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脂质纳米颗粒在基于mRNA的CAR-T细胞工程中表现优于电穿孔法

发布时间：

2026-05-21 22:03

脂质纳米颗粒在基于mRNA的CAR-T细胞工程中表现优于电穿孔法

雷尼·基特、马丁·拉贝尔、雷卡·盖奇、斯特拉·帕克、斯特凡·弗里克、乌尔里克·科尔、以及U. 桑迪·特雷特巴尔

弗劳恩霍夫细胞治疗与免疫学研究所(IZI)，佩利克街1号，04103莱比锡，德国；精密纳米系统公司(现为 Cytiva 的一部分)，北肯特大道50 - 655号，温哥华，不列颠哥伦比亚省V6P6T7，加拿大；3弗劳恩霍夫卓越免疫介导疾病集群CIMD，04103莱比锡，德国；4莱比锡大学医学院临床免疫学研究所，约翰尼斯街30号，04103莱比锡，德国

表达嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞已被证明是治疗特定血液系统恶性肿瘤的有效疗法。然而，已获批的CAR-T细胞疗法严格依赖病毒转导，这是一个耗时且成本高昂的过程，还可能存在安全问题。因此，将体外转录的CAR-mRNA直接导入T细胞被视为CAR-T细胞工程的一种有前景的策略。电穿孔法(EP)目前在临床试验中被用作生成CAR-T细胞的mRNA递送方法，但仅能产生较差的抗肿瘤反应。在此，研究了脂质纳米颗粒(LNPs)用于离体CAR-mRNA递送，并与电穿孔法进行比较。由于CAR-mRNA的持续时间延长和CAR表达，LNP-CAR-T细胞在体外显示出比EP-CAR-T细胞显著更长的疗效，这归因于不同的递送机制，其细胞毒性较小且CAR-T细胞增殖较慢。此外，mRNA-LNP衍生的CAR-T细胞的CAR表达和体外功能与稳定转导的CAR-T细胞相当，但耗竭程度较低。这些结果表明脂质纳米颗粒优于电穿孔法，并强调了mRNA-LNP递送作为用于离体CAR-T细胞修饰(作为临床研究的下一代瞬时方法)的巨大潜力。

引言

嵌合抗原受体(CAR)工程化T细胞因其高特异性和治疗潜力而被视为癌症治疗的一种有前景的工具。事实上，2023年已有六种CAR-T细胞产品获得美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局批准用于治疗血液系统癌症，其中四种针对特定B细胞恶性肿瘤中的CD19。对于CAR-T细胞疗法，分离患者T细胞并进行基因改造，使其在表面表达CAR，然后将产生的CAR-T细胞重新注入患者体内，CAR使T细胞能够特异性识别并摧毁癌细胞。所有获批的CAR-T细胞疗法以及大多数临床试验中使用的疗法都基于病毒转导，导致CAR永久表达。尽管这可以导致长期缓解，但它存在安全问题。CAR-T细胞可与患者的免疫系统相互作用，存在细胞因子释放综合征、神经毒性和靶向非肿瘤毒性等副作用风险。例如，持续的CD19导向的CAR-T细胞通常会消除表达CD19的健康B细胞，导致低丙种球蛋白血症，这与感染风险增加有关。此外，使用病毒载体还存在几个缺点，如载量有限、制造耗时且成本高昂，可能出现具有复制能力的病毒，由于基因组整合导致工程化T细胞发生致癌转化的风险，以及针对离体工程化CAR-T细胞上表达的载体衍生表位的免疫反应风险。因此，正在深入研究替代方法，尤其是非病毒基因转移方法，以改善CAR-T细胞的制造及安全性。

在嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法中，避免使用病毒载体的一种可能性是利用信使核糖核酸(mRNA)。递送编码CAR的mRNA可实现非整合性和短暂性的T细胞修饰，从而改善CAR T细胞疗法的安全性和可控性。基于mRNA的CAR T细胞已在众多临床前研究中得到评估，报告显示出有前景的抗肿瘤反应(见Soundara Ra-jan等人的综述 )，但在大多数治疗血液系统癌症和实体瘤的临床试验中，其表现不佳。在所有临床研究中，通过电穿孔(EP)将CAR-mRNA递送至T细胞。该方法基于对细胞施加电场，导致细胞膜短期破裂，以使mRNA进入。然而，不可修复的膜损伤和细胞内容物的丢失带来了细胞活力降低以及基因和蛋白质表达改变的风险，这可能解释了基于mRNA的CAR T细胞在临床研究中表现不佳的原因。为了克服电诱导细胞操作带来的这些挑战，可将mRNA包裹在完全合成的脂质壳中的脂质纳米颗粒(LNP)用于基于mRNA的CAR T细胞工程，其细胞毒性较低，有可能提供性能更好的基于mRNA的CAR T细胞。与EP相比，LNP的另一个巨大优势是它们具有全身体内应用的潜力，可直接在患者体内产生CAR T细胞，提供一种现成的产品，减少制造时间和成本。

于2023年5月2日收到；2023年10月17日接受；

https://doi.org/10.1016/j.omtm.2023.101139.

通信作者:U. Sandy Tretbar，弗劳恩霍夫细胞治疗与免疫学研究所(IZI)，德国莱比锡佩利克街1号，邮编04103。

电子邮件:sandy.tretbar@izi.fraunhofer.de

图1. 编码CAR的mRNA的生产

(A) mRNA生产过程的工作流程。从包含T7启动子序列和通过聚合酶链式反应(PCR)生成的CAR开放阅读框(CAR-ORF)的线性DNA模板开始，通过体外转录(IVT)和随后的聚腺苷酸化(PolyA)产生具有CleanCap(R)帽结构、 -甲基假尿苷(m1 )修饰和聚(A)尾(pA)的mRNA。图片由BioRender.com创建。(B) 未聚腺苷酸化的CAR-RNA(-pA)和聚腺苷酸化的CAR-mRNA(+pA)的代表性琼脂糖凝胶图像。L，RNA梯尺(RiboRuler High Range RNA Ladder，赛默飞世尔科技)。

