两种实验室规模方案用于增强基于mRNA的CAR-T细胞生成及功能的比较
发布时间：
2026-05-24 21:33
两种实验室规模方案用于增强基于mRNA的CAR-T细胞生成及功能的比较
纳丁·冯·奥(Nadine von Auw) ，罗伯特·塞尔夫林(Robert Serfling) ，雷尼·基特(Reni Kitte) ，纳贾·希尔格(Nadja Hilger) ，张成康(Chengkang Zhang) ，克拉拉·格布哈特(Clara Gebhardt) ，安娜·邓克尔(Anna Duenkel) ，保罗·弗兰茨(Paul Franz) ，乌尔里克·科尔(Ulrike Koehl) ，斯特凡·弗里克(Stephan Fricke) 及U. 桑迪·特雷特巴尔(U. Sandy Tretbar)
将实验室规模的研究工作流程转化为自动化生产程序的工艺开发对于嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法至关重要。因此，细胞活力、扩增、修饰和功能的关键因素是培养基和T细胞激活剂的最佳组合，以及它们在后续按照药品生产质量管理规范(GMP)进行生产时的法规合规性。在本研究中，我们使用当前的实验室规模流程比较了两种用于生成CAR-mRNA修饰的T细胞的方案，分析了所有提及的参数，并评估了这些方案在基于mRNA的CAR-T细胞疗法的扩大规模和工艺开发方面的潜力。
嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞在血液系统恶性肿瘤的治疗中具有治疗用途，2023年有六种获批的CAR-T细胞产品 。一般来说，CAR-T细胞制造过程是一个体外培养和修饰过程，包括采集患者特异性T细胞的白细胞单采、T细胞激活、通过病毒转导进行基因修饰、CAR-T细胞扩增、冷冻保存以及将最终产品重新注入患者体内 。病毒转导的一种替代方法是将编码CAR的mRNA作为体外转录本(IVT)用于T细胞的非整合性、瞬时修饰 ，这已经在多项临床试验中进行了测试 。对于基于mRNA的CAR-T细胞的体外生成，需要一种稍有不同的制造方法，其工艺步骤顺序不同:除了采集患者特异性T细胞进行病毒转导的白细胞单采和激活外，未修饰的T细胞必须首先进行扩增以获得用于实验测试或临床治疗的合适细胞数量，然后用编码CAR的mRNA进行转染，接着进行冷冻保存并重新注入患者体内 。为了实现具有时间和成本效益的生产，自动化和可扩展的流程是核心目标。由于所有T细胞体外基因修饰方法都涉及一定程度的细胞毒性，这可能导致制造过程中大量细胞损失 ，T细胞的激活和扩增是确保mRNA转移前后有足够数量活细胞的关键步骤。因此，支持基于mRNA的CAR-T细胞的活力、扩增、修饰和功能以及在当前药品生产质量管理规范(cGMP)下生产的法规合规性的最佳培养基是关键参数之一。在过去十年中已经出现了不同的方案 ，因为成功的免疫疗法高度依赖于选择合适的培养基以实现所需T细胞类型的有效扩增 。然而，仅有少数用于临床级、符合GMP的基于mRNA的CAR-T细胞制造的方案 。在此，在本研究中，我们使用当前的实验室规模流程比较了两种用于生成CAR-mRNA修饰的T细胞的不同培养基方案，并评估了它们在用于临床级基于mRNA的CAR-T细胞疗法的封闭系统中扩大规模的潜力。使用ImmunoCult"-XF T细胞扩增培养基(加拿大温哥华的StemCell Technologies公司)和最近发布的TheraPEAK T-VIVO 培养基(美国沃克维尔的Lonza公司)以及每个供应商推荐的补充剂，我们使用来自四个不同健康供体的原代T细胞比较了扩增、活力、CAR修饰、T细胞亚群和功能。
