，卢齐娜·卡普卡-斯克日普恰克 以及马尔钦·克鲁谢夫斯基 D
1 放射生物学与生物剂量测定中心，核化学与技术研究所，多罗德纳街16号，03 - 195华沙，波兰
2 波兰克拉科夫市格罗诺斯塔约瓦街7号，雅盖隆大学，生物化学、生物物理学与生物技术学院，生物物理学与癌症生物学系，邮编30-387
3 分子生物学与转化研究部，农村卫生研究所，雅采夫斯基街2号，20-090 卢布林，波兰
世界家庭健康研究所，卡利西亚大学，波兰卡利什62-800
* 通信地址:k.brzoska@ichtj.waw.pl；电话:+48 - 22 - 5041174
摘要:表观遗传变化作为纳米毒理学研究中一个可测量的终点，其重要性越来越受到重视。在本研究中，我们分析了柠檬酸盐和聚乙二醇包覆的 银纳米颗粒(AgNPs)在小鼠4T1乳腺癌肿瘤模型中诱导的表观遗传效应。通过胃内给药( 体重，每日总剂量 体重)或静脉内给药(分两次给药， 体重，总剂量 体重)对动物进行AgNPs处理。我们观察到，无论给药途径如何，用柠檬酸盐包覆的AgNPs处理的小鼠肿瘤中5-甲基胞嘧啶(5-mC)水平均显著降低。对于聚乙二醇包覆的AgNPs，仅在静脉内给药后才观察到DNA甲基化显著降低。此外，用AgNPs处理4T1荷瘤小鼠可降低肿瘤组织中组蛋白H3甲基化。这种效应在静脉内给药的聚乙二醇包覆的AgNPs中最为明显。未观察到组蛋白H3赖氨酸9乙酰化的变化。DNA和组蛋白H3甲基化的降低伴随着编码染色质修饰酶(Setd4、Setdb1、Smyd3、Suv39h1、Suv420h1、Whsc1、Kdm1a、Kdm5b、Esco2、Hat1、Myst3、Hdac5、Dnmt1、Ube2b和Usp22)的基因以及与致癌作用相关的基因(Akt1、Brca1、Brca2、Mlh1、Myb、Ccnd1和Src)表达的变化。所观察到的变化的意义及其发生机制尚不清楚，该领域需要更多的研究。然而，本研究指出表观遗传效应是纳米材料与生物系统之间相互作用的一个重要层面，在分析纳米材料的生物活性和开发纳米药物时应始终予以考虑。
关键词:银纳米颗粒；AgNPs；DNA甲基化；组蛋白修饰；表观遗传学
1. 引言
在过去15年里，大量研究聚焦于生物系统与银纳米颗粒(AgNPs)之间的相互作用机制及其潜在毒性。科学家们持续关注这一研究课题的原因在于AgNPs在工业和医学中的广泛应用引发了合理的安全担忧。最初的研究集中在细胞活力、存活与增殖、DNA损伤、氧化应激、凋亡诱导以及细胞周期紊乱等终点指标[1]。随后，对参与应对AgNPs的细胞机制的其他方面进行了分析，例如基因表达和细胞内信号通路的活性[2,3]。银纳米毒理学研究中使用的生物模型也从简单的二维细胞培养和正常健康动物，转向了更复杂的
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引用:Brzőska, K.; Sochanowicz, B.; Szczygiel, M.; Drzal, A.; Śniegocka, M.; Michalczyk-Wetula, D.; Elas, M.; Kapka-Skrzypczak, L.; Kruszewski, M. 银纳米颗粒诱导乳腺癌小鼠模型中DNA甲基化和组蛋白H3甲基化的变化。《材料》2023年，第16卷，第4163页。https://doi.org/10.3390/ ma16114163
学术编辑:蒋玉燕
收到日期:2023年4月13日
修订日期:2023年5月29日
录用日期:2023年6月1日
发表日期:2023年6月2日
(cc) ①
许可证颁发方:MDPI，瑞士巴塞尔。
版权:© 2023年作者所有。本文是一篇开放获取文章，根据知识共享署名4.0国际许可协议(https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)的条款和条件发布。
