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用纸上色谱法对嘌呤、嘧啶和核苷进行定量分离

发布时间：

2025-04-17 10:55

用纸上色谱法对嘌呤、嘧啶和核苷进行定量分离

作者:罗林·D·霍奇基斯

(来自纽约洛克菲勒医学研究所医院)(1948年3月10日收到发表)

自康斯登、戈登和马丁首次描述(1)以来，许多研究人员已成功地利用有机溶剂在滤纸中迁移的方法分离氨基酸混合物。每种氨基酸在均匀迁移的溶剂中以或多或少界限分明的斑点形式移动，在干燥的滤纸上，这些斑点可通过与茚三酮发生显色反应而显现出来。本文报道了通过正丁醇( -butyl alcohol)在纸条上的边界移动来分离核酸中含有的嘌呤和嘧啶以及几种相关化合物的方法。维舍尔和查加夫(2)描述了在喹啉 - 可力丁混合物的流动体系中从核酸中分离鸟嘌呤和腺嘌呤这两种碱基的主要步骤。在形成不溶性汞盐并在稀酸中洗涤后，通过硫化汞沉淀在滤纸上确定这些嘌呤的位置。完全去除喹啉和可力丁后，可以通过它们在紫外区域的吸收最大值来鉴定鸟嘌呤和腺嘌呤。

下述方法的优点如下:(a)微克级的胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤这五种碱基可以完全相互分离。(b)通过将滤纸切下部分浸泡在水中制备溶液，然后进行紫外分光光度检测来确定分离出的物质。(c)使用的有机溶剂不干扰紫外分光光度法。(d)各成分的回收率基本是定量的，误差在10%或更小。(e)提供了分光光度纯度标准，这使得能够鉴定每种成分，并且(f)可以相当准确地测定二元混合物的组成，这些二元混合物可能是由于迁移距离不够远而未能实现完全分离所产生的。(g)可以检测1微克( )或更少的核酸在部分酶解或酸解过程中其含氮碱基的释放速率。(h)一些简单的衍生物如核苷可以在该方法中得到纯化和鉴定。(i)对于溶解度较低的物质或稀溶液，可以通过将较大体积的溶液蒸发到滤纸上局部加热的小斑点上来使用。

该方法的某些方面仍不尽如人意或存在缺点:(a)鸟嘌呤在丁醇中迁移不明显，因此它会与未水解的核酸、核苷酸或其他醇不溶性物质一起留在起始斑点处。因此，不使用第二种溶剂时，只能从某些简单混合物或完全水解的材料中分离出纯的鸟嘌呤。(b)如果存在苯丙氨酸(可能还有色氨酸，但不是酪氨酸)，它可能会在滤纸上胞嘧啶所在的区域出现。可以通过茚三酮显色反应或对馏分进行分光光度研究来识别其存在。虽然某些合成酚类和芳香酸也会产生干扰，但可能很少有天然产物会如此。(c)与其他纸上色谱法一样，大量的物质甚至某些外来物质往往会使分离效果变差。(d)滤纸含水量的变化或其他不确定因素使得很难准确预测分离出的化合物的位置；另一方面，相对位置和相对流速则始终是可重复的。

上述提到的一些缺点最终可能通过使用连续的溶剂或不同的初始溶剂来克服。所描述的方法有望在核酸及其成分和衍生物的组成定量研究以及它们的酶解或水解降解方式的研究中发挥作用。

实验部分

仪器大多数色谱图是在一个派热克斯玻璃圆筒中展开的，圆筒顶部有一个带凸缘的铝环，该铝环与圆筒紧密贴合，作为支撑黄铜臂的部件，黄铜臂上水平放置着圆柱形玻璃槽和玻璃杆分隔器，长度约为。在铝环的平面上表面放置一块玻璃板，形成一个封闭系统。早期的实验是在一个普通的玻璃和金属水族箱中成功进行的，水族箱一端着地，侧面用玻璃板封闭。在这个腔室中，一个木质和金属的环形支架支撑着一个矩形的玻璃染色皿盖，该盖子用作槽。观察发现，所使用的金属在两个腔室中均未引起任何干扰；然而，木材会因溶剂蒸汽而膨胀并饱和，因此在使用多种有机溶剂的系统中不应使用木材。

体积大于的溶液被滴在滤纸的一小片区域上，通过将滤纸条弯曲在一根水平玻璃管上进行局部加热，玻璃管直径为，该玻璃管连接在一个装有沸水的烧瓶和一个回流冷凝器之间。液体样品通过一个校准过的毛细管移液管(3)滴加，在干燥过程中不时将移液管接触滤纸。没有迹象表明滤纸的局部干燥会影响嘧啶、嘌呤或氨基酸的分离效果。

