核小体占据在MLH1 CpG岛表观遗传沉默中的作用
发布时间：
2025-05-07 17:44
核小体占据在MLH1 CpG岛表观遗传沉默中的作用
Joy C. Lin， Shinwu Jeong， Gangning Liang， Daiya Takai， Merhnaz Fatemi， Yvonne C. Tsai， Gerda Egger， Einav Nili Gal - Yam， 以及Peter A. Jones
美国南加州大学凯克医学院泌尿外科、生物化学和分子生物学系，诺里斯综合癌症中心
美国加利福尼亚州洛杉矶市，南加州大学凯克医学院，邮编:90089
现地址:日本东京大学医院临床检验部，东京113 - 8655
现地址:美国国家环境卫生科学研究所分子致癌作用实验室
美国北卡罗来纳州研究三角园，邮编:27709
*通讯方式:jones_p@ccnt.usc.edu
DOI 10.1016/j.ccr.2007.10.014
摘要
一般认为，肿瘤抑制基因的表观遗传沉默涉及DNA胞嘧啶甲基化、组蛋白共价修饰和染色质浓缩。在这里，我们发现癌细胞中双向MLH1启动子CpG岛的三个转录起始位点的沉默与核小体占据的明显变化有关。在正常细胞的起始位点几乎完全不存在的三个核小体，出现在甲基化且沉默的启动子上，这表明表观遗传沉默可能是通过将核小体稳定地放置到先前空缺的位置来实现的。用5 - 氮杂 - 2’-脱氧胞苷进行去甲基化激活启动子涉及核小体的移除。肿瘤抑制基因的表观遗传沉默可能涉及由胞嘧啶甲基化促成的核小体占据的可遗传变化。
引言
岛通常出现在与癌症相关基因的转录起始位点，一直是大多数表观遗传沉默研究的重点。在正常细胞中，CpG岛与大量染色质具有不同的结构(Tazi和Bird，1990)。它们的特征是缺乏胞嘧啶甲基化、组蛋白H1水平低、组蛋白乙酰化水平高，并且对DNaseI高度敏感，这等同于无核小体区域(Mucha等人，2000；Pfeifer和Riggs，1991；Tazi和Bird，1990)。全基因组分析表明，许多常染色体基因在表达和不表达状态下通常都存在DNaseI敏感位点(Mito等人，2007；Sabo等人，2004)。在一个更具体的例子中，母本印记且受抑制的Igf2基因的起始位点未甲基化，并且与强烈表达的父本基因一样对DNaseI高度敏感(Sasaki等人，1992a)。这些以及其他数据(Davey等人，2004)表明， 岛潜在转录的“开放”或允许状态是有丝分裂可遗传的。因此，允许转录的启动子可能保持无核小体状态，使其能够通过结合适当的转录激活因子而被激活(Li等人，2007)。肿瘤生物学的一个核心目标是了解这种允许的染色质构象如何转变为永久抑制且不允许表达的状态的机制。
肿瘤抑制基因的 岛启动子起始位点最具特征的可遗传共价变化是异常的启动子甲基化(Herman和Baylin，2003；Jones和Baylin，2007)。人们已经花费了大量精力来研究其他表观遗传变化，如负责……的组蛋白共价修饰
意义
岛(CpG岛)通常在正常细胞中固有地处于“开放”状态，与表达无关，并且无甲基化，对染色质中的核酸酶切割敏感。癌症中的沉默涉及DNA甲基化以及染色质共价和结构变化，这些变化具有体细胞遗传性，并促成癌症表型。以MLH1 CpG岛为例，我们发现两种可遗传状态之间的转换涉及双向启动子三个起始位点处核小体的完全缺失或存在。因此，胞嘧啶甲基化可能最终通过甲基化DNA结合蛋白和其他染色质修饰因子的介导，使核小体稳定存在于癌症相关基因的起始位点，从而导致基因沉默。癌症中的异常基因调控。无活性、高甲基化的启动子与封闭或抑制性的染色质构象相关，其特征是组蛋白去乙酰化和多种无活性的组蛋白标记。例如，在结肠癌和乳腺癌细胞中，MLH1(Fahrner等人，2002；McGarvey等人，2006)和RASSF1A(Strunnikova等人，2005)的沉默与组蛋白H3去乙酰化和H3 - K9甲基化增加有关。本研究的目的是探索其他决定因素，如核小体占据在癌症中 岛(CpG岛)沉默中的作用，因为这在酵母、果蝇和人类的转录调控中已有涉及(Bernstein等人，2004；Heintzman等人，2007；Lee等人，2004；Lieb和Clarke，2005；Mito等人，2005；Ozsolak等人，2007；Yuan等人，2005)。
我们聚焦于MLH1，它是DNA错配修复系统中的关键参与者(Modrich和Lahue，1996)，在各种癌症中，它的启动子经常因高甲基化而沉默(Herman等人，1998；Kanaya等人，2003；Kane等人，1997；Murata等人，2002；Xiong等人，2001)。 ，我们确定它有两种转录本，1a和1b，它是一类双向基因对的成员，这类基因对在相反链上以头对头的方式转录，占人类基因的 (Adachi和Lieber，2002；Lavia等人，1987；Takai和Jones，2004；Trinklein等人，2004)。
直到最近，检测核小体定位的方法还依赖于只能揭示细胞群体中所有分子上给定启动子平均状态的技术。然而，我们能够通过使用基于甲基化酶的高分辨率单启动子分析测定法(MSPA)来分析单个分子的情况，从而深入了解染色质重塑的动态过程(Fatemi等人，2005；Gal - Yam等人，2006)。我们在几种细胞系中获得并经传统方法证实的结果显示，在活跃的MLH1启动子的每个起始位点上游，核小体显著缺失，而无活性的启动子与核小体占据相关，且这种占据方式具有有丝分裂遗传性。
