开发改良型HDAC6抑制剂作为轴索性夏科-马里-图斯病的药物治疗方法
发布时间：
2026-01-08 21:10
开发改良型HDAC6抑制剂作为轴索性夏科-马里-图斯病的药物治疗方法
维罗尼克·贝努瓦 - 彼得·范登伯格 - 马修·贾普 - 菲利普·范达姆 。维姆·罗贝雷克 - 卢多·范登博施
摘要 夏科-马里-图思病(CMT)是最常见的遗传性周围神经病，估计患病率为1/2500。运动和感觉神经轴突的退化导致运动和感觉症状，这些症状会随着时间的推移而进展，并对这些患者的日常生活产生重要影响。目前，尚无治愈性治疗方法。最近，我们确定了使 -微管蛋白去乙酰化的组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)，作为轴索性CMT(CMT2)的潜在治疗靶点。对HDAC6去乙酰化功能的药理学抑制逆转了突变小鼠模型中的运动和感觉缺陷
"小热休克蛋白B1"(HSPB1)在行为和电生理水平上诱导了CMT2。为了将这种潜在的治疗策略转化为临床应用，强效且具有选择性的HDAC6抑制剂类小分子药物至关重要。为了筛选这些药物，我们开发了一种方法，该方法由3个不同阶段组成，并基于突变型HSPB1诱导的CMT2小鼠模型的病理发现。测试了三种不同的抑制剂(ACY - 738、ACY - 775和ACY - 1215)，结果表明它们都是强效且具有选择性的HDAC6抑制剂。此外，这些抑制剂增加了……的神经支配
要点
- 开发了一种筛选方法，以鉴定作为强效和选择性组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)抑制剂的类药物小分子。
- 两种HDAC6的嘧啶羟基酰胺小分子抑制剂(ACY-738和ACY-775)对HDAC6抑制表现出高效力和选择性。
- ACY-738和ACY-775恢复了从突变热休克蛋白B1诱导的CMT2小鼠模型培养的背根神经节神经元中的线粒体轴突运输缺陷。
- 所有HDAC6抑制剂(ACY-738、ACY-775和ACY-1215)均改善了运动和感觉神经传导以及神经肌肉接头的神经支配。
- ACY-1215是一个值得在临床试验中进一步测试的有趣候选药物，因为在癌症临床试验中已证明其安全且耐受性良好。
M 卢多·范登·博施
ludo.vandenbosch@vib-kuleuven.be
1 鲁汶大学，神经科学系，实验神经学与鲁汶神经科学与疾病研究所(LIND)，鲁汶大学，比利时鲁汶，邮编B-3000
比利时鲁汶B-3000，脑与疾病研究中心，神经生物学实验室，2 VIB
3 鲁汶大学胃肠疾病转化研究中心(TARGID)，比利时鲁汶，B-3000
美国马萨诸塞州波士顿市4号乙酰龙制药公司
比利时鲁汶大学医院神经科，邮编B-3000，鲁汶市
腓肠肌中的神经肌肉接头，并改善了运动和感觉神经传导，证实HDAC6抑制是CMT2的一种潜在治疗策略。此外，ACY-1215是一种有趣的先导分子，因为它目前正在癌症临床试验中进行测试。综上所述，这些结果可能会加速将HDAC6的药理抑制转化为针对CMT2的治疗方法。
关键词 夏科-马里-图斯病 HSPB1 - 组蛋白去乙酰化酶6 - 线粒体 - 乙酰化 -微管蛋白 - 化合物筛选
引言
翻译后修饰是蛋白质功能的重要调节因子。组蛋白乙酰转移酶将乙酰基添加到组蛋白的赖氨酸残基上，从而改变染色质的结构并改变基因表达、DNA复制和修复 [1]。组蛋白的 -N-乙酰化赖氨酸残基的去除由组蛋白去乙酰化酶(HDACs)催化。后一个家族基于与酵母HDACs的同源性包含11种酶(HDACs 1-11)，其中可以区分4类主要的HDACs:I类(HDACs 1、2、3和8)，IIa类(HDACs 4、5、7和9)，IIb类(HDACs 6和10)，以及IV类(HDAC11)。除了锌依赖性HDACs外，烟酰胺脱氢酶依赖性酶被归类为III类HDACs，包括沉默调节蛋白(1-7)[2]。尽管组蛋白是HDACs研究最多的底物，但也有各种各样的非组蛋白底物，包括转录因子、细胞骨架蛋白、代谢酶和伴侣蛋白 [3]。因此，HDACs通常被称为赖氨酸乙酰化酶，以更好地表明它们的底物特异性 [4]。
HDAC6作为 -微管蛋白的主要去乙酰化酶发挥作用 [5]，并且是HDAC家族中唯一在C端含有锌指泛素结合结构域以及在N端含有2个催化结构域的成员。 -微管蛋白的乙酰化对于分子运动蛋白(驱动蛋白家族和动力蛋白)与微管的结合很重要 [6, 7]。因此，乙酰化减少被认为会影响轴突运输动力学。轴突运输障碍通常与周围神经病变有关 [8]。此外，HDAC6和 -微管蛋白乙酰化的改变与几种人类疾病有关，如阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症和夏科-马里-图斯病(CMT)[9-13]。