溶液以3毫升的量在DU型贝克曼光电石英分光光度计中进行检测。

材料——所用的滤纸是沃特曼1号滤纸，这是氨基酸测定推荐使用的滤纸(1)。如下面所讨论的，这种滤纸的水提取物在紫外区的吸收极低。在本文报道的所有工作中，均使用正丁醇( -Butanol)作为有机溶剂。腔室底部覆盖着等量的丁醇和水，通过加入浓氨水使水相中的气态氨浓度达到约2.5%。槽中装有在当时室温下被水饱和的丁醇，未添加氨。

每种主要碱基都使用了两批样品:来自霍夫曼 - 拉罗什公司(瑞士巴塞尔)的腺嘌呤、鸟嘌呤和尿嘧啶，由A. 克劳德博士慷慨提供；来自施瓦茨实验室(美国纽约)的硫酸腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和酵母核酸；来自伊士曼柯达公司(美国罗切斯特)的尿嘧啶和酵母核酸；来自多尔蒂化学品公司(美国纽约里士满山)的胞嘧啶。此外，还使用了已故P. A. 莱文博士实验室制备的胸腺嘧啶、胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺苷、胞苷、鸟苷和胸苷的结晶样品。脱氧核糖核酸是根据米尔斯基的方法(4)从小牛胸腺中制备的。

将一定重量的纯碱基溶解在水中，必要时将其pH值中和至约7，然后通过凯氏定氮法准确测定其浓度。从这些溶液中获得纯碱基的标准曲线，并制备用于分离的混合物。由于核苷的量不足以进行氮分析；因此，对于这些物质，相对吸收数据比绝对吸收数据更可靠。

本文中所有基于绝对重量的计算均指无水游离碱基。

核酸在高压灭菌器中于的条件下在盐酸水溶液中水解2小时。随后通过真空蒸发至干除去酸，将水解产物溶解在少量水中，并用氢氧化钠或氢氧化铵中和。

纸色谱图的制备——待研究的溶液点在纸条一端约处横向画的铅笔“起始线”上分布的斑点或条带上。斑点在流动方向上较窄( 或更窄)，但沿起始线分布的距离应使每毫米长度大约承载 (最好不超过 )的单个碱基。这里描述的大部分工作是在毫米宽的纸条上进行的，纸条上有三到四个初始斑点，大小约为至，间隔至少。按照上述方式将溶液点在铅笔标记的这些斑点上。这样的斑点可以承载 20 至的单个碱基或核酸的降解产物。

——将纸条的一端插入玻璃槽中，并用一根大玻璃棒压住，使靠近这一端的起始线刚好位于纸条在玻璃棒分隔物上弯曲并向下突出的位置。纸条就位且如前所述在层析室底部加入丁醇 - 水后，将室温下被水饱和的 - 丁醇加入槽中，然后关闭层析室。在圆筒周围放置一层瓦楞纸套，以保护其免受气流影响，避免暴露在散热器或窗户附近，因为这些情况会对未受保护的系统产生灾难性影响。

在约的温度下放置 16 至 24 小时后，标记丁醇前沿的位置，取出纸条并倒挂晾干。此时可以将各个“泳道”切开，分别用茚三酮等进行处理，或分别切割纸条片段。

现在在修剪板上或用剪刀以选定的连续间隔(如每 )从每个泳道上切下横向片段。该方法的精度通常允许切出窄至 5 毫米的片段，在空白区域，20 或宽的片段较为方便。将每个切下的片段放入干净的试管中，然后在 3.5 毫升蒸馏水中浸泡 1 小时或更长时间。在这项工作中，可以用手触摸纸条，但最好尽量减少这种接触。

在分光光度计中测定洗脱溶液在处的吸光度。将此吸光度与从起始线(到片段中点)移动的距离相关联的图表或表格显示出一系列与从原始混合物中分离出的成分相对应的吸收峰。图 1 和图 2 以及表 I 展示了典型数据。可以看出，每个混合物中几种物质的存在情况清晰可见。

通过对各种洗脱溶液进行更详细的分光光度检查来确定分离物质的身份。在下面要描述的工作中，将 3 毫升这些溶液放入石英比色皿中，根据需要进行检查，要么在近似中性状态下，要么在加入的碱或酸之后。为了达到后一种目的，加入 (常规工作中为 1 滴)的氢氧化钠，如有需要，随后加入 (或 1 滴)的 (或浓)盐酸。