细胞与基因治疗开发部，弗劳恩霍夫细胞治疗与免疫学研究所 (IZI)，佩利克街 1 号，04103 莱比锡，德国。 龙沙集团，医学中心大道 9900 号，罗克维尔，马里兰州 20850，美国。 弗劳恩霍夫卓越免疫介导疾病集群 CIMD，莱比锡，德国。 弗劳恩霍夫细胞治疗与免疫学研究所 (IZI)，佩利克街 1 号，04103 莱比锡，德国。 莱比锡大学医学院临床免疫学研究所，约翰尼斯大街 30 号，04103 莱比锡，德国。邮箱:sandy.tretbar@izi.fraunhofer.de
结果
实验室规模的 mRNA-CAR-T 细胞生成工作流程
一般来说，实验室规模的基于 mRNA 的 CAR-T 细胞生成过程需要四个主要步骤:从健康供体中分离原代 T 细胞、T 细胞激活、扩增以及 mRNA 转染。为了研究生成 CAR-T 细胞时 mRNA 摄取的最佳时间点，使用方案 A 扩增 T 细胞，并分析细胞数量、扩增率、活力、T 细胞亚群、转染效率和 CAR 表达水平。考虑到用于实验测试(以及后续临床治疗)的合适细胞数量、较高的 CAR-T 细胞活力以及由于激活状态导致的高疗效，我们将第 6 - 10 天定义为最适合对激活的 T 细胞进行 mRNA 转染以生成瞬时 CAR-T 细胞的时间(总结于补充图 S1)，这导致了图 1A 和 2A 中所示的实验工作流程。
T 细胞扩增与活力
从四名不同健康供体的外周血单核细胞中分离原代 T 细胞，进行冷冻保存，并使用流式细胞术分析 T 细胞纯度(第 -X 天)。尽管不同个体的淋巴细胞组成有所不同，但本研究中使用的所有四名供体的细胞类型频率和 T 细胞纯度均在预期范围内 (补充图 S2)。在第 0 天，解冻 T 细胞，在为期 8 天的扩增过程中进行监测，并使用两种不同的培养基方案比较扩增率、活力、表型、基于 mRNA 的 CAR 修饰和功能。
本研究中首先检测的参数是解冻和激活后 T 细胞的扩增率。尽管来自每个供体的 T 细胞表现出各自的生长行为并适应各自的条件(补充图 S3)，但在所有供体中，方案 B 在第 8 天的 T 细胞数量(158.3 倍 ± 75.3)往往高于方案 A(78.7 倍 ± 37.1)(图 1B)。使用两种方案对细胞进行台盼蓝染色显示，在第 3 天细胞活力下降:方案 A，第 0 天 85.0%±6.1 与第 3 天 66.1%±9.4；方案 B，第 0 天 85.0%±6.1 与第 3 天 62.6%±13.4。在第 6 天，细胞恢复，活力与分离后相同甚至更高(活力 > 80%)。方案 A 和方案 B 的直接比较显示，在第 6 天方案 B 的活力比方案 A 高 10 - 20%(方案 A 81.8%±7.0；方案 B 94.2%±3.7)(图 1C)。这通过显微镜分析得到证实，显微镜分析显示在第 7 天细胞形态存在差异。按照方案 B 培养的细胞呈圆形，而按照方案 A 培养的 T 细胞显得更大，略有变形且细胞碎片更多(图 1D)。
激活后 T 细胞的表征
为了研究不同方案如何影响T细胞群体的组成和激活状态，在第3天到第8天通过流式细胞术监测T细胞亚群和选定的激活/耗竭标志物。在第3天，T细胞的CD3状态差异最为明显(方案A为23.3%±3.9；方案B为84.0%±5.7)，这主要是由于两种方案中使用的激活试剂不同(图1E，左图)。方案A中使用的推荐激活试剂由结合T细胞表面受体的可溶性T细胞激活抗体(抗CD2/抗CD3/抗CD28)混合物组成，导致CD3 内化。相比之下，方案B使用固定在聚合物纳米基质上的抗CD3/抗CD28抗体，导致T细胞激活，但CD3表面受体不会内化到T细胞中。因此，在T细胞激活后(第3 - 6天)，方案B直接获得了更高的CD3信号。