我们还发现，用5 - 氮杂 - 2’-脱氧胞苷(5 - aza - CdR)进行去甲基化使基因重新激活时，核小体会从启动子分子上移除。因此，我们的结果有力地证明，肿瘤抑制基因的表观遗传沉默可能涉及将核小体插入先前空缺的位置。
结果
EPM2AIP1和MLH1基因的组织情况
人类3号染色体3p22.1区域的双向基因EPM2AIP1和MLH1位于一个CpG岛(CpG island)内，该CpG岛长 ，GC含量为 ，CpG观测/预期比值为0.80(Takai和Jones，2003)(图1A)。GenBank网站显示，这两个基因的转录起始位点相距470 bp。然而，对从LoVo结肠癌细胞中分离的mRNA进行的 -RACE分析(数据未显示)表明，MLH1有两个转录起始位点(1a和1b)，间距为 ，这个距离几乎可以容纳两个核小体，而EPM2AIP1仅在一个位点起始转录，该位点位于MLH1的第一个起始位点1a上游321 bp处(图1A)。研究发现，EPM2AIP1的起始位点比GenBank网站显示的更靠近MLH1(1a) bp；因此，这两个反向转录起始位点实际相距321 bp，这个距离也大约可以容纳两个核小体。双荧光素酶报告基因检测证实该启动子确实是双向的(见本文在线补充数据中的图S1)。
图1. 双向启动子的甲基化状态与EPM2AIP1和MLH1表达模式的相关性
(A)双向启动子和CpG岛。水平箭头表示通过 -RACE分析确定的转录起始位点，黑色方框表示各自的第一个外显子。黑色刻度线表示 二核苷酸。刻度线下的水平条代表CpG岛。
(B)通过甲基化敏感单核苷酸引物延伸法(Ms - SNuPE)分析EPM2AIP1/MLH1启动子区域中三个CpG位点的平均甲基化水平，并通过逆转录聚合酶链反应(RT - PCR)检测正常LD419人膀胱成纤维细胞系和各种人癌细胞系中这两个基因的表达。 -肌动蛋白( -ACTIN)的表达作为cDNA输入量的对照。RT作为无内含子基因EPM2AIP1的阴性对照。
双向启动子的内源性甲基化状态与EPM2AIP1和MLH1表达模式的相关性
为了确定双向启动子的甲基化状态与这两个基因表达之间的关系，我们在正常人成纤维细胞以及各种结肠和膀胱癌细胞系中使用了定量甲基化敏感单核苷酸引物延伸法(Ms - SNuPE)(Bender等，1999)和逆转录聚合酶链反应(RT - PCR)。正常人成纤维细胞LD419以及甲基化水平较低的细胞系(LoVo、HCT116、T24、J82、LS174T、LS123、HT29和SW620)均表达EPM2AIP1和MLH1的两种转录本(图1B)。相反，结肠癌细胞系SW48和RKO中没有产生任何转录本，这两个细胞系的启动子呈现高甲基化状态(分别为93%和95%，图1B)。用去甲基化剂5 - 氮杂 - 2’ - 脱氧胞苷(5 - aza - CdR)处理这两个细胞系(SW48和RKO)24小时(Jones和Taylor，1980)后， 甲基化水平降低，同时三种转录本均重新激活(图1B)。因此，双向启动子的内源性甲基化状态与这两个基因的表达模式高度相关，这与其他研究结果一致(Shu等，2006)。
在表达细胞中，MLH1启动子仅存在一个定位高度明确的核小体，而在不表达细胞中，该启动子被核小体占据
由于核小体定位和组蛋白尾部修饰在转录调控中起着至关重要的作用(Bernstein和Allis，2005；Rice和Allis，2001)，我们首先通过脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)超敏性分析研究了所有三个转录起始位点的染色质结构。用不同浓度的DNaseI处理LD419和RKO细胞的细胞核，以获得合适的消化水平(图2A)。
Southern印迹图像显示，在轻度消化的LD419染色质样本泳道中存在一个超敏区域(图2B，泳道2 - 4)，该区域定位到EPM2AIP1/MLH1 1a启动子区域。有趣的是，在较高酶浓度下，还检测到另一个与MLH1 1b上游区域相对应的超敏区域(图2B，泳道4)。在对照的裸露DNA中未检测到这些模式，这表明DNaseI对该区域没有序列偏好性。在基因组水平上，与LD419细胞核相比，RKO细胞核在较高浓度的DNaseI作用下消化程度更高(图2A，泳道11 - 14)。然而，即使在这样的消化条件下，在所检测的特定基因座上，1399 bp的DraI片段在泳道11 - 14中仍然存在(图2B)，未显示出任何离散的DNaseI超敏性。因此，RKO细胞中的该区域更为紧密，DNaseI难以进入。因此，在表达的LD419细胞中，所有三个起始位点上游的区域都极易被访问，但在不表达的RKO细胞中则不然。LD419细胞中的超敏位点可能表明核小体缺失，这是染色质结构变化与基因转录活性相关的结果。
为了证实DNaseI足迹法所提示的核小体缺失，我们在单核小体水平上检测了启动子区域中核小体的存在情况。来自LD419和RKO细胞的细胞核被部分
图2. 通过DNaseI消化检测超敏位点