以下将操作步骤按照四个目标进行分组:(a) 通过研究在吸收峰位置或附近获得的溶液的同一性和纯度，对该方法或新溶剂等进行严格测试；(b) 对在峰附近分离出的物质进行常规鉴定；(c) 对在吸收峰之间的低点处获得的纯溶液或二元混合物进行定量组成测定的常规程序；(d) 对碱基混合物进行完全定量分析。

图 1. 已知碱基在纸色谱图中的分布

图2. 胸腺脱氧核糖核酸在条件下于盐酸中水解2小时后碱基的分布。

分离出的主要成分的鉴定——那些在处具有高吸收值的洗脱溶液可进一步研究以确定其成分。为了在本研究中证明可以从核酸水解物和已知混合物中回收纯的嘧啶和嘌呤，使用贝克曼分光光度计以为间隔测定了220至的吸收曲线。图3至图5给出了纯碱基标准样品的标准曲线以及从纸条上回收的典型样品的曲线。标准碱基和回收碱基的数据高度吻合，表明所分离的物质基本上不含其他紫外吸收物质。下面将更详细地讨论鸟嘌呤(guanine)的情况。

表I

嘧啶和嘌呤在丁醇 - 纸色谱中的位置

物质	纸张中80%分布范围				所有实验的平均值(300 - 350毫米)
物质	已知混合物I	已知混合物II	酵母核酸水解物	胸腺核酸水解物	所有实验的平均值(300 - 350毫米)
	.	毫米	毫米	毫米
溶剂前沿	377	310	360	360
胸腺嘧啶	205-223	167-184		172-188	0.54
腺嘌呤	176-195	138-159	143-163	141-161	0.45
尿嘧啶		107-123	109-132		0.35
胞嘧啶	98-115	81- 96	82- 97	66- 97	0.26
鸟嘌呤	0	0	0	0	0.0
		已知混合物IV	已知混合物V	已知混合物VI
溶剂前沿	377	340	340	351
胸腺嘧啶脱氧核苷			160-183		0.51
腺苷		96-113			0.33
胞苷	56- 77		35- 61		0.16
鸟苷	35-50	22- 41			0.10
鸟嘌呤脱氧核苷				65- 84	0.21
黄嘌呤					0.01
次黄嘌呤					0.18

. 碱基每移动的距离；溶剂通过起始线的移动距离；最大偏差，。分布的定量范围，按后文所述方法确定。

在鉴定碱基和测定其纯度时，将定量数据以相对于在吸收最大值处任意设定为 1.0 的峰值光密度的比率为基础进行处理已被证明是有用的。该最大值通常在左右，在范围内测定，所有光密度值都除以在该波长处测得的值。以这种形式表达结果便于比较在浓度差异很大的情况下获得的曲线。使用所采用的分光光度计，只要峰值吸收在 0.15 至 1.50 光密度单位之间，这些曲线就足以用于鉴定常见的嘌呤和嘧啶。当总吸收较低时，进行下面提到的空白校正就变得更为重要。

图 3. 中性溶液中腺嘌呤和胸腺嘧啶的相对吸收曲线

表 II 汇总了五种碱基在中性、碱性和酸性溶液中的相对吸收数据，以及某些相关化合物的类似标准数据。这些标准值与根据文献(5 - 7)中可用曲线尽可能准确估算的值大致相符。还给出了单位浓度的绝对吸收值，用于根据吸收测量值计算碱基的绝对重量。还给出了碱性和酸性溶液中最大值与中性最大值的比率，表明了在不同酸度下吸收强度的变化。这些变化在某些情况下具有高度特征性，从文献来看似乎并不广为人知。

不仅如图 3 至图 5 所示，中性溶液中纯正碱基和回收碱基的吸收对应关系通常令人满意，而且在碱性或

图 4. 中性溶液中尿嘧啶和胞嘧啶的相对吸收曲线

酸性溶液(此处未显示)的数据中也发现了同样良好的一致性。单独回收的鸟嘌呤纯度不高，尽管它很容易被识别。毫无疑问，部分困难源于鸟嘌呤在正丁醇流动流中的不移动性，使得它往往会与未水解的核苷酸或水解产物中可能少量存在的炭化分解产物留在同一馏分中。无论如何，由于鸟嘌呤在水中极难溶解，只会遇到少量的鸟嘌呤；简单的过滤或离心就足以回收中和水解产物中大部分的鸟嘌呤。

