菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对麦醇溶蛋白细胞毒性及Caco-2细胞紧密连接相关基因表达的蛋白水解作用
发布时间：
2026-07-10 21:48
菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对麦醇溶蛋白细胞毒性及Caco-2细胞紧密连接相关基因表达的蛋白水解作用
马苏梅·萨达特·穆萨维·马莱基 • 胡曼·阿加米尔扎·莫吉姆·阿里·阿巴迪 • 贝赫鲁兹·瓦齐里 • 阿里·阿克巴尔·沙巴尼 • 加扎莱·加瓦米 哈米德·马达尼奇 D • 索鲁什·萨尔达里
收稿日期:2023年7月26日 / 录用日期:2023年9月11日 / 在线发表日期:2023年10月6日
© 作者，独家授权给施普林格 - 维也纳有限公司，施普林格自然集团的一部分，2023年
摘要
用于乳糜泻(CeD)的酶疗法，即将麦醇溶蛋白消化成无免疫原性和无毒的肽段，可能是CeD的一种合适治疗选择。在此，我们使用体外实验，如SDS - PAGE、HPLC和圆二色性(CD)，研究了菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对麦醇溶蛋白消化的有效性。此外，使用MTT法在Caco - 2细胞系中评估了这些酶消化前后麦醇溶蛋白和19聚体肽的细胞毒性。最后，我们研究了这些处理以及醋酸拉佐替丁对Caco - 2细胞系中紧密连接相关基因，如闭合蛋白、紧密连接蛋白3、紧密连接蛋白 - 1和zonulin表达的影响。我们的研究通过SDS - PAGE、HPLC和CD证明了菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对市售和小麦提取的麦醇溶蛋白的消化作用。此外，对Caco - 2细胞的细胞毒性结果表明，添加菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶可降低麦醇溶蛋白和合成19聚体肽的毒性。此外，菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对麦醇溶蛋白的蛋白水解作用表明紧密连接相关基因的表达得到改善。本研究证实菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶混合物可能对改善CeD症状有效。
关键词 麸质 麦醇溶蛋白 菠萝蛋白酶 无花果蛋白酶 乳糜泻
引言
乳糜泻是一种自身免疫性肠病，其特征是小肠黏膜绒毛变平。在遗传易感人群中，摄入麸质(小麦、大麦和黑麦的蛋白质部分)会引发该病(迪·萨巴蒂诺和科拉扎，2009年)。遗传学、免疫学和环境因素在CeD的发展中至关重要。该病选择性地发生在表达HLA - DQ2或HLA - DQ8基因的个体中(洛佩斯·卡萨多等人，2018年)。最重要的环境因素是麸质的摄入，它引发CeD，被认为是该病发病机制的第一阶段(阿尔哈桑等人，2019年)。麸质是一种不溶性醇溶蛋白多肽的复杂混合物，在小麦(麦醇溶蛋白)、大麦(大麦醇溶蛋白)、黑麦(黑麦醇溶蛋白)、玉米(玉米醇溶蛋白)、高粱(高粱醇溶蛋白)中含量高，在燕麦(燕麦醇溶蛋白)和大米(水稻醇溶蛋白)中含量低(塞博拉等人，2018年)。胃肠道蛋白酶对麦醇溶蛋白的消化受损会产生具有免疫原性和毒性的肽段，其中13聚体、19聚体和33聚体肽段的免疫原性和毒性更强(奇巴尔和迪勒曼，2019年)。与CXCR3结合的19聚体肽会导致zonulin释放和紧密连接(TJ)功能障碍。由于肠道通透性，麦醇溶蛋白肽段，尤其是33聚体，到达固有层，在那里它们被组织转谷氨酰胺酶(tTG)修饰，增强了它们与MHC II分子的亲和力，并刺激Th1和Th2炎症途径(阿尔哈桑等人，2019年)。
处理编辑:S. 布勒
M 哈米德·马达尼奇
hamidmadanchi@yahoo.com
& 索鲁什·萨尔达里
ssardari@hotmail.com
1 伊朗塞姆南医科大学神经系统干细胞研究中心，塞姆南
2 伊朗塞姆南医科大学医学院医学生物技术系，塞姆南
3 伊朗塞姆南医科大学学生研究委员会，塞姆南
4 伊朗德黑兰巴斯德研究所生物技术研究中心
5药物设计与生物信息学单元，伊朗巴斯德研究所生物技术研究中心医学生物技术部，伊朗德黑兰13198
乳糜泻影响约 的普通人群，在全球范围内，成人和儿童的发病率都在上升(Agarwal等人，2016年；Alhassan等人，2019年)。目前，乳糜泻唯一可接受的治疗方法是终身遵循无麸质饮食，这对许多患者来说具有挑战性、难以忍受且昂贵(Tye-Din等人，2018年)。此外，仅有无麸质饮食通常不足以控制症状和预防粘膜损伤(Alhassan等人，2019年)。多项针对乳糜泻患者的研究表明，尽管多年来一直坚持无麸质饮食，但肠道粘膜并未完全改善(Lanzini等人，2009年；Rubio-Tapia等人，2010年；Lebwohl等人，2014年；Newnham等人，2016年)。此外，由于食物和药物的污染，许多患者可能会无意中接触到麸质，这会导致症状发作和粘膜损伤(Tye-Din等人，2018年；Alhassan等人，2019年)。一些难治性乳糜泻(RCD)患者对无麸质饮食无反应(Volta和Caio，2016年)。然而，尽管存在上述所有局限性，但遵循无麸质饮食仍被认为是预防和改善乳糜泻症状的最有效方法。尽管如此，开发一种新的非饮食疗法，如与无麸质饮食一起使用的酶疗法，以控制症状、管理疾病和消除肠道炎症可能会有所帮助。
麦醇溶蛋白富含脯氨酸和谷氨酰胺，因此在肠道中不易被消化(Hausch等人，2002年；Helm-erhorst等人，2010年)。能将麦醇溶蛋白消化成非免疫原性肽的麸质消化酶可能是乳糜泻的一种可接受的治疗方法(Yoosuf和Makharia，2019年)。到目前为止，仅对少数源自谷物、细菌和真菌的内肽酶，如ALV003、AN-PEP、STAN-1等，进行了麸质酶消化的研究(Yoosuf和Makharia，2019年)。
菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶分别是半胱氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶家族的成员，它们分别来源于菠萝和榕树的乳胶(Devaraj等人，2008年；Ha等人，2012年)。
菠萝蛋白酶具有蛋白水解作用，有助于蛋白质的消化。菠萝蛋白酶的其他主要药理作用与其抗炎、抗氧化、抗癌和纤溶特性有关(Rathnavelu等人，2016年)。菠萝蛋白酶抑制前列腺素E2的生物合成。此外，菠萝蛋白酶抑制NF-κB途径、环氧合酶2(COX2)和缓激肽，从而减轻疼痛和炎症(Pavan等人，2012年；Esam，2020年)。在由细胞因子产生引起的炎症条件下，菠萝蛋白酶可减少IL-1β、IL-6和TNF-α的分泌(Chermahini，2020年)。研究还表明，菠萝蛋白酶可降低炎症性肠病(IBD)中INF- 、TNF- 和CCL4/巨噬细胞抑制蛋白(MIP)-1 的表达(Onken等人，2008年)。