3D体外模型和动物模型有助于分析银纳米颗粒对发育中的胚胎或肿瘤发生过程进展的影响[4 - 9]。后一个方面在银纳米颗粒潜在抗癌活性的背景下尤为重要，许多作者都报道过这一点，但大多基于体外实验数据[10 - 13]。迄今为止进行的所有纳米毒理学研究都让人们对银纳米颗粒在生物系统中的作用机制有了大致了解，指出细胞内氧化应激的诱导是纳米颗粒毒性的基本机制[14,15]。随着时间的推移，越来越明显的是，纳米颗粒暴露通过表观遗传改变导致生物学效应，表观遗传变化作为纳米毒理学研究中一个可测量的终点的重要性越来越受到重视[16,17]。染色质结构由表观遗传机制决定，表观遗传机制包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA。例如，组蛋白修饰对与基因组转录活性和非活性区域形成相关的染色质结构有深远影响。已证明组蛋白3在赖氨酸4、36和79处发生甲基化时会激活基因表达，而在赖氨酸9和27处发生甲基化时会抑制基因表达[18]。研究表明，银纳米颗粒可以改变DNA甲基化和组蛋白H3修饰状态，并影响非编码RNA的表达。据推测，表观遗传变化可能是暴露于包括银纳米颗粒在内的纳米材料的非常敏感和可靠的标志物[16,17,19 - 21]。
我们最近的研究调查了银纳米颗粒在其包被和给药途径方面如何影响BALB/ccmdb免疫活性小鼠中4T1乳腺癌的发展和转移潜能。研究发现，尽管给予银纳米颗粒不影响肿瘤生长动力学，但它显著抑制了转移的形成[22]。这种效应显然依赖于纳米颗粒包被和给药途径两者，因为仅在胃内给予柠檬酸盐包被而非聚乙二醇包被的银纳米颗粒后才观察到这种效应。尽管转移潜能受到抑制，但与上皮 - 间质转化(EMT)相关的基因表达未检测到改变。因此，我们推测这种效应不是由于银纳米颗粒对癌细胞的直接作用，而是免疫系统调节的结果。本研究通过分析用银纳米颗粒处理的小鼠的4T1肿瘤中的表观遗传变化，扩展了先前的研究。结果表明，银纳米颗粒处理影响了肿瘤的整体DNA甲基化和组蛋白H3甲基化。这伴随着染色质修饰酶以及癌基因和肿瘤抑制基因表达的变化。
2. 材料与方法
2.1. 动物与处理
本研究中使用的动物模型的详细描述见前文[22]。简而言之，将悬浮于 PBS中的 细胞皮下注射到3月龄雌性BALB/ccmdb小鼠的乳腺脂肪垫中。接种后5天肿瘤明显可见。柠檬酸盐包被的银纳米颗粒(标称尺寸20纳米)购自NanoComposix(美国加利福尼亚州圣地亚哥)。根据制造商的数据，通过透射电子显微镜测量的直径为 ，而流体动力学直径为 。zeta电位等于 。如前文[22]所述，从柠檬酸盐包被的银纳米颗粒制备聚乙二醇包被的银纳米颗粒。银纳米颗粒用无菌水稀释，以 的剂量给予动物。为模拟基于纳米颗粒的抗癌剂可能的两种主要给药途径，银纳米颗粒通过胃内给药或经尾静脉注射进行静脉内给药。对照动物接受水。在原研究[22]中，每个实验组使用6只动物。然而，由于技术问题(一些动物的材料量不足以进行项目中计划的所有分析)和预算限制，本研究中描述的表观遗传分析是对每组三只动物的样本进行的。
2.2. 酶联免疫吸附测定(ELISA)
使用EpiQuik 总提取试剂盒(美国纽约州法明代尔市Epigentec公司)从肿瘤组织样本中提取组蛋白。采用考马斯亮蓝法 [23] 测定总蛋白浓度。按照制造商的方案，使用专用ELISA试剂盒(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市Active Motif公司)检测组蛋白H3赖氨酸9位乙酰化、组蛋白H3赖氨酸4位、9位和27位甲基化情况。