在本研究中，使用来自Precision NanoSystems(加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华)的可电离脂质混合物(GenVoy-ILM )和NanoAssemblr® Spark 设备为T细胞配制负载mRNA的LNP，以离体产生基于mRNA的CAR T细胞。与EP衍生的CAR T细胞的直接比较表明，这些LNP在CAR-mRNA和CAR T细胞持久性以及体外CAR T细胞功效持续时间方面优于EP。此外，将基于mRNA-LNP的CAR T细胞与通过慢病毒转导产生的稳定表达CAR的T细胞进行比较，发现它们在体外具有相当的功能。本研究强调LNP作为基于mRNA的CAR T细胞工程的下一代mRNA离体递送平台，并为小鼠研究中的临床前评估和转化为临床应用铺平了道路。

结果

编码CAR的mRNA的特性

通过PCR从线性DNA模板体外转录(IVT)制备了一种编码针对CD123的CAR的mRNA，该CAR具有源自CD28的铰链、跨膜和共刺激结构域以及CD3z信号结构域，随后进行多聚腺苷酸化(图1A)。除了聚(A)尾外，mRNA在末端含有CleanCap®帽结构和完整的 -甲基-假尿苷修饰。通过琼脂糖凝胶电泳分析mRNA，结果显示与未多聚腺苷酸化的RNA相比，存在全长产物以及多聚腺苷酸化mRNA的明显延伸(图1B)。

与EP相比，使用LNP进行mRNA递送的性能

脂质纳米颗粒(LNPs)为电穿孔(EP)提供了一种很有前景的替代方案，而电穿孔仍是临床试验中基于mRNA的嵌合抗原受体(CAR)T细胞工程的最先进方法。在本研究中，使用了Neon转染系统(赛默飞世尔科技公司)进行电穿孔，该系统允许手动更改包括脉冲电压、宽度和次数等各种参数，以提高透明度。为了应用最佳设置，测试并分析了不同的重悬缓冲液和电压对细胞活力和转基因表达的影响(图S1)。基于这些优化结果，此处将T细胞重悬于缓冲液 (试剂盒的一部分)中，并在1600V、、三个脉冲条件下进行电穿孔，因为该设置可实现最大细胞活力和高转基因表达水平(图S1)。当使用不同的电穿孔设备，即美国马里兰州沃克维尔市龙沙公司的4D-核转染仪时，也获得了类似结果，这表明不同电穿孔设备之间具有可比性，并使用了最优化的电穿孔条件来与脂质纳米颗粒进行比较(图S2)。为了将电穿孔与基于脂质纳米颗粒的T细胞转染进行比较，将CAR-mRNA封装到脂质纳米颗粒中。用于mRNA的商业GenVoy-ILM 细胞试剂盒在可电离脂质、结构脂质、辅助脂质、固醇和表面活性剂的选择及其相互比例方面(精密纳米系统公司专有，美国专利20220162552 A1)针对细胞转染进行了优化，并在本研究中使用。选择该T细胞试剂盒是因为它在基于mRNA的CAR T细胞工程中比两种临床批准的脂质纳米颗粒的脂质组合物更有效，且对细胞活力影响较小(图S3A-C)。使用T细胞试剂盒进行mRNA递送被证明完全依赖载脂蛋白E4(ApoE4)，因为只有在向含有脂质纳米颗粒的T细胞中补充ApoE4时才观察到CAR表达(图S3D)，这意味着通过ApoE-低密度脂蛋白受体(LDL-R)途径的递送机制。使用T细胞试剂盒时，实现了的包封效率(平均值标准误， )。CAR-mRNA-脂质纳米颗粒的直径为 (平均值标准误， )，多分散指数(PDI)为 (平均值标准误， )。将编码无功能Mock-CAR构建体的mRNA的脂质纳米颗粒(图S4A/B)配制成mRNA对照，其包封效率为，直径为，PDI为 (平均值标准误，n = 4)(图S4C-E)。就高CAR表达和细胞活力维持而言，每个细胞6微克CAR-mRNA被确定为基于脂质纳米颗粒转染的最佳剂量(图S4F)。

通过电穿孔(EP)或脂质纳米颗粒(LNP)将嵌合抗原受体(CAR)-mRNA转染至T细胞后，通过用抗F(ab’)2- Alexa Fluor 647试剂孵育细胞来监测细胞表面的CAR表达。转染后6小时(第0.25天)，92%的EP来源的T细胞上已经高强度表达CAR，表明mRNA转移迅速且高效(图2A/B)。在这个时间点，达到了最大CAR表达，因为作为CAR表达强度指标的Alexa Fluor 647的中位荧光强度(MFI)在EP处理后第1天已经降低(图2A)。从那天起，表达CAR的细胞比例迅速下降，直到EP处理后第3天降至10%以下。对于LNP介导的mRNA递送，最大CAR表达强度低于EP实现的强度(CAR MFI:9,716±1,334 EP [第0.25天] 对 2,039 LNP [第1天]；平均值标准误，n =4)，这意味着mRNA-LNP导致每个T细胞上的CAR分子更少。然而，对于转染后第1天而非第0.25天获得的LNP转染细胞，检测到表达CAR的细胞的可比峰值为84%，表明LNP的mRNA可用性比EP慢。在第0.25天时间点，LNP处理的细胞的CAR表面表达相对较低，约为50%，尽管在总RNA提取和qPCR分析后，与EP一样，在T细胞内检测到LNP递送的CAR-mRNA水平更高(图S5)。这可能有几个原因:(1)一些转移的mRNA仍包裹在LNP内，因此无法用于翻译成CAR蛋白，(2)EP递送的mRNA量更高，但由于EP后快速翻译导致mRNA降解。在转染后第2、3和4天，LNP来源的CAR T细胞上的CAR表达明显高于EP来源的。表达CAR的细胞百分比在第6天降至10%以下，因此与EP转染相比，用LNP转染时CAR表达可延长约3天，这意味着比传统mRNA技术可达到的时间长约两倍(图2B)。这些结果可以通过与电穿孔T细胞相比，LNP转染的T细胞中CAR-mRNA的持续时间更长来解释(图2C)。在用Mock-CAR-mRNA转染的T细胞中，可以证实LNP处理后转基因表达延长约4天，mRNA持续时间延长(图S6A/B)。