无花果蛋白酶属于C1木瓜蛋白酶家族(CA家族)，被认为是一种巯基酶，具有蛋白酶和过氧化物酶活性(Homaei等人，2017年；Yang等人，2017年)。它在甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、酪氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和缬氨酸的羧基侧切割蛋白质(Yang等人，2017年)。无花果蛋白酶还通过抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达以及抑制IκB/NF-κB、MAPK(ERK、JNK、p38)和STAT3的磷酸化来发挥其抗炎活性(Cho等人，2019年)。
基于我们对菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶酶切位点的了解，以及基于先前研究和这两种酶对麦醇溶蛋白序列切割的预测而得出的它们的抗炎特性，本研究选择了菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶。因此，在本研究中，在模拟菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对麦醇溶蛋白序列以及33聚体和19聚体肽的酶切后，预测了消化片段的毒性和免疫原性。接下来，对通过33聚体和19聚体肽的酶切获得的片段进行转谷氨酰胺酶功能模拟，并用谷氨酸取代它们的谷氨酰胺残基。这些肽片段与HLA-DQ2和HLA-DQ8对接，并将其结果与完整的33聚体和19聚体肽进行比较。接下来，我们通过一系列体外试验，如SDS-PAGE、HPLC和圆二色性(CD)，研究了菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对商业来源和从小麦中提取的麦醇溶蛋白的消化作用。此外，还研究了酶消化前后麦醇溶蛋白和19聚体肽对Caco-2细胞系的细胞毒性。最后，评估了这些处理以及醋酸拉佐肽肽的干预对同一细胞系中参与细胞连接的基因表达的影响。在所有步骤中，合成的19聚体肽用作阳性对照。醋酸拉佐肽(AT-1001)是一种抗zonulin，用作肠道紧密连接调节剂，用于治疗乳糜泻(Hoilat等人，2022年)。
材料和方法
化学品、培养基和细胞系
购自美国密苏里州圣路易斯市西格玛奥德里奇公司的产品有:小麦麦醇溶蛋白(G3375)、菠萝茎菠萝蛋白酶(B4882)、无花果乳胶无花果蛋白酶(F6008)、醋酸拉佐肽(SML2475)和胃蛋白酶。购自德国达姆施塔特默克密理博公司的产品有:乙酸、布拉德福德溶液(超纯水、考马斯亮蓝g-250、95%乙醇、85%正磷酸)、三(羟甲基)氨基甲烷(三羟甲基氨基甲烷)、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)、甘氨酸、 、氯化钠、碳酸氢钠 、1-丁醇、乙腈和三氟乙酸(TFA)。购自伯乐公司的产品有:丙烯酰胺(99.9%，双 -亚甲基双丙烯酰胺)、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)和曲拉通X-100。购自美国密苏里州圣路易斯市西格玛奥德里奇公司的产品有: -四甲基乙二胺(TEMED)。购自普洛麦格公司的产品有:溴酚蓝。还使用了密理博超纯水(UPW)。使用人结肠癌细胞系(来自伊朗巴斯德研究所国家细胞库，NCBI代码C139的Caco-2)进行细胞毒性测试。购自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市吉比科公司的产品有:RPMI(罗斯韦尔公园纪念研究所培养基)1640培养基和胎牛血清(FBS)。用于细胞培养的抗生素(青霉素和链霉素)、台盼蓝染料、胰蛋白酶、盐酸、氢氧化钠、MTT染料[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑]、戊二醛和二甲基亚砜(DMSO)购自美国密苏里州圣路易斯市西格玛奥德里奇公司。
肽合成
具有LGQQQPFPPQQPYPQPQPF序列的19聚体肽由Pepmic有限公司(中国苏州)使用应用N - 9芴甲氧羰基(Fmoc)化学的固相方法合成，并使用C18反相高效液相色谱(RP - HPLC)纯化至95%。在美国康涅狄格州诺沃克市珀金埃尔默公司的Sciex API100 LC/MS质谱仪上以正离子模式进行的质谱分析用于确定合成肽的分子量。
酶促裂解模拟和免疫信息学研究
从NCBI数据库中检索醇溶蛋白的序列，并确定其两个有毒肽序列(33聚体和19聚体)。此外，基于先前的实验研究(阿伦特等人，2011年；费雷蒂等人，2012年；康奈尔和斯特尔马西亚克，2016年；普兰迪，2017年；塞博拉等人，2018年)获得醇溶蛋白的有毒肽序列，并根据其来源进行分类。根据先前研究确定菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶的裂解位点，并在完整的醇溶蛋白、33聚体、19聚体和醇溶蛋白有毒肽中模拟酶促消化。接下来，分别通过ToxinPred(https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/algo.php)和IEDB(https://www.iedb.org)服务器预测酶消化肽的毒性和免疫原性。最后，对33聚体和19聚体肽酶促裂解得到的片段进行组织转谷氨酰胺酶功能模拟，将其谷氨酰胺残基替换为谷氨酸。
分子对接模拟
HLA - DQ2(PDB ID:1s9v)和HLA - DQ8(PDB ID:2nna)的三维结构从蛋白质数据库(PDB)(https://www.rcsb.org/)获得。对结构进行清理，删除结晶水和共结晶分子，仅保留每个受体的单体形式。然后，通过UCSF Chimera软件中的Dock prep工具对这些结构进行制备。此外，将19聚体和33聚体肽及其消化衍生物的序列保存为单独的FASTA格式。在组织转谷氨酰胺酶的作用下模拟所有这些肽的序列变化。利用GalaxyPepDock网络服务器(http://galaxy.seoklab.org/cgibin/submit.cgi?type=PEPDOCK)在选定的人类MHC II类PDB文件和相关肽之间进行蛋白质 -肽对接。基于PRODIGY(蛋白质结合能量预测)网络服务器(https://bianca.science.uu.nl/prodigy/)预测肽 - 蛋白质复合物的结合亲和力和解离常数(Kd)。根据Prodigy(Kd)选择最佳对接结果，即具有最低分子间能量的顶级聚类。
醇溶蛋白的分离和制备
在本研究中，使用了商业麦醇溶蛋白(sigma)和从小麦粉中提取的麦醇溶蛋白。根据Tatham等人(2000年)的方法，从普通小麦粉中提取麦醇溶蛋白。将小麦粉(0.5 g)与5 的1-丁醇在室温下搅拌 。将面粉-丁醇混合物在 下离心 ，然后去除上清液。将沉淀与5 ml的 在室温下混合 。离心后，去除上清液，剩余残渣用水洗涤。将沉淀与 的 乙醇混合并搅拌 以提取麦醇溶蛋白。采用Bradford法测定提取的麦醇溶蛋白浓度，并使用SDS-PAGE将麦醇溶蛋白组分(it)的 与作为对照的商业麦醇溶蛋白一起进行评估。对于商业麦醇溶蛋白，将其 溶解在 的 乙醇中。
菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对麦醇溶蛋白酶解过程的优化
将浓度为 的麦醇溶蛋白分别与相同浓度的菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶以V/V% 1:1(酶；底物)的比例在 下孵育 。此外，在另一个反应中，将麦醇溶蛋白在上述条件下用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶的混合物处理。通过煮沸 终止酶促水解。样品在 下保存，直至进行进一步的化学分析(Cavaletti等人，2019年)。
为了优化菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对麦醇溶蛋白的蛋白水解活性，测试了四个可变参数，包括麦醇溶蛋白和酶的浓度、酶与底物的比例、温度和孵育时间。接下来，选择最佳条件并在此状态下重复测试。将 的麦醇溶蛋白分别与菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶(酶:底物，1:1、1:10、1:100)在室温、 和 下孵育不同时间点( ，以及过夜)。通过煮沸 终止酶促水解。
麦醇溶蛋白胃消化模拟
通过向 的麦醇溶蛋白中加入 的模拟胃液(SGF) 进行体外胃消化。在 下孵育后，加入 的胃蛋白酶并在 下孵育 。通过加入 将 提高到7来终止反应(Smith等人，2015年)。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
使用德国艾本德公司的分光光度计，依据Bradford法，以牛血清白蛋白(BSA)为标准，在595nm波长下测定样品的蛋白质浓度(Bradford，1976年)。
采用SDS-PAGE试验对纯化酶进行纯度测定和分子量估计。将20 l洗脱样品和 l预染蛋白Marker(BLUelf，GeneDirex)用12.5%分离胶和5%浓缩胶进行分离，在 条件下电泳90分钟。运行缓冲液为Tris-甘氨酸(pH 8.3)。电泳后，凝胶用固定液固定60分钟，然后用超纯水洗涤三次。最后，凝胶用考马斯亮蓝胶体(G-250)染色液过夜染色，然后用1% v/v乙酸溶液脱色1小时(Wanderley等人，2004年)。
酶的蛋白水解功能的反相高效液相色谱法
使用克瑙尔高效液相色谱系统(德国)进行反相高效液相色谱(RP - HPLC)分析。样品悬浮于0.1%三氟乙酸(TFA)中，通过C18色谱柱(TSKgel ODS - 100V，5μm，250×4.6mm内径，东曹生物科学有限责任公司，普鲁士国王镇)进行分离。进样体积为 。洗脱液A是超纯水中含 的三氟乙酸(v/v)，洗脱液B是乙腈中含0.1%的三氟乙酸(v/v)。色谱柱用60%的洗脱液B平衡。以 的流速在3分钟内施加60 - 100%的洗脱液B线性梯度对样品进行分离。使用恒温柱温箱，在 条件下进行色谱分离。用紫外二极管阵列(PDA)检测器在 波长处监测色谱柱流出物(Tian等，2014；Cavaletti等，2019)。
圆二色性(CD)研究
用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶处理前后19聚体肽二级结构含量的变化，可能是显示麦醇溶蛋白或19聚体肽被酶的蛋白水解活性消化的另一种方式。在我们的研究中，为了评估用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶处理后19聚体肽的二级结构变化，进行了圆二色光谱测量。首先，制备浓度为 的19聚体肽水溶液的 ，并在 下用浓度为 的菠萝蛋白酶的 处理 。对无花果蛋白酶重复相同的过程。使用Jasco J - 810旋光仪(日本Jasco公司)在 以 扫描速度通过圆二色光谱法测定上述反应在处理前(t0)和处理后(t24)的平均残基摩尔椭圆率。为此，将上述反应装入1mm石英池中，并从190至 扫描其光谱(Herrera等人，2014年)。
酶解前后麦醇溶蛋白和19聚体肽的细胞毒性测定
进行了比色MTT测定(Madanchi等人，2020年)，以确定麦醇溶蛋白、经菠萝蛋白酶-无花果蛋白酶混合物(BF)和醋酸拉佐替丁(LA)处理前后的19聚体肽的毒性。简要地说，将Caco2细胞以 个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在 下，在相对湿度为 的 气氛中孵育 。然后，用含有10%胎牛血清的新鲜RPMI培养基替换旧培养基，并将细胞孵育 。对每个浓度的五个孔进行分析，并使用柱洗脱缓冲液作为对照。向每个孔中加入新鲜制备的 ml PBS中MTT的 溶液，并在 下再孵育 。去除培养基后，在每个孔中加入 DMSO。轻轻摇动平板以确保形成的甲臜晶体完全溶解。使用酶标仪(STAT FAX 2100，BioTek，美国佛蒙特州威努斯基)在 处测量吸光度值。计算细胞毒性百分比和半数最大抑制浓度(IC50)。所有实验均重复三次。
细胞活力的计算方法如下:
通过qRT-PCR评估参与细胞连接的基因表达
为了确定细胞连接蛋白的基因表达，如闭合蛋白、紧密连接蛋白(TJP)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、zonulin和claudin，按照先前描述的方法(Madanchi等人，2022年)进行RT-qPCR。为此，使用血液/培养细胞总RNA纯化试剂盒(德国耶拿的耶拿生物科学公司)根据制造商的方案从Caco-2细胞中分离总RNA。在提取的总RNA最终洗脱后，使用NanoDrop 分光光度计(日本东京的日立公司)检测提取的总RNA的质量和数量。使用SCRIPT cDNA合成试剂盒(德国耶拿的耶拿生物科学公司)进行cDNA合成。使用ABI系统(应用生物系统公司；赛默飞世尔科技公司)和含有高ROX的Real Q plus 2×主混合绿色试剂(丹麦的Ampliqon公司)进行qPCR。qPCR的操作如下:在 下进行初始变性 个循环，变性(在 下20秒)和退火(在52 - 62下 )；然后在 下延伸 。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)管家基因作为内部参照基因。除GAPDH外，使用AllelID软件设计引物序列，并通过寡核苷酸分析仪和引物blast工具进行评估。引物由SinaClon(伊朗德黑兰的SinaClon公司)提供，见表1。
统计分析
使用IBM SPSS Statistics 20版(IBM公司)对数据进行评估。数据以平均值 标准差表示。所有测试均重复三次。使用单因素方差分析，然后进行Tukey事后检验来获得组间差异。 被认为显示出显著差异。
表1引物序列
| 引物名称 | 序列 |
| 闭合蛋白(OCL) | 正向:5’-CATCTGACTATGTGGAAA GAG-3’ |
| 反向:5’-CGAAGTTAATGGAAGCTC CTG-3’ | |
| 紧密连接蛋白3(CLDN) | 正向:5’-GCCACCAAGGTCGTCTAC TC-3’ 反向:5’-ACGTAGTCCTTGCGGTCGT-3’ |
