小胶质细胞CX3CR1通过抑制Sirt 1/p65信号通路促进成体神经发生，且不依赖于CX3CR1
发布时间：
2026-04-06 09:50
小胶质细胞CX3CR1通过抑制Sirt 1/p65信号通路促进成体神经发生，且不依赖于CX3CR1
萨宾·塞尔纳 ，里卡多·帕里西奥 - 蒙特西诺斯 ，阿莱娜·施皮斯 ，安妮特·马苏赫 ，丹尼尔·埃尔尼 ，劳拉·A·哈桑 ，多米尼克·冯·埃尔韦费尔特 ，马里乌斯·施瓦本兰德 ，克努特·比伯 ，奥里·斯塔谢夫斯基 ，塞尔吉奥·利拉 ，斯特芬·荣格 ，马尔科·普林茨 和托马斯·布兰克 。
摘要
纯合子和杂合子cx3cr1突变小鼠在其cx3cr1基因座中携带绿色荧光蛋白(EGFP)，是研究小胶质细胞和外周髓样细胞的广泛使用的动物模型。在此我们报告，与 或 对照相比，cx3cr1 小鼠齿状回(DG)中的小胶质细胞显示出小胶质细胞沉默调节蛋白1(SIRT1)表达水平升高和活化B细胞核因子κB(NF - κB)p65激活，尽管形态未改变。这种表型仅限于DG，并伴有cx3cr1 小鼠成体神经发生减少。值得注意的是，成体神经发生不受 配体、趋化因子 缺乏的影响。从机制上讲，SIRT1的药理激活改善了DG中的成体神经发生，同时cx3cr1 小鼠在海马依赖性学习和记忆任务中的表现增强。当在cx3cr1 小鼠中抑制SIRT1时，会诱导相反的情况，导致成体神经发生减少和海马认知能力降低。总之，我们的数据表明，在静息条件下从小胶质细胞中删除CX3CR1会改变细胞更新率升高的脑区，且不依赖于 。
关键词:小胶质细胞、水迷宫、形态测量学、成体神经发生、沉默调节蛋白1
引言
是一种与 蛋白的 和 亚型偶联的七跨膜结构域受体，其激活与几种细胞内第二信使相关，如磷酸肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和活化B细胞的核因子κB(NFkB)[1]。 在单核细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞亚群以及脑小胶质细胞中显著表达[2]。令人惊讶的是，对于小胶质细胞中哪些细胞内信号通路会受到 缺乏的影响知之甚少。小胶质细胞与其他脑细胞有根本区别，因为它们源自胚胎发育过程中产生的原始髓系祖细胞[3 - 5]。它们是脑中的常驻吞噬细胞，参与免疫介导的防御机制并清除细胞碎片[6]。小胶质细胞不断监测其周围环境，并参与发育过程和整个成年期的突触修剪，因此被认为在调节稳态神经元突触可塑性中起作用[7, 8]。神经元和小胶质细胞被认为通过神经元表达的 配体 (或分形趋化因子)相互通信。 在选定神经元的细胞膜上表达，并与小胶质细胞上的 受体结合并激活。 以两种不同形式存在:全长膜结合形式和含有N端趋化因子结构域的脱落形式。 的脱落趋化因子结构域在切割后作为信号分子起作用，可结合小胶质细胞表达的 受体[11]，而其膜结合粘蛋白柄可作为细胞粘附分子[12]。 在大鼠齿状回(DG)的颗粒细胞层中大量表达，在那里添加重组 可逆转与年龄相关的成年神经发生下降[13]。与野生型对照相比， 和 小鼠的海马神经发生均减少[13, 14]。然而，尚不清楚 在增殖和神经发生中起多大程度的必需作用。除了上述提到的海马神经发生减少外，据报道cx3cr1 小鼠表现出海马IL - 1β表达过多，以及长时程增强(LTP)增强[15]或减弱[14]，导致认知功能改善[15]或受损[13, 14]。需要指出的是，Maggi等人仅使用雌性小鼠(3个月大)。Rogers等人和Bachstetter等人分别对3个月和4个月大的雄性小鼠进行了所有实验。除了这些相互矛盾的结果外，对于 缺乏激活的可能影响突触可塑性和认知的细胞内信号级联知之甚少。这些途径之一可能包括NF - kB信号通路，该通路可能触发小胶质细胞激活并诱导包括IL - 1 在内的炎症因子释放，如在辐射后[16]、正常衰老过程中[17]或神经退行性变时所见[18]。沿着这些思路，沉默调节蛋白1(SIRT1)是沉默调节蛋白家族的成员，可能会因 缺乏而在小胶质细胞中受到调节，因为它可以通过抑制NF - kB信号来抑制炎症反应[19, 20]。
* 通讯作者:thomas.blank@uniklinik - freiburg.de
德国弗莱堡大学神经病理学研究所，布赖萨赫街64号，D-79106弗莱堡
文章末尾提供了完整的作者信息列表
在此，我们研究了小胶质细胞 缺失对细胞形态、NF-κB信号通路激活、SIRT1表达、对神经母细胞、未成熟神经元和认知的影响。我们的研究结果表明，在脑内稳态下，cx3cr1 小鼠的海马小胶质细胞与成年野生型动物的小胶质细胞非常相似(如果不是完全相同的话)，这与新生或发育期间的情况形成对比。然而，成年神经发生区域的海马 小胶质细胞显示出SIRT1和NF-κB通路的激活。我们发现，在 小鼠中操纵SIRT1激活直接影响认知表现，而相同的处理对野生型同窝小鼠的认知没有可检测到的影响。