在精确工作中，需要对吸收测量值进行空白误差校正，例如比色皿吸收和溶剂处理过的纸张空白部分洗脱液的吸收。对于上述纸张，后一种校正值从处的 0.01(光密度单位)到处可能为 0.03(对于从条带切下的片段)，因此在通常的常规工作中可以忽略。这显然是由于在紫外范围内末端吸收较低的物质造成的，并且正丁醇前沿通过纸张对其没有实质性影响。事先用水洗涤纸张在一定程度上可以降低这种影响，但不建议这样做，因为不均匀干燥似乎会导致纸张质地和毛细管特性发生局部变化。

图 5. 中性和碱性溶液中鸟嘌呤的相对吸收曲线

刚刚提到的这类空白误差以及 pH 值的波动往往会使标准曲线在 220 至范围内的重现性稍差，即使是使用纯正样品也是如此；因此，在光谱的这一部分进行的比较不会被过分重视。

在图2中，标记为“表胞嘧啶(epicytosine)”的次要成分有所显示，其迁移速率略大于胞嘧啶。在小牛胸腺脱氧核糖核酸制剂的酸水解产物的色谱图谱中，这个小峰反复出现。该物质的吸收特性在酸、碱等条件下的变化方面与胞嘧啶相似；然而，该组分与胞嘧啶不同，且显然不是尿嘧啶。虽然它可能是酸 - 高温水解的副产物，但其在不同酸浓度下都持续出现，这表明它可能是核酸中预先存在的一种碱基成分。在这方面，值得指出的是，约翰逊(Johnson)和科吉尔(Coghill)报道5 - 甲基胞嘧啶是结核杆菌脱氧核糖核酸的一种成分(8)。此外，确实，表胞嘧啶在吸收光谱和在丁醇中的迁移率方面与胞嘧啶的关系，和胸腺嘧啶(5 - 甲基尿嘧啶)与尿嘧啶的关系相同。在对表胞嘧啶进行进一步研究之前，不能再说更多了。

表二

嘌呤和嘧啶的标准紫外吸收数据

波长，	胸腺嘧啶(Thymine)			腺嘌呤(Adenine)			尿嘧啶(Uracil)
波长，	羟基(OH)			羟基(OH)			羟基(OH)		H
310	0.25	0	0	0	0	0	0.03	0	0
300	0.77	0	0	0	0	0	0.32	0	0
295	0.94	0.02	0.025	0.005	0	0	0.63	0	0
290	1.00	0.10	0.10	0.015	0	0.03	0.885	0	0.01
285	0.985	0.275	0.275	0.12	0.03	0.15	1.00	0.04	0.05
280	0.96	0.51	0.51	0.48	0.12	0.37	0.99	0.17	0.185
275	0.92	0.74	0.75	0.77	0.30	0.60	0.93	0.42	0.42
270	0.87	0.92	9.925	1.00	0.675	0.85	0.85	0.675	0.68
265	0.80	1.00	1.00	0.995	0.88	0.98	0.77	0.90	0.90
260	0.70	0.955	0.955	0.87	1.00	1.00	0.68	1.00	1.00
255	0.575	0.835	0.835	0.685	0.915	0.935	0.58	0.97	0.98
250	0.465	0.66	0.665	0.515	0.765	0.765	0.475	0.84	0.845
245	0.42	0.485	0.49	0.39	0.59	0.59	0.39	0.66	0.665
240	0.475	0.335	0.345	0.31	0.43	0.42	0.38	0.465	0.48
235	0.69	0.245	0.255	0.31	0.295	0.285	0.49	0.305	0.32
230	1.07	0.27	0.285	0.52	0.21	0.215	0.74	0.21	0.23
225	1.55	0.445	0.46	1.02	0.18	0.24	1.12	0.23	0.24
220	2.3	0.72	0.735	1.6	0.29	0.355	1.8	0.42	0.42
最大值/最大数量(Max./Nmax.)	0.67	(1.0)	0.985	0.89	(1.0)	0.96	0.745	(1.0)	1.00
		59			105			72
	胞嘧啶(Cytosine)			鸟嘌呤(Guanine)			胸腺嘧啶脱氧核苷(Thymine desoxyriboside)
310	0.005	0	0	0	0	0.01	0	0	0
300	0.13	0.005	0.045	0.04	0.07	0.08	0.02	0.01	0.02
295	0.385	0.025	0.20	0.215	0.18	0.18			0
290	0.68	0.085	0.475	0.44	0.35	0.32	0.145	0.19	0.20
285	0.895	0.26	0.73	0.70	0.54	0.44	0.345	0.40	0.395
280	1.00	0.555	0.96	0.90	0.7	0.54	0.60	0.64	0.64
275	0.94	0.82	1.00	1.00	0.75	0.60	0.83	0.855	0.85
270	0.79	0.98	0.95	0.97	0.7	0.62	0.97	0.975	0.975
265	0.62	1.00	0.805	0.875	0.68	0.65	1.00	1.00	1.00
260	0.47	0.93	0.62	0.775	0.71	0.73	0.925	0.92	0.915
255	0.36	0.80	0.45	0.72	0.845	0.90	0.80	0.775	0.775
250	0.31	0.72	0.30	0.68	0.975	1.00	0.685	0.60	0.60
245	0.35	0.72	0.19	0.67	1.00	0.99	0.645	0.435	0.44
240	0.525	0.80	0.135	0.67	0.895	0.86	0.70	0.305	0.315
235	0.795	0.93	0.145	0.71	0.71	0.68	0.855	0.24	0.25
230	1.06	1.05	0.23	0.9	0.52	0.52	1.09	0.29	0.305
225	1.25	1.2	0.425	1.6	0.41	0.44	1.3	0.46	0.48
220	1.6	1.3	0.69		0.51	0.51	1.8	0.68	0.70
最大值/最大数量(Max./Nmax.)	1.10	(1.0)	1.60	0.87	(1.0)	1.18	0.775	(1.0)	1.00
		53			40			36

