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合成大麻素(R)-5-氟ADB对人脑海微血管内皮细胞增殖和血管生成作用的评估

发布时间：

2026-07-08 21:35

合成大麻素(R)-5-氟ADB对人脑海微血管内皮细胞增殖和血管生成作用的评估

莱斯·纳赛尔·阿勒-伊坦，赛义夫·祖海尔，伊利亚·亚库布·凯尔，曼苏尔·阿卜杜拉·阿尔加姆迪

约旦科技大学生物技术与基因工程系，伊尔比德22110，约旦

2 沙特阿拉伯哈立德国王大学医学院解剖学系，艾卜哈61421

3 沙特阿拉伯哈立德国王大学医学院基因组学与个性化医学单元，艾卜哈�1421

文章信息

文章类型:

原创

文章历史:

收到日期:2023年4月16日

接受日期:2023年11月22日

关键词:

脑

大麻素

内皮细胞

糖原合酶激酶3β

血管内皮生长因子

摘要

目的:血管形成过程，也称为血管生成，主要依赖于内皮细胞的增殖、迁移和侵袭。近年来，已发现合成大麻素(SCs)可能会影响体内的血管生成过程。我们评估了合成大麻素(R)-5-氟-ADB对人脑血管内皮细胞(hBMECs)增殖率和血管生成的影响。

材料与方法:用(R)-5-氟-ADB处理hBMECs，并研究其细胞活力、迁移率和管状结构形成。此外，在mRNA和蛋白质水平上检测包括血管生成素-1和-2以及血管内皮生长因子(VEGF)在内的血管生成相关蛋白。

结果:结果显示，(R)-5-氟-ADB诱导的HBMECs增殖率显著升高(P值<0.0001)。在至的(R)-5-氟-ADB之间，HBMECs的血管生成能力也得到增强。此外，在不同浓度的(R)-5-氟-ADB中均观察到ANG-1、ANG-2和VEGF mRNA及蛋白质水平的增加，以及GSK-3β磷酸化率的升高。

结论:我们的结果提示了一种药理学上的创新方法，用于解决一系列与血管生成相关的病症。这种方法涉及精确靶向1型和2型大麻素受体。为此，可根据所讨论疾病的特定特征使用这些受体的特异性激动剂或拮抗剂。

请引用本文如下:

AL-Eitan LN, Alahmad SZ, Khair LY, Alghamdi MA. 合成大麻素(R)-5-氟ADB对人脑血管内皮细胞增殖和血管生成作用的评估。伊朗基础医学杂志2024；27:304-310。doi: https://dx.doi.org/10.22038/IJBMS.2023.71819.15605

引言

血管生成被描述为一个生理过程，其特征是新血管和毛细血管的生长和形成。这个复杂的过程涉及多个细胞阶段，包括细胞增殖、迁移和侵袭(1)。毛细血管在促进代谢物和营养物质的交换方面具有关键作用，因为它们存在于所有具有活跃代谢的身体组织附近。组织的代谢活动与血管生成密切相关，这意味着代谢活动的任何改变都可能导致毛细血管形成的相应变化(2)。在脑血管生成中，代谢增加、毛细血管形成与记忆和学习能力的改善之间存在关联，其作用超过神经发生(3)。近年来，血管生成作为一个关键治疗靶点的重要性已得到认可，因为它在利用疾病或抑制其进展中起着关键作用(4)。例如，可以通过刺激血管生成来预防外周动脉和心脏病，而抑制血管生成可以减少癌症发展，因为它在促进肿瘤通过转移从良性状态转变为恶性状态中起着重要作用(5)。多种蛋白质的基因表达调控直接影响血管生成。