图2. 用于生成CD123导向的CAR T细胞的电穿孔(EP)和基于脂质纳米颗粒(LNP)的mRNA递送至原代T细胞的比较

分离、激活人T细胞，7天后，每10个细胞用6μg编码CAR的mRNA通过电穿孔(蓝色)或脂质纳米颗粒(红色)进行转染。(A)从转染后第0.25天(6小时)至第6天，与未转染(UTF，灰色)T细胞相比，T细胞转染后流式细胞术CAR表达分析的代表性直方图。使用抗F(ab’) - 亚历克莎荧光647试剂检测CAR(F(ab’)z+)，并对细胞进行7 - AAD染色，以在分析中排除死细胞(7 - AAD+)。彩色值表示亚历克莎荧光647的中位荧光强度，作为CAR表达强度的指标。(B)与未转染(UTF，黑色)T细胞相比，从转染后0.25天至6天，F(ab’) 细胞所指示的CAR表达细胞比例(n = 4个独立实验/供体的平均值标准误)。(C)转染后0.25天至4天的相对CAR - mRNA水平，以转染后第0.25天的各自水平为基准进行归一化(n 3个独立实验/供体的平均值标准误)。(D)从转染后0.25天至6天，与未转染(UTF，黑色)T细胞相比，基于mRNA的CAR T细胞在共培养中对表达CD123细胞系KG - 1的细胞毒性所指示的功能(T细胞:KG - 1比例 = 1:1，共培养24小时)(n = 4个独立实验/供体的平均值标准误)。ns，无显著性差异；*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；***p < 0.0001，采用Holm - Sidak多重比较检验的双向方差分析(重复测量)。

除了CAR表达和mRNA持久性外，在转染后6天对CAR T细胞功能进行体外分析。与电穿孔转染的CAR T细胞相比，基于脂质纳米颗粒的转染使CAR T细胞疗效延长了多达3天，表现为稍后的峰值以及对表达CD123细胞系KG - 1的细胞毒性下降更慢(图2D)。更确切地说，电穿孔衍生的CAR T细胞在0.25天后达到最大细胞毒性83%，而脂质纳米颗粒转染的CAR T细胞在1天后达到76%的细胞毒性。在这个时间点，脂质纳米颗粒 - CAR T细胞已经比电穿孔 - CAR T细胞显著更有效。电穿孔衍生的CAR T细胞在第3天抗癌疗效降至10%以下，而脂质纳米颗粒衍生的CAR T细胞在转染后第6天，这与表面上的CAR表达水平一致。

基于电穿孔和脂质纳米颗粒的CAR - mRNA递送对T细胞表型、活力和脱靶毒性的影响

在进行电穿孔(EP)和脂质纳米颗粒(LNP)处理后，对所得的基于mRNA的嵌合抗原受体(CAR)T细胞进行了更详细的表征。由于已证明电穿孔会改变基因和蛋白质表达，因此，与未转染的T细胞相比，对转染了CAR - mRNA和Mock - CAR - mRNA的细胞进行了分析，以确定选定的表面标志物，以指示T细胞亚型(CD3、CD4、CD8)、激活状态(CD25)和耗竭状态(淋巴细胞激活基因-3 [LAG - 3])(图3A)。在EP - CAR T细胞和LNP - CAR T细胞以及EP - Mock - CAR T细胞和LNP - Mock - CAR T细胞上，CD3表达以及代表细胞毒性T细胞的细胞比例均未受到影响(图3A)。代表辅助性T细胞的群体在CAR T细胞中略有减少，但不显著，而双阳性群体在EP - CAR T细胞和LNP - CAR T细胞中均显著增加。这些数据表明CAR T细胞上从辅助性T细胞表型向双阳性表型的转变。 T细胞与激活的表型相关(图S7)，CAR T细胞上CD25表达的显著增加也证实了这一点(图3A)。此外，与未转染的T细胞相比，在EP - CAR T细胞和LNP - CAR T细胞上观察到LAG - 3的表达显著更高，其中EP衍生的CAR T细胞上的LAG - 3表达略高于LNP转染的CAR T细胞，表明耗竭略有增加(图3A)由于Mock - CAR T细胞上的CD4、CD8、CD25和LAG - 3表达保持不变，表明EP或LNP对T细胞亚型、激活状态或T细胞耗竭均无影响。因此，仅在CAR T细胞上观察到的激活表型可以通过功能性CAR的存在来解释，这证明了CAR构建体的持续性信号传导。

为了研究对T细胞的毒性影响，用膜联蛋白V和7 - 氨基放线菌素D(7 - AAD)对转染细胞进行染色，以揭示凋亡细胞(膜联蛋白 )和死亡细胞(膜联蛋白 )。在转染后1天，当EP和LNP衍生的CAR T细胞之间的CAR表达相当(图2B)时，与LNP处理相比，EP导致凋亡和细胞死亡增加(29% CAR EP对16% CAR LNP，右上象限，图3B)。因此，可以通过分析膜联蛋白双阴性群体来确定活力。在时间进程实验中，转染后第0.25天和第1天，EP - CAR T细胞的活力显著低于LNP - CAR T细胞(40% EP对65% LNP和46% EP对72% LNP)(图3C)。然而，在第2天，EP - CAR T细胞恢复，导致其活力与LNP - CAR T细胞相当(69% EP对68% LNP)。与LNP - Mock - CAR T细胞相比，在转染后第0.25天，EP - Mock - CAR T细胞的活力也显著较低(55% EP对77% LNP)，表明与LNP相比，EP是一种更具危害性的转染方法。与各自的CAR T细胞相比，Mock - CAR T细胞在第0.25天和第1天的活力更高(图3C)，这意味着CAR(CD28、CD3ζ)的细胞内刺激结构域的持续性信号传导对T细胞活力有负面影响，而Mock - CAR构建体中不存在这些结构域。