CMT是最常见的遗传性周围神经病变, 其特征是运动和感觉神经轴突进行性长度依赖性退化。目前，这些患者没有可用的治疗方法 [14]。总共有 基因的突变与CMT的脱髓鞘形式(CMT1)或轴突形式(CMT2)相关 [15]。小热休克蛋白B1(HSPB1)基因的突变是这些潜在遗传原因之一，导致患者出现CMT2F [16, 17]。以前，我们开发并表征了一种突变型HSPB1诱导的CMT小鼠模型，该模型在神经元中过表达野生型或突变型人类HSPB1 cDNA [13]。通常，这些小鼠从6个月大开始出现运动问题和感觉缺陷，这与人类患者的CMT2F相似。这些运动和感觉功能缺陷是由于运动和感觉神经轴突的进行性退化，复合肌肉动作电位(CMAPs)和感觉神经动作电位(SNAPs)降低证明了这一点。在病理水平上，我们发现坐骨神经中乙酰化 -微管蛋白水平降低 [13]。此外，有症状的突变型HSPB1小鼠的培养背根神经节(DRG)神经元中线粒体的轴突运输受到干扰。有趣的是，HDAC6去乙酰化功能的药理抑制不仅使培养的DRG神经元中出现的缺陷正常化，而且还逆转了体内观察到的运动和感觉异常以及电生理缺陷 [13]。
HDAC6是药物治疗开发中一个有吸引力的靶点，因为HDAC6基因缺失的小鼠能够存活且寿命正常。此外，针对开发具有改善药代动力学特性(如稳定性和血脑屏障通透性)的几种小分子抑制剂的研究正在不断扩展[18 - 21]。目前已经存在大量的HDAC拮抗剂，它们都已进入市场，但缺乏亚型选择性。诸如辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA，也称为伏立诺他)这种已获美国食品药品监督管理局批准的药物，以及曲古抑菌素A(TSA)等异羟肟酸类物质，都是对I类和II类HDAC均具有亲和力的泛HDAC抑制剂[22]。首个HDAC6特异性抑制剂tubacin于2003年通过对一个基于脱乙酰酶的1,3 - 二氧六环文库进行多维细胞筛选而发现[23]。然而，tubacin虽作为一种研究工具很有用，但因其高亲脂性、在体内快速代谢以及合成繁琐，并不适合作为一种类药物化合物。为了寻找高选择性且类似药物的HDAC6抑制剂，基于结构同源性建模开发了异羟肟酸类的tubastatin A，其在体外和体内均显示出抑制能力[24]。在开发强效且选择性的HDAC6去乙酰化功能抑制剂这一里程碑的基础上继续前行，我们设立了一个筛选，以在探索CMT潜在药物治疗的过程中鉴定出具有改善药理特性的新小分子。
本研究的目标是鉴定HDAC6去乙酰化功能的强效且选择性抑制剂，作为CMT的一种潜在药物治疗方法。基于在突变型HSPB1 CMT2小鼠模型中发现的病理和行为缺陷，开展了一项研究，该研究包括3个不同阶段，在这些阶段中对候选HDAC6抑制剂抑制HDAC6的效力和选择性进行测试。第一步，在神经元细胞系中评估对 - 微管蛋白和组蛋白乙酰化的影响。第二步，我们评估这些抑制剂恢复有症状突变型HSPB1小鼠培养的背根神经节(DRG)神经元中线粒体轴突运输缺陷的效率。最后，在突变型HSPB1诱导的CMT2小鼠模型中测试这些HDAC6抑制剂恢复这些小鼠运动和感觉问题的效率。在本研究中，我们使用了ACY - 738和ACY - 775，这两种是最近报道的在抗抑郁治疗背景下作为HDAC6抑制剂的小分子[25]。此外，我们还测试了ACY - 1215(也称为瑞可司他)，它已被证明在人多发性骨髓瘤细胞系中是一种强效且选择性的HDAC6抑制剂[26]。ACY - 1215在外周神经系统中具有活性，并已显示与硼替佐米联合使用时作为治疗多发性骨髓瘤具有协同作用[26]。
材料与方法
细胞培养
小鼠神经母细胞瘤(N2a)细胞(ATCC CCL - 131)在含有谷氨酰胺(美国宾夕法尼亚州匹兹堡市赛默飞世尔科技公司)、100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素(赛默飞世尔科技)、10%胎牛血清(奥地利克雷姆斯明斯特市格瑞纳生物-one公司)、1%非必需氨基酸(赛默飞世尔科技)以及1.6% (赛默飞世尔科技)的杜氏改良伊格尔培养基和F12培养基1:1混合液中培养，培养条件为 和7.5% 。为了传代细胞，用Versene(赛默飞世尔科技)洗涤细胞，并用0.05%胰蛋白酶 - EDTA(赛默飞世尔科技)解离细胞。