| 紧密连接 | 正向:5’-GTGTTGTGGATACCTTGT-3’ |
| 蛋白-1(TGP)或 紧密连接蛋白1(ZO-1) | 反向:5’- GATGATGCCTCGTTCTAC-3’ |
| 闭合蛋白原(ZON) | 正向:5’-TTGTAGAGATTGAGAAGG TTG-3’ |
| 反向:5’-TTGAAGGTAGGCAGATGG-3’ | |
| 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 正向:5’-GTCTCCTCTGACTTCAAC AGCG-3’ |
| 反向:5’-ACCACCCTGTTGCTGTAG CCAA-3’(穆罕默德扎德等人，2023年) |
结果
麦醇溶蛋白、33肽和19肽的酶消化模拟
在麦醇溶蛋白、33肽和19肽的序列中确定了菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶的酶切位点，并在这些序列中模拟了其他麦醇溶蛋白毒性肽和酶切过程，所得片段列于表2、3和4中。此外，还预测了麦醇溶蛋白、33肽和19肽酶切后所得肽的毒性和免疫原性。菠萝蛋白酶的酶切位点在酪氨酸(W)、赖氨酸(K)和丙氨酸(A)残基的C末端，而无花果蛋白酶的酶切位点在甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、酪氨酸(Y)和谷氨酸(E)残基的C末端，这些残基位于疏水亚基之后。显然，菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶可消化麦醇溶蛋白序列及其衍生的毒性肽，用这两种酶酶解得到的肽无毒、无免疫原性或免疫原性较弱。
表2 菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对麦醇溶蛋白的酶消化模拟
| 酶 | 麦醇溶蛋白酶解后的肽序列 | 毒性 | 免疫原性评分 |
| 菠萝蛋白酶 | VRVPVPQLQPQNPSQQQPQEQVPLVQQQQFPGQQQPFPPQQP | NT | - 1.66 |
| POPQPFPSQQP | NT | -0.34 | |
| LOLOPFPOPQLP | NT | - 0.25 | |
| POPOPFRPQOP | NT | - 0.14 | |
| SQPQQPISQQQQQQQQQQQQ | NT | -1.45 | |
| QQQQQQQILQQILQQQLIPCRDVVLQQHSI | NT | -1.02 | |
| GSSQVLQOST | NT | - 0.44 | |
| QLVQOLCCQQLWQIPEOSRCQ | NT | -0.5 | |
| IILHQQQQQQQQQQQQQPLSQVSFQQPQQ | NT | - 2.02 | |
| PSGOGSFOPSOONPO | NT | - 0.63 | |
| OGSVOPOOLPOFEEIRNL | NT | -0.02 | |
| PVGIFGTN | NT | 0.32 | |
| 无花果蛋白酶 | MKTFLILALLAIVATTARIAVRVPVPOLOPONP | NT | 0.63 |
| OOOPQEOVPLVOOOOFP | NT | - 0.48 | |
| OQOPFPPOOP | NT | -0.12 | |
| OOPYLOLOPFPOPOLP | NT | -0.38 | |
| POPOPFRPQOP | NT | -0.0.14 | |
| POSOPOYSOPOOPI | NT | - 0.79 | |
| QQQQQQQQQQQQQKQQQQQQQQILQQILQQQLIPCRDVVLQQHSIAYG | NT | - 2.49 | |
| SOVLOOSTYOLVOOLCCOOLWOIP | NT | - 0.82 | |
| QSRCQAIHNVVHAIILHQQQQQQQQQQQQQPL | NT | -0.86 | |
| FQOPQQQYP | NT | -0.37 | |
| VOPOOLPOF | NT | -0.32 | |
| TLPAMCNVYIPPYCTIAPV | NT | 0.084 |
a免疫原性评分 被视为诺丽免疫原性表位
表3菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对33肽和19肽的酶解模拟
| 酶 | 33肽和19肽酶切后的肽序列 | 毒性 | 免疫原性评分 |
| 菠萝蛋白酶 | PGQQQPFPPQQPY | NT | - 0.35 |
| PQPQPF | NT | - 0.13 | |
| LQLQPFPQPQLPY | NT | - 0.25 | |
| PQPQLPY | NT | - 0.13 | |
| 无花果蛋白酶 | QQQPFPPQQPY | NT | -0.12 |
| PQPQPF | NT | - 0.13 | |
| LQLQPFPQPQLPY | NT | - 0.25 | |
| PQPQLP | NT | 0.13 |
菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶消化前后HLA - DQ2和HLA - DQ8与33肽和19肽相互作用的模拟
为了比较通过菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对33肽(LELEPFPEPELPYPEPELPYPEPELPYPEP)和19肽(LGEEEPFPPEEPYPEPEPF)进行酶切得到的肽段与消化前亲本肽段在与HLA - DQ2和HLA - DQ8分子相互作用时的结合亲和力，利用GalaxyPepdock软件设计了分子对接模拟。如表2所示，在通过菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对这两种肽进行酶切得到的所有肽段中，只有两个序列的残基超过11个且能与HLA - DQ相互作用。因此，对19肽、33肽以及它们酶切得到的两种肽(PGQQQPFPPQQPY 19mer1和LQLQPFPQPQLPY或33mer1)进行组织转谷氨酰胺酶处理，将它们所有的谷氨酰胺都转化为谷氨酸，然后评估它们与HLA - DQ2和HLA - DQ8分子的相互作用(图1)。使用PRODIGY软件进行分子对接分析的结果表明，33肽和19肽与HLA - DQ2和HLA - DQ8分子之间的结合亲和力高于这两种肽经菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶酶切后得到的肽段(表5)。如表5所示，19肽和33肽与HLA - DQ2和HLA - DQ8形成复合物的 和Kd远低于这些肽用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶消化后的情况。 和 参数的值越小，肽与HLA - DQ的结合亲和力就越大，所以用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶消化后的肽引发免疫反应的能力比其完整状态时弱。
