饥饿和淹水条件下水稻组蛋白赖氨酸丁酰化、巴豆酰化和乙酰化的动力学及功能相互作用
发布时间：
2025-12-21 17:18
饥饿和淹水条件下水稻组蛋白赖氨酸丁酰化、巴豆酰化和乙酰化的动力学及功能相互作用
陆悦 ，徐秋涛 ，刘媛 ，余悦 ，程仲毅 ，赵宇 和周道绣
摘要
背景:短链脂肪酸介导的组蛋白赖氨酸酰化与染色质中广泛研究的组蛋白赖氨酸乙酰化不同，尽管这两种修饰在哺乳动物细胞中均受初级代谢调控。在具有独特初级代谢调控途径的植物中，组蛋白酰化和乙酰化是否以及如何相互作用以调控基因表达仍不清楚。
结果:我们通过质谱鉴定了水稻组蛋白上的4个赖氨酸丁酰化(Kbu)位点(H3K14、H4K12、H2BK42和H2BK134)和45个巴豆酰化(Kcr)位点。全基因组Kbu、Kcr和H3K9ac的比较分析结合RNA测序显示，水稻中有25,306个基因被Kbu和Kcr标记，超过95%的H3K9ac标记基因也被二者标记。Kbu和Kcr在表达基因的 区域富集。在饥饿和淹水条件下的水稻中，与H3K9ac相比，Kbu和Kcr的动态变化似乎较小，且在不同的基因集中表现出变化。此外，Kbu似乎优先通过外部胁迫使基因激活，而不是像已证明与H3K9ac紧密相关的内部昼夜节律。另外，我们表明水稻沉默调节蛋白组蛋白去乙酰化酶(SRT2)参与Kcr的去除。
结论:Kbu、Kcr和H3K9ac冗余标记大量活跃基因，但对外部和内部信号表现出不同反应。因此，水稻组蛋白赖氨酸乙酰化和酰化的比例受环境和代谢线索动态调控,这可能代表一种表观遗传机制，用于微调基因表达以适应植物生长。
背景
组蛋白的翻译后修饰影响染色质状态和基因表达。例如, -氨基上的组蛋白赖氨酸乙酰化不仅中和了氨基的正电荷，增强了疏水性，增加了赖氨酸侧链的大小，还为参与染色质和基因调控的蛋白质结合提供了平台。组蛋白乙酰化/去乙酰化是多种生物学过程表观遗传调控中的一个重要过程，包括植物对环境胁迫的反应[1-３]。组蛋白乙酰化水平由组蛋白乙酰转移酶(HAT)和去乙酰化酶(HDAC)的活性决定。组蛋白乙酰化可受初级代谢调控，因为关键代谢物如乙酰辅酶A和NAD+参与蛋白质乙酰化和去乙酰化过程，它们的细胞水平可能调控HAT和HDAC的活性[4,5]。植物代谢在很大程度上受到调控以适应不断变化的环境。因此，表观遗传动力学和代谢之间的协同程序与环境线索进一步相互关联，这可能优化植物的适应性反应和生长[2]。
最近，研究表明组蛋白可以被短链脂肪酸酰化，包括丙酰化，
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*通讯作者:dao-xiu.zhou@u-psud.fr
陆悦和徐秋涛对本工作贡献相同。
作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉430070，中国
巴黎萨克雷植物科学研究所(IPS2)，法国国家科学研究中心(CNRS)，法国国家农业研究院(INRA)，巴黎萨克雷大学
巴黎第十一大学，巴黎萨克雷大学，91405奥赛，法国
作者完整信息列表见文章末尾。
据报道，组蛋白乙酰转移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)可能参与组蛋白酰化动态变化[12]。例如，哺乳动物CBP/p300作为一种组蛋白乙酰转移酶，催化组蛋白乙酰化和非乙酰化酰化[6, 10, 13, 14]。最初基于与酵母sir2组蛋白去乙酰化酶的序列同源性被注释为组蛋白去乙酰化酶的所有七种人类沉默调节蛋白(SIRT1 - 7)，已被描述为具有多种去酰化酶活性，尽管比其去乙酰化酶活性弱[9, 13, 15]。其他研究表明，含锌指结构域的HDACs也参与组蛋白赖氨酸残基的去巴豆酰化[12]。
植物中尚未对组蛋白酰化进行研究。作为光合生物，植物是自养型的，其初级代谢、能量代谢和信号传导途径存在显著差异。例如，糖酵解在生物和非生物胁迫下均被诱导，三羧酸(TCA)循环在光暗转换期间特别活跃[16, 17]。在具有独特初级代谢调控途径的植物中，组蛋白酰化和乙酰化如何相互作用以调节基因表达仍不清楚。