(A)用逐渐增加浓度的DNaseI处理LD419和RKO细胞的基因组裸露DNA和细胞核，然后纯化每个样本中的DNA并用DraI处理，通过Southern印迹分析消化产物。作为对照，使用裸露DNA来确认该酶没有序列特异性。如图所示，DraI处理前的消化样本通过凝胶电泳进行分离。
(B)Southern印迹分析显示EP - 启动子中存在DNaseI超敏性。左侧按比例绘制了DraI消化产生的1399 bp DNA片段、转录起始位点(箭头)和探针片段(黑框)。数字表示以bp为单位的距离。
用微球菌核酸酶(MNase)进行消化，产生各种核小体重复分子。然后将消化后的细胞核中的核小体在蔗糖梯度上进行分离，以分离富含单核小体的组分，并使用位于该区域的八组引物，通过定量PCR分析来自单核小体的DNA(图3A)。与DNaseI的结果一致，在表达的LD419细胞中，EPM2AIP1和MLH1 1a转录起始位点(TIS)之间的区域(图3A，b - d)以及MLH1 1b TIS上游的 区域(图3A，f)在PCR后几乎没有信号。有趣的是，在MLH1启动子(1a + 1b)中，就在MLH1 1a TIS下游有且仅有一个定位高度明确的核小体(图3A，e)，对应于两个超敏位点之间的区域(图2B，泳道4)。然而，在不表达的RKO细胞中未观察到类似的核小体缺失现象(图3A)。综上所述，这些结果表明，在表达的LD419细胞中，所有三个起始位点上游的启动子区域没有核小体，但在不表达的RKO细胞中则被核小体占据。
图3. 通过单核小体DNA和染色质免疫沉淀(ChIP)分析检测核小体缺失
(A)单核小体DNA分析。用MNase部分消化LD419和RKO细胞的细胞核，将反应混合物在蔗糖梯度上进行分离以分离单核小体DNA。使用针对八个区域(a - h)的特异性引物，通过实时PCR分析单核小体DNA的富集情况，这些区域在图的顶部以黑色矩形表示。
(B)在表达的LD419细胞和不表达的RKO及SW48细胞中，EPM2AIP1/MLH1启动子处的染色质结构不同。用抗组蛋白H3和乙酰化组蛋白H3的抗体进行ChIP分析。如(A)所述，通过实时PCR分析免疫沉淀的DNA。将免疫沉淀的DNA的比例计算为输入DNA的百分比。结果以两次或三次实验的平均值(条形图) 标准差表示，这些实验来自两次独立的染色质制备。
EPM2A/P1处不同的染色质结构/
表达中的MLH1启动子
和未表达细胞
接下来，我们使用染色质免疫沉淀测定法(ChIP)来验证上述结果。因为我们希望在起始位点之间相对较小的区域上获得尽可能高分辨率的图谱，所以特别注意确保染色质超声处理产生的片段大小约为 。
与DNaseI和单核小体DNA分析结果一致，在表达的LD419细胞中，EPM2AIP1/MLH1 1a起始位点之间区域的H3占有率明显较低，而在未表达的RKO和SW48细胞中则高得多(图3B，b - d)。在表达的LD419细胞的EPM2AIP1/MLH1 1a启动子区域观察到核小体缺失区域或组蛋白H3占有率的“低谷”(图3B，b - d)。未表达的RKO和SW48细胞中没有明显的低谷，并且与LD419相比，EPM2AIP1/MLH1 1a启动子区域的H3占有率更高(图3B，b - d)。然而，ChIP分析未检测到LD419中 起始位点上游核小体的缺失(图3B，f)，这可能是由于超声处理分辨率有限所致。总体而言，表达的LD419中组蛋白H3乙酰化水平较高，而RKO和SW48中几乎没有(图3B，a - h)。值得注意的是，LD419中的H3乙酰化模式重现了H3和单核小体DNA分析中观察到的模式，即在EPM2AIP1/MLH1 1a启动子处有一个明显的低谷，在MLH1 1b上游区域有一个较小的低谷(图3B，LD419，区域b - d和f)。尽管许多研究表明，启动子区域在活跃启动子中通常与乙酰化增加有关，但没有具体提及H3占有率，我们的结果表明，乙酰化增加实际上与启动子周围区域的H3富集有关(图3B，a和e)。
为了验证这些发现的普遍性，还研究了 岛启动子的染色质结构。与MLH1启动子一致，在表达的T47D和Caov3细胞的未甲基化启动子中再次观察到核小体缺失(见图S2、S3A和S3B，区域R5和R4)。
接下来，我们使用高分辨率的MSPA对MLH1启动子中的单个DNA分子进行足迹分析(Fatemi等人，2005年；Gal - Yam等人，2006年；Kladde和Simpson，1996年)。用M.SssI处理来自表达的、未甲基化的LD419细胞的细胞核，M.SssI可使纯化DNA中所有可及的 位点甲基化，但无法使位于核小体内或被紧密结合的转录因子结合的 位点甲基化(Fatemi等人，2005年；Gal - Yam等人，2006年；Kladde和Simpson，1996年)。经过M.SssI处理、提取DNA的亚硫酸氢盐转化以及启动子区域的PCR扩增后，对单个PCR产物进行克隆和测序，以显示单个DNA链对甲基化酶的可及性。