材料和方法
本文不包含任何作者进行的涉及人类参与者的研究。
小鼠
所有动物实验均遵循“实验动物护理原则”(NIH出版物第86-23号，1985年修订)。所有实验均获得巴登-符腾堡州联邦自然、环境和消费者保护部的批准(G12/71和G11/50)，并按照各自的国家、联邦和机构规定进行。成年8-12周龄雄性小鼠用于实验。小鼠每笼最多饲养5只，采用 光/暗循环，早上6点开灯。食物和水可随意获取。 品系为C57BL/6 J背景，购自杰克逊实验室。 小鼠先前已有描述[21]。在所有实验中，野生型同窝小鼠用作对照。
莫里斯水迷宫(MWM)测试
MWM用于测量空间学习和记忆[22]。该装置由一个直径为 的黑色塑料池组成。一个黑色逃生平台(正方形， )位于水面以下1.0厘米处(隐藏)。在整个实验过程中，水的温度保持恒定 ，训练试验之间允许有10分钟的恢复期。训练包括连续6天的测试，每天进行4次试验。如果小鼠在最长时间(60秒)内未能找到逃生平台，实验者会将动物放置在平台上 。在测试的前6天，小鼠使用隐藏平台进行训练。平台位置保持不变，起始位置在池边的四个固定位置之间变化。小鼠以随机方式在其中一个起始点将鼻子指向墙壁放入水中。在 天，移除平台，让小鼠游泳 以确定它们的搜索偏向。在测试第8天，训练小鼠寻找可见平台，该平台有一个 高的带有白旗的杆子，并且每次试验都会更换到一个新位置。找到可见平台的潜伏期由实验者开始和结束计时。运行BIOBSERVE软件(BIOBSERVE)的计算机分析MWM测试的所有变量。所有行为实验均以双盲方式进行，小鼠按随机顺序进行测试。
小鼠处理
EX527(货号2780)购自Tocris Bioscience(英国布里斯托尔)，溶于含4%二甲基亚砜/10%环糊精的PBS中，以250 ng/μL的浓度每天腹腔注射一次(200 μl，腹腔注射)，共21天[23]。白藜芦醇(货号R5010，美国密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich公司)溶于PBS中，以 的浓度在20天内每天腹腔注射一次[24]。
溴脱氧尿苷注射
成年小鼠在3天内接受两次腹腔(i.p.)溴脱氧尿苷注射(美国密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich公司，50 mg/kg溶于0.9%氯化钠中，间隔8小时)[25]。在最后一次溴脱氧尿苷注射3周后对动物进行灌注。
组织学
组织学检查如前所述进行[26, 27]。用冰冷的pH 7.4的PBS和pH 7.4的4%多聚甲醛/PBS对小鼠进行心脏灌注。取出大脑，在相同固定剂中后固定过夜，然后在 进行石蜡包埋或冷冻。切取 厚度的冠状切片，用二甲苯脱蜡，并用10%山羊血清/PBS加0.2% Triton X - 100封闭。使用灌注固定冷冻脑的30 µm厚的游离冠状脑切片。切片与以下一抗孵育:用于检测小胶质细胞的抗Iba - 1(24小时，4°C下稀释1:500，货号019 - 19741，Wako，日本大阪)[28]，用于检测神经元的抗NeuN(24小时，4°C下稀释1:200，货号MAB377，Merck Millipore，德国达姆施塔特)[29]，用于检测神经母细胞和未成熟神经元的抗DCX(48小时，4°C下稀释1:250，C - 18，sc - 8066，Santa Cruz Biotechnology，美国达拉斯)[30]，用于检测BrdU掺入的抗BrdU(24小时，4°C下稀释1:200，货号OBT0030，ABD，Serotec，美国北卡罗来纳州罗利)[30]，用于标记溶酶体和晚期内体的抗Lamp2(24小时，4°C下稀释1:250，货号ab13524，Abcam，英国剑桥)[28]，用于检测增殖细胞的抗Ki67(24小时，4°C下稀释1:800，货号ab15580，Abcam，英国剑桥)[31]，用于标记分支实质小胶质细胞的抗CD11b(48小时，4°C下稀释1:200，货号ab8878，Abcam，英国剑桥)[32]，以及参与负责凋亡执行的半胱天冬酶激活级联反应的活化半胱天冬酶 - 3(24小时，4°C下稀释1:100，货号9661，Cell Signaling Technology，美国马萨诸塞州丹弗斯)[33]。作为二抗，我们使用:室温下孵育2小时、稀释1:500的Alexa - Fluor - 647偶联二抗(货号A31573，Life technologies，美国沃尔瑟姆)，Alexa - Fluor - 568偶联二抗(货号A11011，Life technologies)在 以1:500的稀释度孵育 ，以及Alexa Fluor 488偶联二抗(货号A11008，Life technologies)，其在 以1:500的稀释度过夜添加。用4,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚(DAPI，货号236276，Boehringer)对细胞核进行复染。使用BZ - 9000 Biorevo显微镜(Keyence，德国新伊森堡)或奥林巴斯FluoView 1000共聚焦激光扫描显微镜(奥林巴斯，日本东京)拍摄图像。使用Image J 1.4软件[34]测量积分荧光强度。