在本研究中，我们首先通过质谱分析水稻组蛋白丁酰化(Kbu)和巴豆酰化(Kcr)位点，然后比较Kbu、Kcr和赖氨酸乙酰化(H3K9ac)的全基因组分布，并结合水稻转录组分析。为研究代谢活性改变是否影响组蛋白酰化和乙酰化，我们通过持续黑暗(饥饿)和淹水处理水稻植株，并研究Kbu、Kcr和H3K9ac的全基因组变化以及基因表达。最后，我们测试了几种水稻HDACs的组蛋白去酰化活性。我们的结果表明，Kbu和Kcr是调节水稻基因表达的强大组蛋白修饰标记。水稻组蛋白酰化和乙酰化受环境信号动态调控，且可能通过不同机制去除。
结果
水稻组蛋白赖氨酸丁酰化(Kbu)和巴豆酰化(Kcr)位点的鉴定
为了研究组蛋白赖氨酸酰化是否存在于植物中，我们首先用特异性抗体进行免疫印迹，并在拟南芥、水稻、玉米和烟草中检测到组蛋白赖氨酸丁酰化(Kbu)和赖氨酸巴豆酰化(Kcr)(图1a)。为了鉴定植物组蛋白Kbu和Kcr位点，我们使用先前报道的质谱方法分析从水稻幼苗中分离的组蛋白[8]。分析在水稻组蛋白的H3(H3K14bu)和H4(H4K12bu)的N末端尾巴以及H2B的核心区域(K42和K134)检测到Kbu(图1b；附加文件1:图S1；附加文件2)。H3K14bu存在于酵母中，但在哺乳动物细胞中未检测到，而H4K12bu在酵母和哺乳动物细胞中均被检测到[6]。相比之下，在H3(K9、K14、K18、K23和K27)和H4(K8、K12和K16)的N末端尾巴中检测到大量Kcr位点(图1b)，其中大多数(H3的K9cr、K18cr、K23cr和K27cr以及H4的K8cr、K12cr和K16cr)也在人和小鼠细胞中被鉴定出来[8]。发现水稻中H2A的几个位点和H2B的许多位点被巴豆酰化(图1b)。总共在水稻组蛋白中鉴定出45个Kcr位点。Kcr位点不仅存在于核心组蛋白的N末端而且存在于球状结构域和C末端。
水稻全基因组组蛋白Kbu、Kcr和H3K9ac的比较分析
为了探索水稻中组蛋白Kbu和Kcr的染色质功能，我们对12日龄野生型幼苗进行了抗Kbu和抗Kcr染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)分析。为了研究组蛋白酰化与组蛋白乙酰化之间的关系，我们还用抗H3K9ac抗体进行了ChIP-seq分析。鉴定出超过30,000个Kbu和Kcr峰(附加文件1:表S1)，表明这两种组蛋白酰化修饰在水稻基因组中广泛分布，尽管一些读数/峰可能与除组蛋白之外的Kbu或Kcr修饰的染色质蛋白相关。Kbu和Kcr修饰在水稻中显示出与H3K9ac相似的基因组分布和图谱(图2a)。大多数Kbu和Kcr峰位于基因区域，并且这些修饰在蛋白质编码基因的转录起始位点(TSS)高度富集，并且与基因表达呈正相关(图2a，b)。相比之下，转座元件(TE)相关基因中的组蛋白Kbu和Kcr水平非常低(图2b)。Kbu和Kcr彼此高度相关，并且与活性组蛋白标记H3K9ac和H3K4me3高度相关，但与H3K9me2、H3K4me2或H3K27me3不相关(图2c)。Kbu和Kcr的基因组和基因分布在某种程度上与水稻中 的分布相似[18]。还观察到Kbu和Kcr与基因长度呈正相关(图2b)。总之，分析表明Kbu和Kcr是水稻中的活性染色质标记。
图1水稻组蛋白Kbu和Kcr修饰的鉴定。a通过免疫印迹检测从水稻、拟南芥、烟草和玉米幼苗中分离的组蛋白中的Kbu和Kcr。b通过质谱检测水稻组蛋白Kbu和Kcr位点(见附加文件1:图S1和附加文件2:数据集1)
在两个重复样本中，水稻中鉴定出26769个Kbu标记基因和26307个Kcr标记基因，其中大部分(25306个)被两种修饰共同标记，表明这两种标记高度共现(图3a)。有趣的是，几乎所有(>96%，21375个中的20511个)H3K9ac标记基因也被Kbu和Kcr修饰，而超过5000个基因被Kbu或Kcr标记，但未被H3K9ac标记(图3a)。然而，不排除这些基因在其他组蛋白赖氨酸残基处被乙酰化标记。在这些基因中，Kbu和Kcr在转录起始位点(TSS)处水平相对较低，但在基因体中水平较高(图3b)。ChIP-seq数据通过对修饰和未修饰基因的ChIP-qPCR测试进行了验证(附加文件1:图S2)。我们定量分析了标记基因中Kbu、Kcr或H3K9ac在总酰化中的比例，发现H3K9ac的比例变化范围比Kbu或Kcr更广(图3c)，表明H3K9ac更具动态性。