表二 - 完

波长，	鸟嘌呤脱氧核苷(Guanine desoxyriboside)			鸟嘌呤核苷(Guanine riboside)			胞嘧啶核苷(Cytosine riboside)
波长，	羟基(OH)			羟基(OH)			羟基(OH)
310	0	0	0.01	0	0	0.02	0	0	0.01
300	0	0.01	0.135	0.01	0.02	0.145	0.04	0.07	0.21
295	0.02	0.075	0.29
290	0.09	0.22	0.45	0.095	0.15	0.455	0.31	0.41	0.745
285	0.305	0.42	0.59	0.305	0.43	0.585	0.59	0.675	0.935
280	0.60	0.58	0.665	0.595	0.575	0.655	0.825	0.88	1.00
275	0.845	0.665	0.69	0.835	0.665	0.685	0.975	1.00	0.96
270	0.97	0.715	0.71	0.96	0.71	0.72	1.00	0.98	0.84
265	1.00	0.75	0.795	1.00	0.75	0.82	0.93	0.89	0.67
260	0.99	0.86	0.935	0.99	0.86	0.965	0.81	0.765	0.495
255	0.96	1.00	1.00	0.965	0.995	1.00	0.725	0.655	0.34
250	0.86	0.995	0.945	0.87	1.00	0.92	0.705	0.60	0.225
245	0.71	0.895	0.785	0.70	0.895	0.74	0.74	0.60	0.155
240	0.54	0.695	0.585	0.55	0.68	0.54	0.81	0.625	0.14
235	0.42	0.475	0.40	0.44	0.475	0.36	0.88	0.675	0.185
230	0.40	0.30	0.26	0.43	0.31	0.25	0.925	0.75	0.31
225	0.61	0.205	0.24	0.66	0.22	0.27	0.99	0.815	0.50
220	1.4	0.21	0.38	1.6	0.25	0.45	1.3	0.91	0.68
最大值/最大数量(Max./Nmax.)	0.83	(1.0)	0.885	0.85	(1.0)	0.905	0.95	(1.0)	1.36
		44			41			30
	腺嘌呤核苷(Adenine riboside)			黄嘌呤(Xanthine)			次黄嘌呤(Hypoxanthine)
310				0.06	0	0	0	0	0
300	0	0	0	0.41	0.01	0	0.01	0.01	0.01
295				0.67	0.04	0	0.04	0.03	0.03
290	0	0.01	0.05	0.89	0.12	0.04	0.08	0.06	0.06
285				1.00	0.31	0.16	0.15	0.12	0.09
280	0.16	0.165	0.23	0.98	0.59	0.39	0.31	0.18	0.14
275	0.39	0.38	0.42	0.86	0.86	0.66	0.60	0.29	0.20
270				0.70	1.00	0.91	0.84	0.43	0.32
265	0.92	0.90	0.89	0.54	0.98	1.00	1.00	0.58	0.50
260	1.00	1.00	0.995	0.43	0.86	0.97	1.00	0.75	0.70
255	0.94	0.95	1.00	0.42	0.68	0.82	0.91	0.91	0.90
250	0.775	0.805	0.84	0.48	0.53	0.64	0.75	1.00	1.00
245	0.57	0.60	0.635	0.53	0.41	0.48	0.60	0.95	0.98
240	0.40	0.42	0.44	0.57	0.36	0.41	0.46	0.79	0.86
235	0.275	0.27	0.29	0.61	0.37	0.46	0.40	0.59	0.66
230	0.24	0.18	0.23	0.78	0.39	0.51	0.48	0.40	0.46
225	0.34	0.17	0.31	1.4	0.42	0.52	0.90	0.29	0.30
220	0.8	0.37	0.58	2.8		0.52	1.8		0.23
最大值/最大数量(Max./Nmax.)	1.00	(1.0)	0.95	1.00	(1.0)	1.02	1.00	(1.0)	1.06
		54			.			.