细胞定量
使用光学分割器对细胞进行计数，这是一种用于无偏立体分析的方法。该方法使用计算机辅助图像分析系统进行，该系统由配备计算机控制电动载物台的徕卡DMRB/DIC荧光显微镜、摄像机和Stereo Investigator软件(MicroBrightField，威利斯顿，佛蒙特州)组成。对齿状回整个 rostrocaudal 范围内的阳性细胞数量进行计数，对冰冻切片 采用编码的1/16系列。我们使用了先前报道的光学分割器方法的改进版本[35 - 37]。将阳性细胞总数乘以16，并报告为每个齿状回的细胞总数。对于石蜡切片 的免疫细胞化学分析，收集跨越海马体 rostrocaudal 范围的连续冠状切片。为了进行定量，每隔 个切片被选中。在这些切片上对每个阳性细胞进行计数，并且，为了获得齿状回中细胞的相对总数，将这些计数乘以12以考虑采样频率[25]。在对照实验中，当通过两种定量方法对样本进行定量时，我们未检测到细胞数量的显著差异。
小胶质细胞的三维重建
来自成年脑组织的冠状冷冻切片用抗Iba - 1(目录号019 - 19741，和光纯药)[28]进行染色 (在 处稀释1:500)，随后用Alexa Fluor 488偶联的二抗(目录号A11008，赛默飞世尔科技)进行染色，该二抗以1:500的稀释度在 处过夜添加。细胞核用DAPI复染。使用 物镜在奥林巴斯Fluoview 1000共聚焦激光扫描显微镜(奥林巴斯)上进行成像。以 步长在 方向对Z轴堆叠进行成像，记录 像素分辨率并使用IMARIS软件(Bitplane)进行分析。每只分析的小鼠重建四个皮质细胞。
激光显微切割
如先前所述，使用蔡司PALM MicroBeam对小胶质细胞进行显微切割，并进行了修改[29]。用CD11b抗体(Serotec)对连续切片进行快速免疫化学分析。免疫染色切片用DAPI复染以便于识别单个细胞。使用Rneasy Micro Plus试剂盒(Qiagen)分离RNA，并根据制造商的建议使用Applied Biosystems试剂进行逆转录(RT)、预扩增和实时PCR。引物对如先前所述[29]使用。
小胶质细胞分离和流式细胞术
使用密度梯度分离从解剖的海马组织中收获成年小胶质细胞，并如之前所述进行制备[27]。简而言之，样品用CD11b和CD45(eBioscience，BD Pharmingen)[4]进行染色。细胞悬液在FACS Canto II(贝克顿·迪金森)上采集，或者细胞群体用MoFlo Astrios(贝克曼库尔特)进行分选并进一步处理。使用FlowJo软件(Tree Star)分析数据。
基因表达分析
将经荧光激活细胞分选术(FACS)分选的小胶质细胞群体直接收集到细胞裂解缓冲液中，随后根据制造商的方案，使用Arcturus Pico Pure RNA分离试剂盒(Life Technologies)分离RNA。使用高容量RNA - 逆转录试剂盒和基因表达主混合试剂(Applied Biosystems)，根据制造商的建议进行逆转录和实时PCR分析。使用Light - Cycler 480(Roche)对RT - PCR进行分析，并按照先前描述的方法进行操作[26, 38]。使用以下引物:HDAC1:正向引物5’-TCACCATGGCGATGGCGTGG-3’，反向引物5’-TGCCGTCTCGCAGTGGGTAGT-3’；HDAC2:正向引物5’-ACAGACCCCAAAGGAGCCAAGT-3’，反向引物5’- GCCAATGTCCTCAAACAGGGAAGG-3’；HDAC3:正向引物5’-CCTCTGACTTCCTTCTGGGTTCCCC-3’，反向引物5’-TCACACCCTCTCCTCCTTGCCA-3’；HDAC4:正向引物5’-TCGGGCACAGTCCTCCCCAG-3’，反向引物5’-TGCGTCCACGGATGCACTCA-3’；HDAC 5:正向引物5’-CCTGTCCCGTCCGTCTGTCTGTT-3’，反向引物5’ -GCCATCTGCCGACTCGTTGGGAGA-3’；HDAC6:正向引物5’-CTGGCGGACTAGAAAGAGCCTTTCC-3’，反向引物5’-GGGGTGACTGGGGATTGTGCC-3’；HDAC7:正向引物5’-CCCACATCAGATAACCCAACCACAG-3’，反向引物5’-CTGGAGGGCAGGGGAGCCTTA-3’；HDAC 