为了研究组蛋白酰化在基因表达中的潜在作用，我们对相同的植物材料进行了RNA-seq分析(附加文件1:表S2)。为了研究Kbu、Kcr和H3K9ac在基因表达中的功能关系，我们分析了由不同标记组合修饰的基因的表达水平(图3d)。H3K9ac标记的基因比仅由Kbu或Kcr标记的基因表达更高。由两种标记组合标记的基因比单标记基因表达更高。具有所有三种标记的基因显示出最高的表达水平。在具有三种标记的基因中，相对于Kbu或Kcr，H3K9ac比例较高的基因表达水平更高(图3e)。然而，具有三种标记的基因的总酰化水平并不高于仅具有两种标记的基因(图3f)。分析表明，H3K9ac在基因活性中占主导地位，Kbu和Kcr可能有助于H3K9ac调节的活性染色质状态。仅由Kbu或Kcr标记的基因(每百万映射标签每千碱基标签数，TPM>50)显示出低表达水平(FPKM<0.1)，并且在应激和非生物刺激反应中富集。其中许多基因在应激下高度诱导(附加文件1:图S3)，推测Kbu和Kcr可能在使基因准备好进行刺激诱导的激活中发挥作用。
图2水稻基因组中组蛋白Kbu和Kcr修饰的分布。a水稻基因组不同区域中组蛋白Kbu/Kcr峰的分布。 不同类别基因中Kbu和Kcr在全基因组的平均占有率。 Kbu、Kcr和其他组蛋白修饰的相关图。基因组被划分为1kb的区间，每个区间的TPM值用于计算相关系数
饥饿和淹水条件下水稻中Kbu、Kcr和H3K9ac的变化
组蛋白乙酰化/酰化的底物，如乙酰辅酶A、丁酰辅酶A和巴豆酰辅酶A，是重要的细胞初级代谢产物。长时间黑暗(饥饿)或淹水(切换到无氧呼吸)等应激条件会极大地影响植物初级代谢。为了研究饥饿和淹水是否改变了Kbu/Kcr/H3K9ac，我们将水稻幼苗在黑暗中处理 或在淹水条件下处理 。对饥饿和淹水诱导的标记基因进行qRT-PCR分析证实了处理的有效性(附加文件1:图S4A)。在 收获材料，并用于用抗Kbu、抗Kcr和抗H3K9ac抗体进行ChIP-seq以及RNA-seq。
染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)分析显示，处理组和对照组之间修饰基因的数量大致相似(补充文件1:表S1)。在两个重复样本中TPM变化倍数为 的基因被定义为差异修饰基因。根据这些标准，在饥饿和水淹处理下，分别有1324个和584个基因的H3K9ac增加，而有2488个和860个基因的该标记减少(图4)。在饥饿和水淹处理下，分别有279个和277个基因的Kbu水平升高，但有1260个和304个基因的Kbu水平降低。处理后显示Kcr变化的基因相对较少(图4a)。因此，H3K9ac似乎比Kbu和Kcr更具动态性。饥饿导致的H3K9ac变化比水淹更多，这表明细胞能量水平可能对植物组蛋白乙酰化有更高的影响。有趣的是，在饥饿(增加和减少)或水淹(减少)后显示Kcr变化的基因中，超过50%的基因也显示出Kbu的变化，这支持了许多基因上这两种标记的并发假说。相比之下，在饥饿或水淹后，只有约10 - 22%的H3K9ac变化基因显示出Kbu或Kcr的变化(图4a)，这表明在这些条件下，H3K9ac和Kbu/Kcr调节不同的基因集，并且H3K9ac和Kbu/Kcr动态调节可能涉及不同的机制。尽管如此，分别有180个(72个上调和108个下调)和85个(17个上调和68个下调)基因在饥饿和水淹处理下显示出三种标记的同时变化(图4；补充文件1:图S5)。
(见上一页的图。)
图３ Kbu、Kcr和H3K9ac修饰的不同组合影响基因表达。a Kbu/Kcr/H3K9ac修饰基因的维恩图。b 所有基因以及仅具有Kbu和Kcr修饰的基因(N = 4７95)中H3K9ac、Kbu和Kcr在全基因组范围内占用率的平均值。c 所有基因中H3K9ac/Kbu/Kcr修饰比例的密度曲线。I 具有不同修饰模式的基因的表达水平。基因数量:H3K9ac(N = 418)、H3K9ac + Kbu(N = 229)、H3K9ac + Kcr(N = 217)、H3K9ac + Kbu + Kcr(N = 20511)、Kbu(N = 1234)、Kcr(N = 784)、Kbu + Kcr ，所有基因 。Y轴代表通过log10(FPKM + 0.001)计算的基因表达水平。e 在正常条件下具有不同比例的H3K9ac、Kbu和Kcr的基因的表达水平。f 具有不同标记组合的基因的总酰化水平