表4 菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶以及这两种酶的混合物对麦醇溶蛋白衍生的毒性肽的酶切作用
| 毒性肽/起源与位置 | 菠萝蛋白酶消化 | 用无花果蛋白酶消化 | 菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶的消化作用 |
| LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQP | LQLQPFPQPQLPY | LQLQPFPQPQLPY | LQLQPFPQPQLPY |
| F/α-2麦醇溶蛋白，56 - 88(33肽) | PQPQLPY | PQPQLPY | PQPQLPY |
| PQPQPF | PQPQPF | PQPQPF | |
| FLQPQQPFPQQPQQPYPQQPQQPFPQ/γ-5麦醇溶蛋白26 - 51 | 弗洛普QQPFPQQPQQPY PQQPQQPFPQ | 弗尔克·冯·昆海姆(Folker von Kunheim) | 弗洛普克奥普弗普克克皮克皮克皮伊 皮克皮克皮克弗普克 |
| LQPQQPFPQQPQQPYPQQPQ/γ-5麦醇溶蛋白，60-79 | LQPQQPFPQQPQQPY PQQPQ | LQPQQPFPQQPQQPY PQQPQ | LQPQQPFPQQPQQPY PQQPQ |
| QQQQPPFSQQQQSPFSQQQQ/谷蛋白 | - | QQQQPPFS QQQQS PFS QQQQ | QQQQPPFS QQQQS PFS QQQQ |
| LGQQQPFPPQQPYPQPQPF/A-醇溶蛋白，31 - 49(19肽) | LGQQQPFPPQQPY PQPQPF | LGQQQPFPPQQPY QQQPFPPQQPY PQPQPF | LGQQQPFPPQQPY QQQPFPPQQPY PQPQPF |
| QLQPFPQPELPYPQPQS/A-麦醇溶蛋白，57-73 | QLQPFPQPELPY PQPQS | QLQPFPQPELPY PQPQS PQPQ | QLQPFPQPELPY PQPQS PQPQ |
| VQGQGIIQPQQPAQL/γ-麦醇溶蛋白 | VQGQGIIQPQQPA QL | VQG QG IIQPQQPAQL | VQGQGIIQPQQPA IIQPQQPAQL |
| QQPPFSQQQQQPLPQ/麦谷蛋白 | - | QOPPFS QQQQQPLPQ | QQPPFS QQQQQPLPQ |
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面粉中提取的麦醇溶蛋白的评估
在本研究中，从小麦面粉中提取了麦醇溶蛋白，并通过SDS - PAGE结果分离了麦醇溶蛋白片段( 和 麦醇溶蛋白)。麦醇溶蛋白的蛋白条带模式如图2所示。此外，提取的麦醇溶蛋白与商业麦醇溶蛋白(sigma)的条带模式比较如图2所示。
菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对麦醇溶蛋白的酶解及该过程的优化
用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对麦醇溶蛋白进行酶解，在不同温度、处理时间和浓度条件下进行，并通过12% SDS - PAGE分析结果。SDS - PAGE凝胶分析结果表明，在所有处理时间和温度下，酶与麦醇溶蛋白浓度比为1:100时，菠萝蛋白酶能更好地分解麦醇溶蛋白(图3)。
还发现，在室温或RT条件下，酶与麦醇溶蛋白比例为1 - 100时，获得了最佳酶解结果。同样，在相同处理比例下， 温度下的酶处理效果优于 温度。之前所有文章都提到菠萝蛋白酶发挥作用的最佳温度是 。在3和 温度下的酶处理结果表明，酶与麦醇溶蛋白比例为1:100时，处理 后麦醇溶蛋白的消化率更高，与麦醇溶蛋白相关的条带变浅。但总体而言，从室温及 温度下的处理获得了几乎相似的结果。
图1 用Chimera软件模拟复合物的三维结构
表5 HLA - 肽复合物的结合能 和亲和力(Kd)分析
| 分子相互作用 | (千卡/摩尔) | ℃时的解离常数(M) |
| HLA - DQ2 - 19聚体 | - 9.4 | 1.4e-07 |
| HLA - DQ2 - 19聚体1 | - 7.9 | 1.5e-06 |
| HLA - DQ2 - 33聚体 | -12.0 | 1.6e-09 |
| HLA - DQ2 - 33聚体1 | -8.3 | 7.8e-07 |
| HLA - DQ8 - 19聚体 | - 9.4 | 1.3e-07 |
| HLA - DQ8 - 19聚体1 | - 7.6 | 2.5e-06 |
| HLA - DQ8 - 33聚体 | - 13.1 | 2.4e-10 |
| HLA - DQ8 - 33聚体1 | - 8.1 | 1.1e-06 |
此外，在一项单独的实验中，在室温和 条件下，以三种酶与麦醇溶蛋白的浓度比重复实验，并处理 时间。该测试结果再次用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析(图4)。结果表明，在高酶与麦醇溶蛋白比例(1:1)下，酶解速率提高，麦醇溶蛋白分解效果更好。此外，在无花果蛋白酶作用下，1:1和1:10(酶与麦醇溶蛋白)的比例中，麦醇溶蛋白条带的分解效果更好
图2 从小麦粉中提取的商业麦醇溶蛋白的蛋白条带比较。第1列与提取的麦醇溶蛋白( /毫升)相关，第2列和第3列与不同浓度(0.5和 )的商业麦醇溶蛋白相关
图3 在不同温度和时间条件下，用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶以1:100比例处理前后麦醇溶蛋白条带模式的SDS-PAGE图。各列代表不同的温度和时间处理，包括1. 蛋白质大小标记物，2. 用无花果蛋白酶或GF( )处理的麦醇溶蛋白，3. 用菠萝蛋白酶或GB 处理的麦醇溶蛋白。GF ，5. GB 。GF(37 ，GB ，8. GF(室温，16小时)，9. GB(室温，16小时)，10. 未用酶处理的麦醇溶蛋白作为对照
图4 在室温和 条件下，用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶以1:100、1:10和1:1比例处理 前后麦醇溶蛋白条带模式的SDS-PAGE图。各列代表不同的温度和时间处理，包括1和11. 蛋白质大小标记物，第2、3和4列分别是在室温、16小时，比例为1:100、1:10和1:1时用菠萝蛋白酶(GB)处理的麦醇溶蛋白。第5、6和7列分别是在室温、16小时，比例为1:100、1:10和1:1时用无花果蛋白酶(GF)处理的麦醇溶蛋白。第8、9和10列是麦醇溶蛋白:菠萝蛋白酶(热灭活)，第18、19和20列是麦醇溶蛋白:无花果蛋白酶(热灭活)，分别作为1:100、1:10和1:1比例的对照。第12至14列，GB， ，比例分别为1:100、1:10和1:1。第15至17列，GF， ，比例分别为1:100、1:10和1:1，比菠萝蛋白酶好。同时，在之前的测试以及同一测试的重复中发现，在1:100处理比例下，菠萝蛋白酶对麦醇溶蛋白的降解比无花果蛋白酶好。