由于激动剂信号传导可能导致非特异性毒性，因此针对CD123阴性的K-562细胞系对CAR T细胞进行了测试，以确定脱靶效应。在EP后第0.25天和第1天以及LNP处理后第0.25天、第1天和第2天，观察到与未转染的T细胞相比毒性显著更高(图3D)，这与各自的CAR表达强度相关。然而，在第1天，当EP-CAR T细胞和LNP-CAR T细胞之间的CAR表达相当时，EP-CAR T细胞对K-562细胞的毒性明显高于LNP-CAR T细胞，这意味着在该时间点LNP衍生的CAR T细胞具有更好的安全性。在转染后第3天，EP-CAR T细胞和LNP-CAR T细胞的脱靶毒性均降至未转染T细胞的水平，表明基于mRNA的CAR T细胞对非靶细胞具有瞬时效应。

在有靶细胞和非靶细胞存在的情况下对基于EP和LNP的mRNA-CAR T细胞的表征

由于CAR T细胞遇到靶细胞后可能发生抗原诱导的增殖，这会影响基于mRNA的CAR T细胞的CAR表达动力学，因此将基于EP和LNP的mRNA-CAR T细胞与KG-1细胞一起接种在挑战试验中，或者作为对照，与K-562细胞一起接种，以分别研究与靶细胞和非靶细胞接触后CAR的表达和CAR T细胞的增殖。从转染后第1天共培养开始时相当的CAR表达开始，与EP-CAR T细胞相比，在接下来的3天里，LNP衍生的CAR T细胞与KG-1细胞共培养时CAR表达显著更高(图4A)，与K-562细胞共培养2天时也是如此(图4B)，这证实了基于LNP的转染可延长CAR表达。与未转染的细胞相比，EP-CAR T细胞和LNP-CAR T细胞不仅在添加KG-1细胞后(图4C)，而且在添加K-562细胞后(图4D)都显示出增殖率增加，表明CAR T细胞的抗原非依赖性增殖，很可能是由CAR介导的T细胞活化诱导的。然而，从转染后第3天开始，LNP-CAR T细胞的增殖比EP-CAR T细胞少，这解释了特别是在后期CAR表达的延长。

基于mRNA和慢病毒的CAR T细胞的比较

由于稳定表达的CAR T细胞仍然是临床上使用的金标准，因此将基于mRNA的CAR T细胞与通过慢病毒(LV)转导产生的CAR T细胞进行了比较。为了比较瞬时和稳定的CAR T细胞，选择了LNP衍生的CAR T细胞，因为与EP衍生的CAR T细胞相比，CAR-mRNA和蛋白质的持久性以及CAR T的功能都得到了延长。

图3. 基于mRNA的CAR T细胞的表征

通过电穿孔(蓝色)或脂质纳米颗粒(红色)用CAR - mRNA或Mock - CAR - mRNA转染人T细胞。未转染的T细胞(UTF，黑色)作为阴性对照进行分析。(A)转染后第1天表达CD3、CD4、CD8、CD25和LAG - 3的细胞比例，用于T细胞鉴定(CD4*)、T细胞亚型分析(CD4*CD8*)。，CD4*CD8*)、活化(CD25*)和耗竭(LAG - 3*)。与UTF细胞相比，对每组进行统计分析。(B)转染后1天单细胞流式细胞术分析的代表性点图。细胞用膜联蛋白V和7 - AAD染色，以指示活细胞(膜联蛋白V 7 - AD ，粗黑框)、凋亡细胞(膜联蛋白V*7 - AAD )和死细胞(膜联蛋白V*7 - AAD*)。数值表示这些群体在单细胞门内的比例。(C)转染后第0.25、第1和第2天，膜联蛋白V 7 - AAD 细胞比例指示的T细胞活力。(D)从转染后第0.25天到第3天，基于mRNA的CAR T细胞对CD123阴性K - 562细胞的共培养(T细胞:K - 562比例 = 1:1，共培养24小时)中的脱靶细胞毒性。条形图表示个独立实验/供体的平均值 SEM。ns，无显著性差异；*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.0001；*****p < 0.0001，双向方差分析(匹配值)(A)或双向方差分析(重复测量)(C、D)，每组均采用Holm - Sidak多重比较检验。

在添加mRNA - LNP后第1天，mRNA - CAR T细胞上的CAR表达强度略高于LV - CAR T细胞(图5A)，但从转染后第2天起低于LV - CAR T细胞的水平。然而，在mRNA转染后长达3天，mRNA - CAR T细胞和LV - CAR T细胞之间CAR阳性细胞的比例相当(图5B)。第3天后，基于mRNA的CAR T细胞中CAR阳性细胞的百分比显著降低，突出了这些细胞的短暂性质。在转染后第1天和第2天，将mRNA - CAR T细胞与LV - CAR T细胞在不同E:T比例下对KG - 1细胞、对不同CD123 靶细胞以及对作为非靶细胞的K - 562细胞的细胞毒性方面进行比较，结果显示mRNA - CAR T细胞和LV - CAR T细胞的性能无显著差异(图5C和5D)。有趣的是，在用KG - 1靶细胞以及K - 562非靶细胞刺激这些细胞后，LV - CAR T细胞比mRNA - CAR T细胞更耗竭，这表现为与mRNA - LNP处理的细胞相比，病毒转导的CAR T细胞上LAG - 3表面表达显著更高(图5E和5F)。

