METTL3通过依赖YTHDF2的方式抑制LINC00312以抑制骨质疏松症进展
发布时间：
2026-04-09 21:09
METTL3通过依赖YTHDF2的方式抑制LINC00312以抑制骨质疏松症进展
杨王 ，田一豪 ，姚刚
中国医科大学附属盛京医院超声科，辽宁沈阳110004； 中国医科大学北方医院北部战区总医院病理科，辽宁沈阳110004； 中国医科大学附属盛京医院骨外科，辽宁沈阳110004
DOI: 10.3892/ijmm.2025.5699
摘要。甲基化和非编码RNA的调控在骨质疏松症的发病机制中起重要作用。大多数微小RNA(miRNA或miR)通过靶基因发挥其生物学功能。长链非编码RNA作为竞争性内源性RNA发挥作用。用miR - 4765、LINC00312和METTL3相关分子转染hFOB 1.19细胞。通过PCR检测LINC00312和miR - 4765的表达，而通过蛋白质印迹法检测裂解的半胱天冬酶3和FOXK2/SFRP1水平。使用微型计算机断层扫描检测骨微结构。对糖尿病小鼠进行针对METTL3和LINC00312的治疗。使用PCR和
免疫组织化学检测FOXK2/SFRP1表达。结果表明，miR - 4765过表达降低了FOXK2/SFRP1和裂解的半胱天冬酶3表达，导致细胞凋亡。在体外和体内均观察到LINC00312受到抑制。LINC00312直接与miR - 4765结合，而miR - 4765直接与FOXK2/SFRP1结合。METTL3和YTHDF2直接结合LINC00312并通过改变其甲基化水平降低其表达。总之，LINC00312通过靶向miR - 4765/FOXK2/SFRP1轴促进hFOB 1.19细胞凋亡，并且METTL3以依赖YTHDF2的方式调节LINC00312表达。
引言
骨质疏松症(OP)是一种代谢性疾病，可分为原发性或继发性(1)。随着OP发病率的逐年上升，近年来相关研究不断加强(2)。然而，OP的具体致病机制仍不清楚(3)。目前的证据表明，成骨细胞过度凋亡是OP的原因之一(4,5)。成骨细胞凋亡是由高血糖(6,7)、雌激素缺乏(8,9)、长期代谢紊乱(10)和糖皮质激素异常(11)引起的。
细胞凋亡是指多细胞生物中程序性细胞死亡的过程(12)。先前的研究表明，抑制成骨细胞凋亡可能改善OP的预后(13,14)。然而，在高血糖条件下维持成骨细胞活力和防止细胞死亡的有效策略仍不确定(6,7)。
甲基化的RNA核苷酸存在于所有生物界，许多生物过程依赖于编码和非编码RNA的动态和可逆甲基化(15)。N6 - 甲基腺苷(m6A)RNA甲基化是最常见的可逆RNA修饰，在转录后调节几个重要的RNA过程(16)。适当的RNA甲基化对于细胞发育和组织稳态至关重要(17)。作为一种可逆的翻译后修饰，RNA甲基化也影响RNA稳定性(18)。在真核生物中，m6A是主要的RNA修饰类型占所有RNA修饰的60%(19)。
微阵列是用于分析基因表达和以相当高的可靠性检查广泛信号通路的高通量平台(20,21)。在本研究中，重点关注miR - 4765的表达。使用公开可用的在线数据库预测叉头框蛋白K2(FOXK2)、分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)和LINC00312。最后，使用SRAMP预测LINC00312的甲基化位点。
通信作者:田一豪博士，中国医科大学北方医院北部战区总医院病理科，辽宁省沈阳市沈河区文化路83号，110004
电子邮件:18940121470@163.com
中国医科大学附属盛京医院骨科，姚刚博士，中国辽宁省沈阳市和平区三好街36号，邮编110004
电子邮件:yaogang@cmu.edu.cn
*共同贡献
缩写:OP，骨质疏松症；IncRNA，长链非编码RNA；ceRNA，竞争性内源RNA；micro-CT，微计算机断层扫描；IHC，免疫组织化学；m6A，N6-甲基腺苷；miRNAs，微小RNA；CCK-8，细胞计数试剂盒-8；NC，阴性对照；OD，光密度；RT-qPCR，逆转录定量PCR；RIPA，放射免疫沉淀法；PVDF，聚偏二氟乙烯；RIP-qPCR，RNA免疫沉淀-qPCR；STZ，链脲佐菌素；FINS，空腹血浆胰岛素；OE，过表达；PBS，磷酸盐缓冲盐水；UTR，非翻译区；miRDB，微小RNA数据库；DIANA，DNA智能分析；U2OS，人骨肉瘤细胞系；BMSCs，骨髓基质/间充质干细胞
关键词:LINC00312，ceRNA，生物信息学分析，甲基化，骨质疏松症
本研究结果表明，miR-4765通过靶向FOXK2和SFRP1抑制细胞凋亡，而LINC00312通过与miR-4765结合促进细胞凋亡。此外，METTL3以YTHDF2依赖的方式增加LINC00312的甲基化，从而降低LINC00312的表达。
材料与方法
数据库使用情况。基因表达谱数据集GSE74209是从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中选取的。GSE74209是使用名为miRCURY LNA microRNA Array第7代(hsa，miRBase 20；https://www.mirbase.org/)的安捷伦GPL20999平台生成的，由De-Ugarte等人提交(22)。GSE74209数据集包含12个样本，其中6个来自OP患者，另外6个是健康对照的骨组织。此后，使用GEO2R方法对GSE74209数据集进行分析(图S1A-H)。在获得差异表达的微小RNA(miRNA或miR)后，对上调和下调的miRNA进行富集分析(图S2A-E)。在GSE74209细胞中检测了miR-4765的表达水平(图S2F和表SI)。miR-4765被选为靶标miRNA，因为其差异表达最为显著。通过识别不同数据库中的重叠基因[TargetScan，http://www.targetscan.org/；微小RNA数据库(miRDB，http://mirdb.org/)；以及DNA智能分析(DIANA；http://diana.imis.athena-innovation.gr/)]预测了miR-4765的靶基因。观察到miR-4765有两个重叠基因，FOXK2和SFRP1。对所有可能靶基因的并集进行了生物信息学分析(图S3A-D，表SII和SIII)。使用序列比对(BLAST)发现LINC00312与miR-4765的表达密切相关(图S4A和B)。最后，使用SRAMP数据库(http://www.cuilab.cn/sramp)预测了LINC00312上可能的甲基化位点。
细胞培养。hFOB 1.19是一种特征明确的人成骨细胞系，因其稳定的成骨细胞表型(例如，骨钙素和I型胶原蛋白的表达)以及对成骨刺激的反应性，被广泛应用于骨质疏松症研究。源自人类的hFOB 1.19细胞(中国科学院)通常用作成骨细胞凋亡的体外模型。hFOB 1.19细胞在补充有10%胎牛血清(Hyclone；Cytiva)和1%链霉素及青霉素(Hyclone；Cytiva)的DMEM/F12(Hyclone；Cytiva)中进行传代培养，之后在含有 和 及 空气的 培养箱中，于最大湿度条件下孵育。每天更换培养基。在处理前，将细胞在无血清培养基中孵育 ，然后在 下，于不同浓度 的葡萄糖存在下培养5天。细胞计数试剂盒 - 8(CCK - 8)。将处理后的细胞以 个细胞/孔的浓度接种到96孔板中。待细胞贴壁于孔表面后，按照 (Dojindo Molecular Technologies, Inc.)试剂盒制造商的说明，向每个孔中加入试剂，然后在 培养箱( ， 和 空气)中孵育 。最后，进行酶联免疫吸附测定(ELISA)(ELx808；BioTek, Inc.)，并使用光密度(OD)值测量每个孔中的吸光度(波长设定为 )，以代表细胞的相对数量。