和分别指碱性、中性和酸性溶液；吸收值是相对于设定为的最大值的比率。将这些最大值与中性最大值相关联；在时每立方厘米是绝对标准在处的中性吸收。

另一个偶尔被注意到的异常现象是“表鸟嘌呤(epiguanine)”的出现，它的迁移速度约为胞嘧啶的 0.7 倍，并且具有类似于鸟嘌呤的双带光谱。这种物质被认为是鸟嘌呤的衍生物，可能是在某些脱氧核糖核酸制剂水解过程中形成的一种副产物。

主要成分的常规鉴定——为了对分离出的组分进行不太严格的鉴定，可利用吸收光谱中几个选定位置的吸收特征。用于区分碱基的特征见表三。再次强调，鸟嘌呤的吸收对的微小波动有响应；因此，该碱基的定量数据不太容易重现。

吸收峰之间二元混合物组成的测定——在某些峰之间的区域，洗脱液在处的吸光度可能低至 0.10 或更低，用此前所述的方法鉴定如此少量的碱基是不可能的。此外，如果溶剂迁移距离不够远，或者纸段切得太宽，这些区域可能含有少量来自所讨论斑点两侧吸收峰的两种单个碱基。如果需要有关这些较弱溶液的信息，可以进行定量分析，其依据是假设它们除了这两种碱基中的一种或两种之外，不含有其他紫外吸收物质。

根据表二中的数据，可以推导出任意两种碱基在任意两个波长处的联立方程。然而，由于这种计算的准确性取决于两种组分吸收贡献的最大差异，因此某些波长比其他波长更有用。简而言之，利用以下事实:加入碱后，胸腺嘧啶或尿嘧啶的吸收向更长波长方向移动的距离比腺嘌呤远得多，并且在中性溶液中，尤其是在酸性溶液中，胞嘧啶的吸收比尿嘧啶向更长波长方向延伸得更远。

在接下来的计算中，总绝对吸收(已校正纸和比色皿空白)用表三中使用的符号表示。为给定组分计算的部分吸收进一步通过

表三

单个嘌呤和嘧啶的特征吸收值

				其他特征
胸腺嘧啶(Thymine)	0.74	0.56	1.03	. 在
腺嘌呤(Adenine)	0.34	0.36	0.05	; 羟基(OH)位移小，在尿嘧啶或胸腺嘧啶中
尿嘧啶(Uracil)	0.46	0.32	0.89	. 在
胞嘧啶(Cytosine)	0.82	1.46	0.68	或 ; 向长波移动
鸟嘌呤(Guanine)	1.1	0.52	0.50	2个吸收带，和 ; 对敏感
胸苷(脱氧核糖苷，Thymidine (desoxyriboside))	0.85	0.67	0.24	与胸腺嘧啶相似，只是位移较小;
腺苷(Adenosine)	0.42	0.32	0.02	与腺嘌呤相似，但不受碱的影响
胞苷(Cytidine)	1.12	1.25	0.37	与胞嘧啶相似，只是向短波移动;
鸟苷(Guanosine)	0.88	0.35	0.16	与鸟嘌呤相似，只是位移较小
鸟嘌呤脱氧核糖苷(Guanine desoxyriboside)	0.89	0.34	0.16	与鸟苷相似
黄嘌呤(Xanthine)	0.87	0.93	0.91
次黄嘌呤(Hypoxanthine)	0.50	0.42	0.26
2 - 氨基尿嘧啶(异胞嘧啶，2-Amino uracil (isocytosine))	1.07	0.26	0.32