正如预期的那样，在未处理的LD419细胞核中，所分析的区域在经M.SssI处理之前几乎未发生甲基化(图4A)。对照实验显示，在与处理细胞核相同的实验条件下，从相同细胞中提取的裸露DNA在该区域经M.SssI处理后几乎完全甲基化，且不存在优先甲基化位点(图4B)。对经M.Sssl处理的细胞核的分析显示，两个起始位点(EPM2AIP1和MLH1 1a)之间的321 bp区域以及MLH1 1b上游 的一个区域在很大程度上可被M.Sssl作用，这可从广泛获得的甲基化情况看出，表明这些区域不存在核小体(图4C)。在321 bp区域分析的30个启动子复制品中，有28个未检测到核小体足迹，在MLH1 1b上游150 bp分析的27个分子中均未检测到核小体足迹(图4C)。此外，有两个明显的难以被作用的区域，表明在MLH1 1a和EPM2AlP1起始位点下游存在核小体(图4C，粉色)。这些区域被定义为至少有两个连续的未甲基化位点，且两侧各至少有两个连续的甲基化CpG位点(Fatemi等人，2005)。基于染色质免疫沉淀(ChIP)和单核小体实验， 和 两端的这些区域也被视为核小体(图3A和3B)。事实上，在MLH1 1a下游区域检测的分子中，有 的分子中精确定位到一个明确的核小体(图4C，粉色)。
还检测到两个难以被作用的区域，其大小太小，不足以被认定为核小体。在EPM2AIP1和MLH1 1a之间的区域观察到一个 的区域，在 a和1b之间的区域也检测到一个 的区域，这可能是未被识别的蛋白质结合位点(图4C，蓝色)。此外，MLH1 1b下游还有一个难以被作用的区域，这可能表明存在另一个核小体，如图3中区域 的高富集情况也暗示了这一点。总之，这些结果表明，在表达的LD419细胞中，EPM2AIP1和MLH1 1a之间的区域没有核小体，而MLH1 1a下游精确定位有一个核小体，随后在MLH1 1b起始位点上游有另一个无核小体区域。这些无核小体区域对应于DNaseI测定中观察到的超敏区域(图2B，第4泳道)，也对应于单核小体DNA分析中富集程度最低的相同区域(图3A，区域b - d和f)。
此外，为了验证观察到的核小体缺失并非仅细胞系特异性现象，MSPA测定法也应用于表达的T24细胞。一致地，如对M.Sssl的高可及性所示，在20个启动子复制品中的17个中，EPM2AIP1和MLH1 1a之间的区域实际上无核小体(见图S4B)。
5 - 氮杂 - 2’-脱氧胞苷(5 - aza - CdR)处理后核小体的移除
由于在不表达的RKO细胞中，启动子被核小体占据，我们有兴趣观察伴随基因激活的染色质结构变化。首先，我们使用定量逆转录聚合酶链反应(qRT - PCR)对5 - aza - CdR处理后沉默基因的表达水平进行了定量。如之前所发现的(图1B)，5 - aza - CdR处理24小时后，在添加药物后 时，所有三种转录本均出现一致的重新激活(图5A)。即使在药物处理44天后，所有三种转录本仍持续表达，尽管表达水平下降了3 - 7倍(图5A)。处理后表达水平随时间下降的现象在其他基因中也有观察到
癌细胞
MLH1 CpG岛的表观遗传沉默可被5 - aza - CdR处理激活，这是由于逐渐重新沉默效应所致(Bender等人，1999)。
图4. 在表达LD419细胞的EPM2AIP1/MLH1启动子区域，天然染色质对M.SssI的可及性
(A - C) 从表达未甲基化的LD419细胞中提取细胞核，然后用M.SssI处理15分钟，接着进行亚硫酸氢盐基因组测序。进行了两次独立的亚硫酸氢盐测序反应，以避免在分析中引入偏差。分析中包括了由蓝色虚线表示的四种不同大小的PCR产物。(A) 未处理的细胞核。(B) 用M.Sssl处理的裸露DNA。(C) 用M.Sssl处理的细胞核。带有圆圈的水平线表示亚硫酸氢盐处理后的DNA经PCR扩增和克隆后测序的单个分子。实心圆圈表示甲基化的CpG二核苷酸；空心圆圈表示未甲基化的CpG二核苷酸。粉色条带表示M.Sssl无法进入的区域或片段，表明存在核小体。片段定义为至少两个连续的未甲基化位点，两侧各有至少两个连续的甲基化CpG位点(Fatemi等人，2005年)。蓝色条带显示了推测的蛋白质结合区域。
然后，我们通过对RKO细胞进行染色质免疫沉淀(ChIP)分析，研究了基因激活时染色质的变化 ，以及在5 - 氮杂 - 2’-脱氧胞苷(5 - aza - CdR)处理后44天的情况。在未处理的RKO细胞中，组蛋白H3乙酰化水平极低，在处理48小时后略有增加，在药物处理72小时后，在所有检测区域中均大幅增加数倍(图5B，a - h)，这与其他研究结果一致(Fahrner等人，2002年)。即使在药物处理44天后，在几乎所有区域中，H3乙酰化水平仍维持在未处理细胞和处理72小时后的中间水平。引人注目的是，基因激活后，乙酰化模式重现了单核小体DNA分析中观察到的情况，即在EPM2AIP1/MLH1 1a启动子处出现下降，在MLH1 1b上游处下降幅度较小，且在处理后的所有时间点均是如此。从定性角度看，H3乙酰化水平的变化与基因表达水平的变化密切相关。
接下来，我们应用甲基化敏感引物延伸分析(MSPA)检测5 - aza - CdR处理激活基因后RKO细胞中染色质结构的变化。为简化分析，我们聚焦于EPM2AIP1/MLH1 1a起始位点之间的区域。在未处理的RKO细胞中，启动子中的几乎所有CpG位点均为内源性甲基化(见图S5A)。根据该药物的预期作用机制(Egger等人，2004年)， 处理后，(15/24)的分子无甲基化或有零星的残留甲基化 (图6A)。这些分子有可能作为M.Sssl的底物，从而使我们能够利用MSPA定位技术寻找新的足迹。