细胞转染。微小RNA - 4765(miRNA - 4765)模拟物、miRNA - 4765抑制剂以及作为微小RNA阴性对照(NC)的无义序列购自上海吉玛制药技术有限公司。LINC00312过表达(OE)质粒、sh - LINC00312以及长链非编码RNA(lncRNA)的无义序列NC购自上海吉凯基因化学有限公司。METTL3 OE质粒、YTHDF2 OE质粒、sh - METTL3、sh - YTHDF2以及与NC类似的无义序列购自上海吉凯基因化学有限公司。按照制造商的说明，使用含有 质粒或 微小RNA寡核苷酸(Invitrogen；Thermo Fisher Scientific, Inc.)的Lipofectamine 2000在 下转染hFOB 1.19细胞6小时。转染后 提取RNA，转染后 提取蛋白质。
逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)。按照制造商的方案(Qiagen Sciences公司)，使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA。根据制造商的说明，使用PrimeScript RT试剂试剂盒(TaKaRa生物技术有限公司)对miRNA、lncRNA和mRNA进行逆转录PCR。使用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(TaKaRa生物技术有限公司)进行RT-qPCR，并使用罗氏Light Cycler II系统(罗氏诊断公司)分析结果。首先，在 下进行 的初始变性步骤。随后进行40个循环的扩增，每个循环包括在 下变性30秒、在 下退火30秒以及在 下延伸30秒。每个基因的相对miRNA表达以U6 RNA的表达为标准进行归一化，而每个基因的相对mRNA和lncRNA表达以GAPDH RNA的表达为标准进行归一化。使用 方法进行基因表达的相对定量。使用以下引物序列:miR-4765正向引物，5’-CCGCGTGAGTGATTGATAGCTATGTTC-3’，反向引物，5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6正向引物，5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物，5’-AACGCT TCACGAATTTGCGT-3’；LINC00312正向引物，5’-AGG GCAGGGTACTCTGATTGGC-3’，反向引物，5’-TGGCTT CTCTCCTGGCTCTGC-3’；FOXK2正向引物，5’-AAGAAC GGGGTATTCGTGGAC-3’，反向引物，5’-CTCGGGAAC CTGAATGTGC-3’；SFRP1正向引物，5’-ACGTGGGCT ACAAGAAGATGG-3’，反向引物，5’-CAGCGACACGGG TAGATGG-3’；METTL3正向引物，5’-TTGTCTCCCAACC TTCCGTAGT-3’，反向引物，5’-CCAGATCAGAGAGGT GGTGTAG-3’；YTHDF2正向引物，5’-AGCCCCACTTCC TACCAGATG-3’，反向引物，5’-TGAGAACTGTTATTT CCCCATGC-3’；以及GAPDH正向引物，5’-GGAGCGAGA TCCCTCCAAAAT-3’，反向引物，5’-GGCTGTTGTCAT ACTTCTCATGG-3’。本研究采用以下短发夹(shRNA)靶序列(不包括质粒骨架序列):模拟物，正义链5’-UGA UUGAUAGCUAUGUUCAA-3’，反义链5’-UUGAAC AUAGCUAUCAAUCA-3’；模拟物-NC正义链’，5’-UUCUCC GAACGUGUCACGUTT-3’，反义链，5’-ACGUGA CACGUUCGGAGAATT-3’；抑制剂，5’-UUGAACAUA GCUAUCAAUCA-3’，抑制剂-NC，5’-CAGUACUUU UGUGUAGUACAA-3’。此外，使用以下shRNA构建体:Sh-FOXK2，CCGAGTGATGCCATC TGACCTCAAT；Sh-SFRP1，GAGTACGACTACGTGAGC TTCCAGT；Sh-LINC00312，CCGCTTGCTGATGGACTC CAAGTAT；Sh-METTL3，GGAGGAGTGCATGAAAGC CAGTGAT；Sh-YTHDF2，AGTCCCTCCATTGGCTTC TCCTATT；以及Sh-NC，5’-CCUAAGGUUAAGUCGCCC UCG-3’。
蛋白质免疫印迹法。将hFOB 1.19细胞在含有蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(碧云天生物技术研究所)的放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液(碧云天生物技术研究所)中裂解，然后将裂解物 在 下离心 。使用二辛可宁酸蛋白质试剂盒(碧云天生物技术研究所)在RIPA和上样缓冲液中以 的浓度测定蛋白质浓度。细胞裂解物在 下使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳与蛋白质标准品(货号26616；赛默飞世尔科技公司)分离，之后将 蛋白质在 下转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上90分钟。膜在5%牛血清白蛋白(BSA；北京索莱宝科技有限公司)溶液中在室温 下孵育 ，然后在 下与以下一抗过夜孵育(浓度根据制造商说明):抗切割的半胱天冬酶-3(1:1000；货号9661；Cell Signaling Technology公司)、抗FOXK2(1:1000；货号12008；Cell Signaling Technology公司)、抗SFRP1(1:1000；货号4690；Cell Signaling Technology公司)、抗METTL3抗体(1:1000；货号ab195352；Abcam公司)、抗YTHDF2抗体(1:1000；货号ab220163；Abcam公司)和抗GAPDH(1:10000；货号10494-1-AP；Proteintech Group公司)。然后将膜在室温(20 - 25°C)下与二抗(1:10000；货号SA00001-2；Proteintech Group公司)孵育2小时，并使用超敏增强化学发光检测试剂盒(货号PK10002；Proteintech Group公司)进行显影。使用ImageJ软件(v1.52；美国国立卫生研究院)进行光密度分析。