血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-1(ANG-1)和血管生成素-2(ANG-2)是常用的研究潜在血管生成生长因子，它们影响血管生成和血管发育。VEGF由于其对内皮细胞的促有丝分裂和抗凋亡作用，增强了血管通透性和细胞迁移，从而有助于调节正常和病理性血管生成(6)。ANG-1和ANG-2作为重要的血管生成调节剂，作用相反。ANG-1具有主要的促血管生成特征，被认为具有血管保护作用，因为它抑制血管炎症、抑制血浆渗漏并有助于预防内皮细胞死亡(7)。相反，ANG-2尽管通过与ANG-1相同的受体激活，但会破坏血管生成的稳定性(8)。

糖原合酶激酶-3(GSK-3)是一种参与众多细胞过程的酶，包括糖原合成、细胞信号传导和基因表达的调节。它作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶发挥作用，主要因其在磷酸化和抑制糖原合酶方面的作用而闻名，从而影响糖原代谢。(9). GSK-3由两种亚型组成:GSK- 和GSK-3β，由不同的基因编码。两种亚型具有相似的功能，在各种组织和器官中广泛表达(10)。值得注意的是，GSK-3β在哺乳动物大脑的多个区域表现出高表达水平(11)，对阿尔茨海默病的发展有显著影响(10,11)。GSK-3 作为血管生成调节剂的作用已通过其对关键信号通路的调节得以确立，这些信号通路包括Wnt/ -连环蛋白通路和PI3K/Akt通路。这些通路对血管生成的各个方面都至关重要，包括内皮细胞增殖、迁移以及增强管形成的潜力等功能(12 - 14)。最近的医学研究表明，抑制GSK-3的表达可能为癌症抑制和治疗提供一种有前景的治疗方法(13)。

伊尔比德22110，约旦。电话:+ (962)-2 -7201000，传真:+ (962)-2-7201071，电子邮件:lneita@just.edu.jo

合成大麻素已在与血管生成和血管形成相关的研究中得到广泛研究。一般来说，大麻素，无论是天然的还是合成的，都直接与内源性大麻素系统的大麻素受体相互作用，该系统调节全身的各种功能(15)。不同大麻素之间的相互作用程度各不相同，合成大麻素物质比天然大麻素表现出更高的效力，并作为内源性大麻素系统受体的完全激动剂(16)。在广泛研究的受体中，有1型和2型大麻素受体，它们在调节细胞内过程和亚细胞定位方面发挥着重要作用。1型大麻素受体(CB1)参与与大脑和神经系统相关的过程，包括突触形成和可塑性，而2型大麻素受体(CB2)与免疫细胞相关(15)。合成的(R)-5-氟-ADB 也称为(R)-5-氟-MDMB-PINACA，与CB1和CB2大麻素受体都结合(图1)(17)。合成大麻素(SCs)最初是为了药理学目的而合成的，旨在探索它们对内源性大麻素系统的影响。然而，不幸的是，它们被可疑实验室非法生产(18)。(R)-5-氟-ADB被认为是最危险的药物之一，与精神病、呕吐、瞳孔散大、意识模糊等严重症状有关，在某些情况下，甚至通过吸入导致死亡(19)。因此，(R)-5-氟-ADB药物在日本等国家已被禁止(20)。

在本研究中，我们假设合成大麻素(R)-5-氟-ADB可以调节内皮细胞的活力和脑细胞的血管生成率。此外，我们研究了GSK-3β的磷酸化状态以及几种促血管生成因子的表达，如人ANG-1、ANG-2和VEGF，以阐明体外血管生成与内源性大麻素系统受体之间的关系。

图1. (R)-5-氟ADB的化学结构

材料与方法

细胞系与培养条件

人脑血管内皮细胞(hBMECs)(CRL-3245*)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并在添加了10%胎牛血清(FBS)、1%抗生素浓度(青霉素和链霉素)、重组人表皮生长因子(rhEGF)、氢化可的松、硫酸肝素、牛脑提取物、L-谷氨酰胺和抗坏血酸(PCS-110-040’")(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯)的DMEM/F12培养基中培养。在的95%空气和培养箱中，在优质条件下进行孵育和细胞生长。细胞传代比例为1:4(21)。