从12个月大的Thy1.2 - HSPB1 S135F小鼠中培养背根神经节(DRG)神经元。将DRG神经元从脊髓中分离出来，保存在添加了B27(赛默飞世尔科技)的冷Hibernate A(赛默飞世尔科技)中，以下简称HA/B27。为了提取DRG神经元，将组织用 木瓜蛋白酶孵育45分钟，并充分重悬直至所有组织被消化。将细胞悬液加入到含有4层 和 Optiprep(美国密苏里州圣路易斯市西格玛奥德里奇公司)的HA/B27梯度溶液中，并在 以 离心(无刹车)，之后将细胞悬液用HA/B27洗涤。再在 以 进行一次离心步骤，然后将细胞接种到含有添加了B27(赛默飞世尔科技)、200 mM L - 谷氨酰胺(赛默飞世尔科技)、68 ng/ml神经生长因子(美国马萨诸塞州贝德福德市密理博公司)和抗生素的Neurobasal A(赛默飞世尔科技)的培养基中。
将N2a细胞和DRG神经元在 下用浓度范围从 到 的化合物或相同体积(v/v)的二甲基亚砜(西格玛奥德里奇公司)处理过夜，以测试最高药物浓度。
蛋白质免疫印迹分析
用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤处理过的细胞，并根据制造商的说明使用EpiQuik总组蛋白提取试剂盒(美国纽约州法明代尔市EpiGentek公司)收集细胞。根据制造商的说明使用微量BCA试剂盒(赛默飞世尔科技)测定蛋白质浓度。在 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺电泳凝胶上分离样品之前，将含有等量蛋白质的样品补充还原样品缓冲液(赛默飞世尔科技)并在 加热5分钟。电泳后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(德国达姆施塔特市默克密理博公司)上。通过将膜在5%牛血清白蛋白(BSA)中孵育来阻断非特异性结合，5% BSA用Tris缓冲盐水吐温(50 mM TRIS，150 mM NaCl，0.1%吐温 - 20；德国达姆施塔特市Applichem公司)稀释，在室温下孵育1小时，然后与一抗孵育过夜。用Tris缓冲盐水吐温稀释的抗体针对 - 微管蛋白(1/5000，T6199；西格玛奥德里奇公司)、乙酰化α - 微管蛋白(1/5000，T6793单克隆抗体；西格玛奥德里奇公司)、甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶[1/1000，AM4300(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市安必昂公司)]、组蛋白H3乙酰化k9 + k14(1/1000，9677L，美国马萨诸塞州丹弗斯市细胞信号技术公司)和组蛋白4(1/1000，ab10158；英国剑桥市Abcam公司)。与碱性磷酸酶偶联的二抗(抗小鼠或抗兔，1/5000；西格玛奥德里奇公司)用于检测一抗的信号。通过添加增强化学荧光底物(瑞典乌普萨拉市通用电气医疗集团)使印迹可视化，并用ImageQuant LAS 4000成像。应用温和的重印迹缓冲液(密理博公司)剥离印迹。使用ImageQuant TL 7.0版软件对印迹进行定量。
免疫细胞化学
通过应用 多聚甲醛溶液固定细胞 ，并用在含0.2% Triton X - 100的PBS中稀释的 牛血清白蛋白(Serva，德国海德堡)在冰上处理10分钟使其通透。用在含0.02% Triton X - 100的PBS中的3%牛血清白蛋白(封闭溶液)封闭非特异性结合30分钟。一抗和二抗用封闭溶液稀释。使用了以下一抗、稀释度和孵育时间:抗乙酰化 微管蛋白(1/5000，T6793单克隆抗体；Sigma - Aldrich)、抗组蛋白H3乙酰化k9 + k14(1/1000，9677L；Cell Signaling)和抗神经元III类β微管蛋白(802001，1/500，过夜；BioLegend，美国加利福尼亚州圣地亚哥)。使用了以下二抗、相应稀释度和孵育时间:驴抗小鼠IgG(Alexa荧光团偶联，1/5000，1小时；Life Technologies，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)或驴抗兔IgG(Alexa荧光团偶联，1/5000，1小时；Life Technologies)。随后用含1.5%牛血清白蛋白的0.02% Triton X - 100/PBS洗涤后，用含4,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚的Vectashield(Vectorlabs，美国加利福尼亚州伯林盖姆)封片以观察细胞核。使用配备AxioCam MRm3相机(Carl Zeiss)的蔡司Axio Imager M1显微镜(Carl Zeiss，德国奥伯科亨)拍摄荧光显微照片。