同时，RNA测序(RNA-seq)分析显示，饥饿和水淹分别导致1967个(1045个上调，922个下调)和1305个(487个上调，818个下调)基因差异表达(FDR < 0.05，变化倍数 > 4)(补充文件1:表S2；图S4B)。基因本体(GO)分析表明，饥饿诱导的差异表达基因富集在能量代谢过程以及应激和刺激反应途径中(补充文件1:表S3)。除应激和刺激反应途径外，受水淹影响的基因还富集在核酸代谢和DNA结合过程中(补充文件1:表S4)。一些富集的基因类别在H3K9ac、Kbu和Kcr变化方面也有富集(补充文件1:表S3、表S4)。值得注意的是，在饥饿和水淹下H3K9ac增加或减少以及在水淹下Kbu和Kcr减少的基因中发现转录因子基因富集(补充文件1:表S3、表S4)。
图4 饥饿和淹水条件下水稻中Kbu、Kcr和H3K9ac的变化。a 饥饿和淹水处理后Kbu/Kcr/H3K9ac变化(增加和减少)的基因重叠情况。考虑了两个重复中TPM变化 倍的基因。b 不同处理下H3K9ac、Kbu和Kcr峰的低分辨率截图。箭头指示差异修饰区域(见附加文件1:图S5)
图5 Kbu、Kcr和H3K9ac动态变化在胁迫诱导和昼夜基因表达中的作用。a 饥饿和淹水条件下水稻中差异表达基因的Kbu、Kcr和HK9ace变化图。X轴:基因表达倍数变化(log2)；Y轴:基因赖氨酸酰化变化(logg2)；酰化水平(TPM)变化>1.5倍的基因用颜色标记。b 散点图显示饥饿/淹水差异表达基因中H3K9ac和Kbu/Kcr的比例变化。每种修饰的比例通过其在基因体中的TPM除以每个基因中的酰化TPM值(K9ac + Kbu + Kcr)来计算。c 具有不同酰化标记组合的饥饿和淹水上调基因的富集情况。**显著富集(p < 0.01)。d 由不同赖氨酸酰化组合标记的昼夜调节基因的富集情况(见附加文件1:图S6)。**显著富集
为了研究组蛋白乙酰化/酰化动态变化与基因表达变化之间的关系，我们分析了胁迫诱导的差异表达基因的H3K9ac、Kbu和Kcr TPM水平变化。分析表明，H3K9ac变化与基因表达变化 呈正相关，而Kbu或Kcr与基因表达变化之间的相关性较弱(图5a)。实际上，对Kbu、Kcr和H3K9ac比例同时变化的定量分析表明，上调的差异表达基因中H3K9ac比例增加而Kbu或Kcr比例降低，而下调基因中观察到相反的趋势(图5b)。该分析支持了上述假设，即H3K9ac在应激反应中的基因激活中占主导地位。饥饿和淹水分别导致283个和129个上调(>4倍)且H3K9ac升高(>1.5倍)的基因，以及371个和146个下调(>4倍)且H3K9ac降低(>1.5倍)的基因(图5a；附加文件3)。在饥饿条件下，除了光合基因外，糖酵解基因(如F1.6BP和GAPDH)表达和H3K9ac降低，而参与能量动员的基因(如编码脂肪酶和糖基水解酶的基因)表达和H3K9ac较高(附加文件3)。在淹水条件下，标志性标记基因Sub1C(Os09g11460，一种AP2转录因子)[19]和赤霉素生物合成基因GA20氧化酶被发现是表达和H3K9ac上调的基因之一。几个ZIM(参与茉莉酸信号传导)和VQ结构域基因，以及许多其他转录因子基因，表达和H3K9ac降低(附加文件3)。按照相同标准，相对较少的基因显示表达和Kbu或Kcr修饰同时变化(图5a；附加文件3)。大多数显示三种标记同时增加或减少的基因，如Sub1C和Os02g52650(图4a；附加文件1:图S4C)，分别上调和下调(附加文件4)。
Kbu可能使外部应激诱导的基因表达处于准备状态
为了检查Kbu和Kcr是否在使基因处于刺激诱导表达的准备状态中发挥作用，我们分析了饥饿和淹水条件下上调的基因，发现仅由Kbu标记或由Kbu和Kcr标记的基因与全基因组平均值相比显著富集(图5c)。相比之下，由三种标记同时修饰或仅由Kcr修饰的基因未观察到富集。该分析支持了Kbu可能具有使基因处于环境应激诱导激活准备状态的功能这一假设
为了研究Kbu是否具有通过内部信号平衡基因激活的功能，我们通过RNA测序(附加文件1:表S2)鉴定了在四个昼夜时间点的水稻幼苗中显示昼夜节律表达的基因，并通过对样品进行ChIP-seq分析H3K9ac(附加文件1:表S1)。在六个比较中的两个以上具有显著表达变化(FDR < 0.05，变化倍数> 2)的基因被认为具有昼夜节律(附加文件1:图S6A)。根据这些标准，发现了2867个昼夜循环基因(约占表达基因的13%)，它们的表达动态与H3K9ac水平紧密相关(附加文件1:图S6B和S6C)。被这三个标记同时标记的基因在昼夜表达中富集，而被Kbu和Kcr标记的基因则没有富集(图5d)。因此，Kbu似乎优先参与为应激诱导的激活平衡基因，而H3K9ac与内部昼夜节律基因表达相关。