药物治疗

从开曼化学公司(16603)订购了药物(R)-5-氟-ADB。将储备溶液稀释以制备除对照外的五种不同浓度和。

MTT 测定

使用 MTT 测定法评估药物处理对细胞活力的影响，该方法依赖于四唑盐颗粒还原形成甲臜晶体。收获细胞并计数，将每孔共个细胞接种到 96 孔板中并孵育。之后，向细胞中加入浓度范围为 0.0001 µM 至的(R)-5-氟-ADB，并孵育。随后，弃去药物，用含有 MTT 溶液的无血清培养基替换。在向每孔加入 DMSO 作为最后一步之前，将每个板孵育，由于其颗粒还原为甲臜，MTT 的黄色变为紫色。在读取结果之前，将板振荡 15 分钟，然后使用酶标仪在 (21)处测量吸光度。

体外伤口愈合测定

通过进行体外伤口愈合测定来评估内皮细胞迁移率。将细胞在 12 孔板中培养直至达到约 90%至 100%汇合度。孵育后，使用 1000 µl 移液器吸头在细胞单层上划出一道划痕，然后用磷酸盐缓冲盐水轻轻冲洗以确保所有脱落的细胞被去除。之后，将含有不同浓度(0.0001 和 )的(R)-5-氟-ADB 和对照的培养基一式三份加入到 12 孔板中并孵育 24 小时。在对细胞单层造成伤口时(基线)以及用药物孵育 24 小时后拍摄显微镜图像。所有测量均使用 ImageJ 软件(22)进行。

体外管形成测定

通过体外管形成测定评估增强血管生成的潜力。从赛默飞世尔科技公司购买冷冻的还原生长因子基底膜基质(BMM)(A1413302)并在下解冻过夜。在加入到 96 孔板后，将 50 µl 的 BMM 在下聚合。将含有的细胞悬液加入到涂有 BMM 的孔中，该细胞悬液存在于无血清生长培养基和三种不同浓度(0.0001μM、0.01 μM 和 1μM)的(R)-5-氟-ADB 的混合物中，并孵育。通过拍摄细胞形成的管状结构的显微镜图像来评估结果。确定各种血管生成测量值，包括管状结构的数量、分支点、环结构以及每个管的总长度(21)。

RNA 提取和实时 PCR 分析

使用总RNA纯化试剂盒(PP - 210L)(德国慕尼黑耶拿生物科学公司)从人脑微血管内皮细胞(hBMECs)中提取RNA，按照制造商推荐的方案进行操作。使用Nano - drop ND - 1000仪器(英国Bio Drop公司)测量纯化RNA样品的浓度和纯度。将纯化的RNA样品逆转录为cDNA。使用SOLIscript一步SolisGreen试剂盒(08 - 63 - 00250)对三个靶基因(VEGF、ANG - 1、ANG - 2)进行逆转录和扩增。具体的逆转录和扩增条件详见表S1。本研究中用于促血管生成基因以及参照基因β - 肌动蛋白的引物是根据之前发表的一篇文章(23)选择的。

蛋白质印迹法

采用蛋白质印迹法评估hBMECs中的蛋白质表达水平。简要地说，使用RIPA裂解缓冲液(ab156034；Abcam公司)和磷酸盐蛋白酶抑制剂(A32959；赛默飞世尔科技公司)的混合物裂解细胞。然后，使用DC蛋白质测定试剂盒II(#5000112，美国加利福尼亚州贝尼西亚市BioRad公司)测定每个样品的蛋白质浓度。总共的蛋白质加载到十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - PAGE)上，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。然后用2%牛血清白蛋白(BSA)封闭每个膜，接着与以下一抗孵育:抗β - 肌动蛋白(4967S；1:1000；Cell Signaling Technology公司)、抗ANG - 1(ab94684；1:500，Abcam公司)、抗ANG - 1(ab94684；1:500，Abcam公司)、抗VEGF - A(ab46154；1:500，Abcam公司)、抗总GSK - 3β(PA5 - 95845；1:1000，赛默飞世尔)和抗Ser9 - p - GSK - 3β(9336S；1:500，Cell Signaling Technology公司)。一抗在温度下与膜孵育过夜。最后，孵育HRP偶联的二抗，并检测化学发光信号。所有图像均使用ImageJ软件(24)进行分析。