细胞凋亡的流式细胞术检测。按照制造商的说明，使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(同仁化学研究所株式会社)对细胞凋亡进行定量分析。简要步骤如下:将hFOB1.19细胞以每孔 个细胞的密度接种到6孔板中，然后根据每组的实验要求进行处理。处理后，收集细胞，用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤两次，并重悬于1X Annexin V结合缓冲液中，使细胞浓度达到 个细胞 。随后，将 的细胞悬液与 的Annexin V-FITC和 的PI混合，然后在室温下于暗处 孵育 。孵育后，向每个样品中加入 的 Annexin 结合缓冲液。使用贝克曼库尔特CytoFLEX流式细胞仪(贝克曼库尔特公司)进行流式细胞术检测。使用FlowJo 10.8.1版本软件(BD生物科学公司)进行数据采集和分析。细胞分类如下:Annexin V-FITC阴性/PI阴性(活细胞)、Annexin V-FITC阳性/PI阴性(早期凋亡细胞)、Annexin V-FITC阳性/PI阳性(晚期凋亡/坏死细胞)和Annexin V-FITC阴性/PI阳性(坏死细胞)。凋亡细胞的总百分比计算为早期凋亡(Annexin )细胞和晚期凋亡(Annexin )细胞的总和。
双荧光素酶报告基因实验。将293T细胞(中国科学院)接种到24孔板中并培养过夜，然后按照制造商的说明，使用罗氏X-tremeGENE HP(产品编号:06366236001；罗氏诊断公司)，每孔转染野生型和突变型FOXK₂和SFRP₁质粒( pMIR-REPORT-野生型-FOXK₂和pMIR-REPORT-野生型-SFRP₁或pMIR-REPORT-突变型-FOXK₂和pMIR-REPORT-突变型-SFRP₁质粒)(上海吉凯基因化学有限公司)。然后，将细胞与 miR-4765模拟物或 miR-4765阴性对照(上海吉玛基因股份有限公司)共转染。转染后，按照制造商的说明，使用双荧光素酶报告基因检测系统(普洛麦格公司)对荧光素酶活性进行定量分析 萤火虫荧光素酶活性以海肾荧光素酶活性为对照进行标准化。
将293T细胞(中国科学院)接种到24孔板中并培养过夜，然后使用罗氏X-tremeGENE HP(产品编号06366236001；罗氏诊断公司)按照制造商的说明，用野生型和突变型LINC00312质粒(每孔0.1 pMIR-REPORT-野生型-LINC00312或pMIR-REPORT-突变型-LINC00312质粒)(上海吉凯基因化学有限公司)进行转染。然后，细胞与 miR-4765模拟物或 miR-4765阴性对照(上海吉玛基因股份有限公司)共转染。转染后，使用双荧光素酶报告基因检测系统按照制造商的说明(普洛麦格公司)对荧光素酶活性进行定量 。萤火虫荧光素酶活性以海肾荧光素酶活性为对照进行标准化。
将293T细胞(中国科学院)接种到24孔板中并培养过夜，随后使用罗氏X-tremeGENE HP(产品编号06366236001；罗氏诊断公司)按照制造商的说明，用野生型和突变型LINC00312质粒(每孔0.1 pMIR-REPORT-野生型-LINC00312或pMIR-REPORT-突变型-LINC00312质粒)(上海吉凯基因化学有限公司)进行转染。然后，细胞与 METTL3/YTHDF2过表达质粒或 METTL3/YTHDF2阴性对照(上海吉凯基因化学有限公司)共转染。
有限公司)。转染后，使用双荧光素酶报告基因检测系统按照制造商的说明(普洛麦格公司)对荧光素酶活性进行定量 。萤火虫荧光素酶活性以海肾荧光素酶活性为对照进行标准化。
m6A定量。使用EpiQuik™ m6A RNA甲基化定量试剂盒(比色法，P-9005)(Epigentek集团公司)按照制造商的说明从提取的RNA中检测m6A水平。每孔含有200 ng RNA。最后，进行酶联免疫吸附测定(ELx808；BioTek公司)，并使用OD值测量每孔的吸光度(波长设置为450 nm)以代表相对甲基化水平。
RNA免疫沉淀-qPCR(RIP-qPCR)。使用Magna RIP试剂盒(产品编号17-700；MilliporeSigma)按照制造商的说明进行RIP实验。对于这些实验，抗m6A(产品编号ab151230)、抗METTL3(EPR18810；产品编号ab195352)、抗YTHDF2(EPR20318；产品编号ab220163)和IgG用作阴性对照。最后，使用蛋白酶从结合蛋白中分离和纯化RNA，并使用先前描述的方法进行qPCR实验。
动物实验。所有动物实验均经北部战区总医院机构审查委员会批准(批准号:2025 - 26；中国沈阳)，并按照美国国立卫生研究院《实验动物饲养与使用指南》进行。中国医科大学提供了总共50只8周龄、体重为 的C57BL/6J雄性无特定病原体小鼠，它们可自由获取水和食物，并在12/12小时光照/黑暗周期、温度设定为 的环境中饲养。小鼠被随机分为以下几组:对照组(5只喂食正常饮食的非糖尿病小鼠)和糖尿病模型组(45只喂食含60%脂肪、20%蛋白质和20%碳水化合物高脂饮食的小鼠)。在糖尿病组中，20只接受与METTL3相关的治疗，20只接受与LINC00312相关的治疗，5只作为未治疗的糖尿病对照。小鼠腹腔注射用 柠檬酸盐缓冲液稀释的载体或链脲佐菌素(STZ)，剂量为 。STZ注射一周后，当空腹血糖水平达到 且胰岛素敏感性降低时，认为糖尿病小鼠模型成功建立。
实验持续时间从STZ注射到终点共8周。安乐死的人道终点包括体重减轻超过基线的20%、严重嗜睡、无法进食或饮水，或痛苦迹象(例如，弓背姿势或呼吸急促)。每天通过目视检查和每周测量体重来监测动物健康和行为。研究结束时，所有动物在异氟烷麻醉(诱导5%，维持2%)下安乐死，随后进行颈椎脱臼。通过心跳停止、呼吸骤停和固定散大的瞳孔确认死亡。实验期间未发生意外死亡。
血浆测量。采集静脉血(尾静脉)，使用OneTouch血糖仪分析仪(罗氏血糖仪)测量空腹血糖，使用小鼠胰岛素试剂盒(默克集团)测量空腹血浆胰岛素(FINS)。胰岛素敏感性指数计算为ln(FINS FPG)。
腺病毒注射。携带METTL3和LINC00312的OE腺病毒(OE - METTL3和OE - LINC00312)、小发夹腺病毒(sh - METTL3和sh - LINC00312)以及相应的携带空载体腺病毒(OE - NC或sh - NC)由上海吉凯基因化学有限公司构建。此后，随机选择40只成功建立的糖尿病小鼠模型接受腺病毒治疗(20只接受与METTL3相关的治疗，其余20只接受与LINC00312相关的治疗)。将包装有腺病毒的OE - METTL3和OE - LINC00312、sh - METTL3和sh - LINC00312或相应的NC连续每周两次经尾静脉注射到小鼠体内( 体重)，共注射4周。此后，解剖小鼠股骨用于后续实验研究。