SRT2参与水稻组蛋白Kcr的擦除
发现哺乳动物的沉默调节蛋白和锌指HDAC蛋白具有去丁酰化酶和/或去巴豆酰化酶活性[9, 20]。为了研究水稻沉默调节蛋白是否可以调节组蛋白Kbu和Kcr，我们使用抗Kbu和抗Kcr抗体通过免疫印迹分析了OsSRT1RNAi植物[21, 22]和ossrt2 CRISPR突变体(附加文件1:图S7)(附加文件1:图S8；图6a)。在OsSRT1 RNAi植物中，我们没有检测到Kbu或Kcr有任何明显差异，但与野生型植物相比，H3K9ac明显增加。在ossrt2突变体中，观察到H3K9ac和Kcr都增加，但Kbu没有增加。此外，我们分析了一种锌结合RPD3型HDAC HDA705 [23, 24]。其突变导致H3K9ac有所增加，但对Kbu和Kcr没有明显影响。结果表明OsSRT2具有去巴豆酰化酶活性。通过荧光测定法证实了大肠杆菌产生的OsSRT2-GST融合蛋白的体外去巴豆酰化酶活性(图6b)。SRT2中SIR2蛋白催化结构域中两个保守残基的替换消除了该活性(图6b)。ossrt2突变的相对较弱影响以及OsSRT11 RNAi对Kbu或Kcr没有影响可能表明OsSRT1和OsSRT2在水稻赖氨酸去酰化中具有冗余功能。
讨论
赖氨酸丁酰化(Kbu)和巴豆酰化(Kcr)导致烃链延长，增加了组蛋白中修饰赖氨酸残基的疏水性和体积，超过了赖氨酸乙酰化。这些表观遗传修饰是否以及如何影响基因表达以及它们如何被调控在植物中仍然未知。在这项工作中，我们在水稻中鉴定了大量水稻组蛋白Kbu和Kcr位点。尽管许多Kbu和Kcr位点在哺乳动物组蛋白中是保守的，但有几个似乎在植物中是特异的。例如，
图6(见下一页图例。)
(见上一页图。)
图6 水稻SRT2具有去巴豆酰化酶活性。a 通过免疫印迹法检测了与野生型(MH63、DJ和ZH11)相比，SRT1 RNA干扰、srt2 CRISPR和hda705 CRISPR植株中的组蛋白H3K9ac、Kbu和Kcr水平。每个样品上样两次，每次免疫印迹显示两个重复。每条带的相对定量信号以第一次野生型上样设置为1表示。b 通过荧光测定法检测OSsRT2的体外赖氨酸去巴豆酰化活性。左图，用大肠杆菌产生的OsSRT1 - GST蛋白进行测定。GST和催化结构域中突变的OsSRT2(S123Y和H215Y)用作对照。右图:用瞬时转染烟草细胞中产生的OsSRT1蛋白进行测定。柱形图为来自三个生物学重复的平均值 标准差。H3K14bu似乎仅存在于植物和酵母中。此外，我们发现水稻Kbu和Kcr在转录起始位点(TSS)区域达到峰值，这与人类或小鼠组蛋白Kbu和Kcr不同，除了TSS外，它们在 区域的增强子中也有一个峰值[8]。这可能是由于植物和哺乳动物基因顺式调控元件的结构差异。我们发现组蛋白Kbu和Kcr标记了水稻中的大量基因。大多数Kbu和Kcr标记的基因也被H3K9ac标记且具有转录活性，这似乎与在哺乳动物细胞中获得的结果不同，在哺乳动物细胞中已表明组蛋白乙酰化与高活性基因启动子的丁酰化动态竞争。水稻基因组中H3K9ac与Kbu/Kcr之间的高度重叠支持了这样一种模型，即基因组位点不是由特定酰化的存在或不存在来区分，而是可能由不同酰化的比例混合来区分。饥饿和淹水诱导的H3K9ac和Kbu/Kcr的差异变化表明，环境和代谢线索控制植物中组蛋白酰化的比例，从而控制响应基因的表达。最近在动物细胞中的几项研究表明，组蛋白酰化比例混合物的改变具有功能后果，并与不同的生理状态相关[10, 11, 25 - 27]。本研究中观察到的与Kbu和Kcr相比，H3K9ac与表达变化之间更高的相关性表明，在植物基因激活过程中，组蛋白酰化可能为H3K9ac提供一个平台。与此假设一致的数据表明，Kbu可能为应激诱导的基因激活做好准备。饥饿和淹水诱导不同基因集之间H3K9ac和Kbu/Kcr的变化，以及相对较少的基因在表达和Kbu或Kcr之间显示出同时变化，这些观察结果表明，在这些情况下，这两种组蛋白酰化标记和H3K9ac具有非冗余功能。因此，由环境和代谢变化调节的组蛋白酰化和乙酰化的相对水平可能是一种微调基因表达调控以适应植物的机制。