图4. 电穿孔(EP)和脂质纳米颗粒(LNP)衍生的mRNA - CAR T细胞遇到靶细胞和非靶细胞后的比较分离、活化人T细胞，7天后每10 个细胞用6 μg编码CAR的mRNA通过电穿孔(蓝色)或脂质纳米颗粒(红色)进行转染。未转染的T细胞(UTF，黑色)作为阴性对照进行分析。转染后24小时，将CAR T细胞与靶细胞(KG - 1)或非靶细胞(K - 562)按1:1接种，并分析(A、B)CellTrace + 细胞部分内F(ab’)2 + 细胞指示的CAR表达以及(C、D)增殖(n 个独立实验/供体的平均值 SEM)。ns，无显著性差异；*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；***p < 0.0001，采用Holm - Sidak多重比较检验的双向方差分析(重复测量)

讨论

嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在治疗特定血液系统恶性肿瘤方面已取得巨大成功。然而，目前的CAR T细胞工程依赖于通过基因组整合病毒载体对细胞进行体外修饰，这存在安全问题，且制造时间长、成本高。将编码CAR的mRNA导入T细胞是病毒载体的一种安全替代方法，因为它提供了一种非整合的、瞬时的T细胞修饰。在临床试验中，通过电穿孔(EP)将CAR-mRNA导入T细胞，但这种CAR T细胞大多显示出较差的抗肿瘤反应。因此，我们的研究比较了基于脂质纳米颗粒(LNP)的mRNA递送和EP，以期提供改进的基于mRNA的CAR T细胞。在此背景下，进行了体外转录(IVT)以产生含有m1Ψ的靶向CD123的CAR编码mRNA，因为这种尿苷修饰已被证明可增强蛋白质表达并降低IVT mRNA在体外和体内的免疫原性。

24小时后，LNP产生的基于mRNA的CAR T细胞与EP产生的CAR T细胞具有相当的CAR表达。这些观察结果与先前研究报告的结果一致。然而，在此，我们通过直接比较证明，LNP衍生的CAR T细胞在体外可提供长达约3天的延长功能，这是由于CAR-mRNA在细胞中的持久性延长以及细胞表面的CAR表达，相较于EP衍生的CAR T细胞有所改进。这些结果与先前一项研究的报告一致，在该研究中，与EP相比，基于LNP转染编码荧光素酶的IVT mRNA后，Jurkat T细胞系中的荧光素酶活性得到延长。对于LNP衍生的CAR T细胞，使用抗FAP-CAR-mRNA观察到类似的CAR表达模式长达约7天，表明我们的结果与使用传统mRNA技术制备LNP衍生的CAR T细胞的其他研究一致。在ErbB2和CEA靶向的CAR T细胞工程中，EP处理后6天可在未激活的T细胞上检测到CAR，因此显示出比本研究中观察到的更长的CAR表达。这是由于T细胞未被激活，因此不会增殖，从而维持细胞表面的CAR表达。然而，T细胞未激活并非临床相关情况，因为适当剂量的瞬时CAR T细胞需要高数量的T细胞。另一项研究报告了不同肿瘤血管靶向CAR构建体的模糊结果。在那里，mRNA-EP处理3天后，含有CD28衍生跨膜结构域(TMD)的CAR不再表达，这与本研究结果一致，但另一种含有CD8α衍生TMD的CAR构建体仍高水平表达，这可以通过CAR在细胞膜中的不同稳定性来解释。除了CAR构建体及其稳定性外，其他几个因素也会影响mRNA-EP处理后的转基因表达，如mRNA的设计和量、细胞数量、电场强度以及T细胞的激活状态，其中大多数因素可能也适用于基于LNP的转染。此外，对于LNP，转基因表达取决于LNP的化学成分，这会影响LNP的细胞摄取和mRNA的内体逃逸。因此，将本研究结果与文献进行比较很困难。然而，在此，通过使用相同的CAR构建体、mRNA设计、mRNA量、细胞计数、转染时间和T细胞扩增条件，对EP和基于LNP的mRNA转移进行了直接比较，结果显示用CAR-mRNA-LNP转染时，T细胞中的CAR表达延长，CAR T细胞功能增强。

图5. 稳定转导的CAR T细胞与基于mRNA的CAR T细胞的比较

人T细胞通过慢病毒转导(LV，绿色)或基于脂质纳米颗粒(LNP)的CAR - mRNA转染(mRNA - LNP，红色)进行修饰，分别稳定或瞬时表达CAR。(A)分别为转导后6天的LV - CAR T细胞以及LNP介导转染后第1天至第6天的LV - CAR T细胞的流式细胞术CAR表达分析的代表性直方图。数值显示抗F(ab’)2 - Alexa Fluor 647的平均荧光强度(MFI)作为CAR表达强度的指标。(B)转导后6天的基于LV的CAR T细胞以及转染后第1天至第6天的基于mRNA - LNP的CAR T细胞中，由F(ab’) *细胞表示的CAR表达细胞的比例。(C)通过使用效应细胞与靶细胞比例为0.125:1、0.25:1、0.5:1、1:1和2:1共培养24小时，对CD123* KG - 1细胞的细胞毒性来表明LV或LNP转染产生的CAR T细胞的功能。转导后第6天使用LV - CART细胞，转染后第1天使用mRNA - LNP - CART细胞，分离后第1天使用未修饰的(UM，黑色)细胞。(D)分别以1:1的效应细胞与靶细胞(ET)比例测试对CD123* KG - 1细胞、CD123* MOM - 13细胞、CD123* HNT - 34细胞和CD123 K - 562细胞的细胞毒性。转导后第7天使用CAR T细胞，转染后第2天使用mRNA - LNP - CAR T细胞，分离后第9天使用未修饰的(UM，黑色)细胞。(E和F)转染后第1天至第4天(F)以及转导后第6天至第9天(LV)或分离后第8天至第11天(UM)，由LAG - 3 +细胞表明的(F)KG - 1和(F)K - 562细胞存在时的CART细胞耗竭情况。显示了n (C，D)或n (B，E，F)个独立实验/供体的平均值标准误。ns，无显著性差异；*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001，单向方差分析(B)或双向方差分析(匹配值)(C，D)或双向方差分析(重复测量)(E，F)，每组均采用Holm - Sidak多重比较检验。