使用德国希尔德市凯杰公司(Qiagen)的DNeasy血液和组织试剂盒，按照制造商提供的方案从肿瘤组织样本中提取DNA。使用美国纽约州法明代尔市表观遗传学公司(Epigentec)的MethylFlash全球DNA甲基化(5-甲基胞嘧啶，5-mC)ELISA简易试剂盒(比色法)，根据制造商的指南测定作为5-甲基胞嘧啶(5-mC)形成的全球DNA甲基化。
2.3. 实时定量PCR分析miRNA和mRNA表达
使用miRNeasy Mini试剂盒(德国希尔德市Qiagen公司)从肿瘤组织样本中提取包括微小RNA(miRNA)在内的总RNA。使用QuantiFluor RNA系统(美国威斯康星州麦迪逊市Promega公司)和Quantus荧光计(美国威斯康星州麦迪逊市Promega公司)测定RNA浓度。
对于miRNA表达分析，使用miScript II RT试剂盒(德国希尔德市Qiagen公司)将250 ng RNA进行逆转录。将cDNA样品用无核酸酶水稀释至 ，并进行实时PCR分析，该分析在含有 稀释cDNA、 QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix(德国希尔德市Qiagen公司)、2.5 μL miScript通用引物(德国希尔德市Qiagen公司)、2.5 μL miScript引物测定试剂(德国希尔德市Qiagen公司)和 的 反应混合物中进行。使用了以下miScript引物测定试剂:Mm_let-7f_1(Mirlet7f-1)、Mm_miR-29a*_2(Mir29a)、Mm_miR-199a-5p_1(Mir199a-1)、Mm_miR-103_2(Mir103-1)、Mm_let-7a_2(Mirlet7a-1)、Mm_miR-9_1(Mir9-1)、Mm_miR-21_2(Mir21)、Mm_miR-200b_3(Mir200b)、Mm_miR-17_1(Mir17)、Mm_let-7g_2(Mirlet7g)、Mm_miR-200c_1(Mir200c)、Mm_miR-200a_1(Mir200a)、Mm_miR-93_1(Mir93)、Hs_SNORD95_11(SNORD95)。使用7500实时PCR系统(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司应用生物系统部)进行PCR扩增。PCR条件如下:初始 步骤在 循环下于 进行 ，持续 ，然后在 进行 。采用 方法，以SNORD95作为内参，来确定miRNA的相对表达量。
对于mRNA表达分析，使用iScript Advanced cDNA合成试剂盒(美国加利福尼亚州赫尔克里士市伯乐公司)将 总RNA逆转录为cDNA。将cDNA用无核酸酶水稀释至 ，并使用表观遗传染色质修饰酶PCR阵列和癌基因与肿瘤抑制基因PCR阵列(美国加利福尼亚州赫尔克里士市伯乐公司)进行实时PCR分析。使用7500实时PCR系统(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司应用生物系统部)进行PCR扩增。采用以下PCR条件:初始2分钟步骤在 循环下于 进行 ，然后在 进行 。采用 方法，以Actb、Gusb和Hprt作为内参，来确定相对mRNA表达量[24]。
所有计算均使用相对定量软件版本2021.1.1 - Q1 - 21 - build11(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司的赛默飞世尔云平台)。
2.4. 统计评估
使用Statistica 7.1软件(美国俄克拉何马州塔尔萨市StatSoft公司)进行统计分析。使用学生 检验和曼 - 惠特尼U检验评估差异的统计学显著性，其中 被视为具有显著性。
3. 结果