免疫组织化学(IHC)。将实验小鼠的股骨分离，在室温下于4%多聚甲醛中固定 。固定后，样本在 乙二胺四乙酸中脱钙2周，脱水并包埋于石蜡中。最后，制作 厚的组织切片并在二甲苯中脱蜡。复水后，切片暴露于抗原表位。用 淬灭过氧化物酶活性10分钟。用PBS洗涤后，切片在室温 下于 牛血清白蛋白中孵育 ，然后在4°C下用兔抗FOXK2多克隆抗体(货号30660 - 1 - AP；Proteintech Group, Inc.)和抗SFRP1抗体(货号26460 - 1 - AP；Proteintech Group, Inc.)孵育过夜。接下来，加入山羊抗兔二抗在室温 下孵育90分钟。最后，切片用ABC工作液(OriGene Technologies, Inc.)在室温(20 - 25°C)下处理20分钟，并用3,3 - 二氨基联苯胺(OriGene Technologies, Inc.)显色。棕色颗粒表示阳性表达。结果用光学显微镜(Leica Microsystems GmbH)分析。
微型计算机断层扫描(micro - CT)扫描。为测量骨微结构，将实验小鼠的股骨和胫骨分离，然后去除软组织并在无菌PBS中孵育。最后，将制备好的骨组织放入微型CT系统(NEMO Micro - CT，NMC - 200；和平医疗科技)中，按照制造商的说明操作(管电压为80 KV；管电流为0.06 mA；源到探测器距离为410 mm；源到扫描物体的距离为90 mm；每秒帧数为20/秒；总帧数为4000；重建类型为FDK；水平视野为50 mm；轴视野为16 mm；像素大小 ；扫描精度 ；尺寸为1,000x1,000x608；CT阈值为1,497.95)。
统计分析。所有数据使用IBM SPSS Statistics(版本23.0；IBM公司)和GraphPad Prism(版本5.0；GraphPad软件公司；Dotmatics)进行分析。P < 0.05被认为表示具有统计学显著差异。每个实验独立重复三次，测量数据以平均值 标准差表示。所有成对比较使用Tukey’s诚实显著差异检验重新分析。具体而言，在对三个或更多组进行单向方差分析后，使用Tukey’s HSD检验确定显著差异。
图1.高血糖可诱导hFOB 1.19细胞凋亡并抑制miR-4765表达。(A)不同葡萄糖浓度(1、2.5、3.5或4.5 g/l)下hFOB 1.19细胞的活力。细胞活力以OD值表示。(B)不同葡萄糖浓度(1、2.5、3.5或4.5 g/l)下hFOB 1.19细胞中裂解的caspase-3蛋白表达。(C)在不同葡萄糖浓度(1、2.5、3.5或4.5 g/l)下，用Annexin V染色检测hFOB 1.19细胞的凋亡水平。(D)不同葡萄糖浓度(1、2.5、3.5或4.5 g/l)下hFOB 1.19细胞中miR-4765的表达。数据表示为平均值 标准差(n = 3)。*P<0.05，**P<0.01。OD，光密度；miR，微小RNA。
结果
高血糖诱导hFOB 1.19细胞凋亡并抑制miR-4765表达。为了确定高血糖环境是否会导致骨质疏松，诱导hFOB 1.19细胞凋亡，并抑制miR-4765表达，将hFOB 1.19细胞培养在不同葡萄糖浓度(1、2.5、3.5和4.5 g/l)的培养基中。CCK-8检测结果表明，随着葡萄糖浓度的增加，细胞数量减少(图1A)。此后，用蛋白质免疫印迹法检测裂解的caspase-3的表达水平(图1B)；用Annexin V染色法检测细胞凋亡水平(图1C)；用RT-qPCR法检测miR-4765的表达水平(图1D)。在葡萄糖浓度为4.5 g/l时，hFOB 1.19细胞的凋亡水平显著增加，而miR-4765的表达水平最低。因此，在随后的实验中选择葡萄糖浓度为4.5 g/l的培养基来模拟骨质疏松。
miR-4765抑制hFOB 1.19细胞凋亡。为了研究miR-4765对hFOB 1.19细胞的影响，用miR-4765模拟物和miR-4765模拟物阴性对照转染细胞，并进行后续实验(图2A)。CCK-8检测结果显示，miR-4765过表达促进细胞数量增加(图2B)。蛋白质免疫印迹法和Annexin V染色显示，将miR-4765模拟物瞬时转染到hFOB 1.19细胞中可抑制细胞凋亡(图2C和D)。用miR-4765抑制剂转染可增加细胞凋亡(图2B-D)。
FOXK2和SFRP1是使用miRDB预测的miR-4765的潜在靶基因。为了进一步研究miR-4765影响细胞凋亡的分子机制，使用了几种在线靶标预测工具，包括miRDB、DIANA和TargetScan，据此鉴定了两个候选靶基因(图3A)。为了评估miR-4765对FOXK2和SFRP1表达的影响，用miR-4765模拟物和抑制剂转染hFOB 1.19细胞。因此，miR-4765模拟物降低了FOXK2和SFRP1的水平，而miR-4765抑制剂则提高了它们的水平(图3B-D)。为了研究FOXK2和SFRP1对hFOB 1.19细胞的影响，用sh-FOXK2、sh-SFRP1、sh-FOXK2阴性对照或sh-SFRP1阴性对照转染细胞(图3E)。CCK-8检测结果和裂解的caspase-3蛋白表达分析表明，敲除FOXK2和SFRP1可增加细胞数量(图3F-I)。此外，转染FOXK2和SFRP1过表达质粒可促进细胞凋亡(图3E-I)。
高血糖环境在体外和体内均促进了FOXK2和SFRP1的表达(图3J - L)。最后，使用显微CT评估骨微结构指标(图3M)。与对照小鼠相比，糖尿病小鼠的骨微结构显示出更多骨质疏松(OP)的特征。miR - 4765直接靶向FOXK2和SFRP1的3’ - 非翻译区(UTR)。将FOXK2和SFRP1 mRNA的野生型3’ - UTR与预测的miR - 4765结合位点一起克隆，以及位于荧光素酶编码序列上游的突变型3’ - UTR(图4A)。与共转染miR - 4765模拟物阴性对照(NC)和FOXK2/SFRP1 mRNA野生型3’ - UTR片段的细胞相比，共转染miR - 4765模拟物和FOXK2/SFRP1 mRNA野生型3’ - UTR片段的细胞中荧光素酶活性较低。相反，与共转染miR - 4765模拟物和FOXK2/SFRP1 mRNA野生型3’ - UTR片段的细胞相比，共转染miR - 4765模拟物和FOXK2/SFRP1 mRNA突变型3’ - UTR片段的细胞中荧光素酶活性更高(图4B和C)。最后，将FOXK2/SFRP1过表达(OE)质粒和miR - 4765模拟物共转染到人成骨细胞系hFOB 1.19细胞中，并使用CCK - 8法和裂解的caspase - 3蛋白表达来确定细胞凋亡程度。结果显示，FOXK2和SFRP1部分逆转了miR - 4765的抗凋亡作用(图4D - G)。这些结果表明，FOXK2和SFRP1可能是miR - 4765的直接靶点，提示miR - 4765通过靶向FOXK2和SFRP1影响细胞凋亡。
图2. miR - 4765可抑制hFOB 1.19细胞凋亡。(A)miR - 4765模拟物和抑制剂的转染效率。(B)用miR - 4765模拟物、抑制剂及其相应的阴性对照(NC)转染后hFOB 1.19细胞的活力。细胞活力以光密度(OD)值表示。(C)用miR - 4765模拟物、抑制剂及其相应的NC转染后裂解的caspase - 3蛋白表达。(D)用miR - 4765模拟物、抑制剂及其相应的NC转染后使用膜联蛋白V染色检测的细胞凋亡水平。数据表示为平均值 标准差(n = 3)。“P < 0.05和“P < 0.01。miR，微小RNA；OD，光密度；NC，阴性对照。