在本研究中观察到，与电穿孔(EP)衍生的T细胞相比，经脂质纳米颗粒(LNP)处理的T细胞中mRNA和嵌合抗原受体(CAR)的持续时间延长，这主要可以通过递送机制来解释。EP是基于电诱导的膜破坏。相比之下，对于基于LNP的转移，此处使用的mRNA-LNP由于吸附了补充的载脂蛋白E4(ApoE4)而模拟低密度脂蛋白(LDL)，并通过LDL受体介导的内吞作用被摄取。这种通过ApoE-LDL受体途径的递送机制已在LNP介导的RNA递送中有所描述。由于内体中值降低，LNP中的可电离脂质带正电荷，导致mRNA-LNP解体，随后带正电荷的可电离脂质与内体双层带负电荷的脂质成分发生静电相互作用。这通过形成反相导致脂质双层破坏，最终使mRNA释放到细胞质中。我们和其他人发现这种细胞内mRNA递送对T细胞的危害较小。虽然将mRNA封装到LNP中可提供针对细胞外和细胞内核酶的保护，并促进细胞摄取和内体逃逸，但对于EP，转移的mRNA是裸露的，使其易受酶降解。此外，在EP过程中，mRNA直接进入细胞，在那里它可以立即被翻译成蛋白质。相比之下，对于LNP介导的递送，mRNA在细胞质中逐渐可用，这可能是为什么与EP-CAR T细胞相比，在LNP-CAR T细胞上观察到每个T细胞中CAR分子数量较少的最可能原因。然而，根据戈麦斯-席尔瓦等人的研究，高CAR表达并不总是可取的，因为它会诱导过度的非靶向T细胞激活，也称为张力信号传导，因为它与T细胞凋亡增加、抗肿瘤活性受损和耗竭有关。事实上，我们还发现，转染1天后，EP-CAR T细胞的活力较低，对靶细胞的效率较低，更容易耗竭，并比LNP-CAR T细胞引起更强的脱靶毒性，这为在基于mRNA的CAR T细胞工程中使用LNP而不是EP提供了许多理由。除了细胞内mRNA可用性的变化外，LNP-CAR T细胞上mRNA持久性延长和CAR表达的另一个原因是这些细胞的增殖率较低，导致在每个细胞分裂过程中mRNA和CAR蛋白的稀释较慢。虽然增殖减少对于稳定转导的CAR T细胞的抗肿瘤疗效不利，但我们表明，对于基于mRNA的CAR T细胞，较慢的CAR T细胞增殖与延长的CAR表达相关，这与基于LNP的修饰提供的CAR T细胞功能延长相关。因此，mRNA转移后CAR T细胞增殖的减少可能是进一步延长基于mRNA的CAR T细胞的CAR表达和疗效的一种有前途的方法。

与稳定转导的体外修饰CAR T细胞相比，基于mRNA-LNP的CAR T细胞在修饰后3天显示出相当数量的CAR表达细胞，在2天内显示出类似的CAR T细胞功能，这与以前的研究一致。这些结果强调了LNP在产生基于mRNA的CAR T细胞方面的能力，当CAR表达水平相当时，这些细胞能够符合临床标准。我们证明，与慢病毒转导相比，基于mRNA-LNP修饰的CAR T细胞耗竭较少，这很可能是由于短暂的CAR表达伴随着短期的CAR介导的T细胞激活。此外，LNP衍生的CAR T细胞也比EP衍生的CAR T细胞耗竭更少，这表明使用LNP时转染方法的压力较小。耗竭减少对CAR T细胞治疗有益，因为它与抗肿瘤反应直接相关，使LNP衍生的CAR T细胞成为临床上短暂CAR T细胞治疗最有前途的候选者。

总之，基于脂质纳米颗粒(LNP)的转染可产生改良的基于mRNA的嵌合抗原受体(CAR)T细胞，因为它通过延长CAR - mRNA和CAR T细胞的持久性，显著延长了CAR T细胞在体外的效力。这归因于不同的mRNA递送机制，其细胞毒性较小，并且在LNP处理后CAR T细胞增殖较慢。下一步，这些源自mRNA - LNP的CAR T细胞将在体内研究中进行测试，为体外生成的mRNA - CAR T细胞的良好生产规范(GMP)工艺开发铺平道路，以便转化应用于临床。除了其生物学优势外，mRNA - LNP已证明具有成本效益和时间效益的可制造性和可扩展性，为临床应用提供了明确的途径。此外，本研究中使用的mRNA - LNP可作为一个灵活的平台，通过改变mRNA序列来生成和筛选不同的CAR T细胞，而无需对制造工艺和LNP组成进行必要的更改。

材料与方法

原代人T细胞的分离与体外培养

T细胞从健康供体血液经密度梯度离心获得的人外周血单核细胞(PBMC)中分离(由德国莱比锡大学诊所输血医学研究所采集，并经德国莱比锡大学诊所医学院伦理委员会批准，因为未引发伦理或科学问题[文件参考编号:272 - 12 - 13082012])。使用Pan T细胞分离试剂盒(德国米尔滕yi生物科技公司，伯格isch格拉德巴赫)，按照制造商说明，通过磁激活细胞分选从PBMC中纯化T细胞。然后将T细胞在补充有10%二甲基亚砜(DMSO)的90%胎牛血清(FBS)中于液氮中冷冻，直至进一步使用。解冻后，通过添加免疫培养人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂(加拿大STEMCELL技术公司，温哥华，不列颠哥伦比亚省)激活T细胞，并在含有 mL人重组白细胞介素 - 2(IL - 2；英国佩普洛泰克公司，伦敦)的免疫培养 - XF T细胞扩增培养基(STEMCELL技术公司)中于和条件下扩增7天。

mRNA合成

mRNA合成的DNA模板源自携带抗CD123 - CAR编码序列的慢病毒载体(美国纽约州雪莉市Creative Biolabs公司)，通过聚合酶链反应(PCR)产生。然后通过体外转录(IVT)生成mRNA，并进行共转录加帽以及随后的多聚腺苷酸化，具体如下所述。