和分别指在碱性、中性和酸性溶液中的绝对吸光度；下标表示最大或最小吸光度对应的波长(单位为 )。

相关物质的下标首字母。因此，表示在波长下碱性溶液中由胸腺嘧啶(thymine)引起的那部分吸光度。

(a) 胸腺嘧啶 - 腺嘌呤混合物 - 对于这一对物质，在碱性溶液中于 290、280 和波长处测定吸光度(中性溶液中波长处的吸光度已已知)。

由于，且可忽略不计，以及 (根据假设)。作为对这些计算值的验证，计算，并将此计算值与在波长处观测到的总(校正后)吸光度进行比较。由于目的是确定在波长处的部分吸光度，使用以下因子 : 和。这些值的总和应非常接近观测到的(校正后) ；但即使它与后者略有偏差，该比率可能也能相当准确地确定两种物质的比例。如果仅存在一种物质，另一种物质的值将是一个非常小的正值或负值。一个较大的负值表明存在基础假设中未考虑到的杂质。

(b) 腺嘌呤 - 尿嘧啶混合物 - 该过程与刚刚讨论的混合物相同，只是数值系数不同。在碱性溶液中于 290、280 和波长处进行读数。我们得到。通过在、处进行比较进行验证，并计算回中性溶液，，并且和之前一样，。

(d) 鸟嘌呤 - 核苷酸混合物 - 在起始斑点中剩余的物质里，鸟嘌呤是其吸光度会因碱而发生偏移的主要物质。加入碱后在处吸光度的增加量大致约为的15%。

(e) 其他混合物 - 胸腺嘧啶和尿嘧啶在滤纸上的位置并不接近，实际上在自然界中似乎也并非紧密关联，但如有必要，可在碱性溶液中的处将它们区分开来。

腺苷(腺嘌呤核糖核苷)可能会出现在滤纸上靠近尿嘧啶的位置。它可以像腺嘌呤本身那样与尿嘧啶区分开来，并且由于其在265至范围内在碱中吸光度无变化，可与腺嘌呤区分开来。

胸苷(胸腺嘧啶脱氧核苷)在 - 丁醇中的迁移位置与胸腺嘧啶非常接近。该核苷的吸光度几乎不受碱的影响，可根据混合物中几乎完全来自游离胸腺嘧啶这一事实进行估算。

鸟苷和胞苷的吸收光谱与其母体碱基非常相似，但在滤纸上与它们的位置明显分开。尿苷尚未进行研究。

^[1]

(f) 结果 - 将上述方程应用于实际纸条实验中遇到的混合物，得到了表IV所示的结果。可以看出，几种混合物可以根据两个部分吸收光谱进行分析，这使得能够成功预测另一个参考波长处的吸光度值。图1和图2中的虚线曲线基于其他情况下的类似分析。可以指出的是，表IV中描述的溶液每立方厘米含有0.6至 (平均 )的总碱基。

表IV

稀二元混合物的定量分析

光密度	胸腺嘧啶 - 腺嘌呤混合物			尿嘧啶 - 腺嘌呤混合物
	混合物I	混合物II	混合物III	混合物I	混合物II	混合物III
数据	0.006	0.008	0.058	0.053	0.019	0.000
数据	0.195	0.072	0.051	0.067	0.063	0.059
结果	0.190	0.066	0.005	0.021	0.046	0.059
	0.005	0.006	0.046
				0.046	0.017	0.000
检查
计算所得	0.097	0.039	0.058	0.069	0.044	0.028
观察所得	0.099	0.042	0.057	0.072	0.046	0.028
计算所得	0.222	0.085	0.088	0.104	0.082	0.066
观察所得	0.222	0.092	0.086	0.105	0.081	0.063
	胞嘧啶 - 尿嘧啶混合物
	混合物I		混合物II		混合物III
数据	0.089		0.043		0.005
数据	0.163		0.172		0.100
结果	0.151		0.071		0.007
结果	0.012		0.101		0.093
检查
计算所得	0.045		0.091		0.070
观察所得	0.052		0.085		0.076
计算所得	0.122		0.163		0.108
观察所得	0.114		0.159		0.108