酶联免疫吸附测定(ELISA)

采用ELISA评估细胞分泌到培养基中的蛋白质数量。在收集hBMECs之前，将其与(R) - 5 - Fluoro - ADB孵育，然后将培养基在10000 rpm下离心10分钟。人血管生成素1 ELISA试剂盒(ab99972)、人血管生成素2 ELISA试剂盒(ab99971)和人VEGF ELISA试剂盒(ab100662)均购自Abcam公司，所有步骤均按照试剂盒说明书中的说明进行。

统计分析

使用单向方差分析(one - way ANOVA)对数据进行统计分析，随后使用GraphPad Prism(美国加利福尼亚州拉霍亚市GraphPad软件公司，版本9.0.0)进行Turkey事后检验。当值低于0.05时，结果具有统计学意义。

结果

合成大麻素(R) - 5 - Fluoro - ADB可提高hBMECs的细胞活力

使用MTT法评估暴露于合成大麻素(R) - 5 - Fluoro - ADB后的细胞活力。结果表明，处理组hBMECs的活力逐渐增加(图2)。在浓度范围为0.01 且值小于0.05的(R) - 5 - Fluoro - ADB处理细胞中观察到显著更高的活力( 值对于值对于和两者)。

合成大麻素(R) - 5 - Fluoro - ADB促进hBMECs的细胞迁移率

内皮细胞迁移是启动血管生成的关键且必不可少的步骤。在不同浓度的(R)-5-氟-ADB作用下，人脑血管内皮细胞(hBMECs)的迁移速率有所提高。显微镜图像还显示细胞单层上造成的伤口尺寸减小(图3a)。与对照组相比，在、0.01μM、0.1μM和1μM(P<0.0001)的(R)-5-氟-ADB处理下，有显著增加(P值 = 0.0343)(图3b)。

图2. 如MTT活力测定所示，合成大麻素(R)-5-氟-ADB提高了hBMECs的增殖能力。在96孔板的每个孔中，将总共置于的DMEM/F12培养基中培养。随后，将hBMECs与(R)-5-氟-ADB孵育。用MTT溶液处理细胞，并使用酶标仪测量每个孔在处的吸光度。数据表示为平均值标准误(SEM)。(*)表示。

图3. 通过伤口愈合试验表明细胞迁移显著增加

(a)代表性显微镜图像显示了在基线(零时间)以及与不同浓度的(R)-5-氟-ADB孵育后的细胞单层。(b)迁移数据的定量分析表明，在不同浓度的(R)-5-氟-ADB下观察到显著的逐渐增加。(***)表示值<0.001。(****)表示值<0.0001。(n = 3)。

图4. 用(R)-5-氟-ADB处理后hBMECs的血管生成能力增强

(a)代表性显微镜图像描绘了与(R)-5-氟-ADB孵育24小时后管状结构的形成。在不同浓度的(R)-5-氟-ADB下检测到显著增加。研究的血管生成参数如下:(b)管状结构，(c)管长度，(d)分支数量(e)环。(**)表示值<0.001。(***)表示值<0.001。(***)表示。(n = 3)。

合成大麻素(R)-5-氟-ADB增强hBMECs的管状结构形成能力

通过体外管形成试验评估hBMECs的血管生成潜力。该试验使用三种浓度和1μM进行。检查了各种血管生成特征，包括管状结构形成数量、环、分支和管长度等指标，以评估血管生成能力。在和 - 5-氟-ADB处理下，所有血管生成参数的血管生成能力均观察到显著增加(图4a - e)。