然而，在第7天，两种方案的CD3水平均达到>90%的CD3阳性细胞(方案A为96.3%±0.4；方案B为99.5%±0.0)(图1E，左图)。对于CD3阳性部分中辅助性T细胞和细胞毒性T细胞的分布，分析了两种培养基方案中的CD4和CD8表达水平。虽然方案A在第7天显示出更高水平的 辅助性T细胞(方案A为54.6%±6.8；方案B为37.7%±6.0)，但方案B促进了更高水平的CD4 细胞毒性T细胞的形成(方案A为37.0%±5.4；方案B为53.7%±6.2)(图1E，中图、右图)。
为了评估T细胞激活状态，分析了CD25表达，结果表明两种方案的表面表达水平相当且稳定，从激活后第6天到 略有下降(图1F，左图)。CD69表达是早期T细胞激活的指标，在激活后第3天到第8天，两种培养基中的T细胞上的CD69表达均下降，表明激活状态下降(图1F，中图)。淋巴细胞激活基因3(LAG - 3)用作T细胞耗竭的代表性标志物。从激活后第3天到第8天，LAG3 + 细胞的比例在扩增过程中下降，表明在用T细胞激活试剂激活后，T细胞的耗竭程度更高(图1F，右图)。
T细胞转染和CAR表达测定
为了总体研究通过电穿孔将mRNA递送至T细胞的最佳方案，使用方案A建立了电穿孔工作流程。因此比较了制造商推荐的不同电穿孔设置，以获得最高的转基因表达，同时保持最佳的T细胞活力。在初始实验中，使用编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的报告mRNA进行T细胞电穿孔，并确定了显示最高EGFP表达和细胞活力的前三个设置(补充图S4)。用编码抗CD123 - CAR和GFP的mRNA验证了这些发现(构建体见补充图S5)，并且脉冲编码CM - 138被揭示为以高转基因表达和保持活力瞬时转染T细胞的最合适设置(补充图S6)。然后将此脉冲编码定义为本方案比较中抗CD123 - CAR - mRNA转染的标准电穿孔设置。
为了评估使用CAR - mRNA电穿孔进行瞬时转染后CAR阳性T细胞的数量，在第8天(转染后24小时)通过F(ab’) -山羊抗小鼠IgG抗体染色来确定CAR表面表达，该抗体识别用作通用的CAR蛋白的抗原结合部分(scFv)
图1. 比较两种不同培养基方案时，原代T细胞在8天培养过程中的实验工作流程、扩增率、活力和表型分析。(A) 使用原代T细胞基于mRNA的CAR-T细胞生成的实验室规模流程，包括分离(第 -X天)、激活(第0天)和扩增(第1 - 8天)。(B、C) 使用方案A(蓝色)和方案B(绿色)在8天培养过程中T细胞扩增和活力的比较。进行了N = 4次独立实验。数值表示为平均值±标准误。(D) 激活后第7天T细胞形态的显微镜分析。每个方案各展示一张代表性图像，显示方案A(蓝色)中细胞形状更大、更不均一，而使用方案B(绿色)时细胞群体均一、呈圆形。比例尺显示为 。(E、F) 使用方案A和方案B在8天培养过程中对T细胞进行流式细胞术分析。将标志物表达百分比相对于培养天数作图。对T细胞亚群(E)和激活状态(F)的分析揭示了所测试的两种方案之间的差异。进行了 次独立实验。数值表示为平均值 标准误。