小鼠
所有动物均按照鲁汶大学(KU Leuven)的指导方针和相关欧洲指导方针(欧盟关于动物实验的2010/63/EU指令)在标准条件下饲养。所有小鼠均培育至杂合状态。所有动物实验均获得了KU Leuven当地伦理委员会的批准(P033/2014和P185/2012)。
使用KAPA Taq Ready Mix(Kapa Biosystems，美国马萨诸塞州威尔明顿)和2组针对人HSPB1 cDNA的引物(正向引物5’-CAGCTGGCTGACCT GTAGC-3’；反向引物5’-CTTGGCGGCAGTCT CATCG-3’)或针对小鼠白细胞介素-2基因(用作内对照，正向引物5’-CTAGGCCA CAGAATTGAAAGATCT-3’；反向引物5’- GTAGTGGAAATTCTAGCATCATCC-3’)对转基因动物进行基因分型。
轴突运输测量
在测量前，用MitoTracker Red FM(50 nM；Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)加载培养的背根神经节(DRG)神经元。为了观察线粒体，用TILL Poly V光源(德国格拉费林)在 激发MitoTracker。在测量过程中，通过加热重力驱动灌注系统(Multichannel systems，德国罗伊特林根)在 用HEPES溶液(含 葡萄糖、 HEPES和 )灌注DRG神经元，并用冷却电荷耦合器件相机(Sensicam QE，PCO，德国凯尔海姆)以1 Hz记录200张图像，使用TILL VisION。为了分析线粒体运动的不同参数，使用Igor Pro(Wavemetrics，美国波特兰)基于先前描述的分析算法[27]使用自定义编写的程序获得动态变化图或时空图。
电生理学
对于神经传导测量，使用1%异氟烷 气体吸入麻醉小鼠，并将其置于加热垫上以维持体温。使用皮下针电极(Technomed Europe，荷兰马斯特里赫特)和与Synergy软件(版本20.1.0.100)兼容的Medelec Syngery肌电图监测仪(Vickers Medical，英国西德卡普)，通过在坐骨切迹水平进行超强刺激(1脉冲/秒， 刺激持续时间)并在腓肠肌处记录来评估复合肌肉动作电位(CMAPs)[12]。通过在尾巴远端进行超强刺激(6脉冲/秒， 刺激持续时间)记录感觉神经动作电位(SNAPs)，并在尾巴 近端进行测量[28]。对于SNAP记录，对多个迹线进行平均。
神经肌肉接头的组织学检查
在解剖前，通过 吸入并随后颈椎脱臼对小鼠实施安乐死。解剖腓肠肌并在液氮冷却的异戊烷中速冻。将冰冻切片 用 多聚甲醛固定 ，并用PBS冲洗。使用在PBS - 0.1% Triton X - 100中稀释的5%正常驴血清(Sigma - Aldrich)阻断非特异性结合。使用抗神经丝轻链抗体(Alexa488偶联，8024S，1/500，过夜孵育；Cell Signalling)使神经轴突可视化，同时用 - 银环蛇毒素(Alexa555偶联， 孵育；Life Technologies)标记神经肌肉终板。为了量化神经支配的神经肌肉接头(NMJs)数量，检查每块肌肉至少100个接头的神经丝轻链和 - 银环蛇毒素信号的共定位。使用配备AxioCam MRm3相机(Carl Zeiss)的蔡司Axio Imager M1显微镜(Carl Zeiss)拍摄荧光显微照片。
结果
在本研究中，我们使用了ACY - 738和ACY - 775，这两种嘧啶羟酰胺小分子抑制剂先前已对其药代动力学特性进行了分析，并且对HDAC6显示出纳摩尔效力和对其他HDAC的选择性[25]。表1总结了最重要的分子和药代动力学特性[25]。最有效的化合物是ACY - 738，其对HDAC6的 值为 ，而ACY - 775是最具选择性的抑制剂(HDAC1/HDAC6选择性指数为283)。选择第三种分子ACY - 1215不仅是因为其对HDAC6的效力和选择性[26]，还因为该化合物目前正在进行针对多发性骨髓瘤的II期临床试验(clinicaltrails.gov标识符:NCT01323751)[26]。因此，在基于CMT2的筛选中获得的阳性结果可能有助于将ACY - 1215转化为用于治疗CMT2的临床药物。
ACY - 738和ACY - 775是N2a细胞中有效的选择性HDAC6抑制剂