研究表明，组蛋白乙酰转移酶，如CBP/p300，可催化组蛋白乙酰化和非乙酰化酰化反应[6, 10, 13, 14]，且不同的酰基辅酶A会竞争与该酶的结合[9]。由ATP柠檬酸裂解酶(ACL)从胞质/核酸柠檬酸产生的乙酰辅酶A是组蛋白乙酰化的主要来源。通过敲低 来消耗乙酰辅酶A会降低动物和植物细胞中的组蛋白赖氨酸乙酰化水平[28, 29]。动物细胞中乙酰辅酶A的细胞质和细胞核池减少会导致CBP/p300催化的Kcr增加，而补充乙酰辅酶A池可减少Kcr的增加[10]。因此，在乙酰辅酶A减少的条件下，其他酰基辅酶A形式将更频繁地用于修饰组蛋白。水稻中Kbu和Kcr在饥饿和淹水条件下的相对稳定性可能是由于在这些条件下三羧酸循环(TCA)活性较低，导致胞质/细胞核乙酰辅酶A减少，这可能有利于稳定组蛋白Kbu/Kcr酰化。此外，饥饿和淹水期间H3K9ac与Kbu/Kcr之间的动态差异也可能与其去除机制的差异有关，因为只有ossrt2的突变对Kcr有影响，而三种测试的HDAC(SRT1、SRT2和HDA705)均导致H3K9ac增加(图6)。这与非乙酰组蛋白酰化主要由沉默调节蛋白HDAC去除，而赖氨酸乙酰化可由沉默调节蛋白和含锌HDAC逆转的观点一致[9]，尽管哺乳动物HDAC1显示具有去巴豆酰化酶活性[12]。然而，不排除检测所有组蛋白位点修饰的抗Kbu和抗Kcr抗体可能不容易检测到特定组蛋白赖氨酸位点的变化。与单一修饰(H3K9ac)相比，不同赖氨酸上的Kcr或Kbu的信号混合物变化可能较小。此外，Kbu/Kcr/H3K9ac可能在胁迫期间的不同时间点受到调节。也不排除与胁迫相关的其他因素可能参与组蛋白酰化的差异变化。
结论
我们鉴定了许多植物组蛋白Kbu和Kcr位点，这些位点标记了水稻中的大量基因。Kbu和Kcr位点在活跃基因的5’区域富集，并且大多数H3K9ac标记的基因同时被Kbu和Kcr标记。然而，组蛋白Kbu、Kcr和H3K9ac在响应环境和代谢线索时表现出不同的动态变化，并且在饥饿和淹水条件下的水稻基因激活中具有非冗余功能。组蛋白酰化(即Kbu)可能使基因易于受到胁迫诱导，并在植物基因激活过程中为H3K9ac提供一个平台。我们的数据表明，水稻组蛋白赖氨酸乙酰化和酰化的比例受环境和代谢信号动态调节，这可能是微调植物适应环境变化的表观遗传控制的一种机制。
方法
植物材料与处理
水稻(Oryza sativa)野生型、突变体或RNAi植株在无激素的1/2强度Murashige和Skoog培养基上，于 的光照/黑暗条件下，在 发芽并生长。对于饥饿处理，将10日龄的野生型东津(DJ)幼苗在 转移到黑暗中并培养 。对于淹水处理，将12日龄的野生型幼苗在中午(上午12:00)淹没在蒸馏水中 。所有样品的幼苗叶片在下午6:00收获，用于染色质和总RNA提取。
组蛋白提取与免疫印迹分析
使用EpiQuik总组蛋白提取试剂盒(美国Epigentek公司，OP-0006-100)从拟南芥、水稻、玉米和烟草植株的幼苗中提取富含组蛋白的组分。将富含组蛋白的组分用于免疫印迹分析；本研究中使用的抗体为抗H3(ab1791；Abcam)、抗H3K9ac(07-352；Millipore)、抗丁酰赖氨酸(PTM-301；PTM Biolabs)和抗巴豆酰赖氨酸(PTM-501；PTM Biolabs)。使用ImageJ(v1.6.0_24)对免疫印迹结果进行定量分析。
CRISPR/Cas9系统的载体构建
CRISPR/Cas9系统的单向导RNA(sgRNA)设计和质粒构建如前所述[30]进行。使用网络应用工具CRISPR-P(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr)选择靶向目标基因外显子的sgRNA。Cas9目的载体由玉米泛素启动子驱动，用于在水稻中表达，sgRNA表达由U3 sgRNA的III型启动子驱动。采用Gibson Assembly克隆方法[31]转移sgRNA，之后将用于共表达Cas9和sgRNA的二元T-DNA载体转化到水稻愈伤组织中。OsSRT2(LOC_Os12g07950)和OsHDA705(LOC_Os08g25570)的基因组序列来自水稻基因组注释项目(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。OsSRT2和OsHDA705的突变位点见补充文件1:图S7。
LC-MS/MS及数据分析