图2. 转染后24小时抗CD123 CAR表达、CAR-T细胞活力和CAR特异性杀伤活性的比较。(A) 通过电穿孔(第7天)用抗CD123 - CAR - mRNA修饰扩增T细胞的实验工作流程，电穿孔后24小时(第8天)检测CAR表达，并在第9天对CAR-T细胞进行功能测试。(B) 转染后24小时，通过F(ab’)2染色和流式细胞术分析确定在方案A(蓝色)或方案B(绿色)培养基中培养的T细胞的CAR表达；进行了n = 3次抗CD123 CAR转染的独立实验。未转染细胞 和水转染细胞 用作阴性对照。数值表示为平均值 标准误，对于 情况则表示为平均值 标准误。(C) 通过7 - AAD染色和流式细胞术分析确定瞬时转染后aCD123 - CAR - T细胞的活力。用方案A扩增的转染及未转染细胞在转染后24小时的活力低于用方案B扩增的(CAR) - T细胞。(D) 当按照方案B(浅绿和深绿)培养CAR-T细胞时，F(ab’/2)染色的直方图明显分为F(ab’)2阳性和F(ab’)2阴性，而当使用方案A(浅蓝和深蓝)培养时，CAR阳性和CAR阴性T细胞的直方图重叠。(E/F) 将aCD123 - CAR - T细胞或水转染对照T细胞消除的死亡靶细胞百分比相对于E:T比0.5:1、1:1和2:1作图。按照方案A培养的T细胞显示为蓝色曲线，按照方案B培养的T细胞显示为绿色曲线。对于aCD123 - CAR - T效应细胞，展示了以技术重复进行的 次独立实验的结果。对于过程控制，展示了以技术重复进行的以 作为对照实验的水电穿孔T细胞。所有数值表示为平均值 标准误，对于 情况则表示为平均值 标准误。
嵌合抗原受体(CAR)检测试剂 。在转染后 ，两种T细胞扩增方案的CAR表达水平相似。在转染后 ，无论用于扩增和转染的方案如何，CAR表达总是至少下降50%，即使使用用于电穿孔的最佳脉冲编码(补充图S6)，并且在转染后72小时不再检测到CAR表达(数据未显示)。然而，其他技术，如脂质纳米颗粒递送CAR-mRNA，目前正在研究中，表明直到转染后第6天CAR表达和CAR-T细胞功能延长(电穿孔与脂质纳米颗粒数据，手稿已接受 )。对于未转染的T细胞，以及作为电穿孔过程对照的水转染T细胞，在根据方案A培养的细胞上观察到非特异性信号，但在用方案B扩增的T细胞上未观察到。这表明用于CAR检测的F(ab’)抗体与仅在方案A中存在的其他F(ab’)结构非特异性结合(图2B)。虽然方案A使用包含可溶性抗CD2/CD3/CD/28抗体的T细胞激活试剂，但方案B使用纳米基质结合的抗CD3/CD28抗体进行T细胞激活，其比留在细胞表面干扰使用F(ab’) -山羊抗小鼠IgG抗体进行CAR染色的可溶性抗体更容易去除。根据方案A扩增的CAR-mRNA转染T细胞(AlexaFluor®647阳性)和未转染T细胞(AlexaFluor®647阴性)的直方图略有重叠，而使用方案B扩增的表达CAR的T细胞(Alex-aFluor®647阳性)和不表达CAR的T细胞(AlexaFluor®_647阴性)则有明显分离(图2D)。
在转染后第 天评估用抗CD123-CAR-mRNA转染对T细胞活力的影响。比较相同扩增方案的CAR-mRNA转染和未转染的T细胞，未转染的对照T细胞比CAR-mRNA转染的T细胞活力高15 - 20%:方案A(51.0%±8.9)，方案B(76.8%±10.3)(图2C)。与未转染的T细胞相比，水转染T细胞的活力略有下降:方案A(60.8%±2.9)，方案B(94.7%±0.2)，表明电穿孔过程本身仅对T细胞活力有轻微影响，而将mRNA引入细胞对活力有更显著影响，与用于扩增的方案无关(图2C)。比较两种方案，用方案A培养的CAR-mRNA转染及水转染和未转染的T细胞活力低于用方案B培养的T细胞(图2C)，这与未转染T细胞在第6天和第7天获得的活力数据一致(图1C)。由于CAR-mRNA电穿孔后活细胞百分比高得多(76.8%±10.3对51.0%±8.9)，方案B比方案A更适合临床应用。目前，一个FDA批准的剂量是每 体重0到 个CD19导向的CAR阳性活T细胞，适用于 患者，具体取决于要治疗的适应症 。如果将此应用于瞬时CAR-T细胞，对于一剂活力为76.8%的活CAR-T细胞，需要生产大约 个CAR-T细胞，这是可行的，即使需要更多剂量用于多次应用。