3.1. 银纳米颗粒处理降低肿瘤的整体DNA甲基化
在本研究中，我们使用了先前研究中的肿瘤样本，在该研究中，对携带4T1肿瘤的小鼠进行了胃内给药(每日1毫克/千克体重，总量
剂量为14毫克/千克体重)或静脉注射(分两次给药，每次剂量为 体重，总剂量为 体重)，使用柠檬酸盐或聚乙二醇包覆的银纳米颗粒[22]。
对肿瘤组织中的全球DNA甲基化进行了分析。结果显示，无论给药途径如何，用柠檬酸盐包被的银纳米颗粒处理的小鼠肿瘤中5-甲基胞嘧啶(5-mC)水平显著下降，约为两倍。对于聚乙二醇包被的银纳米颗粒，仅在静脉内给药后观察到DNA甲基化显著下降(图1)。
图1. 对照组小鼠以及经胃内或静脉途径给予柠檬酸盐或聚乙二醇包被的银纳米颗粒的小鼠的4T1肿瘤中，5-甲基胞嘧啶(5-mC)占总DNA的百分比。显示了平均值和标准差。星号表示与对照组相比具有统计学显著差异。 。
3.2. 银纳米颗粒处理可降低肿瘤组织中组蛋白H3的甲基化水平，但不影响其乙酰化水平
分析的下一步是评估肿瘤样本中组蛋白H3的乙酰化和甲基化水平。相对于对照动物，在用AgNPs处理的小鼠肿瘤中未观察到H3 Lys9乙酰化的变化。然而，用聚乙二醇包覆的AgNPs处理显著降低了肿瘤中H3 Lys4的甲基化。这种效应明显取决于给药途径，因为它仅在静脉注射AgNPs后出现(图2)。对于柠檬酸盐包覆的AgNPs也观察到了类似的趋势，但该效应无统计学意义。
图2. 来自对照小鼠以及通过胃内或静脉途径给予柠檬酸盐或聚乙二醇包被的银纳米颗粒的小鼠的4T1肿瘤中赖氨酸4、赖氨酸9和赖氨酸27处组蛋白H3的乙酰化和甲基化水平。显示了平均值和标准差。星号表示与对照组相比具有统计学显著差异。 。
静脉注射聚乙二醇包被的银纳米颗粒(PEG-coated AgNPs)的小鼠肿瘤中，赖氨酸9(Lys9)和赖氨酸27(Lys27)的甲基化水平均显著降低。然而，在胃内给予这种类型的银纳米颗粒后，仅在赖氨酸27处观察到显著的甲基化降低。对于用柠檬酸盐包被的银纳米颗粒(citrate-coated AgNPs)处理的动物所取出的肿瘤，观察到了不同的模式。在这种情况下，仅在胃内给药的小鼠肿瘤中的赖氨酸27处观察到甲基化水平显著降低(图2)。
一般来说，用银纳米颗粒(AgNPs)处理荷4T1肿瘤小鼠会降低肿瘤组织中的组蛋白H3甲基化，静脉注射聚乙二醇(PEG)包覆的银纳米颗粒时这种效果最为明显。
3.3. 银纳米颗粒处理对肿瘤组织中染色质修饰酶表达的影响
进行基因表达分析，以检查观察到的DNA和组蛋白H3甲基化减少是否伴随着负责染色质修饰的酶和因子的表达变化。实时PCR阵列分析结果显示，有15个基因的表达在肿瘤组织中受到银纳米颗粒处理的影响(图3，补充表S1)。其中六个编码甲基转移酶(Setd4、Setdb1、Smyd3、Suv39h1、Suv420h1和Whsc1)，两个编码去甲基酶(Kdm1a和Kdm5b)，三个编码乙酰转移酶(Esco2、Hat1和Myst3)，一个编码组蛋白脱乙酰酶(Hdac5)[25,26]，一个编码DNA甲基化酶(Dnmt1)[27]。两个编码参与泛素化过程的蛋白质的基因也受到影响(Ube2b和Usp22)[28,29]。
图3. 续。
图3. 经胃内或静脉注射柠檬酸盐或聚乙二醇包被的银纳米颗粒处理的小鼠肿瘤中，负责染色质修饰的酶的相对mRNA表达水平。柱状图显示平均倍数变化。 whiskers代表根据 值的标准差计算出的最小和最大倍数变化。星号表示与对照组相比有统计学显著差异。 。
3.4. 银纳米颗粒处理对肿瘤组织中癌基因和抑癌基因表达的影响
由于DNA和组蛋白的甲基化是调节基因表达的一种强大的表观遗传机制，我们分析了银纳米颗粒处理诱导的DNA和组蛋白H3甲基化变化与同一样本中癌基因和抑癌基因表达之间的可能相关性。实时PCR阵列分析显示，经聚乙二醇包被的银纳米颗粒处理的小鼠肿瘤中有五个基因下调(Akt1、Brca1、Brca2、Mlh1和Myb)，经柠檬酸盐包被的银纳米颗粒处理的小鼠肿瘤中有两个基因下调(Ccnd1和Src)(图4，补充表S2)。