水稻幼苗用液氮研磨；核心组蛋白用H2SO4提取并用胰蛋白酶消化。赖氨酸巴豆酰化(Kcr)和丁酰化(Kbu)肽段用预洗抗体珠(杭州PTM Biolabs)富集。洗脱的肽段按照制造商的说明用C18 ZipTips(Millipore)进行清洗，然后进行LC-MS/MS分析。所得的MS/MS数据使用带有集成Andromeda搜索引擎(v.1.5.2.8)的MaxQuant进行处理。串联质谱针对与反向诱饵数据库串联的UniProt_Oryza sativa数据库(https://www.uniprot.org/)进行搜索。蛋白质、肽段和修饰位点的错误发现率阈值设定为1%；最小肽段长度设定为7；位点定位概率设定为 。
染色质免疫沉淀
两克水稻幼苗叶片用1%甲醛交联，用于染色质提取。超声处理后，染色质片段与包被有抗体(抗H3K9ac、抗Kbu和抗Kcr)的磁珠(Invitrogen/Life Technologies；10001D)孵育过夜。通过斑点印迹法(补充文件1:图S8)测试抗Kbu和抗Kcr的特异性。经过大量洗涤后，免疫沉淀的染色质进行去交联并回收用于qPCR或测序。使用抗H3K9ace(07-352；Millipore)、抗丁酰赖氨酸(PTM-301；PTM Biolabs)和抗巴豆酰赖氨酸(PTM-501；PTM Biolabs)抗体。
ChIP-seq及数据分析
染色质免疫沉淀得到的DNA按照Illumina TruSeqChIP样品制备套装A提供的方案构建测序文库，并在Illumina HiSeq 2000上采用PE 150方法进行测序。
使用Trimmomatic(版本0.32)过滤低质量 reads。通过Bowtie2(版本2.2.5)将clean reads映射到水稻基因组(MSU7.0)，允许最多两个错配。使用Samtools(版本0.1.19)去除潜在的PCR重复序列，并使用MACS软件(版本1.4.2)[32]按照默认参数(带宽，300 bp；模型倍数，10,30； 值，1.00e - 5)调用组蛋白修饰峰。MACS软件生成的Wig文件用于通过IGV(版本2.3.88)进行数据可视化。在两个重复样本中，基因体或基因上游2 kb处有修饰峰的基因被定义为修饰基因。每百万映射reads中每千碱基基因长度的标签数(TPM)用于分析基因修饰水平；两个重复样本中TPM倍数变化 的基因被视为差异修饰基因。
在分析不同组蛋白修饰之间的关系时，将水稻基因组划分为 个bin，并使用每个bin中的TPM值计算相关系数；数据通过R包corrplot(v0.77)进行可视化。在绘制基因上修饰分布的曲线时，将基因体和 - kb区域划分为50 - bp的bin，并绘制每个bin中的平均TPM。每个修饰的比例通过基因体中的TPM值除以每个基因中总酰化TPM值(K9ac + Kbu + Kcr)来计算。
RT - qPCR和ChIP - qPCR分析
使用TRIzol试剂(Invitrogen)分离总RNA。使用4微克总RNA与逆转录试剂盒(Promega)合成互补DNA。在ABI 7500实时PCR系统上使用SYBR Premix ExTaq(TaKaRa)进行实时PCR。在RT - qPCR或ChIP - qPCR中，分别使用水稻ACTIN水平或输入(未进行免疫沉淀的染色质样品)进行标准化。RT - qPCR和ChIP - qPCR中使用的引物列于附加文件1:表S5。
RNA - seq和数据分析
使用TRIzol试剂(Invi - trogen)分离RNA样品。使用Illumina TruSeq RNA Sample Preparation Kit制备RNA - seq文库，并在Illumina HiSeq 2000上采用PE1�0方法进行测序。
通过Trimmomatic(版本0.33)过滤RNA - seq数据以去除污染和低质量reads。使用Tophat(版本2.0.14)和Cufflinks(版本2.2.1)[33]将clean reads映射到水稻基因组(MSU 7.0)并计算差异表达基因。在饥饿或淹水处理中，校正后的 值 且倍数变化 的基因被视为差异表达基因。
体外赖氨酸去巴豆酰化测定
对于OsSRT2点突变，设计覆盖突变位点(S123Y和H215Y)的正向和反向引物(附加文件1:表S6)，并采用融合PCR获得突变的OsSRT2编码序列，然后将其连接到蛋白质表达载体PGEX4T - 1。OsSRT2 - GST、OsSRT2 - GST突变体和GST蛋白在大肠杆菌中表达，并使用谷胱甘肽琼脂糖4B珠(GE Healthcare 17 - 0756101)进行纯化。将OsSRT2全长cDNA克隆到位于35S启动子和GFP序列之间的pCambia 1301载体中。将所得载体35S - SRT2 - GFP和空载体(35S - GFP)转染到烟草叶细胞中。在 感染后，收获叶片。将约2 - g样品在液氮中研磨成细粉。按照先前描述的方法[21]提取核蛋白，并悬浮在 反应缓冲液中。