瞬时抗CD123-CAR-T细胞的功能
用抗CD123嵌合抗原受体(CAR)修饰原代T细胞后，分析瞬时CAR-T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。因此，建立了与CD123阳性的急性髓系白血病细胞系KG-1或作为对照的CD123阴性细胞系K-562共培养24小时的体系。共培养24小时后，通过用7-氨基放线菌素D(7-AAD)染色来确定死亡的靶细胞。与方案B相比，按照方案A培养的抗CD123 CAR-T效应细胞在所有测试的效靶比下导致的KG-1细胞死亡更少(图2E)。用水进行电穿孔的T细胞作为过程对照，未显示或仅显示极少的靶细胞死亡(图2E)。作为脱靶对照，抗CD123 CAR-T细胞与CD123阴性的慢性髓性白血病K-562细胞共培养，与转染水的T细胞相比，未观察到CAR特异性细胞毒性(图2F)。
讨论
为了克服在更高生物安全水平下的安全性问题以及耗时且成本高昂的生产过程，基于mRNA的瞬时CAR-T细胞生成是一种有吸引力的替代方法，可替代目前已获批的通过病毒转导 产生的CAR-T产品。
CAR-T细胞生成过程中的关键步骤是T细胞活化和扩增，以确保有足够数量的活细胞用于实验测试或临床治疗，并在修饰后具有有效的CAR-T功能。由于mRNA转染后CAR表达的瞬时特性，CAR-T细胞的“健康状况”比病毒转导的CAR-T细胞更为关键，后者在每个细胞分裂周期后都能维持CAR表达。
瞬时CAR-T细胞在多项临床前研究中已显示出有效性，并在临床试验中显示出抗肿瘤疗效的初步证据 。然而，仍需要优化生产过程，因为基于mRNA的CAR-T细胞需要多次给药才能产生有效的抗肿瘤反应 。这反过来需要生产和储存多个批次，这只能通过优化扩增条件来实现，以产生尽可能多的最有活力和最有效的CAR-T细胞。
尽管已经发表了一些方案，比较了不同的培养基并报告了体外功能性CAR-T细胞的生成 ，但缺乏一个既考虑时间和成本效益，又考虑到后续基于mRNA的CAR-T细胞自动化和可扩展的符合GMP生产的生产过程。因此，我们未雨绸缪，设计了一种基于mRNA-CAR-T细胞生成的实验室规模方法，以电穿孔作为瞬时转染的示例过程，比较了两种培养基方案，并评估了它们在基于mRNA的CAR-T细胞疗法放大和工艺开发方面的潜力。
正如之前几项研究中对其他测试培养基的报道 ，虽然两种方案都能在体外产生有活力和功能性的CAR-T细胞，但我们的实验室规模研究揭示了在扩增率、活力、T细胞亚群、CAR检测准确性和CAR-T细胞疗效方面的差异。我们确定方案B最适合生成最佳的mRNA-CAR-T细胞，并定义了获得高质量mRNA-CAR-T细胞产品必须满足的以下标准:
1. 转染前T细胞数量多、活力高且处于激活状态。大量高活力和激活的T细胞尤为重要，因为目前的生产过程使用的是大多来自预处理严重、T细胞质量差的患者的患者来源T细胞。对于mRNA方法，在mRNA修饰之前包括一个扩增步骤。T细胞的这个扩增步骤持续6 - 10天，有利于获得高T细胞数量、活力和适当的激活状态，进而产生高质量的瞬时CAR-T细胞。由于患者在接受获批的CAR T细胞产品作为二线或三线治疗时通常经过了大量预处理，起始材料的质量往往很差，活力和淋巴细胞采集效率低 。此外，基因修饰前的T细胞选择和富集降低了不期望细胞被修饰的风险，起始材料中污染的红细胞(RBC)、单核细胞和中性粒细胞可能会对培养中的T细胞扩增以及最终的CAR-T细胞产品特性产生不利影响 。
2. mRNA应在T细胞激活后的第6天至第10天之间递送，否则要么细胞数量还不够高，要么T细胞不再足够激活以在接下来的几天内发挥有效作用。在此，我们确定第7天是递送CAR-mRNA的最合适日期。