3.5. 银纳米颗粒处理不影响肿瘤组织中与转移相关的miRNA的表达
对接受柠檬酸盐包被的银纳米颗粒处理的小鼠及其相应对照组的肿瘤组织中与上皮-间质转化和转移相关的13种miRNA的表达进行了分析。未发现miRNA表达有显著变化(图5)。
图4. 经胃内注射柠檬酸盐或聚乙二醇包被的银纳米颗粒处理的小鼠肿瘤中，癌基因和抑癌基因的相对mRNA表达水平显著失调。显示了根据 值的标准差计算出的平均倍数变化以及最小和最大倍数变化。星号表示与对照组相比有统计学显著差异。 。
图5. 经胃内或静脉注射柠檬酸盐包被的银纳米颗粒处理的小鼠肿瘤中，与上皮-间质转化和转移相关的miRNA的相对表达水平。显示了根据 值的标准差计算出的平均倍数变化以及最小和最大倍数变化。 。
4. 讨论
表观遗传修饰被定义为主要由三个密切调控且相互关联的过程控制的稳定且可遗传的改变:DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA的表达。它们共同改变染色质结构和DNA可及性，从而导致基因表达模式的调节[16]。重要的是要记住，表观遗传变化的观察结果始终是表观遗传因素以及将它们联系起来的许多正负反馈回路的协同作用。
胞嘧啶甲基化是研究最广泛的表观遗传修饰，主要与基因沉默相关。DNA甲基化是基因组印记中的一个关键因素，因为亲本等位基因之一的高甲基化会导致单等位基因表达 -
参考文献[30]。DNA甲基化由DNA甲基转移酶催化，如DNMT1和DNMT3B。DNMT1主要负责在DNA复制过程中维持甲基化，而DNMT3B参与DNA的从头甲基化[31]。癌细胞的DNA甲基化整体显著降低(总体5-甲基胞嘧啶减少20%-60%)。同时，经常观察到肿瘤抑制基因启动子区域的高甲基化[31]。在本研究中，观察到用银纳米颗粒处理的小鼠肿瘤中整体DNA甲基化降低(图1)。这与其他作者发表的结果一致。例如，真木等人报道，直径为10、50或 的柠檬酸盐包被的银纳米颗粒在体外可降低A549肺泡上皮细胞中甲基化DNA的含量。这伴随着Dnmt1蛋白水平的降低，而经 银纳米颗粒处理后，Dnmt3b水平显著升高[32]。与这些结果一致，我们观察到用银纳米颗粒处理的小鼠肿瘤中Dnmt1的表达显著降低(图3)。然而，这一观察结果并不能完全解释检测到的DNA甲基化降低，因为它与观察到的DNA甲基化变化并不完全相关。虽然经胃内和静脉注射银纳米颗粒处理的小鼠中Dnmt1表达均降低，但DNA甲基化仅在静脉注射后降低。此外，用柠檬酸盐包被的银纳米颗粒处理的小鼠中DNA甲基化降低，但Dnmt1水平保持不变。显然，Dnmt1活性的调节是复杂的，不限于转录水平。真木等人认为，银纳米颗粒通过蛋白酶体介导的Dnmt1降解诱导DNA低甲基化[32]。在我们的案例中，似乎涉及多种Dnmt1调节机制。在本研究中，用银纳米颗粒处理后，Dnmt3的表达没有显著变化(补充表S1)。与高脂饮食喂养的小鼠相比，经银纳米颗粒处理的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠的肝脏组织中整体DNA甲基化和羟甲基化也显著降低[33]。在另一项研究中，研究了 对怀孕小鼠的影响。研究结果表明，银纳米颗粒扰乱了第一次减数分裂的进程以及胎盘组织中印迹基因的表达。特别是，经银纳米颗粒处理的胎盘中Zac1基因的甲基化显著降低，而在银纳米颗粒处理组中Igf2r的甲基化略有增加[9]。