在N2a细胞的细胞环境中，通过蛋白质免疫印迹法评估了ACY-738和ACY-775对 -微管蛋白和组蛋白3乙酰化状态的影响(图1a)。作为一种泛HDAC抑制剂，TSA可增强 -微管蛋白和组蛋白3的乙酰化，因此在该筛选中用作阳性对照(图1a - c)。HDAC6抑制剂ACY-738和ACY-775在浓度为 时使 -微管蛋白发生高度乙酰化。组蛋白乙酰化未受影响(图1a - c)。免疫细胞化学用于可视化存在于细胞质中的 -微管蛋白的乙酰化以及在细胞核中可见的组蛋白3的乙酰化。在用赋形剂处理的细胞中， -微管蛋白主要以去乙酰化形式存在，而组蛋白3明显发生了乙酰化(图1a，d)。用ACY-738和ACY-775处理后，可见 -微管蛋白的乙酰化明显增强，而组蛋白乙酰化保持不变(图1f - g)。
表1 Jochems等人[25]报道的ACY-738、ACY-775和ACY-1215的分子和药代动力学特性
| 分子量 (克/摩尔) | 组蛋白去乙酰化酶1 (纳摩尔) | 组蛋白去乙酰化酶6 (纳摩尔) | HDAC1对HDAC6的折叠选择性 | 血浆 (小时) | |
ACY - 738  | 270.29 | 94 | 1.7 | 55 | 0.2 |
ACY - 775  | 330.4 | 2123 | 7.5 | 283 | 0.5 |
ACY - 1215  | 433.5 | 58 | 4.7 | 12 | 3.49 |
HDAC = 组蛋白去乙酰化酶
图1 ACY - 738和ACY - 775是强效且选择性的组蛋白去乙酰化酶6抑制剂。(a) 将N2a细胞与 ACY - 738、ACY - 775或作为阳性对照的曲古抑菌素A (TSA) 一起孵育。通过蛋白质印迹法评估 -微管蛋白(乙酰化 -微管蛋白，acet -tub)的乙酰化水平，以及组蛋白3(乙酰化组蛋白3，acetH3)的乙酰化水平。总 -微管蛋白水平、甘油醛 - 3 -磷酸脱氢酶(gapdh)和组蛋白4(H4)用作等量上样的参照。(b) 计算乙酰化 -微管蛋白与总微管蛋白水平的比率，并将其标准化为经TSA处理的细胞。单向方差分析(ANOVA)；*** 。(c) 评估乙酰化组蛋白3与组蛋白4水平的比率，随后将其标准化为用溶剂处理的细胞。单向ANOVA；** 4。 对用 TSA、ACY - 738和ACY - 775处理的N2a细胞进行乙酰化 -微管蛋白(红色)和乙酰化组蛋白3(绿色)的免疫细胞化学分析
通过在N2a细胞中使用从 到 的浓度建立剂量反应曲线，对ACY - 738和ACY - 775对 -微管蛋白乙酰化的药代动力学特性有了更深入的了解。ACY - 738和ACY - 775对 -微管蛋白乙酰化具有相似的刺激活性(表1，图2a)。在 的浓度下， -微管蛋白的乙酰化增强，在 达到饱和水平。TSA在 时使 -微管蛋白过度乙酰化(图2a，b)。这与ACY - 738和ACY - 775相反，它们需要更高的浓度才能达到最大效果(图2a，b)。
组蛋白去乙酰化酶6抑制剂ACY - 738和ACY - 775可挽救线粒体运输缺陷
随后测试了ACY - 738和ACY - 775恢复从有症状的HSPB1 小鼠培养的背根神经节(DRG)神经元中所见线粒体轴突运输缺陷的能力。为了评估ACY - 738或ACY - 775是否会影响原代神经元细胞中 -微管蛋白的乙酰化，从成年非转基因小鼠(NTG)培养DRG神经元，并用组蛋白去乙酰化酶6抑制剂处理过夜(图3a - c)。通过免疫荧光观察 -微管蛋白的乙酰化(如图3a - c所示)，并定量神经元神经突中的强度，并将其标准化为荧光信号的长度(图3d)。在用溶剂处理的DRG神经元中，已存在乙酰化 -微管蛋白(图3a)。用ACY - 738或ACY - 775处理后，乙酰化 -微管蛋白的信号强度显著增加(图3d)。
a
50 100 500 1 2.5
纳摩尔 纳摩尔 纳摩尔 纳摩尔 微摩尔 微摩尔
- 乙酰化 -微管蛋白
TSA
- -微管蛋白
- 乙酰化 -微管蛋白
ACY-738
- -微管蛋白
ACY-775
- -微管蛋白
图2 ACY - 738和ACY - 775在N2a细胞中的药代动力学特性。(a) 在N2a细胞中建立曲古抑菌素A (TSA)、ACY - 738或ACY - 775对 -微管蛋白乙酰化的剂量反应，并通过蛋白质免疫印迹法测定。(b) 蛋白质免疫印迹法测定乙酰化 -微管蛋白与总微管蛋白水平的比值。数值经 的作用标准化