3. 高效杀伤靶细胞需要CAR-T细胞具备尽可能高的功能。高CD8:CD4比率有助于实现这一点，它能促进快速有效的细胞毒性。对于病毒转导的CAR-T细胞，据描述CD4+ CAR-T细胞在肿瘤杀伤方面最初比CD8+ CAR-T细胞慢，但因此更不易耗竭，在接触抗原后在体内更持久。CD8+ CAR T细胞则相反 。然而，这些情况在瞬时CAR-T细胞中并不起作用。mRNA-CAR-T细胞的瞬时特性要求快速有效地杀伤肿瘤，因此需要高水平的CD8阳性细胞，由于mRNA半衰期短和CAR瞬时表达，无需考虑CAR-T细胞的长期持久性。
只有使用方案B，我们才能在实验室规模的过程中满足高质量瞬时CAR-T细胞产品的所有标准，这表明该方案最适合扩大规模。使用这种最佳的T细胞扩增方案B，我们可以证明外周血单个核细胞(PBMC)可作为T细胞富集的起始材料(补充图S3B、C)，无需像之前所有实验(图1、2)那样通过磁珠预先分离T细胞。T细胞扩增率和活力与分离的T细胞相当，这表明PBMC可能是一种更节省时间和成本的起始材料，可省去额外的纯化步骤以及T细胞扩增前用于分离T细胞的昂贵耗材。此外，该程序已被证明对于使用自动化系统 生成病毒转导的CAR-T有效，这表明对于mRNA CAR-T细胞可能也可以设想类似的程序。
下一步，我们将把这种瞬时CAR-T方案转移到扩大规模的程序中，并使用自动化系统将工艺开发成符合GMP标准的流程。如病毒转导的CAR-T细胞所示，像CliniMACS Prodigy设备这样的自动化系统是下一代以具有时间和成本效益的方式生产CAR-T细胞的方法 。甚至通过电穿孔递送Cas9-mRNA和向导 或基于转座子的睡美人技术 的基因编辑CAR-T细胞也在CliniMACS Prodigy中成功制造出来，这表明自动化系统对于临床转化具有高度相关性。
我们知道，像我们这里描述的实验室规模方案通常旨在转化为GMP标准，但在GMP或类似GMP条件下的实际性能大多需要进一步优化甚至调整 。然而，即使对于实验室规模，我们从一开始就考虑了符合GMP扩大规模的要求。尽管本研究中使用的转染方法依赖于电穿孔，但我们手头有这种最佳的实验室规模mRNA-CAR-T细胞工艺以及基于脂质纳米颗粒(LNP)的转染方法(电穿孔与基于LNP的转染的比较，稿件已接受 )，并且我们拥有自动化设备和经验丰富的团队，能够迈向更高水平，最终确定最适合用于临床试验的mRNA-CAR-T细胞制造方案。
方法
实验设计
原代T细胞分离、扩增及细胞培养
原代T细胞从德国莱比锡大学诊所输血医学研究所收集的健康供体的人外周血单个核细胞(PBMC)中分离得到，该研究经德国莱比锡大学诊所医学系伦理委员会批准，因为未引发伦理或科学问题(文件参考编号:272 - 12 - 1308/2012)。已获得所有健康供体和/或其法定监护人的知情同意。此外，我们确认所有实验均按照相关指南和规定进行。
使用Ficoll梯度离心从供体材料中提取PBMC，并通过流式细胞术进行免疫表型分析。使用全T细胞分离试剂盒(德国米尔滕yi生物科技公司，伯格isch Gladbach)通过磁分离实现T细胞分离。分别通过台盼蓝染色和流式细胞术评估细胞活力和分离质量。随后， 细胞冷冻并保存在液氮中直至第 -X天。为了进行方案比较，将冷冻的T细胞解冻(第0天)，接种到各自方案的培养基中，激活并扩增8天。