PCR

为了生成用于IVT的带有T7启动子的DNA模板，使用Q5高保真DNA聚合酶(德国法兰克福新英格兰生物实验室)按照制造商说明进行PCR。通过正向引物 - GCTAATACGACTCACTATAAGGAGAGGCCGCCAC CATGGCCTTAC - 3’(下划线为T7启动子序列，为整合CleanCap® AG作为帽结构进行了轻微修饰(加粗))添加T7启动子序列。 - CACTACCGAGGCGGCAGGGCCTGCAT - 3′用作反向引物。PCR反应在条件下于孵育，随后在条件下进行35个循环的，在条件下进行，然后在条件下进行。通过NucleoSpin Gel和PCR Clean - up Mini试剂盒(德国杜伦市MACHEREY - NAGEL公司)纯化PCR样品。使用紫外/可见光谱仪(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司的NanoDrop 3000)测定PCR产物的浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳分析完整性。

IVT

使用HighYield T7 RNA合成试剂盒(德国耶拿的耶拿生物科学公司)，加入 HighYield T7反应缓冲液、10 mM二硫苏糖醇、5 mM三磷酸腺苷、5 mM三磷酸胞苷、5 mM三磷酸鸟苷和 -甲基假尿苷三磷酸(耶拿生物科学公司)、模板DNA以及 CleanCap®试剂AG (美国加利福尼亚州圣地亚哥的TriLink生物技术公司)合成加帽mRNA。反应在下孵育，随后用脱氧核糖核酸酶(赛默飞世尔科技公司)在下处理以去除DNA模板。使用NucleoSpin RNA纯化小试剂盒(德国美天旎公司)纯化mRNA，然后在NanoDrop 3000上测定浓度，并在补充有 (德国卡尔斯鲁厄的卡尔·罗斯公司)的琼脂糖凝胶电泳中进行分析。

聚腺苷酸化

为了给加帽mRNA添加聚腺苷酸尾，按照制造商说明使用大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶(新英格兰生物实验室)。反应在下孵育。mRNA的纯化和分析方法与体外转录后相同。

mRNA-脂质纳米颗粒制剂与表征

使用用于mRNA的GenVoy-ILM T细胞试剂盒(Precision NanoSystems)将mRNA封装到LNP中。因此，将11.02 μg的mRNA在试剂盒提供的配方缓冲液和无RNase水中稀释至总体积为 (mRNA稀释)。将48 μL稀释缓冲液、 mRNA稀释液和脂质混合物使用NanoAssemblr® Spark 设备(Precision NanoSystems)的设置#3进行微流混合。配制好的mRNA-LNP在稀释缓冲液中按1:2稀释，并储存在。为了进行表征，通过在Zetasizer Nano ZS(Malvern Panalytical，英国马尔文)上进行动态光散射来测定生成的mRNA-LNP的直径(z平均值)和PDI，使用以下参数:测量类型:尺寸；材料:蛋白质；分散剂:PBS；温度: ；平衡时间: ；样品池类型:ZEN0040；测量角度: 背散射；运行次数:12；运行持续时间:10 s；测量次数:三次，无延迟。为了测定mRNA浓度和mRNA封装效率，根据Precision NanoSystems修改后的方案，在96孔板中进行Quant-iT RiboGreen测定(ThermoFisher Scientific)。因此，将mRNA-LNP在缓冲液中于在孵育，分别在不存在或存在0.6% Triton X-100的情况下测定游离和总mRNA。使用不同浓度的核糖体RNA获得标准曲线。孵育后，加入在 TE缓冲液中1:100稀释的QuantiT RiboGreen RNA试剂，并在Tecan Infinite M200微孔板读数仪(Tecan，瑞士曼纳多夫)上于用测量荧光。荧光强度与RNA量直接相关。标准曲线用于RNA浓度的定量以及封装效率的计算。

通过基于LNP的转染进行mRNA递送

为了用mRNA-LNP进行转染，对分离并扩增的T细胞进行计数，并以个细胞的浓度接种在含有白细胞介素(IL)-2的T细胞扩增培养基中；加入1 μg/mL ApoE4(PeproTech，由Precision NanoSystems的用于mRNA的GenVoy-ILM 细胞试剂盒提供)和个细胞)。细胞在和孵育，直到进一步分析。

通过电穿孔进行mRNA递送

使用Neon转染系统试剂盒(赛默飞世尔科技公司)通过电穿孔法转染T细胞。因此，细胞用PBS洗涤一次，随后重悬于缓冲液R中，以获得细胞浓度为细胞，将细胞与的mRNA混合，并在进行电穿孔，三个脉冲(在电穿孔尖端进行两次)。将电穿孔后的细胞转移至预热的含IL-2的T细胞扩增培养基中，在和孵育，直至进行进一步分析。

慢病毒载体的生产与转导

为生产慢病毒载体，将细胞接种于组织培养皿中培养，然后用的pMD2.G、的pRSV-Rev、12.5 的pMDLg/pRRE包装质粒(美国马萨诸塞州沃特敦市Addgene公司)以及的转移质粒(美国纽约州雪莉市Creative Biolabs公司)，使用 Lipofectamine 2000转染试剂(赛默飞世尔科技公司)进行转染。小时后更换培养基。再经过小时，收集病毒上清液，并用Amicon过滤器(100 kDa；德国达姆施塔特市默克公司)进行离心浓缩。通过用不同体积的浓缩上清液转导HEK-293T细胞并对表达报告蛋白GFP的细胞进行流式细胞术分析来测定病毒滴度。T细胞分离和激活24小时后，以每个细胞1个病毒颗粒的浓度(感染复数[MOI]为1)向细胞中加入慢病毒载体，然后在以1800 rpm离心，并在和过夜孵育。第二天重复此步骤。转导后的T细胞在含IL-2的T细胞扩增培养基中扩增。