这些数值分别代表校正后的光密度值。OH、N 和分别指碱性、中性和酸性溶液；表示碱性溶液在处的总吸光度；表示碱性溶液中腺嘌呤在处的部分吸光度；等等。

碱基的定量回收——由于在每种碱基的峰值吸收区域紧邻范围之外仅存在可忽略不计的碱基量，因此可通过累加该区域内的吸光度立即确定回收量。为此，最好如前所述，对所有可能为混合物的溶液进行分析。纯溶液的总吸光度与混合物中部分吸光度之和，即为若所有回收的碱基都存在于一份洗脱溶剂(在本研究中为 )中时所能获得的吸光度。这是一系列定积分的总和，不过，也可从平滑色谱图上相应峰下的面积来确定，但准确性要差得多。

表 V 展示了从承载单一化合物以及已知混合物的条带上回收碱基的情况。数值以无水碱基的微克数表示。有明确证据表明，回收基本上是定量的，误差可能在很大程度上是由于对纸张中存在的物质进行校正时存在一定的不确定性和可变性所致。

表 V

嘌呤和嘧啶的定量回收

制备分析		胸腺嘧啶(Thymine)	腺嘌呤(Adenine)	尿嘧啶(Uracil)	胞嘧啶(Cytosine)	鸟嘌呤(Guanine)
纯净物
	理论	90	89	94	91
	发现	79	93	92	86
混合物I	理论	84	52	66	84
混合物I	发现	81	50	65	79
混合物II	理论	72	71	75	72
混合物II	发现	67	69	73	69
. 酵母核酸水解 . 在条件下用盐酸
酸的当量浓度
0.4		0	123	7	9	125
0.7		0	112	11	9	125
2.4		0	112	54	18	140
6		0	132	117	52	125

核酸水解研究——作为该方法的一个实际测试，将等量的酵母核酸样品在条件下用不同浓度的盐酸进行水解。水解产物在真空条件下浓缩至干以除去盐酸，中和后，取已知量点样于滤纸上。用丁醇展开后，碱基的回收情况如表五所示。可以注意到，在酸浓度过低而无法释放出明显量的尿嘧啶或胞嘧啶时，游离腺嘌呤会迅速释放出来。在这种部分水解产物中可发现明显量的核苷。在较高酸浓度下，核苷的量减少，尿嘧啶，最后是胞嘧啶以游离形式出现。表五中所示的胞嘧啶最大回收量可能仍代表回收不完全。鸟嘌呤显然和腺嘌呤一样迅速以游离形式释放出来；否则，就会观察到移动速度约为胞嘧啶 0.4 倍的核苷。这些结果与已知的嘌呤核苷比嘧啶核苷更不稳定的情况相符。

^[2]

讨论

上述方法似乎提供了一种较为准确地估算核酸水解产物中组成性嘌呤和嘧啶碱基，可能还有核苷的方法。本文给出的分光光度标准使得能够确定回收碱基的身份和纯度，以及可能遇到的二元混合物的组成。在氨基酸的纸色谱分析中，这些目标远未达到同样的程度。然而，应该指出的是，即使是用于定性目的，本方法也可能有些繁琐，对一次分析的二十或三十个条带片段进行仔细的定量研究可能需要几个小时。此外，要对核酸制剂进行定量水解而不使碱基本身发生一些分解并非易事。如前所述，在某些脱氧核糖核酸制剂的水解产物中发现了两种异常碱基，其中一种被认为是鸟嘌呤的降解产物或其他人为产物。幸运的是，糖成分在水解前后对紫外吸收的贡献都很小。

无论如何，纸带上的定量分离应该能提供一种判断不同核酸中各个碱基比例是否不同的方法。此外，如果核酸在其核苷酸间连接的性质或排列上有所不同，那么在化学或酶促水解过程中各个碱基的释放速率可能会证明是存在的各种结合方式的特征。利用上述技术，对酶促水解过程中释放的残留部分和片段的研究(见(9))应该会更加方便。

自本手稿完成以来，维舍尔(Vischer)和查加夫(Chargaff)的一篇摘要(10)已发表，表明这些研究人员现在已将纸色谱法应用于嘧啶类的尿嘧啶和胸腺嘧啶。他们现在还使用不吸收紫外光的溶剂，并将该分离方法应用于核酸的定量分析。他们的方法无疑与本文报道的方法相当相似，尽管显然是在不同的水解产物和不同的溶剂中分别测定嘌呤和嘧啶。这些研究人员提到在酸水解过程中胞嘧啶会转化为尿嘧啶，而本实验室迄今尚未观察到这种现象，但目前他们在不同核酸水解产物方面的经验似乎更为丰富。

作者希望感谢玛格丽特·布罗菲(Margaret Brophy)耐心而尽责的协助，这对本方法的发展有很大帮助。