我们首先验证了从5 - aza - CdR处理的细胞中提取的裸露DNA可被M.Sssl完全转化为甲基化分子。实际情况确实如此，因为经M.SssI处理后，95%(20/21)的测序分子被广泛甲基化(见图S5B)。因此，DNA中残留的5 - 氮杂胞嘧啶不会因产生虚假模式而使分析复杂化。
从经5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-CdR)处理的细胞中制备的细胞核暴露于M.SssI，对45个分子进行测序和分析(图6B)。总共27个克隆(60%)几乎完全甲基化(总甲基化水平为91%)，但这些克隆没有信息价值，因为我们无法区分它们代表的是未被药物去甲基化的亲本DNA分子，还是被M.Sssl重新甲基化的分子。然而， (45个克隆中的18个)分子可能已被M.SssI修饰，因为这些模式与经5-aza-CdR处理后的RKO细胞中的任何分子模式都不相似(图6A)。此外，还有部分甲基化的分子，其修饰模式在 之前并不存在。在这些分子中， (18个克隆中的11个)有受保护的区域(如先前定义的)，大到足以容纳核小体，并且这些区域中有许多具有诊断性的 或 大小的核小体足迹(Fatemi等人，2005年)(图6B)。这些代表了在MLH1启动子中仍然含有核小体的去甲基化分子，而其他分子与表达LD419的细胞中观察到的模式非常相似(图4C)，在转录起始位点之间具有较高的M.SssI可及性(图6B，蓝色框)。
图5. 5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-CdR)激活基因时的染色质结构变化
用5-aza-CdR处理RKO细胞，然后在添加药物后72小时和44天收获细胞，进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和染色质免疫沉淀(ChIP)分析。(A)定量RT-PCR。表达水平用 -ACT/N进行归一化， -ACT/N作为输入cDNA的对照。无逆转录酶对照作为无内含子基因EPM2AIP1的阴性对照(数据未显示)。结果显示为来自两个独立cDNA制备物的两次PCR的平均值(条形图)±标准差。(B)通过ChIP检测组蛋白H3乙酰化模式。如前所述，通过实时PCR分析免疫沉淀的DNA(图3B)。免疫沉淀DNA的比例计算为输入DNA的百分比。结果显示为来自两个独立染色质制备物的两到三次实验的平均值(条形图) 标准差。
这些数据是通过扩增包括未被5-aza-CdR处理去甲基化的亲本甲基化分子的区域获得的。因此，为了过滤掉这些无信息价值的分子并进一步优化分析，设计了选择性引物，反向引物仅与未甲基化的分子退火，以便更好地代表有信息价值的启动子复制品(图 ，蓝色框下方的箭头)。作为对照，从未处理的RKO细胞的DNA扩增中未产生PCR产物(数据未显示)，而在5-aza-CdR处理后，仅扩增并克隆了基本上未甲基化的分子，证实了引物的特异性(见图S5C)。
从经5-aza-CdR处理的细胞中制备的细胞核在添加药物后 暴露于M.Sssl，然后通过选择性扩增对启动子分子进行测序和分析(图6C)。大约54%(37个分子中的20个)具有核小体区域(如上定义)(图6C)。这些代表了去甲基化的分子
癌细胞
MLH1 CpG岛的表观遗传沉默:在MLH1启动子中仍然含有核小体。相比之下，第二组启动子在转录起始位点之间具有较高的M.SssI可及性，两侧是不可及区域，表明存在一个核小体缺失区域，让人想起在表达细胞中看到的模式(图6C，蓝色框，与图4C相比)。因此，这些数据强烈表明，至少在一部分启动子中，当基因在药物处理后重新激活时，核小体会被移除。至于那些似乎被核小体占据的去甲基化启动子，根据药物作用机制，这些可能反映了在添加药物72小时后仍然存在的半甲基化启动子分子(Bender等人，1999年；Egger等人，2004年)；因此，核小体可能被困在半甲基化的DNA上(图6C)。
图6. 5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理导致核小体移除
(A - E) RKO细胞用5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理24小时，在药物处理开始后 天和44天收获细胞。提取药物处理后的RKO细胞的DNA和细胞核，然后进行M.Sssl处理，接着进行亚硫酸氢盐基因组测序。(A和D) 添加5-氮杂-2’-脱氧胞苷后，RKO细胞中启动子的去甲基化情况:(A) 72小时后；(D) 44天后。(B) 药物添加72小时后，RKO细胞中EPM2AIP1/MLH1 1a启动子区域的天然染色质对M. SssI的可及性。为了过滤掉不适合M.SssI处理的高度甲基化分子，使用仅与未甲基化分子退火的选择性引物进行PCR分析。具体原理见正文。(C和E) 药物处理后的RKO细胞的细胞核在药物添加后(C) 72小时和(E) 44天进行M.Sssl处理，然后用选择性引物进行亚硫酸氢盐基因组测序。分子和片段的描述请参考图4。启动子区域核小体缺失的DNA分子用蓝色框标记。
为了消除这一变量，对用5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理的RKO细胞进行了相同的分析，随后在无药物的条件下培养44天，此时预计不存在或仅存在极少的半甲基化DNA。亚硫酸氢盐基因组测序显示，测序的分子中 仍然完全未甲基化，而其余的则高度甲基化(图6D)，这可能是由于药物去除后的重新甲基化(Bender等人，1999)。