相反，一些实验表明，用亚致死浓度的银纳米颗粒处理后，体外培养的A549、293T和HEK293T细胞中的整体DNA甲基化增加[34]。在HEK293T细胞中，DNA甲基化增加伴随着DNMT1和DNMT3a蛋白水平的升高以及TET2甲基胞嘧啶双加氧酶表达的降低[20]。因此，布兰科等人报道，用聚乙烯吡咯烷酮包被的银纳米颗粒处理的A549细胞中DNA甲基化增加；然而，在这种情况下，纳米颗粒的使用浓度对细胞有毒[35]。在用 银纳米颗粒在半数有效浓度(EC50)处理HT22细胞后，也观察到5-甲基胞嘧啶和DNMT酶水平升高[36]。
本研究分析的另一种非常重要的表观遗传机制是翻译后组蛋白修饰，它负责染色质重构，进而调控转录。分析聚焦于H3组蛋白的四种重要修饰，即赖氨酸9位的乙酰化以及赖氨酸4、9和27位的甲基化。赖氨酸9和27位的甲基化通常与转录抑制相关，而赖氨酸4位的甲基化和赖氨酸9位的乙酰化在活跃基因区域更为富集[18]。尽管我们未观察到赖氨酸9位乙酰化的任何变化，但研究发现所研究的所有三个赖氨酸残基的甲基化水平有下降趋势(图2)。静脉注射聚乙二醇包覆的银纳米颗粒时，这种效应最为明显。关于银纳米颗粒诱导组蛋白修饰变化的文献较少。与本文结果一致，钱等人证明聚乙烯吡咯烷酮包覆的银纳米颗粒通过减少红系细胞中赖氨酸4和赖氨酸79的甲基化来降低β-珠蛋白转录。作者认为分子机制涉及组蛋白甲基转移酶DOT-1L和MLL的减少以及银纳米颗粒与组蛋白的直接结合，这种结合诱导空间位阻效应从而阻止甲基化[37]。另一篇报道描述了
用聚乙烯吡咯烷酮包覆的银纳米颗粒处理后A549细胞中组蛋白H3的去乙酰化[35]。瓦穆乔等人表明，土壤线虫秀丽隐杆线虫暴露于原始银纳米颗粒及其环境转化产物硫化银纳米颗粒会诱导组蛋白H3甲基化的变化。暴露于原始银纳米颗粒会使赖氨酸4位的甲基化增加，而暴露于硫化银纳米颗粒会显著降低赖氨酸4和赖氨酸9位的H3甲基化[38]。这三篇报道以及本研究表明，银纳米颗粒对组蛋白修饰的影响很大程度上取决于银纳米颗粒的配方和所使用的实验模型。
组蛋白修饰由多种酶调控，包括组蛋白甲基转移酶、去甲基酶、乙酰转移酶和去乙酰酶。为阐明所观察到的组蛋白H3甲基化变化的机制，我们对肿瘤样本中染色质修饰酶的表达进行了分析(图3，补充表S1)。观察到的基因表达变化与组蛋白修饰模式没有明显的相关性。尽管我们观察到三种组蛋白乙酰转移酶和一种去乙酰酶的表达有变化，但组蛋白乙酰化并未发生改变。同样，即使编码甲基转移酶的六个基因发生了变化，它们也与所观察到的H3甲基化变化不相关。缺乏明显相关性的一个原因可能是观察到的基因表达变化相对较小，不超过两倍。因此，它们的生物学意义值得怀疑。另一方面，这些观察结果支持了钱等人的假设，他们推测组蛋白H3甲基化的降低(至少部分)是银纳米颗粒与组蛋白结合从而阻碍酶对其修饰的结果[37]。
表观遗传机制，如DNA甲基化和组蛋白修饰，可调节基因表达。在之前对同一组肿瘤样本进行的研究中，我们未发现与上皮-间质转化(EMT)和转移相关的基因表达有任何显著变化。在与炎症相关的基因中，只有白细胞介素12b(II12b)在经胃内给予柠檬酸盐包被的银纳米颗粒(AgNPs)的小鼠所采集的肿瘤组织中上调[22]。在本研究中，使用了专门的PCR芯片来评估一组癌基因和肿瘤抑制基因的表达水平。本研究的这一部分仅限于经胃内给予AgNPs的小鼠，因为只有该实验组观察到了转移抑制。在这组小鼠中，观察到DNA甲基化降低以及赖氨酸27处的组蛋白H3甲基化降低(图1和图2)。这两种修饰都与转录抑制相关；因此，预计基因表达会上调。令人惊讶的是，只有七个基因受到显著影响，并且所有这些基因都下调了(图4)。此外，一组不同的基因受到柠檬酸盐包被和聚乙二醇(PEG)包被的AgNPs的影响，其中PEG包被的纳米颗粒的影响似乎更明显。下调的基因属于癌基因类别(蛋白激酶B1(Akt1)、细胞周期蛋白D1(Ccnd1)、髓细胞白血病1(Myb)和肉瘤病毒癌基因(Src))和肿瘤抑制基因(乳腺癌1号基因(Brca1)、乳腺癌2号基因(Brca2)和错配修复蛋白1(Mlh1))。与致癌作用相关的基因表达中这些相当小的变化与我们之前的研究观察结果一致，即AgNPs处理对肿瘤生长动力学没有影响[22]。