如数据库分析预测的那样，LINC00312可能作为miR - 4765的海绵来调节FOXK2和SFRP1。为了检测LINC00312是否与miR - 4765相互作用，将LINC00312过表达(OE)质粒、sh - LINC00312或LINC00312阴性对照(NC)转染到人成骨细胞系hFOB 1.19细胞中。在确认成功转染后(图5A)，发现LINC00312 OE质粒降低了miR - 4765的表达，而sh - LINC00312增加了其表达(图5B)。
为了评估LINC00312对FOXK2和SFRP1的影响，将LINC00312 OE质粒(sh-LINC00312)或LINC00312阴性对照(NC)转染到人成骨细胞系hFOB 1.19细胞中。LINC00312 OE质粒增加了FOXK2和SFRP1的水平，而sh-LINC00312降低了这些水平(图5C)。
为了评估LINC00312在体内对FOXK2和SFRP1的影响，给糖尿病骨质疏松小鼠注射携带LINC00312的腺病毒用于过表达LINC00312(OE-LINC00312)、sh-LINC00312或相应的阴性对照(NC)。过表达LINC00312在体内增加了FOXK2和SFRP1的mRNA(图5D)和蛋白(图5E)水平，而sh-LINC00312降低了这些水平。
LINC00312可直接与miR-4765结合。LINC00312的野生型3’-区域与推测的miR-4765结合位点一起被克隆，以及位于荧光素酶编码序列上游的突变型3’-区域(图6A)。与共转染miR-4765模拟物阴性对照(NC)和LINC00312野生型3’-区域片段的细胞相比，共转染miR-4765模拟物和LINC00312野生型3’-区域片段的细胞中荧光素酶活性较低。相反，与共转染miR-4765模拟物和LINC00312野生型3’-区域片段的细胞相比，共转染miR-4765模拟物和LINC00312突变型3’-区域片段的细胞中荧光素酶活性更高(图6B)。最后，将hFOB 1.19细胞与LINC00152过表达(OE)质粒和miR-4765模拟物共转染，然后使用CCK-8测定法和裂解的caspase-3蛋白表达来确定细胞凋亡程度。结果表明，miR-4765部分逆转了LINC00312的凋亡作用(图6C和D)。同时，将hFOB 1.19细胞与LINC:00152 OE质粒以及sh-FOXK2和sh-SFRP1共转染，然后使用CCK-8测定法和裂解的caspase-3蛋白表达来确定细胞凋亡程度。值得注意的是，发现sh-FOXK2和sh-SFRP1部分逆转了LINC00312对hFOB 1.19细胞的凋亡作用(图6E-H)。这些结果表明，LINC00312可作为RNA海绵直接与miR-4765结合并发挥其ceRNA功能。LINC00312促进hFOB 1.19细胞凋亡。为了检测LINC00312对hFOB 1.19细胞的凋亡作用，将细胞用sh-LINC00312或LINC00312 NC转染。CCK-8测定结果表明，LINC00312敲除后细胞数量增加(图7A)。蛋白质免疫印迹法和膜联蛋白V染色显示，用sh-LINC00312转染可抑制hFOB 1.19细胞凋亡(图7B和C)，而用LINC00312 OE质粒转染则增加凋亡(图7A和B)。高血糖环境促进了LINC00312的表达(图7D)。
图3. 使用数据库预测FOXK2和SFRP1是miR - 4765的潜在靶基因。(A) 来自三个不同数据库(TargetScan、miRDB和DIANA)与miR - 4765重叠的靶基因维恩图。(B) 用miR - 4765模拟物、抑制剂及相应阴性对照转染后FOXK2 mRNA表达。(C) 用miR - 4765模拟物、抑制剂及相应阴性对照转染后SFRP1 mRNA表达。(D) 用miR - 4765模拟物、抑制剂及相应阴性对照转染后FOXK2和SFRP1蛋白表达。(E) FOXK2和SFRP1过表达质粒、sh - FOXK2和sh - SFRP1及相应阴性对照的转染效率。(F) 用FOXK2过表达质粒、sh - FOXK2及相应阴性对照转染后hFOB 1.19细胞的活力。细胞活力以OD值表示。(G) 用FOXK2过表达质粒、sh - FOXK2及相应阴性对照转染后裂解的caspase - 3蛋白表达。(H) 用SFRP1过表达质粒、sh - SFRP1及相应阴性对照转染后hFOB 1.19细胞的活力。细胞活力以OD值表示。(I) 用SFRP1过表达质粒、sh - SFRP1及相应阴性对照转染后裂解的caspase - 3蛋白表达。(J) 不同葡萄糖浓度(1或4.5 g/l)下hFOB 1.19细胞中FOXK2和SFRP1的表达。(K) 对照和糖尿病小鼠骨组织中FOXK2和SFRP1 mRNA表达。(L) 用免疫组织化学染色法测定对照和患骨质疏松症的糖尿病小鼠骨组织中FOXK2和SFRP1蛋白表达。(M) 对照和患骨质疏松症的糖尿病小鼠膝关节的微型计算机断层扫描。数据表示为平均值 。 “ 和 。miR，微小RNA；NC，阴性对照；sh -，短发夹；OD，光密度；OE，过表达；OP，骨质疏松症。
图4. miR - 4765可直接与FOXK2和SFRPI的3’ - UTR结合。(A) miR - 4765与FOXK2、miR - 4765与SFRPI的结合位点。(B) 在293T细胞中共同转染miR - 4765模拟物和FOXK2野生型或突变型3’ - UTR后的荧光素酶活性。(C) 在293T细胞中共同转染miR - 4765模拟物和SFRP1野生型或突变型3’ - UTR后的荧光素酶活性。(D) 共同转染FOXK2过表达质粒和miR - 4765模拟物及相应阴性对照后hFOB 1.19细胞的活力。细胞活力以OD值表示。(E) 共同转染FOXK2过表达质粒和miR - 4765模拟物及相应阴性对照后裂解的caspase - 3蛋白表达。(F) 共同转染SFRP1过表达质粒和miR - 4765模拟物及相应阴性对照后hFOB 1.19细胞的活力。细胞活力以OD值表示。(G) 共同转染SFRP1过表达质粒和miR - 4765模拟物及相应阴性对照后裂解的caspase - 3蛋白表达。数据表示为平均值 标准差(n = 3)。 “P < 0.05，”P < 0.01和“*P < 0.001。miR，微小RNA；UTR，非翻译区；WT，野生型；MUT，突变型；OD，光密度；NC，阴性对照；OE，过表达。
METTL3通过提高LINC00312的甲基化水平来降低其表达。先前的研究表明，甲基化可发生在骨质疏松症(OP)中，且长链非编码RNA(lncRNAs)可能会发生甲基化变化。因此，有人提出OP中LINC00312水平的变化与其甲基化状态的改变有关。首先，基于SRAMP网站预测LINC00312含有一个m6A修饰位点(得分=0.676)(图8A)。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测高糖(HG)诱导培养和成低糖(LG)培养的成骨细胞中m6A修饰水平的差异。高血糖环境会抑制甲基化水平(图8B)。接下来，分别采用逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹法检测高糖和低糖条件下培养的成骨细胞中METTL3的RNA和蛋白质表达水平。值得注意的是，在高血糖环境中，METTL3的mRNA和蛋白质表达水平均下降(图8C和D)。