同样，在5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理44天后，通过选择性扩增仅检测到大量未甲基化的分子(见图S5D)。其中， (12/13)在转录起始位点之间对M.Sssl具有广泛的可及性，表明存在一个核小体缺失区域，重现了表达细胞中观察到的模式(图 ，蓝色框)。这些结果表明，在药物诱导的甲基化导致基因重新激活时，核小体从一部分启动子中被移除。不仅如此，44天的数据表明，几乎所有去甲基化的启动子分子都缺乏核小体，这确立了核小体移除在去甲基化的活性启动子上的可遗传性。
图7. 表达水平与核小体缺失分子百分比之间的相关性
数据根据图5、图6和图7的结果绘制。表达水平的降低与核小体缺失群体的减少相关。
通过结合定量逆转录PCR和MSPA分析的数据(图4 - 6)，我们发现MLH1 1a和EPM2AIP1的表达水平与核小体缺失分子的百分比之间存在显著的相关性，即表达水平的降低与核小体缺失群体的减少相关(图7)。因此，很可能这种表观遗传沉默基因的重新激活除了需要DNA去甲基化和施加正性组蛋白标记外，还需要核小体缺失。
讨论
我们着手确定独立于转录活性遗传的CpG岛的允许性染色质构象是如何转变为体细胞可遗传的沉默或非允许状态的。最近在酵母、果蝇和人类的全基因组筛选中观察到转录起始位点上游的核小体缺失(Heintzman等人，2007；Lee等人，2004；Mito等人，2005；Ozsolak等人，2007)。这强烈表明，缺乏核小体是允许转录机制进入允许性启动子所必需的(Li等人，2007)。事实上，核小体重塑因子已被证明与转录激活存在因果关系；例如，酵母中PHO5启动子的核小体在转录激活时会完全解体(Boeger等人，2004)。因此，似乎至少缺少一个核小体对于基因转录是必要的。然而，我们应该再次强调，人类细胞中的许多常染色体CpG岛处于明显的允许性构象，这意味着核小体在起始位点是组成性缺失的(Sabo等人，2004；Sasaki等人，1992a)。
我们使用复杂的人类启动子所获得的研究结果，在几个重要方面拓展了这些研究。首先，经传统方法验证的高分辨率MSPA(甲基化敏感的引物延伸分析，Methylation-Sensitive Primer Extension Analysis)方法显示，每个起始位点上游都存在一个核小体的组成性完全缺失(即完全耗竭)。这与我们在GRP78启动子中观察到的情况类似，在我们检测的356个启动子复制品中，未发现核小体的痕迹(Gal - Yam等人，2006年)。虽然这种情况可能是由于核小体的快速可逆占据所致，但我们认为这种可能性不大，因为在染色质免疫沉淀(ChIP)分析前用甲醛固定证实了所检测区域的占据率非常低。关于我们研究结果的普遍性，我们在 启动子上的结果与在MLH1启动子上的结果一致，这表明CpG岛中的核小体耗竭相当常见。
其次，我们发现值得注意的是，产生三种转录本的整个 启动子作为一个整体发挥作用，即要么所有转录本都存在，要么都不存在；因此，起始位点似乎受到协同调控。同样值得注意的是，在表达细胞的几乎所有启动子复制品中都存在一个定位高度精确的乙酰化核小体。CpG岛通常没有TATA框，因此转录起始方式相当多样化。我们的发现可能有助于解释许多哺乳动物CpG岛启动子中存在多个转录起始位点的原因。也许起始位点附近的核小体占据情况决定了特定CpG岛中产生的转录本。这一观点的证据来自我们对 基因中高水平的位置变异和多样化起始位点的观察(Fatemi等人，2005年)，这与 - RACE在MLH1中观察到的三个“明确界定”的位点形成对比。显然，需要进一步的研究来解决这些问题。
我们的研究的第三个意义与占据情况在表观遗传沉默中的作用有关，根据定义，表观遗传沉默是有丝分裂可遗传的。到目前为止，大多数研究都集中在组成性活跃基因或与基因诱导相关的染色质变化上。作为之前对 研究的扩展，该研究表明DNA甲基化可能在H3 - K9甲基化后起到锁定抑制状态的作用(Bachman等人，2003年)，我们的数据表明，可遗传的DNA甲基化模式可能通过在起始位点定位核小体，导致核小体占据情况的可遗传变化，从而维持基因沉默。在我们用5 - 氮杂 - 2’-脱氧胞苷(5 - aza - CdR)进行的实验中，可以看到这一过程几乎具有“数字化”的特征。在这里，药物处理消除DNA甲基化导致所有三个起始位点重新激活、共价激活的乙酰化标记的应用以及所检测区域内核小体的去除。有趣的是，MLH1启动子已经呈现出组蛋白的“凹陷”构象
癌细胞
MLH1 CpG岛的表观遗传沉默
图8. MLH1基因表观遗传沉默的简化模型 和 的活跃启动子在每个转录起始位点的上游至少缺失一个核小体。在沉默状态下，1a和1b的非活跃启动子被核小体占据。用5 - aza - CdR处理会导致启动子区域的DNA大量去甲基化，尽管仍有一些分子保持甲基化状态。虽然一些半甲基化的启动子分子可能仍被核小体占据，但在一些启动子分子中会形成无核小体区域。基因的激活可能源自启动子中具有无核小体区域的这些分子，尽管我们无法明确确定这一点。绿色代表带有激活标记的核小体。红色代表带有抑制标记的核小体。灰色代表占据半甲基化区域的核小体。空心圆圈表示未甲基化的 二核苷酸，实心圆圈表示甲基化的CpG二核苷酸。半甲基化的DNA用半实心圆圈表示。Ac表示乙酰化的组蛋白尾部。