8:正向引物5’-CTCGCGGACGGTTGGAAGTGG-3’，反向引物5’-AGTGGACCATACTGGCCCGTT-3’；HDAC9:正向引物5’-AGCTTCTCGTGGCTGGTGGA-3’，反向引物5’-CGATTCAGGGGTCGGTGGCG-3’；HDAC10:正向引物5’-TTGCTGCAGGTGGCTGCTCC-3’，反向引物5’- CTCGGGCCATGGTTCGCTGG-3’；HDAC11:正向引物5’-CAGCCCAGCGGGCATTGTGA-3’，反向引物5’-TCT GTGCCGAGACGCAGGGA-3’；Sirt1:正向引物5’-AGC TGGGGTTTCTGTCTCCTGTGG-3’，反向引物5’-ACGG CTGGAACTGTCCGGGAT-3’；Sirt2:正向引物5’-CTCG GCCTCTTCTTGTTTCCGCT-3’，反向引物5’-CGAGTCT GAATCGGTCCGGCTC-3’；Sirt3:正向引物5’-CGCTTG ACCCTCTAGGCGCC-3’，反向引物5’-CCTTCTCCCAC CTGTAACACTCCCG-3’；Sirt4:正向引物5’-ACGGATG CATGCACAGAGTCCTG-3’，反向引物5’-GAACACGTC GCCGTCGGGAG-3’；GAPDH:正向引物5’-TCCTGCA CCACCAACTGCTTAGCC-3’，反向引物5’-GTTCAGCT CTGGGATGACCTTGCC-3’。
如先前所述[39, 40]，小鼠在 空间分辨率下，使用低温冷却谐振器(CCR)在超高场(7 T)进行扩散张量成像(DTI)检查。沿着30个梯度方向加上5个无扩散编码的参考方向采集扩散图像，总采集时间为35分钟。在组水平上，通过基于全脑的空间统计(WBSS)将分数各向异性(FA)图与野生型对照进行统计学比较。
沉默调节蛋白1活性测定
为了量化沉默调节蛋白1(Sirt1)的活性，制备了分选的小胶质细胞核提取物(每组三只小鼠的海马体合并)。使用Epigenase通用SIRT活性/抑制测定试剂盒(Epigentek，Farmingdale，NY)[41]，用核提取物测量乙酰化组蛋白的脱乙酰酶活性。
统计分析
使用GraphPad Prism(GraphPad软件，版本6.0，美国拉霍亚)进行统计分析。一般来说，所选样本量与先前出版物[38]中报道的样本量相似。所有数据均应用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性检验。如果数据呈正态分布，则应用不成对 检验。如果数据不符合正态性标准，则应用Mann-Whitney 检验。为了检验治疗或基因型的影响，应用了双因素方差分析(ANOVA)以及事后Bonferroni检验或Tukey-Kramer HSD检验。当 时，差异被认为具有统计学意义。每组动物数量表示为“n”。为了获得无偏数据，实验小鼠由技术人员一起处理，细胞定量由两位科学家独立且分别在盲态下进行。
结果
高效的成年海马神经发生依赖于 的存在，但不依赖于 的存在
注定要成为神经元的新生细胞，在其产生后的几个小时内开始表达微管相关蛋白双皮质素(DCX)[42]。成年海马神经发生的速率是根据两个月大时通过免疫荧光染色检测到的齿状回颗粒下区(SGZ)中存在的 细胞来确定的。在 小鼠中，与 同窝小鼠相比， 细胞的数量减少(图1a，c)。这种减少伴随着增殖细胞标志物 细胞数量的减少，以及 小鼠中 细胞数量的减少(图1a，b)。为了确定 的缺乏是否对 细胞的分化有影响，我们用抗BrdU和神经元标志物NeuN的抗体进行了双重标记(图1a)。同样，与 同窝小鼠相比， 小鼠中BrdU 双阳性细胞的数量减少(图1b)，导致齿状回中 细胞的总数总体较低(图1d)。通过MRI测定， 小鼠齿状回中 细胞数量的减少对海马总体积没有影响(图1e)。有趣的是， 神经母细胞的增殖和分化在 和 小鼠中是相同的(图1f - h)，这表明神经元 和小胶质细胞 之间的信号紊乱不是 小鼠成年神经发生减少的原因。与这些发现一致，我们在成年小鼠中观察到，用三维形态测量法显示， 的消融对齿状回颗粒下区、颗粒细胞层或齿状回门区的小胶质细胞形态没有影响(图1j - n)。我们可以进一步排除 小鼠中 细胞数量减少是由于小胶质细胞吞噬作用增强，因为在 和 小鼠的每个齿状回中，双阳性LAMP2 小胶质细胞的百分比或LAMP2 Iba1 细胞的数量没有差异(图2a，b)。此外， 细胞在caspase - 3介导的凋亡方面没有差异，这两种基因型的每个齿状回中活性caspase - 3 细胞的数量相似(图2c，d)。