图5. 如使用数据库预测的那样，LINC00312可能作为miR-4765的海绵来调节FOXK2和SFRP1。(A)LINC00312过表达(OE)质粒和短发夹RNA(sh-LINC00312)的转染效率。(B)用LINC00312 OE质粒、sh-LINC00312及相应的阴性对照(NC)转染后miR-4765的表达。(C)用LINC00312 OE质粒、sh-LINC00312及相应的NC转染后FOXK2和SFRP1的蛋白质表达。(D)用LINC00312 OE质粒、sh-LINC00312及相应的NC腺病毒转染后，骨质疏松症(OP)糖尿病小鼠骨组织中FOXK2和SFRP1的mRNA表达。(E)用LINC00312 OE质粒、sh-LINC00312及相应的NC腺病毒转染后，通过免疫组织化学染色测定OP糖尿病小鼠骨组织中FOXK2和SFRP1的蛋白质表达。数据表示为平均值 标准差(n = 3)。*P<0.05，**P<0.01。miR，微小RNA；NC，阴性对照；OE，过表达；sh-，短发夹；OP，骨质疏松症。
为了进一步研究METTL3的生物学功能，用METTL3 OE质粒和sh-METTL3转染人永生化成骨细胞系hFOB 1.19细胞。转染成功后(图8E和F)，测定下游LINC00312-miR-4765-FOXK2/SFRP1轴的表达水平。METTL3过表达降低了LINC00312、FOXK2和SFRP1的表达水平，但提高了miR-4765的表达水平，而sh-METTL3则产生相反的效果(图8G-I)。细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测、裂解的半胱天冬酶-3蛋白表达和膜联蛋白V染色结果表明，METTL3过表达增加了细胞数量，而sh-METTL3减少了细胞数量并促进了细胞凋亡(图8J-L)。最后，为了进一步研究METTL3如何抑制LINC00312的表达，进行了双荧光素酶报告基因检测和RNA免疫沉淀-定量聚合酶链反应(RIP-qPCR)。据此揭示了METTL3直接与LINC00312结合(图8M-O)。使用甲基化RIP-qPCR发现，HG诱导的成骨细胞中LINC00312的m6A修饰水平低于LG培养的成骨细胞(图8P)。此外，敲除METTL3降低了LINC00312细胞中m6A的相对富集，而METTL3过表达则产生相反的效果(图8Q)。
接下来，采用免疫组织化学(IHC)检测OP糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠中METTL3的蛋白质表达水平。值得注意的是，OP糖尿病小鼠的METTL3蛋白表达降低(图8R)。
为了评估METTL3在体内对FOXK2和SFRP1的影响，给OP糖尿病小鼠注射携带METTL3的腺病毒OE-METTL3、sh-METTL3或相应的NC。据此发现，OE-METTL3在体内降低了FOXK2和SFRP1的mRNA(图8S)和蛋白质(图8T)表达水平，而sh-METTL3则使其升高。
YTHDF2促进LINC00312甲基化增加。METTL3介导的m6A修饰通常以依赖阅读蛋白的方式发生。首先，分别使用RT-qPCR和蛋白质免疫印迹法检测高糖诱导的和成低糖培养的成骨细胞中YTHDF2的mRNA和蛋白质表达水平。值得注意的是，在高糖环境中YTHDF2的表达降低(图9A和B)。为了进一步研究YTHDF2的生物学功能，用YTHDF2过表达质粒和YTHDF2短发夹RNA转染人永生化成骨细胞系hFOB 1.19细胞。成功转染后(图9C和D)，检测下游LINC00312-miR-4765-FOXK2/SFRP1轴的表达水平。值得注意的是，YTHDF2过表达质粒降低了LINC00312、FOXK2和SFRP1的表达水平，但增加了miR-4765的表达水平，而YTHDF2短发夹RNA则产生相反的效果(图9E-G)。CCK-8检测、裂解的caspase-3蛋白表达和膜联蛋白V染色结果显示，YTHDF2过表达增加了细胞数量，而YTHDF2短发夹RNA则产生相反的效果(图9H-J)。为了进一步研究YTHDF2如何抑制LINC00312的表达，进行了双荧光素酶报告基因检测。值得注意的是，发现YTHDF2直接与LINC00312结合(图9K和L)。研究了METTL3是否以m6A-YTHDF2依赖的方式调节hFOB 1.19细胞中LINC00312的m6A甲基化。在用METTL3过表达质粒和METTL3短发夹RNA转染hFOB 1.19细胞后，使用RNA免疫沉淀-qPCR检测YTHDF2与LINC00312之间的相互作用。与短发夹RNA阴性对照组相比，hFOB 1.19细胞中METTL3的抑制降低了YTHDF2与LINC00312之间的相互作用，而其过表达则产生相反的效果(图9M)。
图6. LINC00312可直接与miR-4765结合。(A)LINC00312与miR-4765的结合位点。(B)在共转染miR-4765模拟物和LINC00312野生型或突变型3’区域的293T细胞中的荧光素酶活性。(C)在共转染LINC00312过表达质粒和miR-4765模拟物及其相应阴性对照的hFOB 1.19细胞中的活力。细胞活力以光密度值表示。(D)在共转染LINC00312过表达质粒和miR-4765模拟物及其相应阴性对照后的裂解的caspase-3蛋白表达。(E)在共转染LINC00312过表达质粒和FOXK2短发夹RNA及其相应阴性对照的hFOB 1.19细胞中的活力。细胞活力以光密度值表示。(F)在共转染LINC00312过表达质粒和FOXK2短发夹RNA及其相应阴性对照后的裂解的caspase-3蛋白表达。(G)在共转染LINC00312过表达质粒和SFRP1短发夹RNA及其相应阴性对照的hFOB 1.19细胞中的活力。细胞活力以光密度值表示。(H)在共转染LINC00312过表达质粒和SFRP1短发夹RNA及其相应阴性对照后的裂解的caspase-3蛋白表达。数据表示为平均值 标准差(n = 3)。“ ，**P < 0.01和***P < 0.001。miR，微小RNA；WT，野生型；MUT，突变型；OD，光密度；NC，阴性对照；OE，过表达；sh-，短发夹。
图7. LINC00312可促进hFOB 1.19细胞凋亡。(A)用LINC00312 OE质粒、sh-LINC00312及相应的阴性对照转染后hFOB 1.19细胞的活力。细胞活力以OD值表示。(B)用LINC00312 OE质粒、sh-LINC00312及相应的阴性对照转染后裂解的caspase-3蛋白表达。(C)用LINC00312 OE质粒、sh-LINC00312及相应的阴性对照转染后通过Annexin V染色测定的凋亡水平。(D)不同葡萄糖浓度(1或4.5 g/l)下hFOB 1.19细胞中LINC00312的表达。数据表示为平均值 标准差(n = 3)。“P<0.05和 P<0.01。OD，光密度；NC，阴性对照；OE，过表达；sh-，短发夹。