图5 该图像显示了麦醇溶蛋白条带在被SGF消化前(第4列)和消化后(第3列)、SGF:菠萝蛋白酶(第2列)以及SGF:BF(第1列)的SDS-PAGE凝胶图。第5列是蛋白质大小标记物
简而言之，可以说，基于对菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶酶切条件的优化，在我们的实验中，这两种酶活性的最佳温度在 下保持 。此外，酶与底物比例为1:100的菠萝蛋白酶在麦醇溶蛋白消化中显示出比无花果蛋白酶更好的结果，但在酶与底物比例为1:1和1:10时，无花果蛋白酶的表现优于菠萝蛋白酶。
胃消化条件下酶对麦醇溶蛋白的消化作用
为了在体外条件下更接近地模拟人体的自然状况，首先让麦醇溶蛋白受到模拟胃液(SGF)的作用，然后，在菠萝蛋白酶和菠萝蛋白酶 - 无花果蛋白酶混合物(BF)的作用下进行处理。图5显示了在模拟胃条件下以及在菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶作用前后麦醇溶蛋白条带的电泳凝胶。如图所示，麦醇溶蛋白在SGF中的消化不完全，在用菠萝蛋白酶和菠萝蛋白酶 - 无花果蛋白酶混合物处理后有所增加。同样明显的是，菠萝蛋白酶 - 无花果蛋白酶混合物对经模拟胃液处理的麦醇溶蛋白的消化作用比单独的菠萝蛋白酶更大。
用高效液相色谱法评估麦醇溶蛋白的酶消化作用
通过反相高效液相色谱分析(图6)评估了菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶水解麦醇溶蛋白序列的能力。在时间点0用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶处理的麦醇溶蛋白被视为零点样品，并作为参考对照运行。正如预期的那样，与零点样品相比，酶处理后色谱图中与麦醇溶蛋白相关的峰显著降低。因此，零点样品的色谱图与孵育期后消化的麦醇溶蛋白有显著差异。这一证据表明，在一定的孵育时间内，菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶都能蛋白水解麦醇溶蛋白。然而，在麦醇溶蛋白消化中(酶与麦醇溶蛋白浓度比为1:1)，无花果蛋白酶的作用比菠萝蛋白酶更好。
用酶处理合成的麦醇溶蛋白19聚体肽并通过圆二色性(CD)进行验证
为了进一步评估源自麦醇溶蛋白的19聚体毒性肽的酶消化作用，我们假设肽19在酶消化前后的二级结构含量会发生变化。因此，我们用CD方法对其进行了研究(图7)。表6显示了用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶处理前后(零点)19聚体肽的二级结构含量(分数比)。如表6所示，用菠萝蛋白酶处理19聚体肽后，其α螺旋和β折叠含量降低，相反，其转角和卷曲的百分比增加。然而，无花果蛋白酶不影响α螺旋的量，但增加了β折叠。然而，用无花果蛋白酶处理后，19聚体肽的转角和卷曲减少。19聚体肽二级结构含量的这种变化再次证实了这两种酶对该肽进行蛋白水解切割的潜力。
细胞毒性结果
通过MTT法测定了单独的麦醇溶蛋白和19聚体肽以及用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶混合物(BF)和醋酸拉佐替丁(LA)处理后(麦醇溶蛋白 - BF和19聚体 - BF)对CaCo - 2细胞的细胞毒性(图8)。此外，还测量了上述酶混合物单独的毒性。用不同浓度(从15.62到 )的每个样品处理Caco2细胞24小时。未处理的细胞用作对照。在暴露于不同浓度的麦醇溶蛋白和19聚体肽24小时后，MTT测定显示Caco - 2细胞的活力显著降低。结果表明，在相同浓度 下，完整麦醇溶蛋白的毒性明显高于19聚体肽。相反，菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶和醋酸拉佐替丁没有显示出明显的毒性。我们的结果表明，用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶混合物消化麦醇溶蛋白和19聚体肽显著降低了它们的毒性 。
图6 菠萝蛋白酶、 麦醇溶蛋白以及酶处理零点时的菠萝蛋白酶、 孵育期后经菠萝蛋白酶处理的麦醇溶蛋白、 无花果蛋白酶、 零点时的无花果蛋白酶和麦醇溶蛋白以及 经无花果蛋白酶处理后的麦醇溶蛋白的高效液相色谱图
图6(续)
图7 19肽在经菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶处理前后的圆二色光谱。图示表明，用这些酶处理后，19肽的二级结构发生了变化
表6 19肽在经菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶处理前后二级结构含量的分数比
| 反应 | 二级结构的比例(%) | |||
| 螺旋 | β链 | 转角 | 无规卷曲 | |
| 19肽-菠萝蛋白酶(处理前) | 11 | 67.7 | 0 | 21.3 |
| 19肽-菠萝蛋白酶(处理后) | 0.4 | 60.4 | 2.9 | 36.3 |
| 19肽-无花果蛋白酶(处理前) | 6.6 | 40.4 | 15.9 | 37.1 |
| 19肽-无花果蛋白酶(处理后) | 6.4 | 60.4 | 4.2 | 29 |
用qRT-PCR评估紧密连接蛋白的基因表达后
通过实时PCR进行基因表达分析，以评估菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶混合物(BF)对麦醇溶蛋白和合成19聚体肽的影响。评估了OCCL、CLDN、TGP(ZO-1)和ZON基因。我们还确定了它们对所需基因以及LA肽表达的影响。结果表明，单独用麦醇溶蛋白处理CaCo-2细胞会增加所有基因(OCCL、TGP、ZON和CLDN)的表达，尤其是ZON，这是对紧密连接蛋白破坏的反应。用19聚体肽处理细胞时基因表达的这种增加(尤其是ZON和OCCL)显著高于用麦醇溶蛋白处理 。众所周知，用BF混合物处理麦醇溶蛋白和19聚体后，与酶处理前相比，所有参与细胞连接的基因，尤其是ZON和OCCL的表达显著降低 (图9A)。
还发现，用LA处理的细胞表达的细胞连接基因明显少于用LA和麦醇溶蛋白混合物(麦醇溶蛋白-LA)处理相同细胞时的情况。这一问题在OCCL、TGP和CLDN基因的表达中很明显(P < 0.001)。此外，在用酶混合物消化麦醇溶蛋白并与LA一起添加到细胞中(麦醇溶蛋白-BF-LA)后，发现所有基因的表达与麦醇溶蛋白-LA相比均显著降低 。因此，在此发现麦醇溶蛋白的酶消化可以降低其对参与细胞连接的蛋白质的毒性作用，并且LA对细胞连接的积极作用再次出现(图9B)。
图8该图表显示了用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶混合物(BF)以及醋酸拉拉佐肽处理前后，麦醇溶蛋白和19聚体肽对Caco-2细胞系的毒性。误差条表示标准差
讨论