图1 在非刺激条件下，齿状回(DG)颗粒下区(SGZ)中双皮质素(DCX)*细胞数量受趋化因子受体CX3CR1调控，而非其配体趋化因子调控。a ex3cr1 (左)和cx3cr1 (右)小鼠冠状DG切片的代表性免疫荧光图像，用神经元标志物NeuN(白色)、增殖标志物溴脱氧尿苷(BrdU，绿色)和DCX(红色)染色。b DG中BrdU BrdU+DCX( ，双尾学生t检验，cv3cr1 对比 )和BrdU+NeuN 阳性细胞数量的定量分析显示，cx2r1 小鼠中的细胞数量低于cx2cr1 小鼠。同样， 小鼠与 对照相比，DCX 、 对比 (c)和NeuN 细胞总数减少(p = 0.0048，双尾学生 检验， 对比 )(d)，尽管两条小鼠品系的整体海马体积无差异 对比 对比 )(e)。f (左)和 (右)小鼠冠状DG切片的代表性免疫荧光图像，用抗NeuN(白色)、BrdU(绿色)和DCX(红色)抗体染色。g 在两种小鼠品系的DG中，BrdU、BrdU + DCX和BrdU+NeuN阳性细胞的数量无统计学差异。DCX 和NeuN 细胞数量的定量分析也无差异(i)( ，双尾学生 检验， 对比 (n = 9))。J 来自 和 小鼠的离子钙结合衔接分子1(Iba-1)标记的小胶质细胞在DG的颗粒下区(顶行)、颗粒细胞层(GCL，中行)和海马角(底行)的三维重建。在对 节段数量、 分支点数量、 突起长度和 终点数量 进行定量分析后，两条小鼠品系的小胶质细胞在形态计量学上无显著差异，双尾学生 检验，4只动物的 细胞对比4只动物的 细胞)。显示了两个代表性实验中的一个。条形表示平均值 标准误；n.s.，无显著差异。
Cx3cr1 小胶质细胞在齿状回局部显示出增加的沉默调节蛋白1和NF-κB信号传导
是一种 -蛋白偶联受体，它抑制包括cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)在内的cAMP信号传导 [43]。所有哺乳动物组蛋白脱乙酰酶(HDACs)都具有潜在的磷酸化位点，其中一些可以被PKA磷酸化 [44]。HDACs的磷酸化状态通常决定其靶基因的转录调控程度，包括它们自身在负反馈回路中的表达，如HDAC1所述 [45]。因此，我们着手对通过荧光激活细胞分选(FACS)从 和 小鼠海马中获得的小胶质细胞中HDACs的表达进行定量RT-PCR分析(图3a)。RT-PCR结果显示，与从 小鼠分离的小胶质细胞相比，在所有分析的HDACs中，沉默调节蛋白1(SIRT1)在 小胶质细胞中表达最高(图3a)。当用抗SIRT1抗体对海马脑切片进行染色时，在DG中来自cx3cr1 小鼠的小胶质细胞(GFP )中检测到最强的信号，当分析来自 和 小鼠的小胶质细胞(CD11b )时，SIRT1信号强度逐渐降低(图3b，上排)。对于所有三种基因型，海马CA1区域的小胶质细胞SIRT1信号均减弱。然而，与杂合子和野生型同窝小鼠的小胶质细胞相比， 小胶质细胞显示出最强的SIRT1信号(图3b，下排)。有趣的是， 小胶质细胞中SIRT1信号的积分荧光密度升高与DG内(图3c，上排)和CA1区域(图3c，下排)的cx3cr1 小胶质细胞中乙酰化p65(acp65)的高信号强度平行，表明存在活性NF-κB复合物 [46]。在这两个区域，来自 和 小鼠的小胶质细胞中的acp65信号减弱，并且与DG小胶质细胞相比，位于海马CA1区域的小胶质细胞中的acp65信号总体上较弱(图3c)。当用白藜芦醇(一种SIRT1激活剂 [47])处理cx3cr1 小鼠时，DG内小胶质细胞中的acp65信号降低。另一方面，通过用SIRT1的选择性抑制剂EX527处理动物， 小鼠中的acp65信号被放大 [48](图3d)。由于细胞因子主要通过NF-κB途径诱导，我们通过激光显微切割从DG区域分离小胶质细胞(图4a)，并发现 小胶质细胞中CXCL10、TNF 和IL- mRNA水平升高，而与 小胶质细胞mRNA相比，CCL2和CCL3的表达没有差异(图4b)。
图2:cx3cr1 小鼠齿状回中DCX 细胞数量减少并非由于小胶质细胞吞噬作用增强或DCX 细胞凋亡。a cx3cr1 (a)和cx3cr1 小鼠(b)的代表性冠状齿状回切片，用小胶质细胞标记物lba1(白色)、吞噬作用标记物溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2，绿色)和DCX(红色)进行免疫染色，DCX标记增殖细胞和年轻的发育中神经元。对LAMP2 Iba1 细胞(右上角)( ，双尾学生 检验，cx 与 )或Iba1 细胞(右中)( ，双尾学生 检验， 与 )的定量分析显示，两种小鼠品系之间无显著差异。在 和 小鼠的齿状回中，用活性半胱天冬酶3标记物(白色)与DAPI(蓝色)和DCX(红色)共染色检测到的凋亡细胞数量相似(d)( ，双尾学生 检验， 与 )，如柱状图(右下角)所示。展示了两个代表性实验中的一个。条形表示平均值 SEM；n.s.，无显著差异