用合成大麻素(R)-5-氟-ADB处理后ANG-1、ANG-2和VEGF的mRNA表达增加

进行实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)以评估(R)-5-氟-ADB处理后人类脑微血管内皮细胞(hBMECs)中的基因表达。PCR分析揭示了血管生成相关mRNA表达倍数变化的改变。血管生成素-1(ANG-1)的mRNA水平在时显示约2.2倍的增加，在时增加2.5倍，在时增加3.5倍，在时增加4.8倍(图5a)。相应地，与对照相比，血管生成素-2(ANG-2)mRNA水平在时增加1.6倍，在时增加 - 倍，在时增加 - 倍，在时增加3.2倍(图5b)。此外，用(R)-5-氟-ADB处理后，血管内皮生长因子(VEGF)的mRNA表达显著升高，与对照相比，在时增加1.4倍，在时增加2倍，在时增加 - 倍，在时增加 - 倍，在时增加5.4倍。

图5. 实时定量PCR显示几种血管生成相关基因的mRNA表达显著增加

(R)-5-氟-ADB处理后人类脑微血管内皮细胞(HBMECs)中(a)血管生成素-1(ANG-1)、(b)血管生成素-2(ANG-2)和(c)血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达率的定量分析。(***)表示 - 值。

合成大麻素(R)-5-氟-ADB增加细胞内Ser9-磷酸化糖原合成酶激酶-3β(Ser9-p-GSK-3β)、血管生成素-1(ANG1)、血管生成素-2(ANG-2)和血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白表达

采用蛋白质免疫印迹法(Western blotting)测定细胞中的蛋白质浓度和表达。在三种浓度的(R)-5-氟-ADB(0.0001μM、0.01μM和1μM)下分析了四种血管生成相关蛋白，包括Ser9-磷酸化糖原合成酶激酶-3β(Ser9-p-GSK-3β)、血管生成素-1(ANG-1)、血管生成素-2(ANG-2)和血管内皮生长因子(VEGF)。在经(R)-5-氟-ADB处理的hBMECs细胞以及对照中检测到Ser9-磷酸化糖原合成酶激酶-3β(~46 kD)、血管生成素-1(~57 kD)、血管生成素-2(~57 kD)和血管内皮生长因子(~27 kD)的特异性条带(图6a)。结果显示，与对照相比，在和时，(R)-5-氟-ADB处理后这些蛋白的表达显著增加(图6b - e)。

合成大麻素(R)-5-氟-ADB增加分泌的血管生成素-1(ANG-1)、血管生成素-2(ANG-2)和血管内皮生长因子(VEGF)的浓度

采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量培养基中细胞分泌的血管生成素-1(ANG-1)、血管生成素-2(ANG-2)和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白的浓度。在至范围内的五种不同浓度的(R)-5-氟-ADB下研究蛋白质分泌。结果表明，在所有血管生成相关蛋白中，四种最高浓度的蛋白质分泌水平显著增加(图7a - c)。

图6. 人类脑微血管内皮细胞(hBMECs)中p-Ser-9-GSK-3β/GSK-3β、血管生成素-1(ANG-1)、血管生成素-2(ANG-2)和血管内皮生长因子(VEGF)的细胞内蛋白表达率

用、 (R)-5-氟-ADB处理以及对照处理后，从人脑微血管内皮细胞(hBMECs)中分离出总蛋白。使用靶向一抗通过蛋白质印迹分析检测蛋白质表达。(a)所得代表性印迹。使用ImageJ软件对(b)Ser9-p-GSK-3β/总GSK-3β、(c)ANG-1、(d)ANG-2和(e)VEGF进行光密度分析。(***)表示。