为了进行细胞扩增，细胞要么在ImmunoCult"-XF T细胞扩增培养基中培养，要么在Thera-PEAK T-VIVO 培养基中培养，并根据供应商的规格补充白细胞介素-2(IL-2)并激活。具体来说，ImmunoCult"-XF T细胞扩增培养基补充了218 IU/mL的IL-2(PeproTech，英国伦敦)，T细胞通过25 µL/mL的ImmunoCult™人CD3/CD28/CD2 T细胞激活试剂以 个细胞/mL的细胞密度激活(StemCell Technologies，加拿大温哥华)(称为方案A)。TheraPEAK T-VIVO 补充了100 IU/mL的IL-2(诺华，瑞士巴塞尔)，T细胞通过 T细胞转导激活剂 试剂以 个细胞 的细胞密度激活(美天旎生物技术公司，德国贝吉施格拉德巴赫)(称为方案B)。
对于这两个方案，T细胞在第0天被激活，并在 和 孵育长达8天。从第3天到第8天，使用细胞计数板监测T细胞数量，通过台盼蓝染色监测细胞活力，并通过流式细胞术监测T细胞亚群。通过添加新鲜培养基将细胞密度调整至 个细胞 。
KG-1和K-562细胞(均来自德国不伦瑞克的德国微生物保藏中心)在补充有10%热灭活胎牛血清 的RPMI1640培养基中培养。
用于 细胞表征的流式细胞术
为了评估T细胞分离的质量，细胞用抗CD45-V500、抗CD3-FITC、抗CD4-APC-H7、抗CD8a-PE、抗CD19-APC、抗CD14-PerCP和抗CD56-PE-Cy7抗体(美国富兰克林湖的贝克顿·迪金森公司)进行荧光染色。为了监测T细胞亚群(第3天至第8天)，细胞用抗CD3-FITC、抗CD4-BV510、抗CD8-PE-Cy7、抗CD127-AlexaFluor®647、抗CD25-PE、抗CD69-APC-H7和抗LAG-3-BV421抗体(美国富兰克林湖的贝克顿·迪金森公司)进行荧光染色。简要地说，收集细胞，洗涤，重悬于pH 7.4的 磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并在 下与抗体孵育 。抗体孵育后，细胞用PBS洗涤，在测量前用7-氨基放线菌素(7-AAD)试剂 孵育，并如下所述通过流式细胞术进行分析。
所有细胞均使用BD FACSCanto™ II(美国富兰克林湖的贝克顿·迪金森公司)通过流式细胞术进行分析。基于7-AAD荧光和散射信号将死细胞和细胞碎片排除在分析之外。使用Kaluza流式细胞术分析软件(美国布雷亚的贝克曼库尔特公司)进行分析。
mRNA转录本
一种编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的报告信使核糖核酸(mRNA)，包括5-甲氧基尿苷(5-moU)碱基修饰、CleanCap"帽1结构和聚腺苷酸(poly(A))尾，作为完全加工的mRNA从美国圣地亚哥的TriLink公司购买。嵌合抗原受体mRNA(CAR-mRNA)通过体外转录(IVT)合成，使用从编码第二代抗CD123嵌合抗原受体±绿色荧光蛋白(Creative Biolabs，美国纽约)的质粒DNA经聚合酶链式反应(PCR)产生的含T7启动子的DNA构建体作为模板。mRNA构建体的示意图见补充图S5。根据制造商的说明，使用高产T7 RNA合成试剂盒(德国耶拿的Jena Biosciences公司)，在 条件下使用T7 RNA聚合酶将1μg模板DNA转录为RNA，反应 。对于mRNA修饰，将 尿苷 -三磷酸(UTP)替换为等量的1- -甲基假尿苷(m1Ψ)5’-三磷酸(德国耶拿的Jena Biosciences公司)。通过使用 CleanCap Regent AG(3 OMe)(美国圣地亚哥的TriLink公司)在转录过程中对IVT mRNA进行加帽。随后，通过在 条件下加入2 U脱氧核糖核酸酶(DNase) 来去除DNA模板。纯化后， mRNA用 大肠杆菌聚腺苷酸聚合酶和补充有核糖核酸酶抑制剂的 腺苷 -三磷酸(ATP)在 条件下处理 。