图3 cx3cr1 小鼠齿状回中增强的小胶质细胞AIRT1表达和p65的乙酰化。基于细胞大小和颗粒度的流式细胞术分析，通过CD11b高/CD45 表达鉴定了来自cx3cr1 和cx3cr1 小鼠的海马小胶质细胞(a，右侧为FACS印迹)。当将cx3cr1 mRNA水平除以cx3cr1 小胶质细胞中发现的mRNA水平时，未发现HDAC4 - HDAC10和sirtuin2 - sirtuin4的mRNA水平有显著诱导( ，双尾学生 检验，cx3cr1 与cx3cr1 )(a，柱状图)。与 小鼠相比， 小鼠海马小胶质细胞中HDAC1 - HDAC3、HDAC11和sirtuin1 mRNA水平显著更高(a，柱状图)。柱状图表示cx3cr1 小胶质细胞 的标准化mRNA表达相对于cx3cr1 小胶质细胞 的倍数(b)对来自cx3cr1 (左)、cx3cr1 (中)和cx3cr1 (右)小鼠的冠状齿状回(上排)和CA1(下排)切片进行免疫染色，检测DAPI(蓝色)、Sirt1(红色)和CD11b(绿色)。在 和 小鼠中，小胶质细胞用GFP(绿色)标记。在齿状回区域， 小胶质细胞中整合的Sirti荧光信号与 小胶质细胞中发现的信号相比增加( 与 )( )，与 小胶质细胞相比，在 中甚至更强( ，双尾学生 检验， 与 )。在CA1区域，发现c3cr1 小胶质细胞Sirt1染色仅略有增加( 配对变化 与 )，而在比较 在齿状回 中的Sirt1信号时没有差异(学生t检验， 与 )。柱状图表示 和 小鼠小胶质细胞中Sirt1信号的整合荧光密度相对于齿状回 小胶质细胞中Sirt1信号的情况(b，右侧柱状图)。 对相同小鼠品系的海马齿状回(上排)和CA1区域(下排)中的小胶质细胞乙酰化p65(红色)进行免疫染色，显示在cx3cr1 的齿状回中信号最强(双尾学生 检验， 与 )和 小鼠 (双尾学生 检验， 与 )。 小鼠CA1小胶质细胞中acp65信号仅略有增加( ，双尾学生 检验， ( )与 ( ))。 和 小鼠中小胶质细胞acp65的信号强度无差异( ，双尾学生 检验， 与 (c，右侧柱状图)。d用白藜芦醇预处理的cx3cr1 小鼠中，cx3cr1 小胶质细胞中acp65的免疫染色显著降低( 与cx3cr1 +白藜芦醇 )，而在EX527处理后增加( )。显示了两个实验中的一个代表性实验。柱状图表示平均值 SEM；n.s.，无显著差异。
沉默调节蛋白1的激活可恢复 小鼠的认知能力和神经发生
借助沉默调节蛋白1活性测定，我们可以确定，与 海马小胶质细胞中的SIRT1活性相比， 海马小胶质细胞中SIRT1水平的升高导致SIRT1活性增加(图5c)。为了确定SIRT1活性的调节是否会影响齿状回中DCX 细胞的数量和增殖，如用细胞增殖标记物Ki67进行双重染色所示，我们用EX527或白藜芦醇处理cx3cr1 小鼠。与载体处理相比，用EX527处理进一步降低了神经元谱系增殖和 细胞的数量，而白藜芦醇激活SIRT1使 小鼠中DCX 细胞的增殖和数量恢复到 小鼠中的情况(图5a、b)。SIRT1活性测定表明，EX527有效降低了 小鼠海马小胶质细胞中的SIRT1活性，而白藜芦醇激活SIRT1的程度甚至高于载体处理的 小鼠中升高的SIRT1活性(图5c)。为了研究SIRT1活性和成年神经发生变化对空间学习和记忆的影响，对动物进行了莫里斯水迷宫测试。用EX527处理 小鼠对学习阶段的逃避潜伏期或作为记忆指标在目标象限花费的时间均无影响(图5d、e)。这一发现表明，在基线条件下，SIRT1活性不参与空间学习和记忆。相比之下，与 小鼠相比， 小鼠表现出学习和记忆受损(图5d、e)。在用EX527预处理的 小鼠中，这种损伤变得更加明显(图5d、e)。在用载体单独或与EX527联合预处理后， 和 小鼠表现出相似的游泳速度(图5h)和找到可见平台的潜伏期(图5i)。通过注射白藜芦醇激活SIRT1可改善 小鼠的空间学习和记忆，使其达到 小鼠所示的水平(图5f、g)。同样，游泳速度和到达可见平台的时间不受处理的影响，表明小鼠没有视觉或动机障碍(图5j、k)。
图4 从齿状回分离的cx3cr1 小胶质细胞中细胞因子表达增加。a 从齿状回区域激光显微切割CD11b阳性细胞，并分离RNA用于实时PCR。b RT-PCR实验表明，CCL2( ，双尾学生 检验， 对比cx3cr1^/+(n = 4))和CCL3(p = 0.107，双尾学生t检验，cx3cri -/- 对比 )在cx3cr1 和cx3cr1 小鼠的小胶质细胞RNA中的表达相似。在cx3cr1 -/- 小鼠中检测到CXCL10( ，双尾学生 检验，cx3cr1 对比cx3cr1+/+(n = 4))、TNF-a( ，双尾学生 检验，cx3cr1 对比cx3cr1+/+ )和IL-1B (双尾学生 检验，cx3cr1 对比cx3cr1 )mRNA的表达水平显著增加。展示了两个实验中的一个代表性实验。柱状图表示平均值 SEM；n.s.，无显著性差异。***p < 0.001；*p < 0.05