药物处理开始48小时后H3乙酰化。然而，我们尚未确定组蛋白修饰是否先于核小体重排，或者活性标记是否应用于重排后的核小体。尽管如此，即使该基因在处理后随时间重新沉默，但在总体群体中仍有7%未甲基化的启动子也没有核小体。实际上，重新激活的RKO细胞中所有三种转录本的表达水平与核小体缺乏程度高度相关。
因此，我们提出了一种MLH1基因表观遗传沉默的模型，其中EPM2AIP1和MLH1(1a和1b)的未甲基化且活跃的启动子在每个转录起始位点的上游刚好缺失一个核小体(图8)。在沉默状态下，甲基化且无活性的启动子被核小体占据，用5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-aza-CdR)处理会导致启动子区域发生显著的DNA去甲基化，尽管有些分子仍保持甲基化状态。值得注意的是，虽然一些半甲基化的启动子分子被核小体占据，但在相当一部分启动子分子中建立了无核小体区域。因为这些启动子分子显示出与表达细胞中观察到的模式惊人地相似(图4C)，所以它们可能与基因的重新表达有关(图8)。相反，在启动子中有核小体的半甲基化启动子分子中，基因很可能被沉默，因为已有研究表明半甲基化会通过抑制转录因子结合来阻止转录(Sasaki等人，1992b)。
我们的数据与早期研究一致，早期研究表明未甲基化的CpG岛可被核酸酶访问，而甲基化的对应物则被随机定位的核小体占据(Patel等人，1997；Pfeifer和Riggs，1991)。然而，这些研究依赖于相对低分辨率的核酸酶消化或体内足迹法，而我们能够通过高分辨率检测以数字化方式展示这一点。在用5-aza-CdR重新激活基因后，从无活性状态到活性状态的转变似乎涉及核小体的移除。Kass等人(1997)的一项研究支持了我们的模型，该研究从机制上表明，甲基化的CpG岛启动子(而非其未甲基化的对应物)在注入非洲爪蟾卵母细胞后会形成核小体阵列。这项在人工系统中进行的研究补充了我们的发现，并可能为我们在癌细胞中观察到的现象提供了机制基础。
诸如MBD1、MBD2或MeCP2等甲基结合蛋白可能参与甲基化启动子的沉默(Klose和Bird，2006)，并且我们已记录了与肿瘤抑制基因相关的甲基化CpG岛处存在MeCP2(Nguyen等人，2001、2002)。因此，可以想象MeCP2和其他甲基结合蛋白会稳定甲基化启动子中核小体的存在。甲基化引起的DNA螺旋性质的直接结构变化也可能直接改变占据情况(Pennings等人，2005)。哪种机制占主导尚不清楚；尽管如此，我们的数据表明，导致永久沉默的核心机制可能是将核小体插入先前未被占据的位点。虽然我们观察到的调节核小体移除的确切染色质重塑复合物尚未确定，但核小体占据可能是涉及DNA、组蛋白和其他染色体蛋白共价修饰的染色质重塑过程的关键结果。
实验步骤
细胞培养
结直肠癌细胞系(LoVo、HCT116、LS174T、LS123、HT29、SW620、SW48、RKO)、膀胱癌细胞系(T24、J82)和宫颈癌细胞系(HeLa)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。所有细胞均按照ATCC的建议进行培养。正常的LD419人膀胱成纤维细胞系在我们实验室构建，并在添加20%胎牛血清(FBS)的McCoy’s 5A培养基中培养。
5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理
将细胞接种于 培养皿中(或每 个细胞接种于 培养皿中)，24小时后，用 -氮杂-2 -脱氧胞苷(西格玛公司)处理细胞 。然后用不含该药物的新鲜培养基更换培养液，继续培养2天，随后从经药物处理的培养物中分离细胞核、DNA和RNA。
甲基化敏感的单核苷酸引物延伸
如先前所述，用亚硫酸氢钠处理基因组DNA(弗罗默等人，1992年)。如先前所述，通过甲基化敏感的单核苷酸引物延伸测定法测定CpG位点的平均胞嘧啶甲基化水平(阮等人，2001年)。所有引物序列可应要求提供。
逆转录聚合酶链反应(RT - PCR)
用Trizol试剂(英杰公司)从细胞中分离总RNA。用随机引物进行逆转录。PCR中使用的引物的 序列如下: -肌动蛋白正向引物，TTTGAGACCTTCAACACCCCAG； -肌动蛋白反向引物，TTTCGTGGAT GCCACAGGA；MLH1正向引物，CAGCTAATGCTATCAAAGAGATGAT TG (1a)和GAGACCTTTTAAGGGTTGTTTGG (1b)；MLH1反向引物，GTTGTAAGAGTAACATGAGCCACATG；EPM2AIP1正向引物，TTTG TGGCCTATGAGAACTACC；EPM2AIP1反向引物，GCTCTGATTCAG ATTCCGTTAG。PCR条件为 ，进行 个循环( 进行25个循环)，其中 持续 ， 持续1分钟， 持续 。PCR产物在 琼脂糖凝胶上进行分离。使用Opticon荧光定量PCR仪和SYBR Green I(西格玛公司)，利用上述列出的引物进行定量逆转录聚合酶链反应。所有值均以 表达比率进行归一化，并使用一组已知量的标准品进行定量。
亚硫酸氢盐基因组测序