反应按照文献[8]所述进行，在96孔微孔板中每孔最终体积为 。简要地说，将 的Boc-Lys(巴豆酰基)-AMC储备溶液 与 纯化蛋白或 核裂解物加入到反应缓冲液 (Tris-HCl，130 mM NaCl，3.0 mM KCl，1 mM MgCl2，0.1% PEG8000，500 μM NAD ，pH = 8.0)中，并在 孵育 。然后通过加入 的胰蛋白酶溶液 (Tris-HCl， NaCl，3.0 mM KCl，1 mM MgCl，30%异丙醇， 胰蛋白酶， )终止反应。将所得溶剂混合并在 再孵育 。通过荧光酶标仪在激发波长和发射波长分别为 和460 nm下分析荧光。Boc-Lys(巴豆酰基)-AMC由赵英明教授实验室提供。
基因本体分析
使用水稻基因组注释项目(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中提供的基因本体分类，按照基因本体联盟数据库(http://www.geneontology.org/external2go/tigr2go)的标准将基因分配到分层生物过程中。使用Pearson卡方检验计算特定GO项的 值，并通过FDR进行校正，以0.05的FDR截止值作为显著性阈值。
附加文件
附加文件1:图S1 - 图S8和表S1 - 表S6。(PDF 469 kb)
附加文件2:LC-MS结果。(XLSX 76 kb)
附加文件3:淹没或饥饿条件下H3K9ac、Kbu或Kcr相关变化的上调或下调基因列表。(XLSX 79 kb)
附加文件4:Kbu、Kcr和H3K9ac同时变化的基因表达水平。(XLSX 40 kb)
附加文件5:审阅历史。(DOCX 37 kb)
致谢
我们感谢赵英明教授慷慨提供用于酶活性测试的巴豆酰基-AMC。
资金
本研究得到了中国国家自然科学基金[31730049]、中国国家重点研发计划[2016YFD0100802]、华中农业大学科技创新基金[项目编号2016RC003]以及中央高校基本科研业务费[2662015PY228]的资助。
数据和材料的可用性
本研究产生的完整质谱数据可在ProteomeXchange(http://www.proteomexchange.org/)上找到，登录号为PXD009091 [34]。本研究中生成的高通量测序数据已存入GEO数据库，登录号为GSE111308 [35]。使用的公开可用数据集如下:H3K4me3和H3K27me3 ChIP-seq数据来自GSE19602 [36]，H3K4me2和H4K12ac ChIP-seq数据来自GSE26734 [37]，H3K9me2 ChlP-seq数据来自GSE81436 [38]，干旱处理的RNA-seq数据来自GSE81462 [39]，盐处理的RNA-seq数据来自GSE101734 [40]，冷处理的RNA-seq数据来自GSE67373 [41]。
审阅历史
审查历史记录可作为补充文件5获取。
作者贡献
YL和QX进行了大部分实验并分析了数据。YL、YY和YZ参与了实验。ZYC负责质谱分析并提供试剂。DXZ监督项目，分析数据，并在YL和QX的协助下撰写了论文。所有作者阅读并批准了最终稿件。
伦理批准和参与同意
不适用。
发表同意
不适用。
利益冲突
作者声明他们没有利益冲突。
出版商说明
施普林格·自然对于已发表地图中的管辖权主张和机构隶属关系保持中立。
作者详情
作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学，武汉 430070，中国。 巴黎萨克雷植物科学研究所 (IPS2)，法国国家科学研究中心，法国国家农业研究院，巴黎第十一大学，巴黎萨克雷大学，91405 奥赛，法国。 景杰生物科技有限公司，杭州 310018，中国。
收稿日期:2018 年 3 月 25 日 录用日期:2018 年 9 月 10 日 网络发表日期:2018 年 9 月 25 日
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