接下来，从有症状的HSPB1 小鼠中培养背根神经节 (DRG) 神经元，并用在NTG DRG神经元中测试的最高剂量 进行处理，以研究ACY - 738和ACY - 775恢复线粒体轴突运输缺陷的能力。动态记录图代表用载体、ACY - 738或ACY - 775处理的HSPB1 DRG神经元神经突中线粒体的总体运动 (图3e)。与用载体处理的DRG神经元相比，观察到线粒体的运动性显著增加，并且神经突内线粒体的总数也增加 (图3f, g)。有趣的是，与用载体处理的细胞相比，在用ACY - 775处理的DRG神经元中观察到逆行运输的线粒体数量显著增加 (图3h)。
ACY - 738、ACY - 775和ACY - 1215逆转HSPB1 CMT2小鼠模型中的运动和感觉轴突缺陷
筛选的最后阶段旨在确定ACY - 738或ACY - 775抑制HDAC6对HSPB1 诱导的CMT2小鼠模型的运动和感觉缺陷的影响。我们在该试验中纳入了另一种HDAC6抑制剂ACY - 1215，因为它之前已被表征且目前正在进行临床试验 [29]。这些实验也是对不同化合物药效学特性的间接测量。
有症状的HSPB1 小鼠每天腹腔注射ACY - 738、ACY - 775或ACY - 1215，持续21天，之后对运动神经和感觉神经进行神经传导研究。用载体处理的小鼠在坐骨神经和尾神经中分别显示出复合肌肉动作电位 (CMAP) 和感觉神经动作电位 (SNAP) 幅度降低 (图4a, b)。HDAC6抑制剂ACY - 738、ACY - 775以 给药，这比使用tubastatin A的原始研究 [13] 中的剂量低 。ACY - 1215以更高的剂量 进行测试。所有抑制剂均增加了运动神经和感觉神经中的动作电位幅度 (图4a, b)。处理后，处死小鼠并解剖腓肠肌以观察神经肌肉接头 (NMJ) 的重新支配。使用 -银环蛇毒素标记运动终板，同时使用识别神经丝轻链的抗体鉴定轴突投射。对双标记的NMJ数量进行定量分析表明，用所有三种HDAC6抑制剂处理后，腓肠肌的神经支配显著增加 (图4c, d)。
讨论
本研究的主要目标是将在CMT2小鼠模型[13]中观察到的HDAC6抑制的有益效果转化为针对目前尚无治疗方法的CMT患者的药物治疗。在基于HSPB1 诱导的CMT2小鼠模型[13]的行为和病理异常的筛选方法中测试了三种嘧啶羟酰胺小分子(ACY-738、ACY-775、ACY-1215)。所测试化合物的化学结构均含有相似的官能团，将它们归类为异羟肟酸，仅封端基团不同。到目前为止，三种含有异羟肟酸的小分子(伏立诺他、帕比司他和贝利司他)已被批准作为抗癌药物，并且这些化合物都是广谱HDAC抑制剂[30]。然而，这些化合物表现出较差的药代动力学，包括快速的代谢降解，以及较差的选择性，会引起脱靶效应和毒性[30]。因此，迫切需要具有改善的药代动力学和药效学特性的选择性HDAC抑制剂。
图3 使用ACY-738和ACY-775抑制组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)可挽救从有症状的HSPB1 小鼠培养的背根神经节(DRG)神经元中的线粒体缺陷。(a - c)将非转基因DRG神经元与 ACY-738或ACY-775孵育。乙酰化 -微管蛋白的免疫细胞化学标记显示HDAC6抑制后神经元中的免疫荧光增加。标尺 。(d)对DRG神经元培养物神经突中乙酰化 -微管蛋白的强度进行定量，并根据信号长度进行校正。每个实验中的所有值均相对于用溶剂处理的细胞进行归一化； ，每种条件下有43 - 61个细胞。(e)代表用ACY-738或ACY-775(2.5 μM)处理的HSPB1 DRG神经元中线粒体轴突运动的动态图。垂直线代表静止的线粒体，向右或向左偏转的线分别表示线粒体的顺行或逆行运动。(f)根据用ACY-738或ACY-775处理的HSPB1 DRG神经元的动态图，对神经突中每 移动的线粒体数量进行定量； 来自3只不同的转基因小鼠。(g)根据用ACY-738或ACY-775处理的HSPB1 DRG神经元的动态图，对神经突中每 线粒体的总数进行定量； 来自3只不同的转基因小鼠。(h)基于用ACY-738或ACY-775处理的HSPB1 DRG神经元的动态图，进行额外分析以评估神经突中每 顺行或逆行移动的线粒体数量； ，每个实验有7 - 10个细胞。单因素方差分析(ANOVA)；* ，*** 。双因素方差分析；*p < 0.05，***p < 0.0001