图5 小胶质细胞SIRT1的激活增加了cx3cr1 小鼠中DCX 细胞的增殖，并改善了空间学习和记忆。a 在齿状回中的免疫组织化学显示，在给予赋形剂的野生型 (左上)和cx3cr1 (左下)小鼠以及用EX527(右上)或白藜芦醇(右下)处理的cx3cr1 小鼠中，细胞核用DAPI染色(蓝色)，增殖标志物Ki67阳性的细胞(白色)和DCX阳性的细胞(红色)。Ib DCX 和DCX’ 细胞的数量，双尾Student氏 检验， 赋形剂 与 赋形剂 相比)，与 在冰上相比， 在冰上的细胞数量减少。两组均给予赋形剂处理。当 三只。小鼠用EX527预处理时，DCX 与 EX527 和DCX 细胞进一步减少。在给予赋形剂的cx3cr1 小鼠和用白藜芦醇处理的c3cr1 小鼠中，DCX 和DCX’/Ki67 细胞的数量没有差异。c 使用分选的小胶质细胞核提取物进行的Sirtuin 1活性测定显示，给予赋形剂的cx3cr1 小鼠 与 小鼠 以及用白藜芦醇处理的c3x 小鼠 之间存在显著差异，双尾Student氏 检验)，给予赋形剂的 和用EX527处理的 小鼠 dent氏 检验)以及给予赋形剂的cx3cr1 和用白藜芦醇处理的cx3cr1 小鼠 之间存在显著差异，双尾Student氏 检验)。d， 通过在6天内找到隐藏平台的逃避潜伏期测量的学习能力(双向方差分析，随后进行Bonferroni事后检验， 赋形剂 与 EX527 赋形剂 与 赋形剂 赋形剂 与cx EX527 )。e， 在24小时后进行的探针测试期间评估的空间记忆保持(双尾Student氏 检验， 赋形剂 与 与 赋形剂 与 -//-+EX527(n = 6))， 学习阶段的游泳速度和 到达单独给予赋形剂或与EX527或白藜芦醇联合给予赋形剂预处理的cx3cr1 和cx3cr1 可见平台的潜伏期。显示了三个代表性实验之一。条形表示平均值 SEM；n.s.，无显著性差异。与 赋形剂组相比时，星号表示 值。 ；** ；*
讨论
通过本研究，我们表明，在静息条件下，位于小鼠齿状回(DG)区域的 小胶质细胞中SIRT1和NF-κB信号通路被激活。这种激活似乎仅限于DG，在海马CA1区则大大减弱。药理学激活SIRT1后，cx3cr1 小鼠受损的成体神经发生和降低的海马认知能力得到恢复。
我们假设小胶质细胞中的NF-κB信号通路和SIRT1酶相互作用以维持体内细胞稳态。由于趋化因子受体 通过与 蛋白偶联受体偶联来抑制包括cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)在内的cAMP信号传导[43]，从小胶质细胞中删除 可能会促进PKA的激活，进而促进NF-κB的激活[49]。导致PKA激活的刺激似乎仅限于某些脑区，例如具有增强细胞更新的齿状回(DG)，因为在CA1区域所见，在DG之外仅检测到边缘性的acp65信号。响应 小胶质细胞中p65乙酰化增加，SIRT1活性被放大，最有可能是为了抵消过度的NF-κB信号传导。SIRT1的激活可诱导NF-κB复合物的RelA/p65组分去乙酰化。Lys310的去乙酰化抑制RelA/p65亚基的反式激活能力，从而抑制NF-κB依赖性基因表达的转录[20]。然而，在 小胶质细胞中，SIRT1活性虽然升高，但似乎不足以阻止NF-κB依赖性基因表达[50]，如海马中IL-1 蛋白水平升高[13]或从cx3cr1 -/-小鼠的DG微切割的小胶质细胞中CXCL10、TNF- 和IL-1 mRNA表达增加所示(图4)。只有额外的SIRT1激活才能有效抵消NF-κB途径的激活。有趣的是，在未检测到小胶质细胞NF-κB激活的野生型小鼠中，SIRT1的激活对成年神经发生或水迷宫试验中的表现没有影响(数据未显示)。先前的研究表明，尤其是IL-1 可通过降低 小鼠DG中的增殖来损害成年神经发生[13]。在应激条件下的野生型小鼠中也观察到类似机制，当升高的IL-1β降低海马神经发生并且给予IL-1受体拮抗剂可恢复应激暴露后的神经发生率[51]。值得注意的是，尽管 小胶质细胞处于促炎激活状态，但与 小胶质细胞相比未检测到形态学变化，这在独立的一组实验中证实了先前的发现[52]。在海马发育过程中，小胶质细胞形态似乎至少部分取决于趋化因子受体，因为在P8时一小群 细胞的特征是表面积非常大。在 小鼠的脑中不存在这群细胞[53]。然而，一份基于免疫组织化学的报告表明，在正常生理条件下，遗传的cx3cr1缺陷与小胶质细胞改变有关，包括细胞数量增加和胞体增大[54]。虽然 的受体在小胶质细胞上高度表达，但 在健康神经元上持续高水平表达。 作为一种跨膜蛋白表达，可通过溶酶体半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶S(CatS)或解整合素和金属蛋白酶(ADAM)家族的成员ADAM-10和ADAM-17的活性切割成可溶性形式，由细胞外N端趋化因子结构域组成。 在神经元上的解剖学表达和 在小胶质细胞上的表达表明神经元可能通过抑制性 信号使小胶质细胞维持在监视/分支状态[56]。从这个角度来看，在 缺陷小鼠中发现神经干/祖细胞的完整增殖和成年神经发生是出乎意料的，而在缺乏 的小鼠中相同过程受损。