讨论

合成大麻素(SCs)最初是为了模拟植物大麻素的作用和相互作用而开发的，有助于研究这些化合物与细胞上大麻素受体结合时发生的反应。不幸的是，这些化合物随后被滥用为成瘾物质，导致了不可预见的不良影响，在某些情况下甚至导致致命的过量服用。然而，多年来的广泛研究表明，SCs与体内各种细胞和化学活动，包括血管生成，有很强的相关性，而血管生成正是本研究的重点。大麻素受体CB1和CB2被认为是体内和脑细胞中最普遍的两种受体，影响大脑和人类神经系统内的细胞内信号(25)。合成大麻素(R)-5-氟-ADB被认为是CB1和CB2的强效激动剂(17)。本研究证明了其对脑细胞血管生成有显著影响，以及对细胞内各种细胞过程，如蛋白质和mRNA表达的影响。

近几十年来进行的大量研究集中在调查SCs对各种类型人类细胞的影响。SCs有可能影响细胞内过程，这可能产生刺激或抑制细胞活力的效果。一项研究评估了JWH-018对SH-SY5Y神经细胞活力的影响，结果显示对这些细胞没有显著影响(26)。然而，另一项研究调查合成大麻素CB83对人HT-29结肠直肠腺癌细胞的影响，清楚地表明细胞活力显著下降(27)。在本研究中，使用MTT活力测定法评估用(R)-5-氟-ADB处理的hBMECs的活力，结果显示细胞活力显著增加。这些发现与之前的一项研究一致，该研究表明当暴露于合成大麻素XLR-11时，hBMECs的增殖率提高且毒性作用降低(21)。

图7. 与(R)-5-氟-ADB孵育后，ANG-1、ANG-2和VEGF的释放显著受到刺激

通过酶联免疫吸附测定(ELISA)，研究了(a)ANG-1、(b)ANG-2和(c)VEGF的释放水平。(*)表示。

细胞迁移是血管生成、细胞发育、癌细胞转移和炎症的基本特征。活细胞应具备在组织和器官内迁移和生长的能力，参与免疫反应等生理和细胞过程(28)。暴露于合成大麻素XLR-11后，迁移率和脑血管生成率均显著提高(21)。此外，(R)-5-氟-ADB的主要受体CB1受体的敲低，损害了迁移和形成管状结构的能力(29)。另一方面，给予不同类型的SCs后观察到了抗血管生成作用。例如，合成大麻素WIN 55,212-2通过MAPK/Akt介导的凋亡信号通路降低了人子宫内膜异位细胞中的血管生成和增殖(30)。此外，暴露于合成大麻素URB447后，在结肠癌和黑色素瘤中观察到了抗转移和抗肿瘤作用(31)。在本研究中，用(R)-5-氟-ADB孵育后，使用体外伤口愈合试验评估了HBMECs的迁移率。结果表明迁移率显著增加，随着药物浓度的增加，细胞单层上造成的伤口以更快的速度缩小。此外，使用体外管形成试验验证了(R)-5-氟-ADB诱导的血管生成能力，显示所有研究的血管生成参数均明显增加。这些发现表明(R)-5-氟-ADB可能是一种有效的血管生成药物。因此，脑血管生成和增殖率的增加与大麻素受体的激活直接相关，表明(R)-5-氟-ADB在血管生成相关疾病的进一步研究和可能的治疗应用方面具有潜力。

血管生成调节涉及许多依赖蛋白质-受体相互作用的信号通路。在这些通路中，血管生成素家族由ANG-1和ANG-2组成，它们都与酪氨酸激酶Tie2受体结合(7)。有趣的是，它们在调节血管生成中表现出相互矛盾的作用，ANG-1促进血管形成和保护，而ANG-2则抵消这些作用并破坏血管生成(7)。ANG-2通过促进内皮细胞迁移、增殖和新分支的出现引发促血管生成反应，特别是在存在VEGF的情况下(32)。在用(R)-5-氟-ADB处理脑内皮细胞后，我们注意到ANG-1和ANG-2的表达均增加。这些发现引起了人们对ANG-1和ANG-2在促进脑血管生成中的潜在生物学功能的关注。此外，它强调了它们与大麻素受体的关系，特别是在存在VEGF的情况下。