乳糜泻(CeD)是一种重要的人类自身免疫性疾病，由遗传易感性个体(具有HLA-DQ2或HLA-DQ8单倍型)对麦醇溶蛋白及相关醇溶蛋白不完全消化产生的有毒肽的极端反应引起。这种疾病的特征是存在多种与麸质相关的临床指征、CD特异性抗体和小肠肠病(Gujral等人，2012年)。如引言中所述，尽管无麸质饮食是乳糜泻的唯一治疗方法，但补充剂、药物和其他食品中存在不需要的麸质降低了该策略的有效性(Alhassan等人，2019年)。植物来源的酶，如淀粉酶、转化酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、脂氧合酶等，在食品制备过程中有许多用途，包括糖浆、烘焙产品、酒精饮料、乳制品等的生产(Meshram等人)。本研究旨在评估菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对麦醇溶蛋白毒性以及对CaCo2细胞系有毒19聚体肽的消化作用。
在使用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对麦醇溶蛋白进行酶解的虚拟模拟中，获得了12个肽片段，并对两种无毒且无免疫原性的酶酶解得到的所有序列进行了预测。在本研究的这一部分中，预测即使这两种酶也能消化麦醇溶蛋白分解产生的两种重要毒性肽(33肽和19肽)。此外，免疫信息学预测表明，用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶消化19肽和33肽得到的片段无免疫原性或毒性。基于这些预测，确定了这两种酶对麦醇溶蛋白衍生的其他12种毒性肽的消化作用。发现菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶单独使用甚至混合使用也能消化这些毒性肽。此外，分子对接结果表明，用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶进行酶解，除了能消化33肽和19肽毒性肽外，还能产生与HLA-DQ2和HLA-DQ8结合亲和力较低的片段。因此，这些消化后的片段可能比未消化的33肽和19肽诱导的免疫反应更弱。因此，可以假设，在使用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对麦醇溶蛋白及其不完全消化产生的毒素肽进行酶解的情况下，乳糜泻易感人群的病理损伤将减少。我们的研究是第一项使用计算机方法模拟麦醇溶蛋白酶解及其不完全消化产生的毒性肽，并预测麦醇溶蛋白消化片段的毒性和免疫原性的研究。此外，尚未有关于麦醇溶蛋白酶解获得的肽片段与HLA-DQ2和HLA-DQ8分子进行分子对接的研究。因此，通过这些虚拟研究和模拟，我们设计了进行体外研究的默认方案。
图9 用 麦醇溶蛋白、19肽及其用酶混合物(BF)消化的衍生物处理的细胞连接相关基因的表达，以及用LA肽、麦醇溶蛋白-拉佐替丁醋酸盐(麦醇溶蛋白-LA)处理的B，以及用BF和LA一起消化的麦醇溶蛋白(麦醇溶蛋白-BF-LA)
活性蛋白酶可水解麦醇溶蛋白，多项研究表明植物蛋白酶最适合此目的(Jayawardana等人，2019年)。菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶是最广泛鉴定的可商购的水果衍生蛋白酶，在烘焙行业安全使用，可用于蛋白质水解(Meshram等人，2018年)。水解条件，如温度和酶-底物比，可显著影响酶解效率(Li等人，2016年)，因此我们的研究考察了这些条件。我们首次评估了菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶组合对麦醇溶蛋白消化的影响。此外，还优化了麦醇溶蛋白和19肽的各种酶解条件，如温度、酶-底物比以及这两种酶的处理时间，并通过SDS-PAGE、RP-HPLC和CD直接观察结果。
酶活性检测的温度范围是根据先前研究的结果确定的。先前研究中提到的温度是 。Pang等人报道菠萝蛋白酶的最佳温度是 。他们还指出，菠萝蛋白酶的活性和稳定性与温度有关，随着孵育温度升高(50 - 70 )，菠萝蛋白酶的活性会降低(Pang等人，2020年)。然而，与许多研究不同，我们的研究表明酶发挥功能的最合适温度是 (生物体温度)。
醇溶蛋白的可溶性蛋白含量(SPC)和SDS-PAGE分析表明该大分子聚合物的哪一部分已解聚(Thiele等人，2004年)；因此，它可以用作评估酶消化效果的方法。在不同条件下用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对醇溶蛋白进行酶消化。SDS-PAGE凝胶分析结果表明，在所有时间和温度下，酶与醇溶蛋白的比例为1:100时，根据蛋白质大小，它比无花果蛋白酶能更好地消化醇溶蛋白。在1:100酶与醇溶蛋白的比例下，最佳结果是在室温(RT)和 (尽管之前所有研究都报道菠萝蛋白酶消化的最佳温度是 )。Buddrick等人(2015年)证明木瓜乳胶中的木瓜蛋白酶在5小时后可降低有毒醇溶蛋白含量。Li等人报道，在酶与底物比例[E/S]为(0.1/0.4%)且反应时间为60 - 90分钟时，木瓜蛋白酶可使醇溶蛋白含量大幅降低(高达99.99%)(Li等人，2016年)。一些研究报道无花果蛋白酶发挥作用的最佳温度为30 - 37°C(Yang等人，2017年)，而其他一些研究报道该温度为 (Fadýloğlu，2001年)。
在无花果蛋白酶1:1和1:10(酶与醇溶蛋白)的比例下，醇溶蛋白的消化效果优于菠萝蛋白酶。菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对醇溶蛋白进行酶消化的HPLC结果表明，这些酶可将醇溶蛋白消化成小肽。HPLC色谱图表明，菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶在水解醇溶蛋白方面具有几乎相似的效果。这证实了这些植物酶的功效。无花果蛋白酶和菠萝蛋白酶属于半胱氨酸蛋白酶家族；然而，它们的酶促水解机制有所不同，它们切割不同的蛋白质键。
醇溶蛋白消化受损后，胃肠道蛋白酶会产生具有免疫原性和毒性的肽。13聚体、19聚体和33聚体肽毒性和免疫原性更强(Chibbar和Dieleman，2019年)；19聚体肽与CXCR3结合并释放闭合蛋白和紧密连接(TJ)功能障碍。33聚体刺激Thl和Th2炎症途径(Alhassan等人，2019年)。
因此，我们首先通过研究19聚体肽二级结构含量的变化，研究菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶对其中一种肽(19聚体肽)的消化情况。然后，我们测定了醇溶蛋白和该肽在这两种酶进行酶消化前后对CaCo - 2细胞系的细胞毒性。最后，我们研究了醇溶蛋白和19聚体肽在菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶进行酶消化前后对参与形成细胞紧密连接的基因表达的影响。
首次，我们以一种创新方法假设，用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶进行酶消化后，19聚体肽的二级结构含量会发生变化，因此我们使用圆二色性(CD)来证明这一点。结果表明，用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶消化该肽后，螺旋、β链、转角和无规卷曲的百分比发生了变化。