在我们研究的第一阶段，ACY-738和ACY-775对HDAC6表现出选择性和强效抑制作用。两种HDAC6抑制剂均能够挽救来自突变型HSPB1-CMT2小鼠模型的培养背根神经节(DRG)神经元中观察到的线粒体轴突运输缺陷。尽管ACY-775的 值较高，但ACY-775比ACY-738表现出更高的诱导 - 微管蛋白乙酰化的效力，这体现在对线粒体运输缺陷有更大的影响。最重要的是，ACY-738和ACY-775还可以逆转CMT2小鼠模型运动和感觉神经中观察到的缺陷。有趣的是，有症状的HSPB1 小鼠仅在坐骨神经远端表现出轴突损失[13]。因此，我们在用HDAC6抑制剂治疗后检查了腓肠肌中神经肌肉接头(NMJ)的神经支配。治疗后在腓肠肌中测得的复合肌肉动作电位(CMAP)振幅增强与NMJ神经支配改善的组织学证据一致。在感觉方面，使用PGP9.5以及β3-微管蛋白的免疫荧光标记对尾皮肤横切片中的感觉神经末梢进行组织病理学检查，观察表皮内神经纤维密度。到目前为止，我们尚未观察到任何形态结构，因此需要进一步研究以确定HDAC6抑制对感觉神经再生的影响以及与改善的感觉神经动作电位(SNAP)振幅的关系。
此外，我们可以使用ACY-1215证实ACY-738和ACY-775的积极作用。这种选择性HDAC6抑制剂在其酶活性和对HDACs的选择性方面已经得到了广泛表征。我们观察到ACY-1215对CMT2小鼠的运动和感觉缺陷均有显著影响。目前，ACY-1215正在进行针对多发性骨髓瘤的II期临床试验，这使其成为作为CMT患者药理学治疗进行测试的便利先导分子。因此，基于CMT2的筛选中的这些积极结果有助于推动ACY-1215转化为新的CMT2疗法。
ACY-738、ACY-775和ACY-1215均为基于异羟肟酸的结构。尽管异羟肟酸作为HDAC抑制剂被广泛使用，但人们对异羟肟酸的潜在致突变性提出了担忧。这些化合物可能具有在DNA中诱导点突变、插入或缺失、染色体断裂和/或染色体重排的能力[30]。具有这种倾向的分子因此可能具有致癌性。然而，ACY-1215在I期研究中已被证明是安全且耐受性良好的，并且是Ames阴性的。因此，这种HDAC6抑制剂是治疗CMT患者的有吸引力的分子。
HDAC6的药理学抑制是CMT患者有前景的新治疗靶点，我们的发现增加了正在进行的临床前和临床研究的不断增加的列表。然而，HDAC6抑制的治疗效果是否仅与HSPB1突变的患者相关，或者是否可以外推到其他形式的CMT2，甚至CMT1，仍有待证明。目前，大多数药理学策略集中在这种脱髓鞘形式的CMT上。不幸的是，在CMT1小鼠模型中观察到的抗坏血酸的有益效果在CMT1A患者中无法重现[31 - 34]。神经营养因子-3给药对髓鞘形成和周围神经病变的影响在可以转化到临床之前需要进一步研究[35]。目前最有前景的治疗策略是由巴氯芬、纳曲酮和山梨醇组成的联合疗法(PXT3003)，其在CMT1A临床前研究中改善了髓鞘形成和神经传导，并在II期临床试验中被证明是安全且耐受性良好的。目前，正在进行III期研究以确定PXT3003对CMT1A患者的有效性[36]。因此，需要进一步研究以证明HDAC6抑制在CMT2中的治疗潜力，并将HDAC6抑制添加到CMT2患者可能的治疗列表中。
图4 使用ACY-738、ACY-775或ACY-1215抑制组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)可逆转运动和感觉神经中的轴突缺陷，并诱导神经肌肉接头的重新支配。(a) 有症状的(12月龄)HSPB1S135F小鼠每天腹腔注射ACY-738、ACY-775(3 mg/kg)、ACY-1215(30 mg/kg)或赋形剂，持续21天。治疗期结束后，从坐骨神经记录复合肌肉动作电位(CMAP)幅度。虚线表示从非转基因小鼠(NTG)获得的值； 小鼠。(b) 治疗后在感觉尾神经上记录的SNAP幅度。虚线表示从NTG小鼠获得的值； 小鼠。
Dunnett多重比较检验，* * * 。(c) 治疗后，通过免疫荧光从腓肠肌观察神经肌肉接头(NMJ)。运动终板用 -银环蛇毒素标记，轴突末端用神经丝轻链定向抗体观察。虚线表示从NTG小鼠获得的值。(d) 通过确定 -银环蛇毒素与神经丝轻链免疫荧光之间的重叠百分比来量化受支配的NMJ数量。虚线表示从NTG小鼠获得的值； 小鼠。Dunnett多重比较检验，**
有趣的是，在帕金森病和阿尔茨海默病模型中，抑制HDAC6的去乙酰化功能或增加 -微管蛋白的乙酰化已被证明可改善轴突运输缺陷[11, 37]。线粒体轴突运输缺陷通常与一般的神经退行性变有关，特别是与周围神经病变有关[8]。因此，可以通过研究HDAC6抑制在其他周围神经病变中的作用来进一步探索。