最后，采用免疫组化法检测骨质疏松症糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠中YTHDF2的蛋白表达水平。值得注意的是，骨质疏松症糖尿病小鼠中YTHDF2的蛋白表达水平降低(图9N)。
讨论
基于GSE74209数据库，miR-4765在健康个体中表达增加，在骨质疏松症患者中表达降低。此后，使用数据库(TargetScan、miRDB和DIANA)预测上游lncRNA和下游靶基因，并鉴定出LINC00312和FOXK2/SFRP1。使用在线数据库(SRAMP)预测LINC00312内的m6A修饰位点。最后，进行细胞实验以验证预测的准确性。
FOXK2是叉头转录因子Foxk家族的成员，广泛参与各种细胞活动，如调节有氧糖酵解(23)、抑制缺氧反应(24)、抑制萎缩和自噬程序(25)，以及各种细胞周期调控过程。一些研究表明FOXK2促进细胞凋亡，这与本研究结果一致。FOXK2 OE在体内诱导透明细胞肾癌细胞凋亡(26)。此外，另一项研究发现，基于caspase-3活性，FOXK2在人骨肉瘤细胞系(U2OS)中促进细胞凋亡(27)。然而，其他研究表明FOXK2也抑制细胞凋亡。事实上，先前的一项研究发现FOXK2通过PI3K/AKT/mTOR调节途径促进颗粒细胞增殖(28)。
SFRP1通过直接与Wnt相互作用来调节Wnt信号，已广泛参与各种疾病，如阿尔茨海默病(29)、视网膜神经发生(30,31)和白血病(32)，以及骨质疏松症的发病机制。一些研究表明SFRP1促进骨质疏松症，这与本文给出的结果一致。例如，先前的一项研究发现，增加SFRP1的表达水平会降低骨形成和骨量(33)。另一项研究表明，SFRP1抑制骨髓基质/间充质干/基质细胞(BMSCs)的增殖，并降低钙结节形成和碱性磷酸酶活性(34)。有证据进一步表明，SFRP1作为Wnt信号通路的负调节因子，在骨质疏松症中显著上调(35)。因此，抑制SFRP1表达通过诱导成骨细胞分化在骨形成中起重要作用(36)。尽管如此，其他研究表明增加SFRP1表达可促进骨形成，并且SFRP1可用于治疗骨质疏松症(37)。
长链非编码RNA LINC00312产生一种无内含子的转录本，被认为具有肿瘤抑制功能。LINC00312参与多种细胞学过程，如DNA损伤修复(38)、侵袭和迁移(39 - 41)。此外，LINC00312促进细胞凋亡，这与本文呈现的结果一致。例如，先前的一项研究发现，LINC00312通过Bcl - 2/半胱天冬酶 - 3信号通路促进细胞凋亡，从而增强顺铂耐药卵巢癌亚系SKOV3/DDP对顺铂的敏感性(42)。另一项研究表明，使用慢病毒载体强制表达LINC00312可抑制人肝母细胞瘤和原发性人肝癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡(43)。LINC00312受HOXA5调控，在非小细胞肺癌中也被发现可抑制肿瘤增殖并促进细胞凋亡(44)。此外，LINC00312抑制鼻咽癌细胞的增殖并诱导细胞凋亡(45)。
图8. METLS通过提高LINC00312的甲基化水平来降低其表达水平。(A) 使用SRAMP预测LINC00312可能的m6A修饰位点。(B) 通过m6A比色分析测定不同葡萄糖浓度(1或4.5 g/l)下hFOB 1.19细胞的相对m6A水平。(C) 不同葡萄糖浓度(1或4.5 g/l)下hFOB 1.19细胞中METTL3 mRNA表达。(D) 不同葡萄糖浓度(1或4.5 g/l)下hFOB 1.19细胞中METTL3蛋白表达。(E) METTL3 OE质粒和sh - METTL3的转染效率。用METTL3 OE质粒、sh - METTL3及相应的NCs转染后METTL3 maRNA表达。(F) METTL3 OE质粒和sh - METTL3的转染效率；用METTL3 OE质粒、sh - METTL3及相应的NCs转染后METTL3蛋白表达。(G) 用METL3 OE质粒、sh - METTL3及相应的NCs转染后LINC00312表达。(H) 用METTL3 OE质粒、sh - METTL3及相应的NCs转染后miR - 4765表达。(I) 用METTL3 OE质粒、sh - METTL3及相应的NCs转染后FOXK2和SFRP1蛋白表达。(J) 用METTL3 OE质粒、sh - METTL3及相应的NCs转染后hFOB 1.19细胞的活力。细胞活力以OD值表示。(K) 用METTL3 OE质粒、sh - METTL3及相应的NCs转染后裂解的caspase - 3问题表达。(M) m6A (L) 用METTL3 OE质粒、sh - METTL3及相应的NCs转染后通过Annexin V染色测定的凋亡水平。(M) LINC00312的m6A修饰位点。(N) 用METTL3 OE质粒和LINC00312 WT或MUT 3’ - 区域共转染293T细胞中的荧光素酶活性。(O) 用METTL3 OE质粒、sh - METTL3及相应的NCs转染后METTL3在LINC00312中的相对富集。(P) 通过甲基化RNA免疫沉淀 - 定量PCR测定不同葡萄糖浓度(1或4.5 g/l)下LINC00312中m6A的相对富集。(Q) 用METTL3 OE质粒、sh - METTL3及相应的NCs转染后LINC00312中m6A的相对富集。(R) 通过免疫组化染色测定糖尿病骨质疏松小鼠和非糖尿病小鼠骨组织中METTL3蛋白表达。(S) 用METTL3 OE质粒、sh - METTL3及相应的NCs腺病毒转染后糖尿病骨质疏松小鼠骨组织中FOXK2和SFRP1 mRNA表达。(T) 用METTL3 OE质粒、sh - METTL3及相应的NCs腺病毒转染后糖尿病骨质疏松小鼠骨组织中通过免疫组化染色测定的FOXK2和SFRP1蛋白表达。数据表示为平均值 标准差(n = 3)。“P < 0.05且 P < 0.01。OE，过表达；sh - ，短发夹；WT，野生型；MUT，突变体；NC，阴性对照；OD，光密度；miR，微小RNA；OP，骨质疏松症；IHC，免疫组化。
图9. YTHDF2参与提高LINC00312的甲基化水平。(A) 不同葡萄糖浓度(1或4.5 g/l)下hFOB 1.19细胞中YTHDF2 mRNA表达。(B) 不同葡萄糖浓度(1或4.5 g/l)下hFOB 1.19细胞中YTHDF2蛋白表达。(C) YTHDF2 OE质粒和sh - YTHDF2的转染效率。用YTHDF2 OE质粒、sh - YTHDF2和相应的NCs转染后YTHDF2 mRNA表达。(D) YTHDF2 OE质粒和sh - YTHDF2的转染效率。用YTHDF2 OE质粒、sh - YTHDF2和相应NCs转染后YTHDF2蛋白表达。(E) 用YTHDF2 OE质粒、sh - YTHDF2和相应NCs转染后LINC00312表达。(F) 用YTHDF2 OE质粒、sh - YTHDF2和相应NCs转染后miR - 4765表达。(G) 用YTHDF2 OE质粒、sh - YTHDF2和相应NCs转染后FOXK2和SFRP1蛋白表达。(H) 用YTHDF2 OE质粒、sh - YTHDF2和相应NCs转染后hFOB 1.19细胞的活力。细胞活力以OD值表示。(I) 用YTHDF2 OE质粒、sh - YTHDF2和相应NCs转染后裂解的caspase - 3蛋白表达。(J) 用YTHDF2 OE质粒、sh - YTHDF2和相应NCs转染后通过Annexin V染色测定的凋亡水平。(K) LINC00312的m6A修饰位点。(L) 用YTHDF2 OE质粒和LINC00312野生型或突变型3’ - 区域共转染293T细胞中的荧光素酶活性。(M) 用METTL3 OE质粒、sh - METTL3和相应NCs转染后YTHDF2在LINC00312中的相对富集。(N) 通过免疫组织化学染色测定糖尿病骨质疏松小鼠和非糖尿病小鼠骨组织中YTHDF2蛋白表达。数据表示为平均值 标准差(n = 3)。“P < 0.05”和“P < 0.01”。WT，野生型；MUT，突变型；NC，阴性对照；OD，光密度；OE，过表达；sh -，短发夹；miR，微小RNA。