醇溶蛋白和19聚体肽在CaCo2细胞系上酶消化前后的MTT结果表明，用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶混合物处理后，醇溶蛋白和合成的19聚体肽的毒性降低。
麦醇溶蛋白及其衍生的毒性肽作用于小肠上皮细胞的紧密连接，增加其通透性(Yoosuf和Makharia，2019年)。这一过程增加了毒性肽渗入固有层的量，并引发更多免疫反应(Yoosuf和Makharia，2019年)。因此，我们通过实时PCR方法评估了麦醇溶蛋白和19聚体肽在被BF混合物酶消化前后对一些编码细胞间紧密连接蛋白的基因表达的影响。qRT-PCR结果表明，用麦醇溶蛋白处理的CaCo-2细胞以及用BF消化后的19聚体肽，其紧密连接蛋白未被破坏。因此，CaCo-2细胞无需表达额外的基因来产生这些蛋白质。因此，与完整的麦醇溶蛋白和19聚体肽相比，用BF处理麦醇溶蛋白和19聚体肽后，细胞间紧密连接蛋白的基因表达降低。在我们的研究中，BF消化的麦醇溶蛋白存在时，ZO-1基因的表达降低。这些基因的表达随麦醇溶蛋白增加。ZO-1和闭合蛋白基因的表达可能是乳糜泻患者紧密连接结构和功能异常的分子根源。ZO-1蛋白是定位在新生紧密连接复合体中的初始分子，在跨膜蛋白和细胞质肌动蛋白丝(骨架)之间形成连接(Anderson等人，1995年；Fanning和Anderson，2009年)。Pizzuti等人证明，乳糜泻中ZO-1基因的表达降低，肌动蛋白结构受到干扰，但在采用无麸质饮食后，ZO-1表达和肌动蛋白组织的异常得到逆转(Pizzuti等人，2004年)。闭合蛋白是紧密连接通透性的关键因素。紧密连接的紧密程度由闭合蛋白的组成、数量和参与比例决定(Günzel和Yu，2013年)。研究表明，闭合蛋白对于紧密连接蛋白的维持和排列至关重要(Saitou等人，2000年)。TJ蛋白功能障碍会破坏细胞间连接，刺激肠道通透性和炎症(Lee，2015年)。简而言之，我们研究中的实时PCR结果是这样解释的。麦醇溶蛋白和19聚体肽通过增加zonulin的表达来增加细胞的通透性。zonulin会破坏其他蛋白质，如OCCL、TGP(ZO-1)和CLDN。因此，由于对Caco2细胞的处理，麦醇溶蛋白或12聚体肽增加了zonulin的表达，结果，降解的OCCL、TGP和CLDN的表达也增加以补偿它们的损失。BF混合物的酶处理导致麦醇溶蛋白和19聚体肽的消化，因此与用完整的麦醇溶蛋白或19聚体肽处理时相比，Caco2细胞中zonulin的表达降低，并且无需过度补偿OCCL、TGP和CLDN，所以它们的表达也低于用完整的麦醇溶蛋白处理时。
zonulin通过破坏细胞质锚定蛋白ZO-1与跨膜封闭蛋白之间的接触来控制肠道通透性(Sturgeon和Fasano，2016年)。肠道通透性的增加取决于zonulin的表达，zonulin抑制剂FZI/0的处理可防止肠道通透性增加(Watts等人，2005年)。Tammara Watts等人证明，与对照组相比，I型糖尿病患者血清zonulin水平显著升高(Watts等人，2005年)。Duerksen等人表明，乳糜泻患者血清zonulin水平升高，在采用无麸质饮食后恢复正常(Duerksen等人，2010年)。我们的研究表明，在麦醇溶蛋白和BF酶存在的情况下，zonulin和闭合蛋白基因的表达降低。随后，这些结果可以证实菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶用于治疗乳糜泻患者的有效性。然而，这一问题应通过体内和临床试验进行验证。
我们还测量了完整的麦醇溶蛋白以及用这两种酶与LA肽一起消化的麦醇溶蛋白对上述基因表达的影响。这种肽通过调节紧密连接蛋白来防止乳糜泻患者肠道细胞的破坏(Hoilat等人，2022年)。
在用月桂酸(LA)处理的Caco-2细胞中，检测参与细胞连接的基因表达的结果表明，与未处理的细胞相比，所有上述基因的表达均显著降低。然而，当将麦醇溶蛋白添加到用LA处理的细胞中时，OCCL、CLDN、TGP和ZON基因的表达显著增加。相反，当将用酶混合物消化的麦醇溶蛋白添加到用LA处理的细胞中时，所有这些基因的表达均降低，并且再次观察到LA的保护作用。
因此，我们的结果表明，菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶混合物对麦醇溶蛋白的酶促消化可以降低麦醇溶蛋白对参与细胞连接的蛋白质的毒性作用，并且LA对细胞连接的积极作用再次出现。
结论
尽管食用无麸质食品(GFD)是预防乳糜泻临床表现的唯一策略，然而，无麸质食品的不良味道，
参考文献
Agarwal S, Kovilam O, Zach TL, Agrawal DK (2016) Immunopatho-genesis and therapeutic approaches in pediatric celiac disease. Expert Rev Clin Immunol 12:857-869这些产品的高成本以及意外摄入麸质是尚未提出解决方案的问题。关于麸质降解酶，特别是植物酶的研究正在增加。我们的研究表明，菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶的混合物能够很好地消化麦醇溶蛋白及其衍生的有毒肽。用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶消化麦醇溶蛋白产生的肽对Caco-2细胞的毒性比完整的麦醇溶蛋白小得多。此外，基因表达研究表明，用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶混合物消化麦醇溶蛋白和19聚体肽可保留该细胞系中参与紧密连接的蛋白质，并增强醋酸拉佐替德治疗肽在维持紧密细胞连接方面的作用。因此，除了具有抗炎特性外，使用菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶还可能有助于消化由于麦醇溶蛋白不完全消化产生的有毒肽。通过进行体内研究，我们有望看到这两种天然酶在治疗乳糜泻方面的治疗潜力。
致谢 作者感谢伊朗巴斯德研究所药物设计和生物信息学部门的工作人员以及塞姆南医科大学医学院医学生物技术研究中心的工作人员。
作者贡献 HM:论文导师，概念构思、设计和研究实施，数据收集与分析，撰写和编辑手稿；SS:论文导师并参与数据收集；MSMM:博士生，数据收集与分析，撰写手稿；BV:论文顾问并在高效液相色谱和十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳方面提供咨询；AAS:论文顾问；HAMAA和GG:参与数据收集。
资金支持 本项目得到塞姆南医科大学的批准和支持(批准号:A - 10 - 500 - 4)。
数据可用性 数据包含在文章或补充材料中。
声明
利益冲突 所有作者声明不存在竞争利益或财务利益，并且作者确认本文内容不存在利益冲突。
伦理批准和参与同意 不适用。
发表同意 所有作者声明同意发表。
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