HDAC6抑制显著改善了线粒体轴突运输动力学，特别是在逆行方向。驱动蛋白需要 -微管蛋白的乙酰化形式才能沿微管向前运输货物[7]。然而，仅 -微管蛋白的乙酰化形式不足以在体外影响驱动蛋白-1的速度和运行长度[38, 39]。因此，通过抑制HDAC6的去乙酰化功能来增加 -微管蛋白的乙酰化并不意味着对顺行运输有直接影响。另外，已知HDAC6通过动力蛋白运动复合体参与将多聚泛素化蛋白募集到聚集体中[40, 41]。HSPB1中的突变导致细胞质聚集体的形成[17]。在我们的突变HSPB1诱导型CMT2小鼠模型中，我们提出了一个双重假设，即HDAC6将多聚泛素化蛋白(如突变的HSPB1)运输到聚集体中，但反过来会使微管去乙酰化，导致轴突运输受阻。在我们的背根神经节神经元培养物中，抑制HDAC6特异性地刺激了线粒体的逆行运输，从而支持了我们的双重假设。此外，Calderilla-Barbosa等人[42]提出了一个模型。在该模型中，HDAC6和SQSTM-1都识别多聚泛素化蛋白，它们竞争与动力蛋白的结合，并且SQSTM-1与动力蛋白的相互作用对于动力蛋白的正常功能是必需的。这可能表明HDAC6抑制对逆行运输的有益作用是通过动力蛋白运动介导的。
因此， -微管蛋白的乙酰化是线粒体轴突运输过程中的关键组成部分，在需要轴突运输以满足突触处高能量需求的神经元中很重要[43, 44]。 -微管蛋白乙酰化的改变与癌症、心脏病、炎症和免疫有关，也与许多神经系统疾病有关[44]。此外，HDAC6抑制还可以改善阿尔茨海默病小鼠模型中的认知缺陷，也已被证明具有抗抑郁作用，其治疗效果也在缺血性脑梗死模型中得到证实[25, 45, 46]。因此，鉴定具有改善的药代动力学和药效学特性的HDAC6抑制剂不仅对开发CMT的药物治疗很重要，而且对多种其他疾病也可能很重要。
我们的筛选方法还需要进一步研究和优化，因为目前的方法导致能够同时测试的化合物数量有限。存在几种替代技术来加速和扩大从N2a细胞到动物测试的化合物筛选。通过蛋白质免疫印迹法检测 -微管蛋白和组蛋白的乙酰化可以被AlphaLisa [47]替代，与蛋白质免疫印迹法相比，它不需要洗涤步骤，具有更大的检测窗口和更短的检测时间。涉及诱导多能干细胞(iPSC)以及向特定细胞类型分化的技术正在迅速发展[48]。此外，CRISPR-Cas9技术在处理人类细胞方面提供了广泛的可能性[49]。从CMT2患者来源的成纤维细胞开始，iPSC衍生的背根神经节神经元可用于确定新的HDAC6抑制剂对 -微管蛋白乙酰化和线粒体缺陷的影响。此外，iPSC还可以分化为运动神经元。由于我们只能培养胚胎运动神经元，而Thy-1.2启动子仅在出生后活跃，因此我们无法测试HDAC6抑制剂对突变HSPB1小鼠运动神经元的影响。因此，使用基于iPSC的技术，可以测试大量化合物恢复运动和感觉神经元中线粒体轴突运输缺陷的能力。
总之，我们建立了一种由3个不同阶段组成的筛选方法，以鉴定能够在CMT(Charcot-Marie-Tooth)2F小鼠模型中功能性恢复运动和感觉缺陷的选择性和强效HDAC6抑制剂。这些抑制剂中的一种有可能转化为临床应用，因为它已经在临床试验中进行测试并且Ames试验呈阴性。未来的研究将针对携带替代功能基序的新型HDAC6抑制剂[50]。此外，探索HDAC6抑制在其他遗传形式的CMT中的治疗潜力的研究对于了解HDAC6抑制剂在CMT中的治疗潜力至关重要。
致谢 VB、MJ和LVDB负责研究设计。MJ提供了化合物。VB在体外测试了化合物，并进行了行为测试和组织病理学检查。VB和PVB分析并解释了线粒体运输数据。VB、LVDB、PVB和WR解释了结果。VB和LVDB起草了手稿。所有作者都审查了手稿内容并批准了最终版本。这项工作得到了弗拉芒科学研究基金(FWO-Vlaanderen)、鲁汶大学、比利时政府(比利时联邦科学政策办公室大学间吸引极)、比利时抗神经肌肉疾病协会(ABMM)、肌肉萎缩症协会(MDA)、欧洲共同体健康第七框架计划(FP7/2007 - 2013，资助协议259867)和美国国立卫生研究院(NS079183)的资助。WR、LVDB和PVD得到了“开启未来”基金(鲁汶大学)的支持。WR得到了“E. von Behring神经肌肉和神经退行性疾病主席”的支持。VB得到了弗拉芒科学技术创新局(IWT-Vlaanderen)的支持。PVD拥有弗拉芒科学研究基金(FWO-Vlaanderen)的临床研究职位。MJ是Acetylon制药公司的员工。MJ是Acetylon制药公司的股东。其余作者声明无利益冲突。
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轴索性,ACY-738,ACY-775,ACY-1215,HDAC6,α- 微管蛋白
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