如果 的结合引发维持小胶质细胞处于静止状态的强直性抑制信号，其缺失应导致激活的或促炎的小胶质细胞，对神经发生和神经发育产生负面影响。虽然研究之间对于 信号在体外的神经保护作用达成共识，但一些体内研究甚至表明 在阿尔茨海默病和帕金森病动物模型中具有神经毒性作用。在这里， 可作为小胶质细胞吞噬活性的抑制剂并导致整体小胶质细胞激活[57,58]。在肺内皮细胞中观察到另一种显著的作用模式，其对刺激作出反应并产生 。这导致表达唯一 受体 的单核白细胞亚群的内皮附着[59]。在用脂多糖(LPS)攻击后，与野生型对照相比， 小鼠在肺组织中表现出 表达降低和NF-κB信号传导受损[60]。 是一种可能具有多种活性的分子，可能没有、有益或具有破坏性潜力，这可能取决于其主要靶细胞的激活状态。支持我们的发现， 小鼠在任何主要器官(包括脑)中没有组织学异常，血液和淋巴组织中的造血谱系基本正常，并且它们没有表现出任何明显的行为异常。
正常情况[21]。也存在一种替代的 配体的可能性，其作用可能类似于 。最近有报道称，在人类中，嗜酸性粒细胞趋化因子-3/CC趋化因子配体26是 的功能性配体；然而，在小鼠中，CCL26基因可能是一个假基因，因为尚未报道有cDNA或表达序列标签(EST)[62]。与之前的报道相似，我们发现缺乏 的小鼠海马神经发生减少[15]。由于白细胞介素-1β的作用增强，这些小鼠在认知功能和长时程增强诱导方面表现出显著缺陷[14]。有两份报告表明，与野生型对照相比， 小鼠的海马认知能力有所改善[15,54]，神经元前体的生成要么增强[54]，要么受损[15]。目前尚不清楚这种不一致的原因。
结论
我们的研究结果表明，在 小鼠齿状回颗粒下区(SGZ)中， 细胞的数量减少，这与 配体 无关。齿状回中微胶质细胞NF-κB依赖性基因表达增强导致白细胞介素-1β等趋化因子水平升高，进而抑制神经发生和空间认知功能。对SIRT1活性的操纵会干扰NF-κB信号传导、成体神经发生，并最终影响海马的学习和记忆。
缩写
EGFP:增强型绿色荧光蛋白；FACS:荧光激活细胞分选；HDAC:组蛋白去乙酰化酶；LTP:长时程增强；MWM:莫里斯水迷宫；NF-κB:活化B细胞的核因子κB轻链增强子；SIRT1:沉默调节蛋白1
致谢
我们感谢Maria Oberle、Margarethe Ditter和Christine El Gaz提供的出色技术支持。
资金支持
MP得到了德国联邦教育与研究部资助的多发性硬化症能力网络(KKNMS)、神经退行性疾病能力网络(KNDD)、德国研究基金会(DFG)(SFB 992、FOR1336、PR 577/8-3、莱因哈特-科塞勒克资助)以及弗里茨-蒂森基金会的支持。TB得到了玛丽·居里整合资助项目(编号248033 - MBfUSEDIT)的支持，该项目是根据FP7 - PEOPLE - 2009 - RG呼吁提交的，同时也得到了德国研究基金会(DFG)(BL 1153/1-1)的支持。
数据和材料的可用性
不适用。
作者贡献
TB、MP、SJ、SL设计实验、进行分析并起草了手稿；SS、RPM、MS和AS进行了免疫组织化学、蛋白质印迹分析并解释了数据；TB、AS监督并解释了行为学研究；AM、KB进行了细胞重建；LAH和DVE参与了MRI实验和分析；DE和OS进行了分子实验工作、分析并讨论了数据。所有作者阅读并批准了最终手稿。
作者信息
不适用。
利益冲突
作者声明他们没有利益冲突。
发表同意书
不适用。
伦理批准和参与同意
不适用。
作者详情
神经病理学研究所，弗莱堡大学，Breisacher Str. 64，D - 79106弗莱堡，德国。 精神病学与心理治疗系，弗莱堡，德国。 放射学与医学物理系，弗莱堡大学医学中心，弗莱堡，德国。 神经科学系，格罗宁根大学医学中心，格罗宁根大学，格罗宁根，荷兰。 免疫学研究所，西奈山伊坎医学院，纽约，美国。 免疫学系，魏茨曼科学研究所，雷霍沃特，以色列。 BIOSS生物信号研究中心，弗莱堡大学，弗莱堡，德国。 当前地址:实验性中风研究实验室，慕尼黑大学医学中心中风与痴呆研究所(ISD)，81377慕尼黑，德国。 当前地址:神经科学系，马克斯·德尔布吕克分子医学中心(MDC)，柏林 - 布赫，Robert - Rössle - Str. 10，13092柏林，德国。 当前地址:卓越神经治疗集群，神经科学研究中心，柏林夏里特大学医学中心，Charitéplatz 1，10117柏林，德国。 当前地址:临床化学与检验医学研究所，格赖夫斯瓦尔德大学医学中心，Ferdinand - Sauerbruch - Str.，17475格赖夫斯瓦尔德，德国。
收到日期:2016年8月11日 接受日期:2016年9月10日
在线发表日期:2016年9月17日
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