本研究中评估的第三种表观遗传机制是微小RNA(miRNA)表达。我们之前已经表明，包括AgNPs在内的纳米材料可以在体外影响miRNA表达[21]，这与其他研究[39 - 41]一致。在这里，分析集中在已知与EMT和转移相关的miRNA上，希望找到可能导致观察到的AgNPs介导的转移抑制的表观遗传机制。然而，在从接受AgNPs的小鼠采集的肿瘤组织中未发现miRNA表达的变化(图5)，这支持了我们之前论文中提出的假设，即AgNPs介导的转移抑制不是纳米颗粒对癌细胞直接作用的结果，而是AgNPs诱导的免疫系统活性调节的结果[22]。
总之，我们已经表明AgNPs会影响细胞调节的表观遗传机制，如DNA和组蛋白甲基化，以及体内肿瘤组织中的基因表达。然而，观察到的变化的意义以及导致其发生的机制尚不清楚，因此该领域需要更多的研究。尽管如此，
本研究的结果对生物医学领域很重要，因为它们指出表观遗传效应是纳米材料与生物系统之间相互作用的一个重要层面。因此，不仅在纳米毒理学研究期间，而且在新型基于纳米颗粒的抗癌疗法的开发和评估过程中，都应始终考虑纳米材料诱导的表观遗传效应。
补充材料:可在以下网址下载以下支持信息:https://www.mdpi.com/article/10.3390/ma16114163/s1，表S1:经胃内或静脉内给予柠檬酸盐或PEG包被的AgNPs的小鼠肿瘤中染色质修饰酶在mRNA水平的表达。Rq - 相对于对照的平均表达水平。相对于对照的统计学显著变化用突出显示；表S2:经胃内给予柠檬酸盐或PEG包被的AgNPs的小鼠肿瘤中癌基因和肿瘤抑制基因在mRNA水平的表达。Rq - 相对于对照的平均表达水平。相对于对照的统计学显著变化用突出显示。
作者贡献:概念构思，M.E.和M.K.；数据整理，K.B.、M.S.和M.K.；形式分析，K.B.、M.S.和M.K.；资金获取，M.K.；调查，K.B.、M.S.、A.D.、M.S.、D.M.-W.、L.K.-S.和B.S.；方法学，K.B.、M.E.和B.S.；项目管理，M.K.和L.K.-S.；资源，M.K.、L.K.-S.、K.B.和M.S.；监督，M.K.和M.E.；验证，M.K.和M.E.；可视化，K.B.和B.S.；撰写原始草案，K.B.和B.S.；撰写 - 审阅和编辑，M.K.所有作者都已阅读并同意发表的手稿版本。
资金来源:本研究由波兰国家科学中心(NCN)资助，资助编号为2014/15/B/NZ7/01036，同时还获得了波兰科学与高等教育部对核化学与技术研究所的法定资金支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、决定发表以及撰写本文稿过程中均未发挥任何作用。
机构审查委员会声明:本研究遵循《赫尔辛基宣言》的指导方针进行，所有程序均获得第一地方动物实验伦理委员会批准，批准号分别为109/2016、215/2016、216/2016、217/2016。
知情同意声明:不适用。
数据可用性声明:原始数据可向通讯作者索取。
致谢:作者感谢克里斯蒂娜·乌尔班斯卡(Krystyna Urbańska)进行的有益讨论。
利益冲突:作者声明无利益冲突。
References
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柠檬酸盐,银纳米颗粒,小鼠4T1乳腺癌肿瘤
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