VEGF与血管内皮生长因子受体(VEGFRs)结合时参与大多数血管生成信号过程(33)。VEGF参与多种血管功能，如血管腔的发育和诱导内皮细胞增殖。VEGF在内皮细胞迁移中也起着重要作用(6)。此外，发现VEGF蛋白家族调节胚胎以及肿瘤血管生成。抗VEGF药物对VEGFR信号的抑制现已成为癌症治疗的靶点(33)。有人提出大麻素受体激活可显著降低各种癌细胞系中VEGF的水平(34)。许多研究已经确定，受体行为根据所涉及细胞的特定特征和类型而有所不同。在本研究中，我们发现用(R)-5-氟-ADB孵育可显著改善HBMECs中大麻素受体的激活。我们的结果表明，促血管生成因子VEGF可能在促进大脑中与大麻素受体激活相关的血管生成中起关键作用。

糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)是一种广泛认可的蛋白质，参与人体全身的各种过程，包括神经发生和神经元迁移。研究发现，GSK-3β受细胞内钙水平的瞬时变化和一种钙依赖性酪氨酸激酶的调节(参考文献35、36)。此外，GSK-3β在发育中的大脑神经元中高度表达，但在人的一生中逐渐减少，在老年时达到最低浓度(参考文献10)。GSK-3β通过Tyr216的自磷酸化而被激活，而Ser9的磷酸化则导致其失活(参考文献37)。最近的研究表明，GSK-3可能是控制血管生成的主要靶点。GSK-3可能是治疗人类胶质瘤细胞的一种潜在策略，这揭示了GSK-3在血管生成调节中的关键作用(参考文献38)。此外，通过触发内皮细胞中的血管内皮生长因子A(VEGFA)，GSK-3/β-连环蛋白途径可诱导血管生成。抑制GSK-3信号传导可能通过促进内皮细胞释放多种血管生成蛋白来增强血管生成(参考文献39)。一项研究表明，合成大麻素HU-210通过激活CB1受体提高小脑颗粒细胞前体(GCPs)的增殖率。给予HU-210导致Ser9-p-GSK-3β磷酸化增加，表明磷酸化的Ser9-p-GSK-3β途径参与了GCP增殖的管理和调节(参考文献40)。我们发现，在用(R)-5-氟-ADB处理后，人脑微血管内皮细胞(hBMECs)在刺激大麻素受体时，Ser9-p-GSK-3磷酸化水平以及随后的GSK-3失活显著增强。这意味着GSK-3β可能参与大麻素受体激活后的细胞内途径，可能在脑血管生成中发挥作用。

我们已经证明了(R)-5-氟-ADB对脑内皮细胞的促血管生成作用，并研究了这些发现对血管生成过程的影响。然而，必须承认这项研究存在某些局限性。血管形成是一个由多种蛋白质调节的复杂过程，本研究未对这些蛋白质进行研究，包括成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGFs)以及NOTCH和WNT信号通路等。探索这些蛋白质的表达谱及其与大麻素受体激活的关联至关重要。此外，研究其他与GSK-3β相关的细胞内蛋白质，如 -连环蛋白和Akt，也具有重要意义。

结论

每年都会在药物滥用者中发现新的合成大麻素(SCs)，因为它们被开发出来以逃避监管并对使用者产生更强的影响。据我们所知，这是第一项关于(R)-5-氟-ADB对体外脑血管生成影响的研究。用合成大麻素(R)-5-氟-ADB处理hBMECs，在中高浓度下可提高内皮细胞的活力和血管形成能力，表明(R)-5-氟-ADB刺激脑血管生成。此外，Ser9-p-GSK-3β、血管生成素-1(ANG-1)、血管生成素-2(ANG-2)和血管内皮生长因子(VEGF)介导了脑内皮细胞中的诱导血管生成信号。这些结果揭示了SCs对脑内皮细胞影响的更多细节，这有助于发现控制和调节几种血管生成相关疾病的新治疗方法。