通过NucleoSpin RNA Clean-up试剂盒(德国迪伦的Macherey-Nagel公司)从反应混合物中分离出m1Ψ修饰的mRNA，并按照制造商的建议在无核酸酶水中洗脱。使用Nanodrop 2000c分光光度计(美国沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)测定RNA浓度。通过含有0.3%过氧化氢 的琼脂糖凝胶电泳分析加帽和聚腺苷酸化的mRNA。
瞬时转染和嵌合抗原受体表达分析
在第7天，使用4D-Nucleofector™ X Unit和P3原代细胞4D X试剂盒L(美国沃克维尔的Lonza公司)将扩增的T细胞用抗CD123嵌合抗原受体±绿色荧光蛋白mRNA进行瞬时转染。为了优化电穿孔参数，使用市售的EGFP-mRNA和抗CD123嵌合抗原受体+绿色荧光蛋白，而在培养基测试时，使用不含绿色荧光蛋白的抗CD123嵌合抗原受体。总共 个细胞重悬于 - Nucleofector溶液中，与6μg mRNA混合，转移至Nucleocuvetter中，在定义的脉冲编码下进行电穿孔(见补充图S4、S6)，重悬于各自培养基的 中，并在24孔板中于 和 条件下培养。
转染后24小时，使用针对小鼠IgG-F( 片段的AlexaFluor®647偶联山羊 抗体(美国西格罗夫的杰克逊免疫研究实验室)测量CAR表达水平。这种染色方法能够独立于其靶抗原检测CAR中的scFv在细胞表面的表达，因此可作为一种通用的CAR检测方法 。因此，收集细胞，洗涤后，重悬于 PBS中，在 与 -山羊抗小鼠IgG抗体孵育 ，用 PBS洗涤，然后使用流式细胞术进行分析。
第8天(转染后24小时)的CAR-T功能测试(杀伤试验)
使用CellTrace™ Violet细胞增殖试剂盒(美国沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)按照制造商的说明书对CD123+(KG-1)和CD123 (K-562)靶细胞进行染色，并在 和 以不同的效应细胞:靶细胞(E:T)比例(2:1、1:1、0.5:1)与抗CD123-CAR-T效应细胞共培养 。仅在补充有 热灭活胎牛血清 的RPMI 1640培养基中培养的靶细胞用作阴性对照，而在培养基 中用0.2%吐温20溶液处理的靶细胞用作阳性对照。共培养 后，收获细胞并与7-AAD孵育。通过流式细胞术监测CellTrace™ Violet染色的靶细胞群体中7-AAD标记的死细胞来确定靶细胞杀伤情况。
数据可用性
作者声明，支持本研究主要发现的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。
收到日期:2023年3月21日；接受日期:2023年10月17日
在线发表日期:2023年10月24日
参考文献
1. Watanabe, N., Mo, F. & McKenna, M. K. Impact of manufacturing procedures on CAR T cell functionality. Front. Immunol. 13, 876339. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.876339 (2022).
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培养基,mRNA-CAR-T,原代T细胞,CM-138
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