图10. 图形摘要。LINC00312通过靶向miR - 4765 - FOXK2/SFRP1轴增加hFOB 1.19细胞凋亡，该轴以YTHDF2依赖的方式被METTL3进行m6A修饰。miR，微小RNA。该图像使用www.Figdraw.com创建。
先前的研究表明METTL3抑制骨质疏松症。在骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中METTL3表达上调(46)。一项使用骨质疏松模型的先前研究表明，METTL3表达水平降低，并且METTL3沉默抑制了BMSCs(47)和脂肪来源干细胞(48)的成骨分化，最终导致小鼠骨质疏松症(49)。也有报道称METTL3通过Wnt信号通路(50)、LINC00657/miR - 144 - 3p/BMPR1B轴(51)和MIR99AHG/miR - 4660轴(52)促进成骨分化来减轻骨质疏松症。此外，已发现墨旱莲对骨质疏松症具有治疗作用，可通过增加METTL3表达来实现(53)。一项研究表明METTL3可引发骨质疏松症的发展。另一项使用小鼠颅骨来源的3T3样成骨细胞系建立的1细胞的研究表明，METTL3基因敲除可通过降低铁死亡水平来治疗骨质疏松症(54)。其他研究表明METTL3通过促进破骨细胞分化来促进骨质疏松症(55)。
有趣的是，可以确定三个潜在的冲突点:第一，涉及的细胞类型不同，成骨作用于间充质干细胞或成骨细胞，而破骨细胞生成作用于单核细胞前体；第二，作用的分子水平不同，成骨作用调节mRNA稳定性(例如，胚胎致死、异常视觉、果蝇样1靶点)和miRNA加工(56,57)，而破骨细胞生成通过ceRNA机制发挥作用(58)；第三也是最关键的一点，下游通路完全独立，成骨作用遵循Wnt/ -连环蛋白或BMP通路，而破骨细胞生成依赖RANK/RANKL信号。这种组织特异性调节类似于同一把关键钥匙(METTL3)，它允许不同的锁(细胞环境)打开不同的门(通路)。鉴于骨稳态依赖于成骨作用和破骨细胞生成之间的平衡，METTL3的双重作用可能代表一种维持平衡的自然机制，类似于控制油门和刹车。然而，在病理条件下(例如，糖尿病或绝经后雌激素缺乏)，微环境的变化会导致失衡。
作为一种治疗靶点，METTL3调节miR-324-5p和miR-4526的成熟，激活成骨通路(56,57)，并阻断circ_0008542的甲基化，从而抑制破骨细胞通路对骨代谢的双向作用(58)；然而，其使用需要细胞类型特异性调节，以避免相互冲突的双向作用。尽管METTL3表达与骨代谢活性直接相关，但仍缺乏临床验证数据(59)。关于协同作用，METTL3激动剂理论上可以促进成骨，而双膦酸盐抑制骨吸收，从而带来互补的治疗益处。动物实验表明，miR-324-5p可促进显著的骨再生，提示协同增强作用(56)。然而，目前的研究结果仍停留在机制和理论层面，尚未获得临床研究的直接证据。
YTHDF2靶向非编码RNA以释放其成骨潜能。例如，YTHDF2已被证明通过降解抑制性长链非编码RNA LINC01013来促进骨形成，从而解除对成骨基因(例如，骨钙素和骨唾液蛋白)的抑制(60)。这一机制与我们当前研究中的假设相似，即LINC00312的降解促进骨形成。两种机制都表明通过清除抑制因子来增强成骨作用，但其生物学结果存在差异。先前的一项研究强调促进成骨分化，而当前研究则突出抑制成骨细胞凋亡。尽管现有文献仅报道LINC01013是YTHDF2的靶点，但据作者所知，当前研究是首次揭示LINC00312的抑制作用，从而扩展了YTHDF2的靶点谱。与先前研究结果的差异主要归因于靶基因的类型，这最终决定了功能方向。首先，靶向促进因子会抑制骨形成；也就是说，YTHDF2通过降解 runt相关转录因子2 mRNA来显著抑制成骨细胞分化和矿化(61)。同样，YTHDF2与成纤维细胞生长因子21 mRNA(一种促进骨形成的因子)结合，在高血糖条件下可能通过介导其降解间接抑制成骨分化(62)。其次，本研究关注的是细胞命运的调节而非直接的成骨作用。在这种情况下，YTHDF2通过降解破骨细胞相关基因(例如，Traf6和Map4k4)并抑制NF-κB/MAPK通路来抑制骨吸收(63,64)。
本研究存在一些显著局限性。尽管直接研究了LINC00312和FOXK2/SFRP1在hFOB 1.19细胞中的作用，但其在健康个体和骨质疏松症患者中的水平仍不清楚。然而，需要进一步研究来探索LINC00312和FOXK2/SFRP1表达的临床相关性。本研究主要研究了骨质疏松症中成骨细胞的凋亡；然而，它没有对成骨分化进行系统分析，例如特定分化标志物的表达或矿化动力学。未来的研究可以包括对关键标志物(如Runx2和ALP)的时间进程检测，以及对矿化结节形成的评估。此外，可以使用体内双荧光标记来量化动态矿物质沉积率。这些方法将有助于阐明干预对成骨功能的总体影响，从而更全面地理解骨形成机制，并支持优化靶向治疗的开发。
总之，本研究结果表明，LINC00312通过靶向miR-4765-FOXK2/SFRP1轴促进hFOB 1.19细胞凋亡。此外，miR-4765过表达下调FOXK2/SFRP1表达并减少hFOB 1.19细胞凋亡。总体而言，这些发现表明，以YTHDF2依赖方式被METTL3进行m6A修饰的LINC00312/miR-4765/FOXK2/SFRP1轴可能是OP的一种新型生物标志物和治疗靶点(图10)。
致谢
不适用。
资金
未获得资金。
数据和材料的可用性
本研究中产生的数据可向通讯作者索取。
作者贡献
YW构思并设计了本研究。YT进行了语言编辑、数据整理和图表绘制。GY进行了生物信息学分析。所有作者阅读并批准了本稿件的最终版本。YW、YT和GY确认了所有原始数据的真实性。
伦理批准和参与同意
所有动物实验均按照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行，并获得北部战区总医院机构审查委员会的批准(批准号:2025 - 26；中国沈阳)。
患者发表同意书
不适用。
##利益冲突
作者声明他们没有利益冲突。
##参考文献
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m6A甲基化,非编码RNA,糖尿病,miR‑4765,LINC00312,METTL3,YTHDF2
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