流式细胞术

使用AlexaFluor 647偶联的亲和纯F(ab’)2抗小鼠IgG、对人、牛和马血清蛋白交叉反应最小的F(ab’)2片段(称为抗F(ab’)2-Alexa Fluor 647试剂；英国伊利市Jackson ImmunoResearch公司)、7-氨基放线菌素D(7-AAD；美国加利福尼亚州圣何塞市BD Biosciences公司)、FITC Annexin V(美国加利福尼亚州圣何塞市BD Biosciences公司)、PE-Cy5 CD3(克隆:UCHT-1，美国加利福尼亚州圣何塞市BD Biosciences公司)、BV510 CD4(克隆:SK3，美国加利福尼亚州圣何塞市BD Biosciences公司)、PE-Cy7 CD8(克隆:RPA-T8，美国加利福尼亚州圣何塞市BD Biosciences公司)、PE CD25(克隆:2A3，美国加利福尼亚州圣何塞市BD Biosciences公司)、BV421 LAG-3(克隆:T47-530，美国加利福尼亚州圣何塞市BD Biosciences公司)和PE-Cy7 LAG-3(克隆:3DS223H，赛默飞世尔科技公司旗下的美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen公司)，在BD FACSCanto II流式细胞仪(加拿大安大略省密西沙加市BD Biosciences公司)上对流式转染T细胞的CAR表达、活力和表面标志物进行分析。数据在Kaluza分析软件(版本2.1；德国克雷费尔德市Beckman Coulter公司)中进行评估。

细胞内mRNA定量

在每个分析时间点，收集细胞并用PBS洗涤。将细胞沉淀重悬于TRI试剂(德国弗莱堡的Zymo Research公司)中，并在下冷冻，直至进行RNA分离。因此，将收获的细胞解冻，并使用Direct-zol RNA Microprep试剂盒(Zymo Research)分离RNA。使用Nanodrop测定分离的RNA的浓度。根据制造商的建议，使用带有Oligo d(T) 引物的RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒(赛默飞世尔科技)对100 ng分离的RNA进行逆转录。cDNA在中按1:1000稀释用于定量PCR。因此，将PerfeCTa SYBR Green FastMix试剂(美国马萨诸塞州贝弗利的Quantabio公司)与cDNA和CAR特异性引物对(正向5’-ATGTGCAGATCACCCAGTCC-3’，反向5’-TTG TTGGTCTTGCCAGGCTT-3’)混合，反应混合物在下孵育10分钟，然后在下进行40个循环的，在下进行 (退火和延伸)，随后在LightCycler 480(瑞士罗特kreuz的罗氏公司)上进行标准熔解曲线分析。使用5’-GGACTCATGACCA CAGTCCAT-3’作为正向引物和5’-AGGTCCACCACTGACACGTT- 作为反向引物选择GAPDH作为管家基因。

细胞毒性测定

为了分析CAR T细胞的功能，选择CD123阳性(KG-1、MOLM-13和HNT-34)和CD123阴性(K-562)细胞系(德国布伦瑞克的莱布尼茨研究所，DSMZ - 德国微生物和细胞培养物保藏中心)作为靶细胞，根据制造商的说明使用CellTrace Violet细胞增殖试剂盒对其进行标记，用于流式细胞术(赛默飞世尔科技)。然后，将25,000个标记的靶细胞(T)接种在含有RPMI + 10% FBS培养基的96孔U型底板中，与不同数量的CAR T细胞作为效应细胞(E)一起培养:E:T = 0.125:1时为3,125个，E:T = 0.25:1时为6,250个，E:T = 0.5:1时为12,500个，E:T = 1:1时为25,000个，E:T = 2:1时为50,000个。使用整个CAR T细胞群体，使得相同E:T比例的每种共培养物的总细胞数相同。在不含效应细胞的RPMI + 10% FBS培养基中培养的靶细胞用作参考样品，用吐温20处理的靶细胞用作阳性对照。在共培养后，在和下收获细胞，用7 - AAD孵育以染色死细胞，并在BD FACSCanto II上进行分析。细胞毒性用以下公式计算:细胞毒性[％] = 100％ - (共培养样品中CellTrace Violet -AAD 细胞[％]/参考样品中CellTrace Violet 细胞[％])* 100％。

挑战试验

为了表征CAR-T细胞在遇到靶细胞和非靶细胞后的情况，使用CellTrace Violet细胞增殖试剂盒(用于流式细胞术，赛默飞世尔科技)按照制造商说明对CAR-T细胞进行标记；将50,000个标记的CAR-T细胞与50,000个未标记的KG-1或K-562细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI培养基中，置于96孔F型底培养板中，在和条件下孵育，直至进行分析。因此，收获细胞并制备用于流式细胞术分析CellTrace 细胞组分。通过CellTrace 组分中F(ab’)2+细胞的比例确定CAR表达。CAR-T细胞增殖使用以下公式计算:增殖倍数[x倍] = 分析日CellTrace 组分在天的初始。

统计学

使用适用于Windows的GraphPad Prism 6.00版本(GraphPad软件公司，美国加利福尼亚州拉霍亚，www.graphpad.com)生成图表并进行统计分析。数值表示为独立实验的均值标准误。按照图注中所述进行统计检验，p值通过Holm-Sidak检验进行多重比较校正。当时发现有统计学显著差异。

数据和代码可用性

可根据合理请求向通讯作者获取数据。

补充信息

补充信息可在网上https://doi.org/10.1016/j.omtm.2023.101139获取。

致谢

我们非常感谢Marie-Madeleine Nzila和Robert Serfling博士在使用Neon转染系统和4D-Nucleofector的工作中提供的出色技术支持。本出版物所基于的项目由德国联邦教育与研究部资助，资助代码为16GW0322。

作者贡献

概念化，R.K., M.R., U.S.T.；方法学，R.K., M.R., R.G., S.P.；调查，R.K., R.G., S.P.；形式分析，R.K.；可视化，R.K.；资金获取，S.F., U.S.T.；项目管理，S.F., U.S.T.；监督，S.F., U.K., U.S.T.；撰写 - 原始草案，R.K.；撰写 - 审阅与编辑，所有作者。