从细胞中提取的DNA用亚硫酸氢盐处理，用针对亚硫酸氢盐转化DNA的特异性引物进行PCR扩增，然后连接到pGEM - T easy载体(普洛麦格公司)中。对于MLH1 1a，产生了大小分别为250、536和708 bp的三个DNA PCR扩增产物。对于MLH1 1b，产生了大小为416 bp的DNA PCR扩增产物。引物序列和PCR条件可应要求提供。此外，在RKO细胞的甲基化特异性引物扩增(MSPA)测定中，仅使用与未甲基化分子退火的反向引物进行选择性扩增，以消除无法分析的高度甲基化克隆的扩增(有关原理请见正文)。为了提高引物对未甲基化DNA的特异性，在反向引物的 末端引入了一个错配碱基，这将破坏非特异性双链的形成。用于选择性扩增的引物的 序列如下:正向引物，TGGGTTGGAAAATTAGAGTTTTGTT；反向引物，ACCAAATAACCCCT ACCACAAATA。单个质粒分子在拉腊根公司(洛杉矶)和南加州大学(USC)的微量化学核心实验室通过自动DNA测序仪进行测序。
cDNA末端快速扩增，5 -RACE
如上文所述，从LoVo细胞中提取总RNA，并按照制造商的说明，使用RNA连接酶介导的快速扩增cDNA末端(RLM - RACE)试剂盒(Ambion公司)测定mRNA的 末端。将 - RACE反应产物克隆到pGEM - T易载体(普洛麦格公司)中并进行测序。
M.Sssl处理
细胞核制备和M.SssI反应按先前描述的方法进行(法特米等人，2005年)。简而言之，将纯化的基因组DNA和新鲜提取的细胞核用M.Sssl在 条件下处理 。通过加入等体积的终止液(20 nM Tris - HCl [pH 7.9]、600 mM NaCl、1% SDS、10 mM EDTA、 蛋白酶 )终止反应，在 条件下孵育过夜，然后通过酚/氯仿萃取和乙醇沉淀法纯化DNA。
DNasel足迹法
按上述方法提取LD419细胞的细胞核。将细胞核重悬于RSB缓冲液(10 mM Tris - HCl [pH 7.4]、10 mM )中，再加入 蔗糖，然后在 条件下与不同浓度的DNasel(沃辛顿公司)孵育15分钟，以获得通过溴化乙锭染色显示的合适范围的基因组DNA消化产物。按上述方法纯化消化后的DNA，再用Dral限制性内切酶切割，在1.5%的琼脂糖凝胶上进行分离，然后进行Southern印迹杂交。印迹膜与一个163 bp的PCR扩增的Dral探针杂交，该探针跨度为相对于MLH1 1b的 - 29至134 bp。使用High Prime(罗氏公司#0)用 标记该探针，并使用ExpressHyb杂交溶液(BD生物科学公司)进行杂交。用于探针扩增的 PCR引物序列如下:正向，GTTC CCTGACGTGCCAGTCA；反向，AAATTAAGTGGCTTCCTTACTTA GTTAACG。通过分子动力学磷屏成像仪观察印迹膜。
单核小体DNA的制备与分析
详细方案先前已发表(加尔 - 亚姆等人，2006年)。使用AmpliTaq Gold DNA聚合酶(应用生物系统公司)和SYBR Green I，通过DNA Engine Opticon系统(MJ Research公司，马萨诸塞州剑桥市)进行定量PCR。引物序列可根据要求提供。使用以下PCR条件:在 条件下进行 ，然后45个循环，每个循环包括在 条件下进行 、在 条件下进行 ，以及在 条件下进行 ，最后在 条件下进行 。数值用裸露DNA进行归一化处理。
染色质免疫沉淀(ChIP)分析
ChIP分析按先前描述的方法进行(阮等人，2001年)。使用以下抗体: 的抗组蛋白H3(Abcam公司)或抗乙酰化组蛋白H3(Upstate公司)抗体，以及1 μl兔IgG(Upstate公司)作为非特异性抗体对照。
免疫沉淀DNA的实时PCR扩增
使用AmpliTaq Gold DNA聚合酶(应用生物系统公司)和TaqMan探针(Biosearch公司)，通过DNA Engine Opticon系统(MJ Research公司，马萨诸塞州剑桥市)进行定量PCR。
癌细胞
引物和探针序列可根据要求提供。采用以下PCR条件: 持续 ，并进行45个循环，即 持续 ， 持续 。对于每个PCR反应，加入一组已知量的DNA作为定量标准，同时也加入用非特异性抗体进行免疫沉淀的样本。免疫沉淀DNA的比例以输入DNA的百分比计算。
补充数据
补充数据包括EPM2AIP1/MLH1 1a启动子的缺失分析以及BRCA1/ 启动子的额外数据，还有五幅补充图，可在本文的在线版本(http://www.cancercell.org/cgi/content/full/ 12/5/432/DC1/)中找到。
致谢
我们感谢Susan J. Clark博士提出的建议。这项工作得到了美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)R01 CA82422资助。亚硫酸氢盐测序图是使用Mark A. Miranda(markmir@ ucla.edu)创建的CpG气泡图生成器软件生成的。
接收日期:2007年4月6日
修订日期:2007年8月23日
接受日期:2007年10月1日
发表日期:2007年11月12日
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